一种萘乙酰胺新化合物的制作方法
一种萘乙酰胺新化合物的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于化合物的医药领域，涉及一种新的酰胺类化合物及其盐，并公开其其 制备方法和用途。
[0002]
【背景技术】：缺血性脑卒中的治疗药物：第一类是血管扩张药（如潘生丁等）。过去 认为只要药物能使脑血管扩张，便可以使血液从堵塞的血管中多流些过去。却发现扩张血 管药非但做不到这一点，还会使病变部位的血液反流到健康的脑组织里去（此称为脑内盗 血综合征），所以已不主张用此类药。第二类是改善微循环、扩充血容量的药物（如低分子 右旋糖酐等）。目前此类药用得较多，但是有心脏病的病人应慎用，否则可能会引起心力衰 竭。第三类是溶解血栓的药物（如尿激酶等）。应用此类药如果能达到溶解栓子的目的是 最为理想的，可是全身静脉用药时往往需要大剂量，有时会造成出血的危险性。现在多向病 人推荐使用介入治疗，就是通过导管把药物直接注入梗死的部位来溶解栓子，但采取此治 疗方法的前后都要做一次脑血管造影，这本身就又有一定的危险性，何况介入治疗要求病 人在得病后6小时内进行，有时往往已错过时机。第四类是抗凝治疗（如肝素等）。这类药 物能防止血液凝固，但使用时要每天查凝血酶原时间和活动度，条件较差的医院无法进行。 此外抗凝治疗也有出血的危险性。第五类是使用钙离子拮抗剂（如尼莫地平等）。这类药 物可以防止钙离子从细胞外流入细胞内，起到轻微扩张脑血管，保护脑细胞，增加脑细胞利 用氧和葡萄糖等作用。第六类是防止血小板凝聚的药（如阿司匹林等）。血小板的凝聚往 往是脑血栓形成的开端，如果能有效地阻断血小板的凝聚，也许能防止血桂进一步形成。目 前这类药物在世界上应用得十分广泛，但与其说是作为治疗药物还不如说是作为预防药物 更为恰当，因为脑卒中的急性期使用这类药物效果并不理想。
【发明内容】
：
[0003] 本发明的目的是提供一种用于缺血性脑卒中的新的酰胺类化合物，及其制备方法 和用途。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0005]
[0006] 通过动物试验证明，安慰剂组没有减小大鼠脑缺血梗塞体积的作用，不能改善脑 缺血的症状，也不具备改善睡眠的作用，本发明中化合物则具有很好的改善脑缺血症状的 作用，并且能够改善动物的睡眠状态。
[0007] R = H时，我们使之与碱金属或有机碱成盐，所述的碱指钠、钾、镁、钙及有机碱氨 丁三醇、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、乙二胺、、二甲胺、羟乙基乙二胺、氨基乙醇胺。
[0008] 式I所示的化合物与碱金属成盐首选钠盐。
[0009] 本发明还提供了用于治疗缺血性脑卒中的药物组合物，其特征是含有治疗有效量 的通式（1)化合物或其盐和药学上可接受的载体。可以是口服制剂或注射制剂。
[0010] 实验证明采用实施例1中化合物Ic制备的注射液，经过溶血、刺激性实验表明，具 有良好的耐受性，适宜制备成注射液在临床使用，用于治疗脑卒中患者的脑部细胞坏死和 改善患者的睡眠。 具体实施例：
[0011] 实施例1 :各化合物的制备：
[0012] 由于本文所述化合物有很强的连贯性，为了详细、准确、方便地描述各化合物制备 方法，将其以1个实施例来表达，下述的合成路线各化合物下方表明化合物的序号，为更加 简明的阐述，在下面的制备方法中以序号代替：
[0013] _I " H η 1c
[0014] (1)化合物3的合成：
[0015] 准确称取93. 1克原料2加入到200.0 mL二氯亚砜中，在80°C下搅拌反应6小时， 停止反应，反应液冷却至室温，加入75. 7克的三乙胺和300mL四氢呋喃，搅拌20分钟，将 I. 〇克L-脯氨酸甲酯溶于200mL的四氢呋喃中，缓慢滴加到上述反应液中，继续反应4小 时，停止反应，向反应液中加入300mL 2. ON的盐酸溶液和200mL蒸馏水，充分搅拌30分 钟，静置分层，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取（200mLX3)，合并有机层，用蒸馏水洗涤 (200mLX 3)，减压蒸馏除去溶剂得到121. 8克化合物3,产率为81. 7%。HNMR(400Hz，DMSO): 7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)，7. 29-7. 27 (m， 1H)，7. 20-7. 18 (m，1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 29-4. 27 (m，1H)，3. 88 (s，2H)，3. 68 (s，3H)， 3. 52-3. 50 (m，2H)，2. 44-2. 41 (m，2H)，2. 02-1. 98 (m，2H) ;MS (m/z) :298. 3。
[0016] (2)化合物4合成：
[0017] 准确称取120. 0克原料3和36. 3克甘氨酸加入到200.0 mL的四氢呋喃中， 80°C下搅拌反应6小时，停止反应，反应液冷却至室温，向反应液中加入IOOmLL ON的盐 酸溶液和200mL蒸馏水，充分搅拌30分钟，静置分层，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取 (200mLX3)，合并有机层，用蒸馏水洗涤（200mLX3)，减压蒸馏除去溶剂得到119. 2克化 合物 4,产率为 86. 7%。HNMR(400Hz，DMSO) :11. 0(s，1H)，8. 00(s，1H)，7. 79-7. 77(m，1H)， 7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)，7. 29-7. 27 (m，1H)，7. 20-7. 18 (m， 1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 40-4. 38 (m，1H)，4. 14 (s，2H)，3. 88 (s，2H)，3. 52-3. 50 (m，2H)， 2.44-2.41(m，2H)，2.02-1.98(m，2H) ;MS(m/z) :298.3。
[0018] (3)化合物la、lb、lc的合成：
[0019] 准确称取29. 7克化合物4加入到200.0 mL的无水乙醇中，(TC下搅拌30分钟，缓 慢滴加23. O克二氯亚砜到上述反应液中，大约30分钟滴加完毕，然后继续反应4小时，反 应液自然升温至室温。停止反应，减压蒸馏除去溶剂，向残余物中加入IOOmL乙酸乙酯和 200mL蒸馏水，充分搅拌30分钟，静置分层，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取（IOOmLX 3)， 合并有机层，减压蒸馏除去溶剂后得到化合物Ia的粗品，用乙酸乙酯和石油醚重结晶， 真空干燥后得到28. 2克化合物la，产率为76. 7%。HNMR(400Hz，DMSO) :8. 00(s，lH)， 7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)，7. 29-7. 27 (m， 1H)，7. 20-7. 18 (m，1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 40-4. 38 (m，1H)，4. 14 (s，2H)，4. 14-4. 10 (m， 2H)，3. 88 (s，2H)，3. 52-3. 50 (m，2H)，2. 44-2. 41 (m，2H)，2. 02-1. 98 (m，2H)，I. 31 (t，J = 3.6Hz，3H) ;MS(m/z) :369.5。
[0020] 重复上述的反应步骤，得到27. 4克化合物lb，产率为71. 7lHNMR(400Hz，DMS0): 8. 00 (s，1H)，7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)， 7. 29-7. 27 (m，1H)，7. 20-7. 18 (m，1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 40-4. 38 (m，1H)，4. 32-4. 30 (m， 1H)，4. 16 (s，2H)，3. 88 (s，2H)，3. 52-3. 50 (m，2H)，2. 44-2. 41 (m，2H)，2. 02-1. 98 (m，2H)， 1.35(d，J = 3.2Hz，6H) ;MS(m/z) :383.4。
[0021] 准确称取29. 7克化合物4加入到50.0 mL的无水乙醇中，(TC下搅拌30分钟，分批 加入7. 48克乙醇钠到上述反应液中，然后继续反应1小时，向反应液中缓慢滴加200.0 mL 无水乙醚，反应液中有大量的沉淀析出，继续搅拌1小时，静置30分钟，抽滤，滤饼用无水乙 醚洗涤（50mLX3)，真空干燥后得到22.7克化合物lc，产率为76.7%。HNMR(400Hz，DMS0): 8. 00 (s，1H)，7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)， 7· 29-7. 27 (m，1H)，7· 20-7. 18 (m，1H)，7· 12-7. 10 (m，1H)，4· 40-4. 38 (m，1H)，4· 14 (s，2H)， 3· 88 (s，2H)，3· 52-3. 50 (m，2H)，2· 44-2. 41 (m，2H)，2· 02-1. 98 (m，2H) ;MS (m/z) :362. 3。
[0022] 实施例2 :实施例1中化合物4对局部脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响
[0023] (1)实验材料和方法
[0024] Wistar大鼠，体重250-280g。手术前后单独饲养，室温保持23-25°C，自有进食和 进水。按照1〇叩&等的方法制备丨1?^0模型。大鼠用10%水合氯醛麻醉（35〇11^/1^，;[.口.）， 体温维持在37±0. 5°C，仰卧位固定于手术台上。沿颈正中线切开皮肤，仔细分离右侧颈总 动脉（CCA)，颈外动脉（ECA)，颈内动脉（ICA)。将ECA结扎剪断，拉直与ICA成一直线。在 ECA上剪一小口，将一根长4. 0cm，直径0.26mm的圆头硅化尼龙绳（用0. 1 %多聚赖氨酸包 被）由此开口插入ICA约I. 85-2. 00cm，指大鼠大脑前动脉起始处，阻断大脑中动脉的血流 供应。缺血2小时后小心抽出尼龙线，结扎ECA开口并缝合手术切口，动物放回笼中再灌24 小时。
[0025] (2)实验分组及给药
[0026] 大鼠40只随机分4组：模型对照组，注射用水（lOOml/kg)，实施例1中的化合物4 给药组（25、50、100mg/kg)，MCA阻断造成缺血后10分钟时口服给药。
[0027] (3)脑梗塞体积的测定
[0028] 大鼠再灌注损伤24小时后，即刻断头取脑，去除嗅束、小脑和低位脑干，将其冠 状切成6片（第一至第五片2mm/片，第六片4mm)，迅速置于5ml含有I. 5ml4 % TTC及 0.1 ml IMK2HPO4的溶液中染色（37°C，避光）20-30分钟，其间每隔5分钟翻动一次。经TTC 染色后，正常组织深染呈红色，梗死组织呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存。求算每 片的梗死面积，并最终叠加换算成梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示，以 消除脑水肿的影响。
[0029] 脑梗塞体积（％) =(手术对侧半球体积-手术侧半球未梗塞部分的体积）/手术 对侧半球的体积*100%
[0030] ⑷实验结果
[0031] 缺血2小时再灌注24小时后，溶剂对照组的脑梗塞体积（％)为33. 8%。假手术 组没有任何脑梗塞出现。其他组脑梗塞体积结果如表1所示：
[0032] 表1 :灌胃给药对局部缺血大鼠脑梗塞体积（％)的影响
[0033]
[0034] 与溶剂对照组比，化合物4组口服给药均可以显著缩小脑梗塞体积。
[0035] 实施例3 :实施例1中化合物Ia对大鼠睡眠作用的影响：
[0036] 改善睡眠作用试验
[0037] 动物来源：昆明种小白鼠，18-22克，雄性。实验动物饲养室温度22±2°C ，相对湿 度50-70%。本实验设化合物Ia给药剂量为25mg/kg，另设蒸馏水对照组。
[0038] 样品处理：各取样品25mg分别加蒸馏水至20ml，使成均勾悬液，供试。
[0039] 给样途径：灌胃
[0040] 实验方法：戊巴比妥钠阈上剂量催眠试验：
[0041] 选用体重18-22g雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，连续给样30天，于 第30天样品灌胃15分钟后，给各组动物50mg/kg. b. w的戊巴比妥钠腹腔注射，注射量为 0. 2ml/20g.b. w，以小鼠翻正反射消失达1分钟以上作为入睡判断标准，观察给戊巴比妥钠 60分钟内各组动物的入睡时间和睡眠时间。
[0042] 结果：
[0043] 表2 :样品对动物体重的影响
[0044]
[0045] 由上表可见，样品各剂量组动物体重与对照组相比，均无显著性差异。
[0046] 表3 :阈上剂量的戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
[0047]
[0048] *P < 0· 05与对照组相比（经方差分析）
[0049] 由上表可见，化合物Ia组样品动物在阈上剂量戊巴比妥钠诱导下的入睡时间和 睡眠时间与对照组相比，有显著性差异。
[0050] 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验：
[0051] 选用体重18-22g雄性小鼠40只，随机分为四组，每组10只，连续给样28天，于 第28天样品灌胃15分钟后，给各组动物30mg/kg. b. w的戊巴比妥钠腹腔注射，注射量为 0. 2ml/20g. b. w，以小鼠翻正反射消失达1分钟以上作为入睡判断标准观察给戊巴比妥钠 25分钟内各组动物发生睡眠的动物数。
[0052] 结果：
[0053] 表4 :阈下剂量的戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的影响
[0054]
[0055] *P < 0· 05与对照组相比（经卡方检验）
[0056] 由上表可见，化合物1组和对照组在阈下剂量戊巴比妥钠诱导下的入睡动物和睡 眠发生率与对照组相比，均有显著性差。
[0057] 总结：经口给予小鼠样品30天后，化合物Ia组具有改善睡眠的作用。
[0058] 实施例4 :采用实施例1中化合物Ic制备的注射液：
[0059]
[0060] 按处方量准确称取实施例1制备的化合物1置一容器中，加适量注射用水，搅拌至 全溶，并调节pH至8. 5-8. 8,加注射用水至4000ml，加入2g针用活性炭，煮沸15min，抽滤脱 碳，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，溶液灌封于玻璃安瓿内（每支含化合物Ia为94mg)制 剂经115°C加压灭菌15min。
[0061] 实施例5 :实施例4中注射液溶血性及刺激性试验
[0062] 液溶血性试验：
[0063] 体外溶血试验：向盛有2%红血球混悬液的各支药液管中分别加入不等量的实施 例4制备的注射液的低浓度和高浓度（0. 63mg/mL和I. 88mg/mL)，各支药液管在3小时内不 产生溶血作用。说明实施例4制备的注射液体外溶血性试验阴性。具体的实验方法和实验 结果如下：
[0064] 1、受试药物的配制：
[0065] (1)高剂量组：取实施例4制备的注射液（4mL :94mg/瓶）1瓶，吸出0· 5mL后用 0. 9% (0. 9g/100ml)氯化钠注射液稀释至6. 25mL，使成浓度为I. 88mg/mL的溶液。
[0066] (2)低剂量组：取上述浓度为I. 88mg/mL的溶液2mL，用(λ 9% (0· 9g/100ml)氯化 钠注射液稀释至6mL，稀释成浓度为0. 63mg/mL的溶液。
[0067] 2、给药方法：
[0068] (1) 2 %红血球混悬液的制备：
[0069] 取兔血数毫升，放入盛有含玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使 成脱纤血液。然后分装在数支离心管中，每管加约10倍量的0. 9%氯化钠注射液，摇匀，离 心（1500转/分，15分钟），除去上清液，沉淀的红血球再用0. 9 %氯化钠注射液洗涤2-3 次，直至上清液不显红色为止。将所得红血球用0. 9%氯化钠注射液配成2%的混悬液，供 试验用。
[0070] 取口径大小均匀的洁净试管7只（每管均设平行管），编号后，用移液管按表9所 示配比量依次加入2%红血球混悬液、0. 9%氯化钠注射液、注射用水和受试药液，混匀后立 即置37°C恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次， 共观察3小时。
[0071] 表5 :2%红血球混悬液的制备编号
[0072]
[0073] 注：其中1-5管为供试品管，第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。
[0074] (2)结果观察：
[0075] 如试验中溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，即表示有溶血 发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。如溶液中有棕红色或红棕 色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，需进一步判 定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将聚集物放在载波片上， 在盖玻片边缘滴加2滴0. 9%氯化钠注射液，在显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假 凝聚；若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
[0076] 3、结果判定
[0077] 当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶 液在3小时内不产生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3小时内 产生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射使用。
[0078] 4、试验结果
[0079] 分别加入低浓度为0. 63mg/mL和高浓度为I. 88mg/mL的注射液溶液的各支药液管 在3小时内均不产生溶血作用，体外溶血性试验阴性。详见下表6和表7。
[0080] 表6 :注射液（高剂量组）溶血性试验结果（肉眼观察）
[0081]
[0082] 注：" + "表示全溶血，表示不溶血；第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。
[0083] 表7 :注射液（低剂量组）溶血性试验结果（肉眼观察）
[0084]
[0085] 注：" + "表示全溶血，表示不溶血；第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。
[0086] 注射液血管刺激性试验
[0087] 兔血管刺激性试验：试验选用健康新西兰兔8只，采用同体左右侧耳朵自身对比 法，左侧耳缘静脉注射受试药物，给药体积5ml/kg体重，各给药组给予相应剂量的实施例4 制备的注射液，低剂量组和高剂量组剂量分别是3. 15mg/kg · bw和9. 4mg/kg · bw，（按浓度 计算其低浓度和高浓度分别为〇. 63mg/mL和I. 88mg/mL，是临床一次静脉滴注拟用浓度的 0. 7-1. 4倍和2-4倍），右耳给予等体积0. 9 % (0. 9g/100ml)氯化钠注射液作对照，每天一 次，连续3天。8只兔依次给予受试药的高浓度和低浓度后，再分别给予0. 9%氯化钠注射 液。各取低剂量和高剂量的2只兔于末次给药后48小时剖检，余下低浓度和高浓度的4只 兔在末次给药2周恢复期结束后剖检。结果8只动物双耳血管轮廓较清晰，兔耳厚薄均匀， 未见明显改变；病理组织学检查，动物双耳血管未见有毒理学意义的改变。说明实施例4制 备的注射液血管刺激性试验符合规定。具体的实验方法和实验结果如下：
[0088] (1)、受试物的配制：
[0089] 高剂量组：取实施例4制备的注射液（4mL :94mg/瓶）2瓶，吸出8mL后用0. 9% (0. 9g/100ml)氯化钠注射液稀释至100.0 mL，使成浓度为I. 88mg/mL的溶液。
[0090] 低剂量组：取上述浓度为I. 88mg/mL的溶液30mL，用0. 9 %氯化钠注射液稀释至 90.0 mL，稀释成浓度为0. 63mg/mL的溶液。
[0091] (2)、动物称重：给药前及末次给药后48小时和14天各称重一次。
[0092] (3)、一般观察与动物取材：
[0093] 每天给药前观察并记录动物和血管注射部位的反应，末次给药后48小时，分别放 血处死受试药物的高浓度和低浓度的2只新西兰兔，肉眼观察并记录血管组织的反应后， 从耳根部剪下双兔耳（先剪左耳，后剪右耳，并标记），然后分别剪取一段兔耳标本固定在 10%中性甲醛溶液中（标本长约8cm，宽约Icm ;远心端切口距第一针眼约0. 5cm处，近心端 切口距第三针眼约2cm处，挂线端为近心端）。各留下受试药物的高浓度和低浓度2只动物 继续观察至末次给药后14天，进行如下病理检查：以第一针眼为界，远端切一段；以第三针 眼为界，近端切二段；制片时血管横切，常规石蜡制片，切片厚度约4-5 μ m，H-E染色，然后 进行病理组织学检查。
[0094] (4)、结果判定
[0095] 根据肉眼观察和病理检查的结果进行综合判断。
[0096] (5)、试验结果
[0097] 肉眼观察：
[0098] 每天给药前肉眼观察并记录动物血管注射部位的反应，给药期间肉眼可见受试药 物高浓度和低浓度的部分动物给药侧和对照侧兔耳进针部位血管表皮内外侧呈红色，面积 由0.1 cmX 0. 2cm至0. 2cmX I. 0cm。在末次给药后48小时，受试药物的高浓度和低浓度的 4只兔的双侧兔耳血管轮廓较清晰，兔耳厚薄均匀，未见明显改变，详见表12和表13。末次 给药后14天剖检受试药物的高浓度和低浓度的4只兔，双侧兔耳血管轮廓较清晰，兔耳厚 薄均匀，未见明显改变。
[0099] 病理检查：
[0100] 受试药物的高浓度和低浓度的4只兔于末次给药后48小时剖检，余下受试药物的 高浓度和低浓度的4只兔在2周恢复期结束后剖检。病理组织学检查均未见血管组织有变 性或坏死等显著刺激性反应。结果见表8和表9 :
[0101] 表8 :注射液（高剂量组）对兔耳血管刺激反应（末次给药后48小时肉眼观察结 果）
[0102]
[0103] 表9 :注射液（低剂量组）对兔耳血管刺激反应（末次给药后48小时肉眼观察结 果）
[0104]
[0105] 以上结果说明采用实施例1中的化合物1制备的注射液经过溶血性和血管刺激性 试验表明具有良好的安全性，适宜制备成注射液在临床使用。
【主权项】
1. 一种具有预防和治疗脑血管缺血性疾病的化合物，如下图所示： I2. R选自H，CV6烷基，C 3_6环烷基，苄基，苯基，其中烷基苯基、苄基和环烷基未取代或被 1-3个独立选自卤素、羟基、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、-C02H、C02Cl-6和三氟甲基的取 代基取代。3. 如权利要求2所述化合物R优选-CH 3, -C2H5，-C3H7, -C4H9, -C3H5。4. 如权利要求R = H时所述的化合物与碱金属反应所生成的盐，自药学上可接受的钠、 钾、镁、钙及有机碱氨丁三醇、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、乙二胺、、二甲胺、羟乙基乙二胺、氨 基乙醇胺等，优选钠盐。5. 权利要求1-4所述化合物在制备改善睡眠药物中的应用。
【专利摘要】一种新化合物(式I所示)及其盐，实验证明可以用于治疗和预防脑缺血性疾病、改善睡眠，R＝H时，可以与碱金属钠、镁、钾、钙和有机碱tris、二乙胺、三乙胺等生成盐，具有治疗和预防缺血性心脑血管疾病和改善睡眠的作用。
【IPC分类】C07K5/078, A61K38/05, A61P9/10, A61P25/20
【公开号】CN104892725
【申请号】CN201510259391
【发明人】陈秀兰
【申请人】广州诺威生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
【技术领域】：
[0001] 本发明属于化合物的医药领域，涉及一种新的酰胺类化合物及其盐，并公开其其 制备方法和用途。
[0002]
【背景技术】：缺血性脑卒中的治疗药物：第一类是血管扩张药（如潘生丁等）。过去 认为只要药物能使脑血管扩张，便可以使血液从堵塞的血管中多流些过去。却发现扩张血 管药非但做不到这一点，还会使病变部位的血液反流到健康的脑组织里去（此称为脑内盗 血综合征），所以已不主张用此类药。第二类是改善微循环、扩充血容量的药物（如低分子 右旋糖酐等）。目前此类药用得较多，但是有心脏病的病人应慎用，否则可能会引起心力衰 竭。第三类是溶解血栓的药物（如尿激酶等）。应用此类药如果能达到溶解栓子的目的是 最为理想的，可是全身静脉用药时往往需要大剂量，有时会造成出血的危险性。现在多向病 人推荐使用介入治疗，就是通过导管把药物直接注入梗死的部位来溶解栓子，但采取此治 疗方法的前后都要做一次脑血管造影，这本身就又有一定的危险性，何况介入治疗要求病 人在得病后6小时内进行，有时往往已错过时机。第四类是抗凝治疗（如肝素等）。这类药 物能防止血液凝固，但使用时要每天查凝血酶原时间和活动度，条件较差的医院无法进行。 此外抗凝治疗也有出血的危险性。第五类是使用钙离子拮抗剂（如尼莫地平等）。这类药 物可以防止钙离子从细胞外流入细胞内，起到轻微扩张脑血管，保护脑细胞，增加脑细胞利 用氧和葡萄糖等作用。第六类是防止血小板凝聚的药（如阿司匹林等）。血小板的凝聚往 往是脑血栓形成的开端，如果能有效地阻断血小板的凝聚，也许能防止血桂进一步形成。目 前这类药物在世界上应用得十分广泛，但与其说是作为治疗药物还不如说是作为预防药物 更为恰当，因为脑卒中的急性期使用这类药物效果并不理想。
【发明内容】
：
[0003] 本发明的目的是提供一种用于缺血性脑卒中的新的酰胺类化合物，及其制备方法 和用途。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0005]
[0006] 通过动物试验证明，安慰剂组没有减小大鼠脑缺血梗塞体积的作用，不能改善脑 缺血的症状，也不具备改善睡眠的作用，本发明中化合物则具有很好的改善脑缺血症状的 作用，并且能够改善动物的睡眠状态。
[0007] R = H时，我们使之与碱金属或有机碱成盐，所述的碱指钠、钾、镁、钙及有机碱氨 丁三醇、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、乙二胺、、二甲胺、羟乙基乙二胺、氨基乙醇胺。
[0008] 式I所示的化合物与碱金属成盐首选钠盐。
[0009] 本发明还提供了用于治疗缺血性脑卒中的药物组合物，其特征是含有治疗有效量 的通式（1)化合物或其盐和药学上可接受的载体。可以是口服制剂或注射制剂。
[0010] 实验证明采用实施例1中化合物Ic制备的注射液，经过溶血、刺激性实验表明，具 有良好的耐受性，适宜制备成注射液在临床使用，用于治疗脑卒中患者的脑部细胞坏死和 改善患者的睡眠。 具体实施例：
[0011] 实施例1 :各化合物的制备：
[0012] 由于本文所述化合物有很强的连贯性，为了详细、准确、方便地描述各化合物制备 方法，将其以1个实施例来表达，下述的合成路线各化合物下方表明化合物的序号，为更加 简明的阐述，在下面的制备方法中以序号代替：
[0013] _I " H η 1c
[0014] (1)化合物3的合成：
[0015] 准确称取93. 1克原料2加入到200.0 mL二氯亚砜中，在80°C下搅拌反应6小时， 停止反应，反应液冷却至室温，加入75. 7克的三乙胺和300mL四氢呋喃，搅拌20分钟，将 I. 〇克L-脯氨酸甲酯溶于200mL的四氢呋喃中，缓慢滴加到上述反应液中，继续反应4小 时，停止反应，向反应液中加入300mL 2. ON的盐酸溶液和200mL蒸馏水，充分搅拌30分 钟，静置分层，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取（200mLX3)，合并有机层，用蒸馏水洗涤 (200mLX 3)，减压蒸馏除去溶剂得到121. 8克化合物3,产率为81. 7%。HNMR(400Hz，DMSO): 7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)，7. 29-7. 27 (m， 1H)，7. 20-7. 18 (m，1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 29-4. 27 (m，1H)，3. 88 (s，2H)，3. 68 (s，3H)， 3. 52-3. 50 (m，2H)，2. 44-2. 41 (m，2H)，2. 02-1. 98 (m，2H) ;MS (m/z) :298. 3。
[0016] (2)化合物4合成：
[0017] 准确称取120. 0克原料3和36. 3克甘氨酸加入到200.0 mL的四氢呋喃中， 80°C下搅拌反应6小时，停止反应，反应液冷却至室温，向反应液中加入IOOmLL ON的盐 酸溶液和200mL蒸馏水，充分搅拌30分钟，静置分层，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取 (200mLX3)，合并有机层，用蒸馏水洗涤（200mLX3)，减压蒸馏除去溶剂得到119. 2克化 合物 4,产率为 86. 7%。HNMR(400Hz，DMSO) :11. 0(s，1H)，8. 00(s，1H)，7. 79-7. 77(m，1H)， 7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)，7. 29-7. 27 (m，1H)，7. 20-7. 18 (m， 1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 40-4. 38 (m，1H)，4. 14 (s，2H)，3. 88 (s，2H)，3. 52-3. 50 (m，2H)， 2.44-2.41(m，2H)，2.02-1.98(m，2H) ;MS(m/z) :298.3。
[0018] (3)化合物la、lb、lc的合成：
[0019] 准确称取29. 7克化合物4加入到200.0 mL的无水乙醇中，(TC下搅拌30分钟，缓 慢滴加23. O克二氯亚砜到上述反应液中，大约30分钟滴加完毕，然后继续反应4小时，反 应液自然升温至室温。停止反应，减压蒸馏除去溶剂，向残余物中加入IOOmL乙酸乙酯和 200mL蒸馏水，充分搅拌30分钟，静置分层，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取（IOOmLX 3)， 合并有机层，减压蒸馏除去溶剂后得到化合物Ia的粗品，用乙酸乙酯和石油醚重结晶， 真空干燥后得到28. 2克化合物la，产率为76. 7%。HNMR(400Hz，DMSO) :8. 00(s，lH)， 7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)，7. 29-7. 27 (m， 1H)，7. 20-7. 18 (m，1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 40-4. 38 (m，1H)，4. 14 (s，2H)，4. 14-4. 10 (m， 2H)，3. 88 (s，2H)，3. 52-3. 50 (m，2H)，2. 44-2. 41 (m，2H)，2. 02-1. 98 (m，2H)，I. 31 (t，J = 3.6Hz，3H) ;MS(m/z) :369.5。
[0020] 重复上述的反应步骤，得到27. 4克化合物lb，产率为71. 7lHNMR(400Hz，DMS0): 8. 00 (s，1H)，7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)， 7. 29-7. 27 (m，1H)，7. 20-7. 18 (m，1H)，7. 12-7. 10 (m，1H)，4. 40-4. 38 (m，1H)，4. 32-4. 30 (m， 1H)，4. 16 (s，2H)，3. 88 (s，2H)，3. 52-3. 50 (m，2H)，2. 44-2. 41 (m，2H)，2. 02-1. 98 (m，2H)， 1.35(d，J = 3.2Hz，6H) ;MS(m/z) :383.4。
[0021] 准确称取29. 7克化合物4加入到50.0 mL的无水乙醇中，(TC下搅拌30分钟，分批 加入7. 48克乙醇钠到上述反应液中，然后继续反应1小时，向反应液中缓慢滴加200.0 mL 无水乙醚，反应液中有大量的沉淀析出，继续搅拌1小时，静置30分钟，抽滤，滤饼用无水乙 醚洗涤（50mLX3)，真空干燥后得到22.7克化合物lc，产率为76.7%。HNMR(400Hz，DMS0): 8. 00 (s，1H)，7. 79-7. 77 (m，1H)，7. 66-7. 64 (m，1H)，7. 53-7. 51 (m，1H)，7. 33-7. 31 (m，1H)， 7· 29-7. 27 (m，1H)，7· 20-7. 18 (m，1H)，7· 12-7. 10 (m，1H)，4· 40-4. 38 (m，1H)，4· 14 (s，2H)， 3· 88 (s，2H)，3· 52-3. 50 (m，2H)，2· 44-2. 41 (m，2H)，2· 02-1. 98 (m，2H) ;MS (m/z) :362. 3。
[0022] 实施例2 :实施例1中化合物4对局部脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响
[0023] (1)实验材料和方法
[0024] Wistar大鼠，体重250-280g。手术前后单独饲养，室温保持23-25°C，自有进食和 进水。按照1〇叩&等的方法制备丨1?^0模型。大鼠用10%水合氯醛麻醉（35〇11^/1^，;[.口.）， 体温维持在37±0. 5°C，仰卧位固定于手术台上。沿颈正中线切开皮肤，仔细分离右侧颈总 动脉（CCA)，颈外动脉（ECA)，颈内动脉（ICA)。将ECA结扎剪断，拉直与ICA成一直线。在 ECA上剪一小口，将一根长4. 0cm，直径0.26mm的圆头硅化尼龙绳（用0. 1 %多聚赖氨酸包 被）由此开口插入ICA约I. 85-2. 00cm，指大鼠大脑前动脉起始处，阻断大脑中动脉的血流 供应。缺血2小时后小心抽出尼龙线，结扎ECA开口并缝合手术切口，动物放回笼中再灌24 小时。
[0025] (2)实验分组及给药
[0026] 大鼠40只随机分4组：模型对照组，注射用水（lOOml/kg)，实施例1中的化合物4 给药组（25、50、100mg/kg)，MCA阻断造成缺血后10分钟时口服给药。
[0027] (3)脑梗塞体积的测定
[0028] 大鼠再灌注损伤24小时后，即刻断头取脑，去除嗅束、小脑和低位脑干，将其冠 状切成6片（第一至第五片2mm/片，第六片4mm)，迅速置于5ml含有I. 5ml4 % TTC及 0.1 ml IMK2HPO4的溶液中染色（37°C，避光）20-30分钟，其间每隔5分钟翻动一次。经TTC 染色后，正常组织深染呈红色，梗死组织呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存。求算每 片的梗死面积，并最终叠加换算成梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示，以 消除脑水肿的影响。
[0029] 脑梗塞体积（％) =(手术对侧半球体积-手术侧半球未梗塞部分的体积）/手术 对侧半球的体积*100%
[0030] ⑷实验结果
[0031] 缺血2小时再灌注24小时后，溶剂对照组的脑梗塞体积（％)为33. 8%。假手术 组没有任何脑梗塞出现。其他组脑梗塞体积结果如表1所示：
[0032] 表1 :灌胃给药对局部缺血大鼠脑梗塞体积（％)的影响
[0033]
[0034] 与溶剂对照组比，化合物4组口服给药均可以显著缩小脑梗塞体积。
[0035] 实施例3 :实施例1中化合物Ia对大鼠睡眠作用的影响：
[0036] 改善睡眠作用试验
[0037] 动物来源：昆明种小白鼠，18-22克，雄性。实验动物饲养室温度22±2°C ，相对湿 度50-70%。本实验设化合物Ia给药剂量为25mg/kg，另设蒸馏水对照组。
[0038] 样品处理：各取样品25mg分别加蒸馏水至20ml，使成均勾悬液，供试。
[0039] 给样途径：灌胃
[0040] 实验方法：戊巴比妥钠阈上剂量催眠试验：
[0041] 选用体重18-22g雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，连续给样30天，于 第30天样品灌胃15分钟后，给各组动物50mg/kg. b. w的戊巴比妥钠腹腔注射，注射量为 0. 2ml/20g.b. w，以小鼠翻正反射消失达1分钟以上作为入睡判断标准，观察给戊巴比妥钠 60分钟内各组动物的入睡时间和睡眠时间。
[0042] 结果：
[0043] 表2 :样品对动物体重的影响
[0044]
[0045] 由上表可见，样品各剂量组动物体重与对照组相比，均无显著性差异。
[0046] 表3 :阈上剂量的戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
[0047]
[0048] *P < 0· 05与对照组相比（经方差分析）
[0049] 由上表可见，化合物Ia组样品动物在阈上剂量戊巴比妥钠诱导下的入睡时间和 睡眠时间与对照组相比，有显著性差异。
[0050] 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验：
[0051] 选用体重18-22g雄性小鼠40只，随机分为四组，每组10只，连续给样28天，于 第28天样品灌胃15分钟后，给各组动物30mg/kg. b. w的戊巴比妥钠腹腔注射，注射量为 0. 2ml/20g. b. w，以小鼠翻正反射消失达1分钟以上作为入睡判断标准观察给戊巴比妥钠 25分钟内各组动物发生睡眠的动物数。
[0052] 结果：
[0053] 表4 :阈下剂量的戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的影响
[0054]
[0055] *P < 0· 05与对照组相比（经卡方检验）
[0056] 由上表可见，化合物1组和对照组在阈下剂量戊巴比妥钠诱导下的入睡动物和睡 眠发生率与对照组相比，均有显著性差。
[0057] 总结：经口给予小鼠样品30天后，化合物Ia组具有改善睡眠的作用。
[0058] 实施例4 :采用实施例1中化合物Ic制备的注射液：
[0059]
[0060] 按处方量准确称取实施例1制备的化合物1置一容器中，加适量注射用水，搅拌至 全溶，并调节pH至8. 5-8. 8,加注射用水至4000ml，加入2g针用活性炭，煮沸15min，抽滤脱 碳，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，溶液灌封于玻璃安瓿内（每支含化合物Ia为94mg)制 剂经115°C加压灭菌15min。
[0061] 实施例5 :实施例4中注射液溶血性及刺激性试验
[0062] 液溶血性试验：
[0063] 体外溶血试验：向盛有2%红血球混悬液的各支药液管中分别加入不等量的实施 例4制备的注射液的低浓度和高浓度（0. 63mg/mL和I. 88mg/mL)，各支药液管在3小时内不 产生溶血作用。说明实施例4制备的注射液体外溶血性试验阴性。具体的实验方法和实验 结果如下：
[0064] 1、受试药物的配制：
[0065] (1)高剂量组：取实施例4制备的注射液（4mL :94mg/瓶）1瓶，吸出0· 5mL后用 0. 9% (0. 9g/100ml)氯化钠注射液稀释至6. 25mL，使成浓度为I. 88mg/mL的溶液。
[0066] (2)低剂量组：取上述浓度为I. 88mg/mL的溶液2mL，用(λ 9% (0· 9g/100ml)氯化 钠注射液稀释至6mL，稀释成浓度为0. 63mg/mL的溶液。
[0067] 2、给药方法：
[0068] (1) 2 %红血球混悬液的制备：
[0069] 取兔血数毫升，放入盛有含玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使 成脱纤血液。然后分装在数支离心管中，每管加约10倍量的0. 9%氯化钠注射液，摇匀，离 心（1500转/分，15分钟），除去上清液，沉淀的红血球再用0. 9 %氯化钠注射液洗涤2-3 次，直至上清液不显红色为止。将所得红血球用0. 9%氯化钠注射液配成2%的混悬液，供 试验用。
[0070] 取口径大小均匀的洁净试管7只（每管均设平行管），编号后，用移液管按表9所 示配比量依次加入2%红血球混悬液、0. 9%氯化钠注射液、注射用水和受试药液，混匀后立 即置37°C恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次， 共观察3小时。
[0071] 表5 :2%红血球混悬液的制备编号
[0072]
[0073] 注：其中1-5管为供试品管，第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。
[0074] (2)结果观察：
[0075] 如试验中溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，即表示有溶血 发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。如溶液中有棕红色或红棕 色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，需进一步判 定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将聚集物放在载波片上， 在盖玻片边缘滴加2滴0. 9%氯化钠注射液，在显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假 凝聚；若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
[0076] 3、结果判定
[0077] 当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶 液在3小时内不产生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3小时内 产生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射使用。
[0078] 4、试验结果
[0079] 分别加入低浓度为0. 63mg/mL和高浓度为I. 88mg/mL的注射液溶液的各支药液管 在3小时内均不产生溶血作用，体外溶血性试验阴性。详见下表6和表7。
[0080] 表6 :注射液（高剂量组）溶血性试验结果（肉眼观察）
[0081]
[0082] 注：" + "表示全溶血，表示不溶血；第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。
[0083] 表7 :注射液（低剂量组）溶血性试验结果（肉眼观察）
[0084]
[0085] 注：" + "表示全溶血，表示不溶血；第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。
[0086] 注射液血管刺激性试验
[0087] 兔血管刺激性试验：试验选用健康新西兰兔8只，采用同体左右侧耳朵自身对比 法，左侧耳缘静脉注射受试药物，给药体积5ml/kg体重，各给药组给予相应剂量的实施例4 制备的注射液，低剂量组和高剂量组剂量分别是3. 15mg/kg · bw和9. 4mg/kg · bw，（按浓度 计算其低浓度和高浓度分别为〇. 63mg/mL和I. 88mg/mL，是临床一次静脉滴注拟用浓度的 0. 7-1. 4倍和2-4倍），右耳给予等体积0. 9 % (0. 9g/100ml)氯化钠注射液作对照，每天一 次，连续3天。8只兔依次给予受试药的高浓度和低浓度后，再分别给予0. 9%氯化钠注射 液。各取低剂量和高剂量的2只兔于末次给药后48小时剖检，余下低浓度和高浓度的4只 兔在末次给药2周恢复期结束后剖检。结果8只动物双耳血管轮廓较清晰，兔耳厚薄均匀， 未见明显改变；病理组织学检查，动物双耳血管未见有毒理学意义的改变。说明实施例4制 备的注射液血管刺激性试验符合规定。具体的实验方法和实验结果如下：
[0088] (1)、受试物的配制：
[0089] 高剂量组：取实施例4制备的注射液（4mL :94mg/瓶）2瓶，吸出8mL后用0. 9% (0. 9g/100ml)氯化钠注射液稀释至100.0 mL，使成浓度为I. 88mg/mL的溶液。
[0090] 低剂量组：取上述浓度为I. 88mg/mL的溶液30mL，用0. 9 %氯化钠注射液稀释至 90.0 mL，稀释成浓度为0. 63mg/mL的溶液。
[0091] (2)、动物称重：给药前及末次给药后48小时和14天各称重一次。
[0092] (3)、一般观察与动物取材：
[0093] 每天给药前观察并记录动物和血管注射部位的反应，末次给药后48小时，分别放 血处死受试药物的高浓度和低浓度的2只新西兰兔，肉眼观察并记录血管组织的反应后， 从耳根部剪下双兔耳（先剪左耳，后剪右耳，并标记），然后分别剪取一段兔耳标本固定在 10%中性甲醛溶液中（标本长约8cm，宽约Icm ;远心端切口距第一针眼约0. 5cm处，近心端 切口距第三针眼约2cm处，挂线端为近心端）。各留下受试药物的高浓度和低浓度2只动物 继续观察至末次给药后14天，进行如下病理检查：以第一针眼为界，远端切一段；以第三针 眼为界，近端切二段；制片时血管横切，常规石蜡制片，切片厚度约4-5 μ m，H-E染色，然后 进行病理组织学检查。
[0094] (4)、结果判定
[0095] 根据肉眼观察和病理检查的结果进行综合判断。
[0096] (5)、试验结果
[0097] 肉眼观察：
[0098] 每天给药前肉眼观察并记录动物血管注射部位的反应，给药期间肉眼可见受试药 物高浓度和低浓度的部分动物给药侧和对照侧兔耳进针部位血管表皮内外侧呈红色，面积 由0.1 cmX 0. 2cm至0. 2cmX I. 0cm。在末次给药后48小时，受试药物的高浓度和低浓度的 4只兔的双侧兔耳血管轮廓较清晰，兔耳厚薄均匀，未见明显改变，详见表12和表13。末次 给药后14天剖检受试药物的高浓度和低浓度的4只兔，双侧兔耳血管轮廓较清晰，兔耳厚 薄均匀，未见明显改变。
[0099] 病理检查：
[0100] 受试药物的高浓度和低浓度的4只兔于末次给药后48小时剖检，余下受试药物的 高浓度和低浓度的4只兔在2周恢复期结束后剖检。病理组织学检查均未见血管组织有变 性或坏死等显著刺激性反应。结果见表8和表9 :
[0101] 表8 :注射液（高剂量组）对兔耳血管刺激反应（末次给药后48小时肉眼观察结 果）
[0102]
[0103] 表9 :注射液（低剂量组）对兔耳血管刺激反应（末次给药后48小时肉眼观察结 果）
[0104]
[0105] 以上结果说明采用实施例1中的化合物1制备的注射液经过溶血性和血管刺激性 试验表明具有良好的安全性，适宜制备成注射液在临床使用。
【主权项】
1. 一种具有预防和治疗脑血管缺血性疾病的化合物，如下图所示： I2. R选自H，CV6烷基，C 3_6环烷基，苄基，苯基，其中烷基苯基、苄基和环烷基未取代或被 1-3个独立选自卤素、羟基、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、-C02H、C02Cl-6和三氟甲基的取 代基取代。3. 如权利要求2所述化合物R优选-CH 3, -C2H5，-C3H7, -C4H9, -C3H5。4. 如权利要求R = H时所述的化合物与碱金属反应所生成的盐，自药学上可接受的钠、 钾、镁、钙及有机碱氨丁三醇、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、乙二胺、、二甲胺、羟乙基乙二胺、氨 基乙醇胺等，优选钠盐。5. 权利要求1-4所述化合物在制备改善睡眠药物中的应用。
【专利摘要】一种新化合物(式I所示)及其盐，实验证明可以用于治疗和预防脑缺血性疾病、改善睡眠，R＝H时，可以与碱金属钠、镁、钾、钙和有机碱tris、二乙胺、三乙胺等生成盐，具有治疗和预防缺血性心脑血管疾病和改善睡眠的作用。
【IPC分类】C07K5/078, A61K38/05, A61P9/10, A61P25/20
【公开号】CN104892725
【申请号】CN201510259391
【发明人】陈秀兰
【申请人】广州诺威生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
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