二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物及其制备方法
二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于合成医药技术领域，具体涉及一种具有光控释放一氧化碳性能的二肽 小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，以及该化合物在抗缺血性灌注再损伤方面 的应用。
【背景技术】
[0002] CO是一种剧毒气体，对人体的伤害极大，但近年来研宄表明，CO与NO -样是一种 非常重要且能释放生物信号的分子。实际上，人体内血红素氧合酶降解血红素过程中会不 断产生少量的C〇,它展现出细胞保护、抗炎症性、促进血管舒张、防止缺血再灌注损伤以及 其他治疗功效。
[0003] 为了发展CO治疗的有效形式，一系列一氧化碳释放分子（CO Releasing Molecules，CO-RMs)得以发展。在自然条件下被确定能够释放出CO的化合物存在五种。 第一种是醛类：初步的研宄数据确定了它们的潜在生物活性，但其CO释放速度慢，且其毒 物学性质妨碍了其作为CO-RMs的发展；第二种是草酸类：释放CO的速度太慢；第三种是硼 的碳酸酯：是一种众所周知的CO释放物，然而，这些化合物的化学转换范围受限，且不满足 化合物所应具有的合适药物学特征；第四种是硅的碳酸酯：这类化合物只有在热的有机溶 剂、强的催化剂存在时，才能释放出C0,其高温、强的基础活性的要求表明它们与生物系统 不相容；第五种是金属羰基化合物：具有稳定好，实现可控释放和靶向传输的优势，是一类 极具医学应用前景的C〇-RMs。
[0004] 近年来，随着科学技术的发展，烧伤的皮肤移植、肾移植、肝脏移植等器官移植慢 慢解决以前无法攻克的问题，并且取得了较大的进展，然而仍然存在着这样那样的技术问 题。机体组织器官正常代谢、功能的维持，有赖于良好的血液循环。各种原因造成的局部组 织器官的缺血，常常使组织细胞发生缺血性损伤，但在动物试验和临床观察中也发现，在一 定条件下恢复血液再灌注后，部分动物或患者细胞功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反 而加重，因而将这种血液再灌注后缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血再灌注损伤。缺 血再灌注损伤的发生机制主要有：自由基的作用、钙超载的作用、白细胞的作用、高能磷酸 化合物缺乏、内皮素的作用、血管紧张素 II的作用等等，而自由基的氧化作用是重中之重。
[0005] 缺血所引的组织损伤是致死性疾病的主要原因，诸如冠动脉硬化导致的心肌梗 死、脑卒中等。在缺血性疾病抢救和治疗过程中，医学家们渐渐发现，对组织造成损伤的主 要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应 的组织内的细胞造成的。有许多证据说明仅仅缺血还不足以导致组织损伤，而是在缺血一 段时间后又突然恢复供血（即再灌注）时才出现损伤。在创伤性休克、外科手术、器官移 植、烧伤、冻伤和血栓等血液循环障碍时，都会出现缺血后再灌注损伤。缺血组织再灌注时 造成的微血管和实质器官的损伤主要是由活性氧自由基引起的，这已在多种器官中得到证 明。在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧了自由基对 缺血后再灌注组织的损伤。一氧化碳释放法分子释放出的CO具有清除自由基的抗氧化作 用，并且CO具有抗菌消炎的生理作用更增加了一氧化碳释放分子，特别是金属羰基化合物 在抗缺血性灌注再损伤方面的作用，但是现有的金属羰基化合物存在水溶性差、热稳定性 差、毒性大、生物相容性低、一氧化碳的不可控释放等缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于克服现有金属羰基化合物存在的缺点，提供一种 热稳定较好、毒性较低，且具有较好的水溶性和生物相容性，能够实现光控释放一氧化碳， 有效的应用于抗缺血性灌注再损伤的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物， 以及该化合物的制备方法。
[0007] 解决上述技术问题所采用的技术方案是：该二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fischer卡宾化合物的结构式如下所示：
[0008]
[0009] 式中M代表Cr、Mo或W，R1、R2、R3、R4各自独立的代表-H、烷基、-C nH2n-R5、苄基中的 任意一种，其中R5代表-H、-OH、-C00H、-NH 2、-SH、-SCH3*的任意一种，η为1~3的整数。
[0010] 上述的Rp R2、R3、R4优选各自独立的代表-Η、C广C 4烷基、苄基中的任意一种。
[0011] 本发明二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的制备方法如下：
[0012] 1、在无水无氧，氮气保护条件下，以无水甲醇为溶剂，将式1所示的Fischer卡宾、 式2所示的氨基酸、弱碱室温反应5~10小时，室温减压旋转蒸发除去溶剂，得到式3所示 的氨基酸修饰的Fischer卡宾，反应路线如下：
[0013]
[0014] 2、在无水无氧条件下，以二氯甲烷为溶剂，将式3所示的氨基酸修饰的Fischer卡 宾与4-二甲氨基吡啶（DMAP)、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺（DCC)、式4所示的氨基酸甲酯盐 酸盐在冰浴条件下反应18~24小时，采用柱色谱分离，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fischer卡宾化合物，反应路线如下：
[0015] 3 ^
[0016] 上述的Fischer卡宾与氨基酸、弱碱、4-二甲氨基吡啶、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺、 氨基酸甲酯盐酸盐的摩尔比为I: (1~1. 2) : (1~6) : (0. 2~0. 3) : (1. 5~2) : (1~1. 2)， 所述的弱碱为三乙胺、1(20)3或Na 2C03。
[0017] 本发明的有益效果如下：
[0018] 本发明先通过氨基酸与Fischer卡宾偶联生成氨基酸修饰的Fischer卡宾，然后 在催化剂作用下将氨基酸修饰的Fischer卡宾与氨基酸甲酯盐酸盐偶联生成稳定的酰胺 键，即二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物，其容易分离且纯度较高。
[0019] 本发明通过二肽小分子对Fischer卡宾进行修饰，不仅增加了 Fischer卡宾的水 溶性、生物相容性，降低了分子的毒性，并且极大地增加了分子的热稳定性。
[0020] 本发明二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物在紫外光照射下能够迅速 释放一氧化碳分子，对光具有较好的响应性，且该化合物分子量较小，携带的CO较多，每个 分子可携带五个CO, CO释放效率很高，可作为光控一氧化碳释放分子，实现一氧化碳的可 控释放，用于病变组织的抗菌抗炎和缺血性组织再灌注损伤的治疗，为一氧化碳释放分子 的靶向释放开辟了一条新的道路。
【附图说明】
[0021] 图1是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的晶体 图。
[0022] 图2是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物沿a方 向的一维层状图。
[0023] 图3是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的多面 体堆积微孔图。
[0024] 图4是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的晶体 图。
[0025] 图5是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物沿a方 向的一维层状图。
[0026] 图6是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的多面 体堆积的微孔图。
[0027] 图7是五羰基铬的Fischer卡宾的热重分析图。
[0028] 图8是实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的 热重分析图。
[0029] 图9是肌红蛋白法测试一氧化碳释放分子的CO释放。
[0030] 图10是10umol/L实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物在PBS中的CO释放动力学图。
[0031] 图11是20umol/L实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物在PBS中的CO释放动力学图。
[0032] 图12是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在器 官保存液中的释放动力学图。
[0033] 图13是小鼠左肾缺血不同时间再灌注后的存活情况。
[0034] 图14是小鼠尾静脉分别注射实施例1化合物及生理盐水1小时后行肾致死性缺 血/再灌注的存活情况。
[0035] 图15是小鼠尾静脉分别注射失活的实施例1化合物及生理盐水1小时后行肾致 死性缺血/再灌注的存活情况。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0037] 实施例1
[0038] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0039]
[0040] 1、在兀7」、兀羊I1求1十r，符DDDZg Ummo丄；H班整m tfJ nscner卡宾和 0. 1501g(2mmol)甘氨酸加入到反应瓶中，加入15mL无水甲醇和0. 3mL(2mmol)三乙胺，室温 条件下反应5小时，室温减压旋转蒸发除去溶剂，得到甘氨酸修饰的Fischer卡宾。
[0041 ] 2、在无水无氧条件下，向步骤1得到的甘氨酸修饰的Fischer卡宾中加入 0· 02510g(2mmol)甘氨酸甲酯盐酸盐、0· 0611g(0. 5mmol)4-二甲氨基吡啶（DMAP)、 0. 4124g(2mmol)二环己基碳二亚胺（DCC)、20mL无水二氯甲烷，在冰浴条件下反应24小 时，反应结束后，以二氯甲烷作为洗脱剂采用柱色谱分离产物，干燥产物，得到黄色固体 二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为77. 6%，结构表征数据为： IR(CH2C12, cm-1) ：V(C0) = 2056cm_1U927cm_1, V(COCH3) = 1748cm-1, V(CONH) = 1697cm_\ 1518CHT1; 1H-NmrGOOMHz, CDCl3) (Z/E = 5/2) δ :9. 51(s，J = 96. 5Hz，lH，NH)，6.37(s， J = 134.2Hz，lH，NH)，4.40(dd，J = 191.8、3.8Hz，4H)，3.81(s，3H，CH3)，2.75(d，J = 52.3Hz，3H，CH3) ;13C-匪R(101MHz，CDCl3) δ :217.70(C0)，217.5(C0)，169.74(CTCH3)， 169. 65 (COCH3)，166. 80 (CONH)，165. 71 (CONH)，53. 30 (OCH3)，52. 83 (CH)，52. 78 (CH)， 48. 37 ( = CCH3)，45. 36 ( = CCH3)，41. 42 (CH2)，37. 23 (CH2) ;ESI-Ms :理论值[M] = 364. 00， 实测值[M] = 362· MM。
[0042] 采用低温溶液扩散法，将IOOmg得到的黄色固体加入小瓶中，加入二氯甲烷至刚 好溶解，然后沿烧杯壁缓慢加入二氯甲烷体积1-2倍的正己烷，密封，放入冰箱中在-18°C 静置至有黄色晶体析出。所得晶体的晶体图见图1，沿a方向的一维层状图见图2,多面体 堆积微孔图见图3,单晶结构和晶体数据见表1。
[0043] 表1单晶结构和晶体数据
[0044]
[0045] 实施例2
[0046] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0047]
[0048] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的丙氨酸替换，其它步骤与实施例1相 同，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为51 %，结构表征 数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(CO) = 2056011^1927011' V(COCH3) = 1748CHT1，V(CONH)= 1697CHT1，1518CHT1; 1H-NmrGOOMHz, CDCl3) δ :9. 66 (s，1H，ΝΗ)，6· 35 (s，1H)，5· 30 (s，1H， H)，4.59-4.47(m，lH，CH)，4.12(d，J = 3.7Hz，2H，CH2)，3.80(s，3H，C0CH3)，2.75(d，J = 19.5Hz，3H，CH3)，1.56(d，J = 6.8Hz，3H，CH3) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :217.61(C0)， 169. 92 (COCH3)，169. 80 (CONH)，55. 24 (OCH3)，53. 43 (CH)，52. 76 (CH2)，41. 39 (CH3)， 35. 96(CH3)，19. 73( = CCH3) ;ESI-Ms :理论值[M] = 378. 02,实测值[M+23] = 401. 0005。
[0049] 实施例3
[0050] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0051]
[0052] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的苯丙氨酸替换，其它步骤与实施例1 相同，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为78% .，结构表 征数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(CO) = 2055(^^1924011' V(COCH3) = 1749CHT1，V(CONH) =1692011^1515011-1; 1H-NMR (400MHz，CDCl3) δ :9. 49 (s，lH，NH)，7.40-7. 29 (m，3H，Ph)， 7.20(d，J = 6.7Hz，2H，Ph)，6. ll(s，lH，NH)，4.61(d，J = 6. 1Hz，1H，CH)，4.09(d，J = 4. lHz，2H，CH2)，3. 79(s，3H，OCH3)，3. 15(ddd，J = 21. 8、13. 7、6. 9Hz，2H，CH2)，2. 32(s，3H， CH3) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :221.81(C0)，216.45(C0)，168.58(C0CH3)，167.43(OTNH)， 133. 43 (Ph)，128. 32 (Ph)，128. 28 (Ph)，127. 01 (Ph)，60. 33 (OCH3)，51. 76 (CH)，40. 38 (= CCH3)，39. 07 (CH2)，34. 74 (CH2) ;ESI-Ms :理论值[M] = 454. 05,实测值[M+23] = 477. 0334。
[0053] 实施例4
[0054] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0055]
[0056] 在实施例1中，所用的甘氨酸甲酯盐酸盐用等摩尔的亮氨酸甲酯盐酸盐替换，其 它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率 为 73. 14%，结构表征数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(C0) = 2055011^1924(^1, V(COCH3)= 1743〇11-1，￥(0)順）= 1693011^151601^^-^^(40011^0)(:13)(2/^ = 7/1) δ :9. 44(d，J = 100. 3Hz，1H，NH)，6· 14(dd，J = 112. 1、7· 3Hz，1H，NH)，4· 61(ddd，J = 43. 8、11· 8、6· 5Hz，1H， CH)，4. 17-3. 86 (m，2H，CH2)，3. 71 (s，3H，OCH3)，2. 67 (d，J = 50. 4Hz，3H，CH3)，I. 75-1. 61 (m， 2H，CH2)，1.61-1.42(m，lH，CH)，0.90(t，J = 5.6Hz，6H，C(CH3)2) ;13C-NMR(101MHz，CDC13) δ : 216. 70 (CO)，216. 54 (CO)，172. H(COCH3)，172. 05 (COCH3)，164. 47 (CONH)，164. 35 (CONH)， 51. 71 (OCH3)，51. 67 (OCH3)，50. 21 (CH2)，50. 17 (CH2)，47. 49( = CCH3)，40. 54( = CCH3)， 36. 23 (CH)，23. 93 (CH2)，23. 85 (CH2)，21. 67 (CH3)，21. 63 (CH3)，20. 90 (CH3)，20. 82 (CH3); ESI-Ms :理论值[M] = 420. 06,实测值[M+23] = 443. 0494。
[0057] 实施例5
[0058] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0059]
[0060] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的丙氨酸替换，所用的甘氨酸甲酯盐酸盐 用等摩尔的亮氨酸甲酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子修饰的杂N 稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为50%，结构表征数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(CO)= 2054cm_\l924cm_1, V(COCH3) = 1743cm_1, V(CONH) = 1693cm_\ 1516cm-1； 1H NMR(400MHz, CDC13)S :9.30(d，J = 126.6Hz，lH)，5.96(dd，J = 80.7、8.2Hz，lH)，4.73-4.23(m，2H)， 3. 70(s，3H)，2. 68(t，J = 6. 8Hz，3H)，I. 69-1. 54(m，3H)，I. 48(dd，J = 10. 1、5. 9Hz，3H)， 1.19(s，2H)，0.89(dt，J = 12·9、6·4Ηζ，6Η) ;13C 匪R(101MHz，CDC13)S :216.57(C0)， 171. 86 (COCH3)，168. 36 (CONH)，54. 46 (OCH3)，51. 62 (CH)，50. 15 (CH)，40. 37( = CCH3)， 35. 11 (CH2)，23. 94 (CH2)，21. 65 (CH3)，20. 88 (CH3)，18. 61 (CH3) ;ESI-Ms :理论值[M]= 4：M· 〇8,实测值[M+23] = 457. 〇636。
[0061] 采用低温溶液扩散法，将IOOmg得到的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer 卡宾化合物加入小瓶中，加入二氯甲烷至刚好溶解，然后沿烧杯壁缓慢加入二氯甲烷体积 1~2倍的正己烷，密封，放入冰箱中在-18°C静置至有黄色晶体析出。所得晶体的晶体图 见图4,沿a方向的一维层状图见图5,多面体堆积微孔图见图6,单晶结构和晶体数据见表 2〇
[0062] 表2单晶结构和晶体数据
[0063]
[0064] 实施例6
[0065] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0066]
[0067] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的亮氨酸替换，所用的甘氨酸甲酯盐酸 盐用等摩尔的苯丙氨酸甲酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子 修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为48%，结构表征数据为：IR(CH 2C12， cm-1) ：V(CO) = 2055cm_1U925cm_1, V(COCH3) = 1742cm_1, V(CONH) = 1686cm_\ 1513cm-1； 1H-NmrgoomHzJDCI3) δ :9. 05 (d，J = 6. 3Hz，lH，NH)，7. 30-7. 19 (m，3H，Ph)，6.98 (dd，J = 7. 6、1. 6Hz，2H，Ph)，5. 91(d，J = 7. 7Hz，1H，NH)，4. 82(dt，J = 7. 6、6. 0Hz，1H，CH)，4. 20(dd， J = 14.0、7.7Hz，lH，CH)，3.65-3.75(s，3H，CH3)，3.20(dd，J = 14.1、5.7Hz，1H，CH2)， 3. 02(dd，J = 14. 1、6. 2Hz，1H，CH2)，2. 52(s，3H，CH3)，I. 61-1. 48(m，3H，CH_CH2)，0· 86(dd， J = 16. 0、6.2Hz，6H，C(CH3)2) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :216. 57(C0)，170. 55(C0CH3)， 167. 62 (CONH)，134. 15 (Ph)，128. 09 (Ph)，127. 78 (Ph)，126. 52 (Ph)，66. 94 (CH)， 58. 37 (OCH3)，52. 09 (CH)，51. 72 (CH)，40. 90 ( = CCH3)，36. 53 (CH)，34. 98 (CH2)，23. 67 (CH2)， 21.55(CH3)，21.07(CH3) ;ESI-Ms :理论值[M] = 510. 11，实测值[M+23] = 533.0947。
[0068] 实施例7
[0069] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0070]
[0071] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的苯丙氨酸替换，所用的甘氨酸甲酯盐 酸盐用等摩尔的苯丙氨酸甲酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子 修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为40%，结构表征数据为：IR(CH 2C12， cm-1) ：V(CO) = 2054cm_\l925cm_1, V(COCH3) = 1743cm_1, V(CONH) = 1687cm_\ 1511cm-1； 1H-Nmr goomHzJDCI3) δ :9. 27 (d，J = 7. 5Hz，1H，NH)，7. 30-7. 22 (m，3H，Ph)，7. 22-7. 16 (m， 3H，Ph)，7.09(dd，J = 7.4、1.7Hz，2H，Ph)，6.90(dd，J = 6.5、2.9Hz，2H，Ph)，5.86(d， J = 7.5Hz，lH，CH)，4.85-4.74(m，lH，NH)，4.38(td，J = 8.1、5.7Hz，lH，CH)，3.71(s， 3H)，3. 13 (dd，J = 14. 0、5. 8Hz，1H，CH)，3. 09-2. 92 (m，3H，OCH3)，2. 21 (d，J = 0· 5Hz，3H， CH3) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :216. 38 (CO)，170. 21 (COCH3)，166. 67 (CONH)，133. 96 (Ph)， 133. 30 (Ph)，128. 34 (Ph)，128. 25 (Ph)，128. 03 (Ph)，127. 80 (Ph)，126. 97 (Ph)，126. 52 (Ph)， 60. 46 (CH)，52. 37 (OCH3)，51. 70 (CH2)，38. 61 ( = CCH3)，36. 43 (CH2)，34. 81 (CH2) ;ESI-Ms :理 论值[M] = 544. 〇9,实测值[M+23] = 567· 〇784。
[0072] 为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂 N稳定的Fischer卡宾化合物进行了各种性能测试，具体实验如下：
[0073] 1、热稳定性测试
[0074] 发明人采用热重分析仪对五羰基铬的Fischer卡宾和实施例1~7制备的二肽小 分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的热稳定进行测试，结果见图7~8,由图7~ 8可见，五羰基铬的Fischer卡宾在45°C开始分解，并且一个阶段快速分解完毕，说明五羰 基络的Fischer卡宾的热稳定性差，而实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fi scher 卡宾化合物分别在 140 °C、152 °C、148 °C、139 °C、150 °C、129 °C、155 °C 开始分解（其 中实施例1和4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在最开始的少量 失重为溶剂的挥发），并且2~3个阶段分解，与原料五羰基铬的Fischer卡宾相比热稳定 性明显提尚。
[0075] 2、一氧化碳释放性能测试
[0076] (1)肌红蛋白法测试CO-RM在PBS中的释放性能试验
[0077] 称取IOmg肌红蛋白加入到5mL容量瓶中，然后用pH值为7. 4的磷酸缓冲溶液 (PBS)定容，配制成肌红蛋白溶液。用移液枪吸取ImL肌红蛋白溶液加入比色皿中，然后加 入25mg Na2S2O4，在室温条件下，采用紫外-可见分光光度计测试被还原的肌红蛋白的在波 长为500~600nm范围内的紫外吸收光谱，然后向被还原的肌红蛋白溶液中通入CO气体直 至溶液颜色变红，测试其在波长为500~600nm范围内的紫外吸收光谱。结果见图9。
[0078] 分别称取0. 0012g实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物，加入120uL DMSO溶解得到母液，然后将得到的母液用DMSO配制成lOumol/L和 20umol/L的标准溶液。取5uL标准溶液加入到ImL肌红蛋白溶液中，加入25mg Na2S2OJg 匀，比色皿上方加入2滴石蜡油密封，然后采用紫外-可见分光光度计测试在波长为500~ 600nm范围内的紫外吸收光谱。由图10和11可见，刚开始没有光刺激的条件下扫描测试6 次（1次Imin)，化合物几乎没有CO的释放；然后采用365nm的紫外灯在20 %的透过率下照 射2s，化合物较敏锐的响应紫外光的照射，并且迅速释放出C0, 一段时间之后，化合物几乎 不释放CO ;继续采用365nm的紫外灯在50%的透过率下照射2s，化合物又迅速释放出C0， 一段时间之后，化合物几乎不释放CO ;再采用365nm的紫外灯在100%的透过率下照射2s， 化合物继续迅速释放出C0,化合物几乎不释放CO后再次采用365nm的紫外灯在100%的透 过率下照射2s ;最后用365nm的紫外灯在100%的透过率照射60s，化合物光谱不再有明显 变化。
[0079] 由上述实验结果可见，实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer 卡宾化合物具有非常好的光响应性，并且具有较好CO释放性能、每一分子的化合物释放出 较多的C0,几乎是五个CO完全释放。
[0080] (2)肌红蛋白法测试CO-RM在器官保存液中的释放性能试验
[0081] 将上述红蛋白法测试CO-RM在PBS中的释放性能试验中的PBS用pH = 7. 1的器 官保存液替换，测试实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在 器官保存液中的释放性能，具体操作与试验（1)相同。由图12可见，实施例1制备的二肽 小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在器官保存液中具有非常好的光响应性，并 且具有较好CO释放性能、每一分子的化合物释放出较多的C0,几乎是五个CO完全释放。
[0082] 3、抗缺血性灌注再损伤实验
[0083] (1)建立肾致死性缺血/再灌注模型
[0084] 雄性BALB/c(H-2d)小鼠（8~10周，20~25g)，腹腔内注射1%戊巴比妥钠（6mL/ kg)麻醉。左肾缺血30、40或50分钟（5只/组），随后移除血管夹并切除对侧肾。观察再 灌注后死亡情况，建立肾致死性缺血/再灌注模型。
[0085] 在分别对小鼠左肾缺血30、40或50分钟后移除血管夹并切除对侧肾后观察15 天，结果显示50分钟组小鼠死亡率最高，术后1天死亡4只，术后2天死亡1只；而30分钟 组和40分钟组小鼠均存活至15天后（见图13)，所以确定缺血50分钟后再灌注为小鼠肾 致死性缺血/再灌注模型。
[0086] (2)排除DMSO对于小鼠的毒性作用
[0087] 尾静脉注射不同浓度DMSO (5 %、10 %、20 %、30 %，200 μ L/只）及生理盐水（20mg/ kg)，不作其他处理，观察DMSO对于小鼠的影响。结果未发现小鼠有任何不良反应，进食进 水如常，精神状态佳，在15天内未发生死亡。证明DMSO在上述浓度时对小鼠无明显毒性。
[0088] (3)检验实施例1化合物对于小鼠肾致死性缺血/再灌注的保护作用
[0089] 按照20mg/kg的浓度将实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物溶于DMSO中，将溶液用生理盐水稀释至10 %，尾静脉注射小鼠，1小时后对小鼠行 肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情况。对照组尾静脉注射生理盐水，1小时后行 肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情况。
[0090] 通过观察发现，小鼠尾静脉分别注射实施例1化合物及生理盐水（对照组）1小时 后行肾致死性缺血/再灌注，每组7只，仅在第4天和第6天各死亡1只，其余5只存活至 15天以后（见图14)。
[0091] (4)检验失活的实施例1化合物对于小鼠肾致死性缺血/再灌注的作用
[0092] 按照20mg/kg的浓度实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾 化合物溶于DMSO中，室温放置24小时，使实施例1化合物中的CO完全释放，得到失活的实 施例1化合物。按照20mg/kg的浓度将失活的实施例1化合物溶于DMSO中，将溶液稀释至 10%，尾静脉注射5只小鼠，1小时后对小鼠行肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情 况。对照组尾静脉注射生理盐水，1小时后行肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情 况。
[0093] 通过观察发现，小鼠尾静脉注射失活的实施例1化合物1小时后行肾致死性缺血 /再灌注，发现5只小鼠分别于第2、3、4、7、9天死亡；对照组小鼠在第1、2天全部死亡（见 图 15)。
【主权项】
1. 一种二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其特征在于该化合物的结 构式如下所示：式中M代表Cr、Mo或W，R2、R3、R4各自独立的代表-H、烷基、-C nH2n-R5、苄基中的任 意一种，其中R5代表-H、-OH、-C00H、-NH 2、-SH、-SCH3*的任意一种，η为1~3的整数。2. 根据权利要求1所述的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其特征 在于：所述的Rp R2、R3、&各自独立的代表-H、C广C 4烷基、苄基中的任意一种。3. 权利要求1所述的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的制备方法， 其特征在于它由下述步骤组成： (1) 在无水无氧条件下，以甲醇为溶剂，将式1所示的Fischer卡宾、式2所示的氨基 酸、弱碱常温反应5~10小时，常温减压旋转蒸发除去溶剂，得到式3所示的氨基酸修饰的 Fischer 卡宾； (2) 在无水无氧条件下，以二氯甲烷为溶剂，将式3所示的氨基酸修饰的Fischer卡宾 与4-二甲氨基吡啶、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺、式4所示的氨基酸甲酯盐酸盐在冰浴条件下 反应18~24小时，柱色谱分离，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物；上述的Fischer卡宾与氨基酸、弱碱、4-二甲氨基吡啶、Ν，Ν' -二环己基碳酰 亚胺、氨基酸甲酯盐酸盐的摩尔比为I: (1~1. 2) : (1~6) : (0. 2~0. 3) : (1. 5~ 2) : (1~1. 2)，所述的弱碱为三乙胺、1(20)3或他20)3;式1中M代表Cr、Mo或W，式2和 式3中Rn R2、R3、R4各自独立的代表-H、烷基、-CnH 2n-R5、苄基中的任意一种，其中1?5代 表-H、-OH、-C00H、-NH2、-SH、-SCH3*的任意一种，η 为 1 ~3 的整数。
【专利摘要】本发明公开了一种二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物及其制备方法和应用，该化合物的结构式为其是在弱碱性条件下，通过氨基酸与Fischer卡宾偶联生成氨基酸修饰的Fischer卡宾，然后在催化剂作用下与氨基酸甲酯盐酸盐偶联生成稳定的酰胺键，即二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物。本发明化合物热稳定好、毒性较低，且具有较好的水溶性和生物相容性，携带的一氧化碳源较多，在紫外光下能够实现一氧化碳的可控释放，可应用于抗缺血性灌注再损伤。
【IPC分类】C07F11/00, C07K5/062, A61P9/10, C07K5/065
【公开号】CN104892724
【申请号】CN201510245559
【发明人】张伟强, 周玲玲, 张国防, 高子伟, 杨积娟, 王苏, 扎西罗布, 杨淑红
【申请人】陕西师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
【技术领域】
[0001] 本发明属于合成医药技术领域，具体涉及一种具有光控释放一氧化碳性能的二肽 小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，以及该化合物在抗缺血性灌注再损伤方面 的应用。
【背景技术】
[0002] CO是一种剧毒气体，对人体的伤害极大，但近年来研宄表明，CO与NO -样是一种 非常重要且能释放生物信号的分子。实际上，人体内血红素氧合酶降解血红素过程中会不 断产生少量的C〇,它展现出细胞保护、抗炎症性、促进血管舒张、防止缺血再灌注损伤以及 其他治疗功效。
[0003] 为了发展CO治疗的有效形式，一系列一氧化碳释放分子（CO Releasing Molecules，CO-RMs)得以发展。在自然条件下被确定能够释放出CO的化合物存在五种。 第一种是醛类：初步的研宄数据确定了它们的潜在生物活性，但其CO释放速度慢，且其毒 物学性质妨碍了其作为CO-RMs的发展；第二种是草酸类：释放CO的速度太慢；第三种是硼 的碳酸酯：是一种众所周知的CO释放物，然而，这些化合物的化学转换范围受限，且不满足 化合物所应具有的合适药物学特征；第四种是硅的碳酸酯：这类化合物只有在热的有机溶 剂、强的催化剂存在时，才能释放出C0,其高温、强的基础活性的要求表明它们与生物系统 不相容；第五种是金属羰基化合物：具有稳定好，实现可控释放和靶向传输的优势，是一类 极具医学应用前景的C〇-RMs。
[0004] 近年来，随着科学技术的发展，烧伤的皮肤移植、肾移植、肝脏移植等器官移植慢 慢解决以前无法攻克的问题，并且取得了较大的进展，然而仍然存在着这样那样的技术问 题。机体组织器官正常代谢、功能的维持，有赖于良好的血液循环。各种原因造成的局部组 织器官的缺血，常常使组织细胞发生缺血性损伤，但在动物试验和临床观察中也发现，在一 定条件下恢复血液再灌注后，部分动物或患者细胞功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反 而加重，因而将这种血液再灌注后缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血再灌注损伤。缺 血再灌注损伤的发生机制主要有：自由基的作用、钙超载的作用、白细胞的作用、高能磷酸 化合物缺乏、内皮素的作用、血管紧张素 II的作用等等，而自由基的氧化作用是重中之重。
[0005] 缺血所引的组织损伤是致死性疾病的主要原因，诸如冠动脉硬化导致的心肌梗 死、脑卒中等。在缺血性疾病抢救和治疗过程中，医学家们渐渐发现，对组织造成损伤的主 要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应 的组织内的细胞造成的。有许多证据说明仅仅缺血还不足以导致组织损伤，而是在缺血一 段时间后又突然恢复供血（即再灌注）时才出现损伤。在创伤性休克、外科手术、器官移 植、烧伤、冻伤和血栓等血液循环障碍时，都会出现缺血后再灌注损伤。缺血组织再灌注时 造成的微血管和实质器官的损伤主要是由活性氧自由基引起的，这已在多种器官中得到证 明。在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧了自由基对 缺血后再灌注组织的损伤。一氧化碳释放法分子释放出的CO具有清除自由基的抗氧化作 用，并且CO具有抗菌消炎的生理作用更增加了一氧化碳释放分子，特别是金属羰基化合物 在抗缺血性灌注再损伤方面的作用，但是现有的金属羰基化合物存在水溶性差、热稳定性 差、毒性大、生物相容性低、一氧化碳的不可控释放等缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于克服现有金属羰基化合物存在的缺点，提供一种 热稳定较好、毒性较低，且具有较好的水溶性和生物相容性，能够实现光控释放一氧化碳， 有效的应用于抗缺血性灌注再损伤的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物， 以及该化合物的制备方法。
[0007] 解决上述技术问题所采用的技术方案是：该二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fischer卡宾化合物的结构式如下所示：
[0008]
[0009] 式中M代表Cr、Mo或W，R1、R2、R3、R4各自独立的代表-H、烷基、-C nH2n-R5、苄基中的 任意一种，其中R5代表-H、-OH、-C00H、-NH 2、-SH、-SCH3*的任意一种，η为1~3的整数。
[0010] 上述的Rp R2、R3、R4优选各自独立的代表-Η、C广C 4烷基、苄基中的任意一种。
[0011] 本发明二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的制备方法如下：
[0012] 1、在无水无氧，氮气保护条件下，以无水甲醇为溶剂，将式1所示的Fischer卡宾、 式2所示的氨基酸、弱碱室温反应5~10小时，室温减压旋转蒸发除去溶剂，得到式3所示 的氨基酸修饰的Fischer卡宾，反应路线如下：
[0013]
[0014] 2、在无水无氧条件下，以二氯甲烷为溶剂，将式3所示的氨基酸修饰的Fischer卡 宾与4-二甲氨基吡啶（DMAP)、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺（DCC)、式4所示的氨基酸甲酯盐 酸盐在冰浴条件下反应18~24小时，采用柱色谱分离，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fischer卡宾化合物，反应路线如下：
[0015] 3 ^
[0016] 上述的Fischer卡宾与氨基酸、弱碱、4-二甲氨基吡啶、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺、 氨基酸甲酯盐酸盐的摩尔比为I: (1~1. 2) : (1~6) : (0. 2~0. 3) : (1. 5~2) : (1~1. 2)， 所述的弱碱为三乙胺、1(20)3或Na 2C03。
[0017] 本发明的有益效果如下：
[0018] 本发明先通过氨基酸与Fischer卡宾偶联生成氨基酸修饰的Fischer卡宾，然后 在催化剂作用下将氨基酸修饰的Fischer卡宾与氨基酸甲酯盐酸盐偶联生成稳定的酰胺 键，即二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物，其容易分离且纯度较高。
[0019] 本发明通过二肽小分子对Fischer卡宾进行修饰，不仅增加了 Fischer卡宾的水 溶性、生物相容性，降低了分子的毒性，并且极大地增加了分子的热稳定性。
[0020] 本发明二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物在紫外光照射下能够迅速 释放一氧化碳分子，对光具有较好的响应性，且该化合物分子量较小，携带的CO较多，每个 分子可携带五个CO, CO释放效率很高，可作为光控一氧化碳释放分子，实现一氧化碳的可 控释放，用于病变组织的抗菌抗炎和缺血性组织再灌注损伤的治疗，为一氧化碳释放分子 的靶向释放开辟了一条新的道路。
【附图说明】
[0021] 图1是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的晶体 图。
[0022] 图2是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物沿a方 向的一维层状图。
[0023] 图3是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的多面 体堆积微孔图。
[0024] 图4是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的晶体 图。
[0025] 图5是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物沿a方 向的一维层状图。
[0026] 图6是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的多面 体堆积的微孔图。
[0027] 图7是五羰基铬的Fischer卡宾的热重分析图。
[0028] 图8是实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的 热重分析图。
[0029] 图9是肌红蛋白法测试一氧化碳释放分子的CO释放。
[0030] 图10是10umol/L实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物在PBS中的CO释放动力学图。
[0031] 图11是20umol/L实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物在PBS中的CO释放动力学图。
[0032] 图12是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在器 官保存液中的释放动力学图。
[0033] 图13是小鼠左肾缺血不同时间再灌注后的存活情况。
[0034] 图14是小鼠尾静脉分别注射实施例1化合物及生理盐水1小时后行肾致死性缺 血/再灌注的存活情况。
[0035] 图15是小鼠尾静脉分别注射失活的实施例1化合物及生理盐水1小时后行肾致 死性缺血/再灌注的存活情况。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0037] 实施例1
[0038] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0039]
[0040] 1、在兀7」、兀羊I1求1十r，符DDDZg Ummo丄；H班整m tfJ nscner卡宾和 0. 1501g(2mmol)甘氨酸加入到反应瓶中，加入15mL无水甲醇和0. 3mL(2mmol)三乙胺，室温 条件下反应5小时，室温减压旋转蒸发除去溶剂，得到甘氨酸修饰的Fischer卡宾。
[0041 ] 2、在无水无氧条件下，向步骤1得到的甘氨酸修饰的Fischer卡宾中加入 0· 02510g(2mmol)甘氨酸甲酯盐酸盐、0· 0611g(0. 5mmol)4-二甲氨基吡啶（DMAP)、 0. 4124g(2mmol)二环己基碳二亚胺（DCC)、20mL无水二氯甲烷，在冰浴条件下反应24小 时，反应结束后，以二氯甲烷作为洗脱剂采用柱色谱分离产物，干燥产物，得到黄色固体 二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为77. 6%，结构表征数据为： IR(CH2C12, cm-1) ：V(C0) = 2056cm_1U927cm_1, V(COCH3) = 1748cm-1, V(CONH) = 1697cm_\ 1518CHT1; 1H-NmrGOOMHz, CDCl3) (Z/E = 5/2) δ :9. 51(s，J = 96. 5Hz，lH，NH)，6.37(s， J = 134.2Hz，lH，NH)，4.40(dd，J = 191.8、3.8Hz，4H)，3.81(s，3H，CH3)，2.75(d，J = 52.3Hz，3H，CH3) ;13C-匪R(101MHz，CDCl3) δ :217.70(C0)，217.5(C0)，169.74(CTCH3)， 169. 65 (COCH3)，166. 80 (CONH)，165. 71 (CONH)，53. 30 (OCH3)，52. 83 (CH)，52. 78 (CH)， 48. 37 ( = CCH3)，45. 36 ( = CCH3)，41. 42 (CH2)，37. 23 (CH2) ;ESI-Ms :理论值[M] = 364. 00， 实测值[M] = 362· MM。
[0042] 采用低温溶液扩散法，将IOOmg得到的黄色固体加入小瓶中，加入二氯甲烷至刚 好溶解，然后沿烧杯壁缓慢加入二氯甲烷体积1-2倍的正己烷，密封，放入冰箱中在-18°C 静置至有黄色晶体析出。所得晶体的晶体图见图1，沿a方向的一维层状图见图2,多面体 堆积微孔图见图3,单晶结构和晶体数据见表1。
[0043] 表1单晶结构和晶体数据
[0044]
[0045] 实施例2
[0046] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0047]
[0048] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的丙氨酸替换，其它步骤与实施例1相 同，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为51 %，结构表征 数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(CO) = 2056011^1927011' V(COCH3) = 1748CHT1，V(CONH)= 1697CHT1，1518CHT1; 1H-NmrGOOMHz, CDCl3) δ :9. 66 (s，1H，ΝΗ)，6· 35 (s，1H)，5· 30 (s，1H， H)，4.59-4.47(m，lH，CH)，4.12(d，J = 3.7Hz，2H，CH2)，3.80(s，3H，C0CH3)，2.75(d，J = 19.5Hz，3H，CH3)，1.56(d，J = 6.8Hz，3H，CH3) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :217.61(C0)， 169. 92 (COCH3)，169. 80 (CONH)，55. 24 (OCH3)，53. 43 (CH)，52. 76 (CH2)，41. 39 (CH3)， 35. 96(CH3)，19. 73( = CCH3) ;ESI-Ms :理论值[M] = 378. 02,实测值[M+23] = 401. 0005。
[0049] 实施例3
[0050] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0051]
[0052] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的苯丙氨酸替换，其它步骤与实施例1 相同，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为78% .，结构表 征数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(CO) = 2055(^^1924011' V(COCH3) = 1749CHT1，V(CONH) =1692011^1515011-1; 1H-NMR (400MHz，CDCl3) δ :9. 49 (s，lH，NH)，7.40-7. 29 (m，3H，Ph)， 7.20(d，J = 6.7Hz，2H，Ph)，6. ll(s，lH，NH)，4.61(d，J = 6. 1Hz，1H，CH)，4.09(d，J = 4. lHz，2H，CH2)，3. 79(s，3H，OCH3)，3. 15(ddd，J = 21. 8、13. 7、6. 9Hz，2H，CH2)，2. 32(s，3H， CH3) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :221.81(C0)，216.45(C0)，168.58(C0CH3)，167.43(OTNH)， 133. 43 (Ph)，128. 32 (Ph)，128. 28 (Ph)，127. 01 (Ph)，60. 33 (OCH3)，51. 76 (CH)，40. 38 (= CCH3)，39. 07 (CH2)，34. 74 (CH2) ;ESI-Ms :理论值[M] = 454. 05,实测值[M+23] = 477. 0334。
[0053] 实施例4
[0054] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0055]
[0056] 在实施例1中，所用的甘氨酸甲酯盐酸盐用等摩尔的亮氨酸甲酯盐酸盐替换，其 它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率 为 73. 14%，结构表征数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(C0) = 2055011^1924(^1, V(COCH3)= 1743〇11-1，￥(0)順）= 1693011^151601^^-^^(40011^0)(:13)(2/^ = 7/1) δ :9. 44(d，J = 100. 3Hz，1H，NH)，6· 14(dd，J = 112. 1、7· 3Hz，1H，NH)，4· 61(ddd，J = 43. 8、11· 8、6· 5Hz，1H， CH)，4. 17-3. 86 (m，2H，CH2)，3. 71 (s，3H，OCH3)，2. 67 (d，J = 50. 4Hz，3H，CH3)，I. 75-1. 61 (m， 2H，CH2)，1.61-1.42(m，lH，CH)，0.90(t，J = 5.6Hz，6H，C(CH3)2) ;13C-NMR(101MHz，CDC13) δ : 216. 70 (CO)，216. 54 (CO)，172. H(COCH3)，172. 05 (COCH3)，164. 47 (CONH)，164. 35 (CONH)， 51. 71 (OCH3)，51. 67 (OCH3)，50. 21 (CH2)，50. 17 (CH2)，47. 49( = CCH3)，40. 54( = CCH3)， 36. 23 (CH)，23. 93 (CH2)，23. 85 (CH2)，21. 67 (CH3)，21. 63 (CH3)，20. 90 (CH3)，20. 82 (CH3); ESI-Ms :理论值[M] = 420. 06,实测值[M+23] = 443. 0494。
[0057] 实施例5
[0058] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0059]
[0060] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的丙氨酸替换，所用的甘氨酸甲酯盐酸盐 用等摩尔的亮氨酸甲酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子修饰的杂N 稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为50%，结构表征数据为：IR(CH2C12, cnT1) :V(CO)= 2054cm_\l924cm_1, V(COCH3) = 1743cm_1, V(CONH) = 1693cm_\ 1516cm-1； 1H NMR(400MHz, CDC13)S :9.30(d，J = 126.6Hz，lH)，5.96(dd，J = 80.7、8.2Hz，lH)，4.73-4.23(m，2H)， 3. 70(s，3H)，2. 68(t，J = 6. 8Hz，3H)，I. 69-1. 54(m，3H)，I. 48(dd，J = 10. 1、5. 9Hz，3H)， 1.19(s，2H)，0.89(dt，J = 12·9、6·4Ηζ，6Η) ;13C 匪R(101MHz，CDC13)S :216.57(C0)， 171. 86 (COCH3)，168. 36 (CONH)，54. 46 (OCH3)，51. 62 (CH)，50. 15 (CH)，40. 37( = CCH3)， 35. 11 (CH2)，23. 94 (CH2)，21. 65 (CH3)，20. 88 (CH3)，18. 61 (CH3) ;ESI-Ms :理论值[M]= 4：M· 〇8,实测值[M+23] = 457. 〇636。
[0061] 采用低温溶液扩散法，将IOOmg得到的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer 卡宾化合物加入小瓶中，加入二氯甲烷至刚好溶解，然后沿烧杯壁缓慢加入二氯甲烷体积 1~2倍的正己烷，密封，放入冰箱中在-18°C静置至有黄色晶体析出。所得晶体的晶体图 见图4,沿a方向的一维层状图见图5,多面体堆积微孔图见图6,单晶结构和晶体数据见表 2〇
[0062] 表2单晶结构和晶体数据
[0063]
[0064] 实施例6
[0065] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0066]
[0067] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的亮氨酸替换，所用的甘氨酸甲酯盐酸 盐用等摩尔的苯丙氨酸甲酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子 修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为48%，结构表征数据为：IR(CH 2C12， cm-1) ：V(CO) = 2055cm_1U925cm_1, V(COCH3) = 1742cm_1, V(CONH) = 1686cm_\ 1513cm-1； 1H-NmrgoomHzJDCI3) δ :9. 05 (d，J = 6. 3Hz，lH，NH)，7. 30-7. 19 (m，3H，Ph)，6.98 (dd，J = 7. 6、1. 6Hz，2H，Ph)，5. 91(d，J = 7. 7Hz，1H，NH)，4. 82(dt，J = 7. 6、6. 0Hz，1H，CH)，4. 20(dd， J = 14.0、7.7Hz，lH，CH)，3.65-3.75(s，3H，CH3)，3.20(dd，J = 14.1、5.7Hz，1H，CH2)， 3. 02(dd，J = 14. 1、6. 2Hz，1H，CH2)，2. 52(s，3H，CH3)，I. 61-1. 48(m，3H，CH_CH2)，0· 86(dd， J = 16. 0、6.2Hz，6H，C(CH3)2) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :216. 57(C0)，170. 55(C0CH3)， 167. 62 (CONH)，134. 15 (Ph)，128. 09 (Ph)，127. 78 (Ph)，126. 52 (Ph)，66. 94 (CH)， 58. 37 (OCH3)，52. 09 (CH)，51. 72 (CH)，40. 90 ( = CCH3)，36. 53 (CH)，34. 98 (CH2)，23. 67 (CH2)， 21.55(CH3)，21.07(CH3) ;ESI-Ms :理论值[M] = 510. 11，实测值[M+23] = 533.0947。
[0068] 实施例7
[0069] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0070]
[0071] 在实施例1中，所用的甘氨酸用等摩尔的苯丙氨酸替换，所用的甘氨酸甲酯盐 酸盐用等摩尔的苯丙氨酸甲酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到二肽小分子 修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为40%，结构表征数据为：IR(CH 2C12， cm-1) ：V(CO) = 2054cm_\l925cm_1, V(COCH3) = 1743cm_1, V(CONH) = 1687cm_\ 1511cm-1； 1H-Nmr goomHzJDCI3) δ :9. 27 (d，J = 7. 5Hz，1H，NH)，7. 30-7. 22 (m，3H，Ph)，7. 22-7. 16 (m， 3H，Ph)，7.09(dd，J = 7.4、1.7Hz，2H，Ph)，6.90(dd，J = 6.5、2.9Hz，2H，Ph)，5.86(d， J = 7.5Hz，lH，CH)，4.85-4.74(m，lH，NH)，4.38(td，J = 8.1、5.7Hz，lH，CH)，3.71(s， 3H)，3. 13 (dd，J = 14. 0、5. 8Hz，1H，CH)，3. 09-2. 92 (m，3H，OCH3)，2. 21 (d，J = 0· 5Hz，3H， CH3) ;13C-NMR(101MHz，CDCl3) δ :216. 38 (CO)，170. 21 (COCH3)，166. 67 (CONH)，133. 96 (Ph)， 133. 30 (Ph)，128. 34 (Ph)，128. 25 (Ph)，128. 03 (Ph)，127. 80 (Ph)，126. 97 (Ph)，126. 52 (Ph)， 60. 46 (CH)，52. 37 (OCH3)，51. 70 (CH2)，38. 61 ( = CCH3)，36. 43 (CH2)，34. 81 (CH2) ;ESI-Ms :理 论值[M] = 544. 〇9,实测值[M+23] = 567· 〇784。
[0072] 为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂 N稳定的Fischer卡宾化合物进行了各种性能测试，具体实验如下：
[0073] 1、热稳定性测试
[0074] 发明人采用热重分析仪对五羰基铬的Fischer卡宾和实施例1~7制备的二肽小 分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的热稳定进行测试，结果见图7~8,由图7~ 8可见，五羰基铬的Fischer卡宾在45°C开始分解，并且一个阶段快速分解完毕，说明五羰 基络的Fischer卡宾的热稳定性差，而实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fi scher 卡宾化合物分别在 140 °C、152 °C、148 °C、139 °C、150 °C、129 °C、155 °C 开始分解（其 中实施例1和4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在最开始的少量 失重为溶剂的挥发），并且2~3个阶段分解，与原料五羰基铬的Fischer卡宾相比热稳定 性明显提尚。
[0075] 2、一氧化碳释放性能测试
[0076] (1)肌红蛋白法测试CO-RM在PBS中的释放性能试验
[0077] 称取IOmg肌红蛋白加入到5mL容量瓶中，然后用pH值为7. 4的磷酸缓冲溶液 (PBS)定容，配制成肌红蛋白溶液。用移液枪吸取ImL肌红蛋白溶液加入比色皿中，然后加 入25mg Na2S2O4，在室温条件下，采用紫外-可见分光光度计测试被还原的肌红蛋白的在波 长为500~600nm范围内的紫外吸收光谱，然后向被还原的肌红蛋白溶液中通入CO气体直 至溶液颜色变红，测试其在波长为500~600nm范围内的紫外吸收光谱。结果见图9。
[0078] 分别称取0. 0012g实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物，加入120uL DMSO溶解得到母液，然后将得到的母液用DMSO配制成lOumol/L和 20umol/L的标准溶液。取5uL标准溶液加入到ImL肌红蛋白溶液中，加入25mg Na2S2OJg 匀，比色皿上方加入2滴石蜡油密封，然后采用紫外-可见分光光度计测试在波长为500~ 600nm范围内的紫外吸收光谱。由图10和11可见，刚开始没有光刺激的条件下扫描测试6 次（1次Imin)，化合物几乎没有CO的释放；然后采用365nm的紫外灯在20 %的透过率下照 射2s，化合物较敏锐的响应紫外光的照射，并且迅速释放出C0, 一段时间之后，化合物几乎 不释放CO ;继续采用365nm的紫外灯在50%的透过率下照射2s，化合物又迅速释放出C0， 一段时间之后，化合物几乎不释放CO ;再采用365nm的紫外灯在100%的透过率下照射2s， 化合物继续迅速释放出C0,化合物几乎不释放CO后再次采用365nm的紫外灯在100%的透 过率下照射2s ;最后用365nm的紫外灯在100%的透过率照射60s，化合物光谱不再有明显 变化。
[0079] 由上述实验结果可见，实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer 卡宾化合物具有非常好的光响应性，并且具有较好CO释放性能、每一分子的化合物释放出 较多的C0,几乎是五个CO完全释放。
[0080] (2)肌红蛋白法测试CO-RM在器官保存液中的释放性能试验
[0081] 将上述红蛋白法测试CO-RM在PBS中的释放性能试验中的PBS用pH = 7. 1的器 官保存液替换，测试实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在 器官保存液中的释放性能，具体操作与试验（1)相同。由图12可见，实施例1制备的二肽 小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在器官保存液中具有非常好的光响应性，并 且具有较好CO释放性能、每一分子的化合物释放出较多的C0,几乎是五个CO完全释放。
[0082] 3、抗缺血性灌注再损伤实验
[0083] (1)建立肾致死性缺血/再灌注模型
[0084] 雄性BALB/c(H-2d)小鼠（8~10周，20~25g)，腹腔内注射1%戊巴比妥钠（6mL/ kg)麻醉。左肾缺血30、40或50分钟（5只/组），随后移除血管夹并切除对侧肾。观察再 灌注后死亡情况，建立肾致死性缺血/再灌注模型。
[0085] 在分别对小鼠左肾缺血30、40或50分钟后移除血管夹并切除对侧肾后观察15 天，结果显示50分钟组小鼠死亡率最高，术后1天死亡4只，术后2天死亡1只；而30分钟 组和40分钟组小鼠均存活至15天后（见图13)，所以确定缺血50分钟后再灌注为小鼠肾 致死性缺血/再灌注模型。
[0086] (2)排除DMSO对于小鼠的毒性作用
[0087] 尾静脉注射不同浓度DMSO (5 %、10 %、20 %、30 %，200 μ L/只）及生理盐水（20mg/ kg)，不作其他处理，观察DMSO对于小鼠的影响。结果未发现小鼠有任何不良反应，进食进 水如常，精神状态佳，在15天内未发生死亡。证明DMSO在上述浓度时对小鼠无明显毒性。
[0088] (3)检验实施例1化合物对于小鼠肾致死性缺血/再灌注的保护作用
[0089] 按照20mg/kg的浓度将实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物溶于DMSO中，将溶液用生理盐水稀释至10 %，尾静脉注射小鼠，1小时后对小鼠行 肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情况。对照组尾静脉注射生理盐水，1小时后行 肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情况。
[0090] 通过观察发现，小鼠尾静脉分别注射实施例1化合物及生理盐水（对照组）1小时 后行肾致死性缺血/再灌注，每组7只，仅在第4天和第6天各死亡1只，其余5只存活至 15天以后（见图14)。
[0091] (4)检验失活的实施例1化合物对于小鼠肾致死性缺血/再灌注的作用
[0092] 按照20mg/kg的浓度实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾 化合物溶于DMSO中，室温放置24小时，使实施例1化合物中的CO完全释放，得到失活的实 施例1化合物。按照20mg/kg的浓度将失活的实施例1化合物溶于DMSO中，将溶液稀释至 10%，尾静脉注射5只小鼠，1小时后对小鼠行肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情 况。对照组尾静脉注射生理盐水，1小时后行肾致死性缺血/再灌注处理，观察小鼠死亡情 况。
[0093] 通过观察发现，小鼠尾静脉注射失活的实施例1化合物1小时后行肾致死性缺血 /再灌注，发现5只小鼠分别于第2、3、4、7、9天死亡；对照组小鼠在第1、2天全部死亡（见 图 15)。
【主权项】
1. 一种二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其特征在于该化合物的结 构式如下所示：式中M代表Cr、Mo或W，R2、R3、R4各自独立的代表-H、烷基、-C nH2n-R5、苄基中的任 意一种，其中R5代表-H、-OH、-C00H、-NH 2、-SH、-SCH3*的任意一种，η为1~3的整数。2. 根据权利要求1所述的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其特征 在于：所述的Rp R2、R3、&各自独立的代表-H、C广C 4烷基、苄基中的任意一种。3. 权利要求1所述的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的制备方法， 其特征在于它由下述步骤组成： (1) 在无水无氧条件下，以甲醇为溶剂，将式1所示的Fischer卡宾、式2所示的氨基 酸、弱碱常温反应5~10小时，常温减压旋转蒸发除去溶剂，得到式3所示的氨基酸修饰的 Fischer 卡宾； (2) 在无水无氧条件下，以二氯甲烷为溶剂，将式3所示的氨基酸修饰的Fischer卡宾 与4-二甲氨基吡啶、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺、式4所示的氨基酸甲酯盐酸盐在冰浴条件下 反应18~24小时，柱色谱分离，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物；上述的Fischer卡宾与氨基酸、弱碱、4-二甲氨基吡啶、Ν，Ν' -二环己基碳酰 亚胺、氨基酸甲酯盐酸盐的摩尔比为I: (1~1. 2) : (1~6) : (0. 2~0. 3) : (1. 5~ 2) : (1~1. 2)，所述的弱碱为三乙胺、1(20)3或他20)3;式1中M代表Cr、Mo或W，式2和 式3中Rn R2、R3、R4各自独立的代表-H、烷基、-CnH 2n-R5、苄基中的任意一种，其中1?5代 表-H、-OH、-C00H、-NH2、-SH、-SCH3*的任意一种，η 为 1 ~3 的整数。
【专利摘要】本发明公开了一种二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物及其制备方法和应用，该化合物的结构式为其是在弱碱性条件下，通过氨基酸与Fischer卡宾偶联生成氨基酸修饰的Fischer卡宾，然后在催化剂作用下与氨基酸甲酯盐酸盐偶联生成稳定的酰胺键，即二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物。本发明化合物热稳定好、毒性较低，且具有较好的水溶性和生物相容性，携带的一氧化碳源较多，在紫外光下能够实现一氧化碳的可控释放，可应用于抗缺血性灌注再损伤。
【IPC分类】C07F11/00, C07K5/062, A61P9/10, C07K5/065
【公开号】CN104892724
【申请号】CN201510245559
【发明人】张伟强, 周玲玲, 张国防, 高子伟, 杨积娟, 王苏, 扎西罗布, 杨淑红
【申请人】陕西师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
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