一种西曲瑞克的制备方法
一种西曲瑞克的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种西曲瑞克的固相合成方 法。
【背景技术】
[0002] 西曲瑞克(商品名Cetrotide)是一种有效的黄体酮释放激素抑制素（LH-RH)受体 拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。并可用于治疗乳 腺癌和妇科癌，子宫内膜异位症，性早熟，子宫子宫肌瘤，卵巢雄激素过多和经前综合症。
[0003] 西曲瑞克被用于辅助生殖抑制过早促黄体激素激增。药物作用机理是由于阻断促 性腺激素释放激素的作用，从而迅速抑制黄体生成激素（LH)和卵泡刺激素（FSH)的产生和 作用。西曲瑞克用于治疗对激素敏感的前列腺癌和乳腺癌和一些良性妇科疾病(子宫内膜 异位症，子宫肌瘤和子宫内膜变薄)。西曲瑞克通过剂量依赖抑制脑垂体腺的黄体生成激素 (LH)和卵泡刺激素（FSH)的分泌，抑制作用是直接的，并通过连续的治疗来维持，不引起黄 体激素受体活性在初始时高涨随后下调。西曲瑞克的治疗采用每天多次〇. 25毫克皮下注 射或作为单剂量为3mg皮下注射。大量研宄表明，西曲瑞克对卵巢癌、前列腺癌、子宫纤维 瘤、子宫内膜异位等疾病有较好的疗效，而且对良性前列腺肥大和卵巢过度刺激综合征有 预防和改善作用。
[0004] 西曲瑞克是一种合成的十肽，其分子结构如结构1 :
[0005] 西曲瑞克的氨基酸序列为： AcnNallHci-Phe2-D-SPal3-Ser4-Tyr 5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala 1c1-NH20
[0006] 其中氨基酸的缩写分别为： D-2Nal: D-2-萘丙氨酸 D-4C1-Phe: D-4-氯-苯丙氨酸 D-3Pal: D-3-吡啶丙氨酸 Ser:丝氨酸 Tyr:酪氨酸 D-Cit: D-瓜氨酸 Leu:亮氨酸 Arg:精氨酸 Pro:脯氨酸 D-Ala: D-丙氨酸。
[0007] 有许多已知的方法可用于多肽药物的合成。液相多肽合成（LPPS)-直是生产大 量多肽的优选方法，另一种目前常用的多肽合成方法是固相多肽合成法（SPPS)，其中所 需肽链从C末端开始在树脂上依次进行氨基酸的连接。在这些方法中的氨基酸的侧链需要 进行保护，以避免其他侧链副反应。
[0008] 专利CN101284863B公开了西曲瑞克的一种Fmoc固相合成方法。该方法包括以 下步骤：Fmoc Linker MBHA树脂被用作起始原料，并依次连接N-末端Fmoc保护的氨基 酸，以获得全保护的十肽树脂；苯并三氮唑_Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟 基苯并三氮唑或N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基苯并三氮唑作为偶联剂，偶联反应在 35-50摄氏度下进行0.5 - 2小时；多肽连接完成后使用乙酸酐进行乙酰化封端；然后进 行三氟醋酸树脂切割和侧链脱保护，粗肽用反相C18或C8色谱柱纯化并冷冻干燥，得到西 曲瑞克。由于瓜氨酸残基的侧链没有采用保护基团，可以在乙酰化反应过程中发生侧链 的乙酰化副反应，以形成[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克工艺杂质（见结构2和结构3)，其序列为 AcuNal1HCl-Phe2-D-SPal3 -Ser4-Tyr5-D-Cit (Ac) 6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala lcl-NH2，它是 一种毒性较大的杂质[专利CN104086632A]，用现有技术的手段很难除去，该杂质的存在严 重影响西曲瑞克的含量以及使用安全。因此，这种方法制备西曲瑞克容易产生有毒杂质， 不适用于工业化大规模合成西曲瑞克。此外，所述氨基酸偶联反应温度为35-50摄氏度， 氨基酸在这样的高温下，容易发生消旋从而影响产品的光学纯度。
[0009] D-瓜氨酸侧链被乙酰化的[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克杂质的两种可能结构(结构2和 结构3):
[0010] 专利CN104086632A公开了西曲瑞克的另一种Fmoc固相合成方法。该方法包括以 下步骤：1) AM树脂用作初始树脂依次连接N-末端Fmoc保护的氨基酸，以获得全保护的十 肽树脂，其中所述肽序列6-位氨基酸连接使用的Fmoc-D-Orn (Dde)-OH; 2)当偶联完成后， 去除Fmoc保护基团，并进行N-端乙酰化封端；3)用水合肼/N，N-二甲基甲酰胺3:97体 积比的溶液去除D-鸟氨酸侧链Dde保护基；然后加入叔丁基异氰酸酯，将多肽中D型鸟氨 酸转换为瓜氨酸，从而得到全保护的西曲瑞克肽树脂；4)将肽树脂进行三氟醋酸裂解，纯 化，盐交换，并冻干以获得西曲瑞克。采用这种制备方法，[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克杂质的含 量小于0. 1 %。但是，这种方法需要使用Dde保护基的Fmoc-D-Orn (Dde) -OH以及有毒的水 合肼试剂用来除去Dde保护基，并将D-鸟氨酸转化成D-瓜氨酸。此制备工艺复杂，不适用 于工业化西曲瑞克的制备。
[0011] 专利CN104277093A公开了西曲瑞克的一种Fmoc化学和微波加热相结合的固相合 成方法。该方法包括以下步骤：Rink Amide-AM树脂被用作起始原料，并依次加上N-末端 Fmoc保护的氨基酸，以获得全保护的十肽树脂；采用N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基 苯并三氮唑作为偶联剂，偶联反应用微波加热进行；多肽连接完成后使用乙酸酐进行乙酰 化封端；然后进行三氟醋酸树脂切割和侧链脱保护，然后进行三氟醋酸树脂切割和侧链脱 保护，粗肽用反相C18色谱柱纯化并冷冻干燥，得到西曲瑞克。由于此方法也使用了侧链没 有保护基的Fmoc-Cit-ΟΗ，同样无法避免有毒[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克杂质的产生，微波加 热的方法也不适用于工业化制备合成。
[0012] 专利CN101863960B公开了西曲瑞克的一种Boc固相合成方法。该方法包括以下 步骤：使用的Boc氨基酸和Wang树脂为原料，依次连接Boc氨基酸。多肽连接完成后，使用 10%重量比的氨水进行氨解切割，然后使用H2/钯除去侧链保护基以获得粗肽。该粗肽通过 反相C18色谱柱纯化，得到西曲瑞克。此Boc固相合成法采用大量的三氟醋酸除去Boc保 护基以及氨水用于氨解切割，对环境污染大。另外，使用H 2/钯进行侧链脱保护，可能会导 致最终产品的重金属污染。
[0013] 因此，目前迫切需要一种能够避免[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克有毒杂质，且安全高效 和环境污染小的生产方法。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的在于提供一种西曲瑞克的制备方法，主要解决现有固相合成法中有 毒且难分离的D-瓜氨酸侧链被乙酰化的[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克工艺杂质问题，及现有固 相合成法使用有毒试剂从而导致环境污染以及产品中可能有重金属污染的问题。本发明以 最少保护基的原则快速制备，得到理想的合成结果。
[0015] D-瓜氨酸侧链被乙酰化的[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质是一种毒性较大的工艺杂 质，它的产生是由于侧链未受保护的瓜氨酸被用于偶联反应，在最后的多肽封端过程中，瓜 氨酸的侧链也被部分乙酰化。由于[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质有毒并且难以纯化，杂质的 存在极大地影响了产品的安全性和工艺效率。为了避免这种杂质，专利CN104086632A公开 的固相Fmoc法，其中所述肽序列6-位氨基酸偶联使用Fmoc-D-Orn (Dde) -OH。完成多肽连 接和Ac封端以后，用水合肼除去D-鸟氨酸侧链Dde保护基，然后加入叔丁基异氰酸酯把鸟 氨酸转化为瓜氨酸。尽管[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质能够有效地控制在0.1 %以下，但该 方法需要采用侧链Dde保护的鸟氨酸Fmoc-D-Orn (Dde) -OH，完成多肽连接后用有毒的水合 肼试剂去除Dde保护基，并将鸟氨酸转化成为瓜氨酸，此工艺复杂。为此，本发明人重点研 宄如何完全避免产生[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克工艺杂质而不影响西曲瑞克的收率问题。本 专利公开了一种西曲瑞克的制备方法，本方法能够有效避免[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克有毒 杂质，且采用最少保护基团策略，环境污染较小。
[0016] 本发明提供了 一种西曲瑞克的固相合成法，通过Fmoc氨基酸的逐个偶联完 成西曲瑞克序列的固相合成。其中最后一个氨基酸采用Ac-D-2Nal-OH。由于使用 Ac-D-2Nal-OH，避免了最后的乙酰化封端。即使使用侧链无保护的Fmoc- D-Cit-OH也可从 根本上避免侧链的乙酰化杂质。本发明工艺既可以采用固相合成也可以采用液相合成。
[0017] 本发明涉及一种制备西曲瑞克的Fmoc固相合成方法，其特征在于包括以下步骤： a)以氨基树脂为固相载体，通过固相合成法依次偶联西曲瑞克序列中相对应的Fmoc-保 护氨基酸，最后一个氨基酸的连接采用Ac-D-2Nal-OH，制备侧链部分保护或全保护的西曲 瑞克肽树脂；b)使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护，得到西曲瑞克粗 肽；c)经纯化、转盐以及冻干得到西曲瑞克。可以在a)步骤中使用肽偶联剂和/或偶联添 加剂。
[0018] 作为优选，所述氨基树脂为Rink Amide树脂，Rink Amide AM树脂，Rink Amide MBHA树脂，或Sieber树脂。
[0019] 作为优选，固相合成中采用侧链无保护的Fmoc-D-Cit-ΟΗ。在固相合成中依次偶 联西曲瑞克序列中相对应的氨基酸，其中氨基酸侧链采用易酸解的保护基，比如以下氨基 酸：：Fmoc-D_Ala-〇H， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-〇H， Fmoc-Leu-OH， Fmoc-D-Cit-OH， Fmoc-Tyr(tBu)-O H， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-D_3Pal-〇H， Fmoc-D-Phe(4_Cl)-〇H， Ac-D-2Nal-OH。
[0020] 最后一个氨基酸的连接采用Ac-D-2Nal-OH以避免乙酰化封端反应及相应的氨基 酸侧链乙酰化副产物。
[0021] 典型的肽偶联剂是以下中的一种或多种：邻（7-氮杂苯并三唑-1-基）-1，1，3， 3_四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)，邻（苯并三唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)，邻（苯并三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲基四氟硼酸脲鑰（TBTU)，六氟磷酸苯并三 唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)鱗（BOP)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷 基鱗（PyBOP)，N，N-双（2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰二氯（BOP-Cl)，六氟磷酸溴-三-吡 咯烷基鱗（PyBroP)，氯甲酸异丁酯（IBCF)，1，3-二环己基碳二亚胺（DCC)，1，3-二异丙 基-碳二亚胺（DIC)，1-(二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（WS⑶I)，N-乙氧基 羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉（EEDQ)，氯甲酸异丙酯（IPCF)，2-(5-降冰片烯-2, 3-二 甲酰亚胺基)-1，1，3,3_四甲基四氟硼酸脲鑰（TNTU)，丙基膦酸酐（PPAA)和2-琥珀酰亚胺 基_1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲鑰（TSTU)。一种优选的偶联剂是1，3_二异丙基-碳二 亚胺（DIC)。
[0022] 典型的肽偶联添加剂是1-羟基-IH-苯并三唑（HOBt), 6-氯-1-羟基-IH-苯 并三唑（6-Cl-H〇Bt)，3-羟基-1，2,3-苯并三嗪-4(3H)_酮（HOOBt)，2-肟氰乙酸乙酯 (Oxyma)，1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt)。
[0023] 优选地在偶联反应中氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的14倍，偶联反应温度为 030 ° C。Ac-D-2Nal-OH偶联反应温度为020 ° C。偶联反应时间优选为0. 54小时。
[0024] 本发明的制备西曲瑞克的固相合成方法中脱去Fmoc优选使用体积比5-30%六氢 吡啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，洗脱时间优选为1530分钟。所用的酸解切割剂为三氟醋 酸溶液，三氟醋酸的比例为80-97%体积比。0 - 30 ° C切肽反应1. 5 - 3小时，过滤， 滤液加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤，干燥，获得西曲瑞克粗品。
[0025] 产物纯化步骤优选采用C18或C8反相柱色谱分离纯化，流动相为0. 05%_0. 5%盐 酸或磷酸或三氟醋酸的水溶液和乙腈溶液，用液相色谱仪跟踪收集所需要的产品馏分，检 测波长为220 nm ;样品峰合并后换盐，冷冻干燥，得到最终的西曲瑞克纯品。
[0026] 在该工艺制备的西曲瑞克粗肽中，未检出[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质。经纯化和 冷冻干燥得到西曲瑞克成品，产品纯度高达99%，收率高达40%。该合成方法可以通过附 图1中的方案表示。
[0027] 本工艺的制备方法采用最少保护基团策略的Fmoc固相合成法，优点在于没有 [D-Cit (Ac)]-西曲瑞克有毒杂质，产品纯度及收率高，操作方法简便，成本较低。对环境污 染少，适于工业化大规模生产西曲瑞克。
[0028] 最终产物的高效液相色谱图见附图2。
【附图说明】 图1为一种西曲瑞克的制备方法。 图2为最终产物的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0029] 西曲瑞克的合成采用从Fmoc Rink酰胺树脂和氨基酸以逐步偶联的固相多肽合成 法进行。
[0030] 实施例1。
[0031] 步骤 I. Fmoc Rink Amide 树脂（3. 0 mmol, 5. I g,取代度 0· 59 mmol/g)置于 一反应器中，用N，N-二甲基甲酰胺（100毫升）溶胀30分钟。悬浮液过滤，将20%哌啶/ N，N-二甲基甲酰胺（100mL)加入到树脂中并搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保 护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，准备用于步骤2偶联。
[0032] 步骤2.将3. Ilg Fmoc-DAla-OH, 1. 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1. 58 mL N, N-二 异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分钟。活 化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到树脂的 反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液 中搅拌30分钟以除去Fmoc。Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗绦，并准 备用于步骤3偶联。
[0033] 步骤 3.将 3. 37 g Fmoc-Pro-OH, 1. 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1. 58 mL N, N-二 异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分钟。活 化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到树脂的 反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液 中搅拌30分钟以除去Fmoc。Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗绦，并准 备用于步骤4偶联。
[0034] 步骤 4.将 6. 48 g Fmoc-Arg (Pbf)-OH, 1. 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1. 58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤5偶联。
[0035] 步骤 5.将 3. 53 g Fmoc-Leu-OH, L 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 L 58 mL N, N-二 异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分钟。活 化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到树脂的 反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液 中搅拌30分钟以除去Fmoc。Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗绦，并准 备用于步骤6偶联。
[0036] 步骤 6.将 3.97 g Fmoc-D-Cit-OH, 1.35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1.58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行I - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分 钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤 7偶联。
[0037] 步骤 7.将 4.59 g Fmoc-Tyr(tBu)-〇H, 1.35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1.58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤8偶联。
[0038] 步骤 8.将 3. 83 g Fmoc-Ser(tBu)-〇H, L 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 L 58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤9偶联。
[0039] 步骤 9.将 3.88 g Fmoc-D3Pal-OH, 1.35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1.58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树 脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤10偶联。
[0040] 步骤 10.将 2. 53 g Fmoc-D4Cpa-OH, L 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 L 58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤11偶联。
[0041] 步骤11.在步骤10得到的肽树脂中（340 mg，0.1 mmol)加入Ac-D-2Nal-OH (78 mg，0. 3 mmol)和1-羟基苯并三氮挫（41 mg，0. 3 mmol)的N, N-二甲基甲酰胺溶液。然后 加入N，N-二异丙基碳化二亚胺（47微升，0.3 mmol)，偶联反应在0 - 5摄氏度下进行1 -4小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤五 次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，该树脂然后进行三氟醋酸切割。
[0042] 三氟醋酸切割及侧链去保护：将干燥后的肽树脂悬浮在三氟醋酸切割液中三氟 醋酸：水（95:5，10 ml/g树脂），在室温下切割2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中 沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。粗肽的产率为89. 4%，高效液相色 谱纯度为81. 8%。通过高效液相色谱分析在粗产物中未检测到[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂 质。
[0043] 纯化，盐交换：将西曲瑞克粗肽溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系 C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。
[0044] 冻干：盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸西曲瑞克产物 (最终产物的高效液相色谱见附图2)。最终产品的纯度为99%，收率为40%。
[0045] 实施例2。
[0046] 按实施例1中步骤1至步骤10的方法合成九肽树脂，然后连接Ac-D-2Nal_0H。
[0047] 在步骤 10 得到的九肽树脂中（340 mg，0.1 mmol)加入 Ac-D-2Nal-OH (78 mg，0. 3 mmol)和邻（7-氮杂苯并三唑-1-基)-l，l，3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU) (114 mg，0. 3 mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液。然后加入N，N-二异丙基乙胺（52微升，0.3 mmol)，偶联 反应在0 - 5摄氏度下进行1 - 4小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，该树脂然后进行三 氟醋酸切割。
[0048] 三氟醋酸切割：将干燥后的肽树脂悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸：水 (95:5，10 ml/g树脂），在室温下切割2. 5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗 肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。粗肽的产率为83. 1%。通过高效液相色谱分析 在粗产物中未检测到[D-Cit(Ac)] -西曲瑞克杂质。
[0049] 纯化，盐交换：将西曲瑞克粗肽溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系 C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。
[0050] 冻干：盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸西曲瑞克产物。 最终产品的纯度为99 %，收率为36 %。
【主权项】
1. 一种制备西曲瑞克的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：a)以氨基树脂为 固相载体，通过固相合成法依次偶联西曲瑞克序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，最后一 个氨基酸的连接采用Ac-D-2Nal-0H，制备得到侧链部分保护或全保护的西曲瑞克肽树脂； b)使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护。2. 根据权利要求1所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于在a)步骤中使用肽偶联 剂和/或偶联添加剂。3. 根据权利要求1至2之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于该方法还包括对 产物的纯化步骤。4. 根据权利要求1至3之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于固相合成中采用 了侧链无保护的Fmoc-D-Cit-OH。5. 根据权利要求1至4之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于固相 合成法依次偶联的氨基酸为：Fmoc-D-Ala-〇H，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg (Pbf)-OH， Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Cit-〇H, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-D-3Pal-〇H, Fmoc-D-Phe(4-C1)-OH，Ac-D-2Nal-OH。6. 根据权利要求I至5之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于所述偶联反应中 氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的1 一 4倍，偶联反应温度为0 - 30 °C。7. 根据权利要求1至6之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于固相合成中 Ac-D-2Nal-0H偶联反应温度为0 - 20 °C。8. 根据权利要求2至7之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于肽偶联剂是以 下中的一种或多种：邻（7-氮杂苯并三唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)， 邻（苯并三唑-1-基）_1，1，3,3_四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU)，邻（苯并三唑-1-基）-1， 1，3, 3-四甲基四氟硼酸脲鑰（TBTU)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基） 鱗（B0P)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基鱗（PyBOP)，N，N_? (2-氧 代-3-噁唑烷基）膦酰二氯（BOP-Cl)，六氟磷酸溴-三-吡咯烷基鱗（PyBroP)，氯甲酸异 丁酯（IBCF)，1，3_二环己基碳二亚胺（DCC)，1，3_二异丙基-碳二亚胺（DIC)，1-(二甲基 氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（WS⑶I)，N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉 (EEDQ)，氯甲酸异丙酯（IPCF)，2-(5-降冰片烯-2, 3-二甲酰亚胺基)-1，1，3, 3-四甲基四氟 硼酸脲鑰（TNTU)，丙基膦酸酐（PPAA)和2-琥珀酰亚胺基_1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲 鑰（TSTU);肽偶联添加剂选自1-羟基-IH-苯并三唑（HOBt), 6-氯-1-羟基-IH-苯并三唑 (6-(：1-1108〇，3-羟基-1，2,3-苯并三嗪-4(311)-酮〇1008〇，2-肟氰乙酸乙酯（(^ 7111&)， 1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt);-种优选的偶联剂是1，3-二异丙基-碳二亚胺（DIC)， 偶联反应时间为0. 5 - 4小时。9. 根据权利要求1至8之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于脱去Fmoc使用体 积比5-30%六氢吡啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，洗脱时间为15 - 30分钟。10. 根据权利要求1至9之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于步骤b)中所述 的酸解切割剂为三氟醋酸的溶液，三氟醋酸的比例为80-97%体积比；0 - 30 °C切肽反 应1. 5 - 3小时，过滤，滤液加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤，干燥，获得西曲瑞克粗 品。11. 根据权利要求3至10之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于产物纯化步骤 采用C18或C8柱色谱分离纯化，流动相为0. 05%-0. 5%盐酸或磷酸或三氟醋酸的水溶液和 乙腈溶液，用液相色谱仪跟踪收集所需要的产品馏分，检测波长为220nm;样品峰合并后 换盐以及冷冻干燥得到醋酸西曲瑞克。12. 根据权利要求1至11所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于该方法合成的西曲 瑞克中不含[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质。13. -种制备西曲瑞克可药用盐的方法，其特征在于按照权利要求1至12之一所述的 方法制备西曲瑞克，之后将其制成可药用盐。14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述的西曲瑞克可药用盐为醋酸西曲瑞 克。15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于通过对所述的西曲瑞克进行醋酸转盐， 冻干，获得醋酸西曲瑞克。
【专利摘要】本发明公开了一种西曲瑞克的固相合成方法，该方法完全避免了D-瓜氨酸侧链乙酰化的[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克有毒杂质。本发明方法以氨基树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次连接西曲瑞克序列中相对应的Fmoc-氨基酸，经缩合反应及脱保护反应，得到全保护西曲瑞克肽树脂；再进行酸解切割和乙醚沉降，得到西曲瑞克粗肽；经色谱纯化、醋酸转盐以及冷冻干燥得到醋酸西曲瑞克。本发明选用Ac-D-2Nal-OH作为最末位氨基酸的连接，以避免乙酰化封端。本发明工艺既可以采用固相合成也可以采用液相合成，工艺副产物少，易于分离纯化。所得最终的醋酸西曲瑞克产物纯度高达99％，收率高达40％，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
【IPC分类】C07K7/23, C07K1/06, C07K1/04
【公开号】CN104892732
【申请号】CN201510332163
【发明人】李湘, 徐琪, 魏忠勇
【申请人】中肽生化有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种西曲瑞克的固相合成方 法。
【背景技术】
[0002] 西曲瑞克(商品名Cetrotide)是一种有效的黄体酮释放激素抑制素（LH-RH)受体 拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。并可用于治疗乳 腺癌和妇科癌，子宫内膜异位症，性早熟，子宫子宫肌瘤，卵巢雄激素过多和经前综合症。
[0003] 西曲瑞克被用于辅助生殖抑制过早促黄体激素激增。药物作用机理是由于阻断促 性腺激素释放激素的作用，从而迅速抑制黄体生成激素（LH)和卵泡刺激素（FSH)的产生和 作用。西曲瑞克用于治疗对激素敏感的前列腺癌和乳腺癌和一些良性妇科疾病(子宫内膜 异位症，子宫肌瘤和子宫内膜变薄)。西曲瑞克通过剂量依赖抑制脑垂体腺的黄体生成激素 (LH)和卵泡刺激素（FSH)的分泌，抑制作用是直接的，并通过连续的治疗来维持，不引起黄 体激素受体活性在初始时高涨随后下调。西曲瑞克的治疗采用每天多次〇. 25毫克皮下注 射或作为单剂量为3mg皮下注射。大量研宄表明，西曲瑞克对卵巢癌、前列腺癌、子宫纤维 瘤、子宫内膜异位等疾病有较好的疗效，而且对良性前列腺肥大和卵巢过度刺激综合征有 预防和改善作用。
[0004] 西曲瑞克是一种合成的十肽，其分子结构如结构1 :
[0005] 西曲瑞克的氨基酸序列为： AcnNallHci-Phe2-D-SPal3-Ser4-Tyr 5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala 1c1-NH20
[0006] 其中氨基酸的缩写分别为： D-2Nal: D-2-萘丙氨酸 D-4C1-Phe: D-4-氯-苯丙氨酸 D-3Pal: D-3-吡啶丙氨酸 Ser:丝氨酸 Tyr:酪氨酸 D-Cit: D-瓜氨酸 Leu:亮氨酸 Arg:精氨酸 Pro:脯氨酸 D-Ala: D-丙氨酸。
[0007] 有许多已知的方法可用于多肽药物的合成。液相多肽合成（LPPS)-直是生产大 量多肽的优选方法，另一种目前常用的多肽合成方法是固相多肽合成法（SPPS)，其中所 需肽链从C末端开始在树脂上依次进行氨基酸的连接。在这些方法中的氨基酸的侧链需要 进行保护，以避免其他侧链副反应。
[0008] 专利CN101284863B公开了西曲瑞克的一种Fmoc固相合成方法。该方法包括以 下步骤：Fmoc Linker MBHA树脂被用作起始原料，并依次连接N-末端Fmoc保护的氨基 酸，以获得全保护的十肽树脂；苯并三氮唑_Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟 基苯并三氮唑或N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基苯并三氮唑作为偶联剂，偶联反应在 35-50摄氏度下进行0.5 - 2小时；多肽连接完成后使用乙酸酐进行乙酰化封端；然后进 行三氟醋酸树脂切割和侧链脱保护，粗肽用反相C18或C8色谱柱纯化并冷冻干燥，得到西 曲瑞克。由于瓜氨酸残基的侧链没有采用保护基团，可以在乙酰化反应过程中发生侧链 的乙酰化副反应，以形成[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克工艺杂质（见结构2和结构3)，其序列为 AcuNal1HCl-Phe2-D-SPal3 -Ser4-Tyr5-D-Cit (Ac) 6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala lcl-NH2，它是 一种毒性较大的杂质[专利CN104086632A]，用现有技术的手段很难除去，该杂质的存在严 重影响西曲瑞克的含量以及使用安全。因此，这种方法制备西曲瑞克容易产生有毒杂质， 不适用于工业化大规模合成西曲瑞克。此外，所述氨基酸偶联反应温度为35-50摄氏度， 氨基酸在这样的高温下，容易发生消旋从而影响产品的光学纯度。
[0009] D-瓜氨酸侧链被乙酰化的[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克杂质的两种可能结构(结构2和 结构3):
[0010] 专利CN104086632A公开了西曲瑞克的另一种Fmoc固相合成方法。该方法包括以 下步骤：1) AM树脂用作初始树脂依次连接N-末端Fmoc保护的氨基酸，以获得全保护的十 肽树脂，其中所述肽序列6-位氨基酸连接使用的Fmoc-D-Orn (Dde)-OH; 2)当偶联完成后， 去除Fmoc保护基团，并进行N-端乙酰化封端；3)用水合肼/N，N-二甲基甲酰胺3:97体 积比的溶液去除D-鸟氨酸侧链Dde保护基；然后加入叔丁基异氰酸酯，将多肽中D型鸟氨 酸转换为瓜氨酸，从而得到全保护的西曲瑞克肽树脂；4)将肽树脂进行三氟醋酸裂解，纯 化，盐交换，并冻干以获得西曲瑞克。采用这种制备方法，[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克杂质的含 量小于0. 1 %。但是，这种方法需要使用Dde保护基的Fmoc-D-Orn (Dde) -OH以及有毒的水 合肼试剂用来除去Dde保护基，并将D-鸟氨酸转化成D-瓜氨酸。此制备工艺复杂，不适用 于工业化西曲瑞克的制备。
[0011] 专利CN104277093A公开了西曲瑞克的一种Fmoc化学和微波加热相结合的固相合 成方法。该方法包括以下步骤：Rink Amide-AM树脂被用作起始原料，并依次加上N-末端 Fmoc保护的氨基酸，以获得全保护的十肽树脂；采用N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基 苯并三氮唑作为偶联剂，偶联反应用微波加热进行；多肽连接完成后使用乙酸酐进行乙酰 化封端；然后进行三氟醋酸树脂切割和侧链脱保护，然后进行三氟醋酸树脂切割和侧链脱 保护，粗肽用反相C18色谱柱纯化并冷冻干燥，得到西曲瑞克。由于此方法也使用了侧链没 有保护基的Fmoc-Cit-ΟΗ，同样无法避免有毒[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克杂质的产生，微波加 热的方法也不适用于工业化制备合成。
[0012] 专利CN101863960B公开了西曲瑞克的一种Boc固相合成方法。该方法包括以下 步骤：使用的Boc氨基酸和Wang树脂为原料，依次连接Boc氨基酸。多肽连接完成后，使用 10%重量比的氨水进行氨解切割，然后使用H2/钯除去侧链保护基以获得粗肽。该粗肽通过 反相C18色谱柱纯化，得到西曲瑞克。此Boc固相合成法采用大量的三氟醋酸除去Boc保 护基以及氨水用于氨解切割，对环境污染大。另外，使用H 2/钯进行侧链脱保护，可能会导 致最终产品的重金属污染。
[0013] 因此，目前迫切需要一种能够避免[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克有毒杂质，且安全高效 和环境污染小的生产方法。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的在于提供一种西曲瑞克的制备方法，主要解决现有固相合成法中有 毒且难分离的D-瓜氨酸侧链被乙酰化的[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克工艺杂质问题，及现有固 相合成法使用有毒试剂从而导致环境污染以及产品中可能有重金属污染的问题。本发明以 最少保护基的原则快速制备，得到理想的合成结果。
[0015] D-瓜氨酸侧链被乙酰化的[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质是一种毒性较大的工艺杂 质，它的产生是由于侧链未受保护的瓜氨酸被用于偶联反应，在最后的多肽封端过程中，瓜 氨酸的侧链也被部分乙酰化。由于[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质有毒并且难以纯化，杂质的 存在极大地影响了产品的安全性和工艺效率。为了避免这种杂质，专利CN104086632A公开 的固相Fmoc法，其中所述肽序列6-位氨基酸偶联使用Fmoc-D-Orn (Dde) -OH。完成多肽连 接和Ac封端以后，用水合肼除去D-鸟氨酸侧链Dde保护基，然后加入叔丁基异氰酸酯把鸟 氨酸转化为瓜氨酸。尽管[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质能够有效地控制在0.1 %以下，但该 方法需要采用侧链Dde保护的鸟氨酸Fmoc-D-Orn (Dde) -OH，完成多肽连接后用有毒的水合 肼试剂去除Dde保护基，并将鸟氨酸转化成为瓜氨酸，此工艺复杂。为此，本发明人重点研 宄如何完全避免产生[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克工艺杂质而不影响西曲瑞克的收率问题。本 专利公开了一种西曲瑞克的制备方法，本方法能够有效避免[D-Cit (Ac)]-西曲瑞克有毒 杂质，且采用最少保护基团策略，环境污染较小。
[0016] 本发明提供了 一种西曲瑞克的固相合成法，通过Fmoc氨基酸的逐个偶联完 成西曲瑞克序列的固相合成。其中最后一个氨基酸采用Ac-D-2Nal-OH。由于使用 Ac-D-2Nal-OH，避免了最后的乙酰化封端。即使使用侧链无保护的Fmoc- D-Cit-OH也可从 根本上避免侧链的乙酰化杂质。本发明工艺既可以采用固相合成也可以采用液相合成。
[0017] 本发明涉及一种制备西曲瑞克的Fmoc固相合成方法，其特征在于包括以下步骤： a)以氨基树脂为固相载体，通过固相合成法依次偶联西曲瑞克序列中相对应的Fmoc-保 护氨基酸，最后一个氨基酸的连接采用Ac-D-2Nal-OH，制备侧链部分保护或全保护的西曲 瑞克肽树脂；b)使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护，得到西曲瑞克粗 肽；c)经纯化、转盐以及冻干得到西曲瑞克。可以在a)步骤中使用肽偶联剂和/或偶联添 加剂。
[0018] 作为优选，所述氨基树脂为Rink Amide树脂，Rink Amide AM树脂，Rink Amide MBHA树脂，或Sieber树脂。
[0019] 作为优选，固相合成中采用侧链无保护的Fmoc-D-Cit-ΟΗ。在固相合成中依次偶 联西曲瑞克序列中相对应的氨基酸，其中氨基酸侧链采用易酸解的保护基，比如以下氨基 酸：：Fmoc-D_Ala-〇H， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-〇H， Fmoc-Leu-OH， Fmoc-D-Cit-OH， Fmoc-Tyr(tBu)-O H， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-D_3Pal-〇H， Fmoc-D-Phe(4_Cl)-〇H， Ac-D-2Nal-OH。
[0020] 最后一个氨基酸的连接采用Ac-D-2Nal-OH以避免乙酰化封端反应及相应的氨基 酸侧链乙酰化副产物。
[0021] 典型的肽偶联剂是以下中的一种或多种：邻（7-氮杂苯并三唑-1-基）-1，1，3， 3_四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)，邻（苯并三唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)，邻（苯并三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲基四氟硼酸脲鑰（TBTU)，六氟磷酸苯并三 唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)鱗（BOP)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷 基鱗（PyBOP)，N，N-双（2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰二氯（BOP-Cl)，六氟磷酸溴-三-吡 咯烷基鱗（PyBroP)，氯甲酸异丁酯（IBCF)，1，3-二环己基碳二亚胺（DCC)，1，3-二异丙 基-碳二亚胺（DIC)，1-(二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（WS⑶I)，N-乙氧基 羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉（EEDQ)，氯甲酸异丙酯（IPCF)，2-(5-降冰片烯-2, 3-二 甲酰亚胺基)-1，1，3,3_四甲基四氟硼酸脲鑰（TNTU)，丙基膦酸酐（PPAA)和2-琥珀酰亚胺 基_1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲鑰（TSTU)。一种优选的偶联剂是1，3_二异丙基-碳二 亚胺（DIC)。
[0022] 典型的肽偶联添加剂是1-羟基-IH-苯并三唑（HOBt), 6-氯-1-羟基-IH-苯 并三唑（6-Cl-H〇Bt)，3-羟基-1，2,3-苯并三嗪-4(3H)_酮（HOOBt)，2-肟氰乙酸乙酯 (Oxyma)，1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt)。
[0023] 优选地在偶联反应中氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的14倍，偶联反应温度为 030 ° C。Ac-D-2Nal-OH偶联反应温度为020 ° C。偶联反应时间优选为0. 54小时。
[0024] 本发明的制备西曲瑞克的固相合成方法中脱去Fmoc优选使用体积比5-30%六氢 吡啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，洗脱时间优选为1530分钟。所用的酸解切割剂为三氟醋 酸溶液，三氟醋酸的比例为80-97%体积比。0 - 30 ° C切肽反应1. 5 - 3小时，过滤， 滤液加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤，干燥，获得西曲瑞克粗品。
[0025] 产物纯化步骤优选采用C18或C8反相柱色谱分离纯化，流动相为0. 05%_0. 5%盐 酸或磷酸或三氟醋酸的水溶液和乙腈溶液，用液相色谱仪跟踪收集所需要的产品馏分，检 测波长为220 nm ;样品峰合并后换盐，冷冻干燥，得到最终的西曲瑞克纯品。
[0026] 在该工艺制备的西曲瑞克粗肽中，未检出[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质。经纯化和 冷冻干燥得到西曲瑞克成品，产品纯度高达99%，收率高达40%。该合成方法可以通过附 图1中的方案表示。
[0027] 本工艺的制备方法采用最少保护基团策略的Fmoc固相合成法，优点在于没有 [D-Cit (Ac)]-西曲瑞克有毒杂质，产品纯度及收率高，操作方法简便，成本较低。对环境污 染少，适于工业化大规模生产西曲瑞克。
[0028] 最终产物的高效液相色谱图见附图2。
【附图说明】 图1为一种西曲瑞克的制备方法。 图2为最终产物的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0029] 西曲瑞克的合成采用从Fmoc Rink酰胺树脂和氨基酸以逐步偶联的固相多肽合成 法进行。
[0030] 实施例1。
[0031] 步骤 I. Fmoc Rink Amide 树脂（3. 0 mmol, 5. I g,取代度 0· 59 mmol/g)置于 一反应器中，用N，N-二甲基甲酰胺（100毫升）溶胀30分钟。悬浮液过滤，将20%哌啶/ N，N-二甲基甲酰胺（100mL)加入到树脂中并搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保 护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，准备用于步骤2偶联。
[0032] 步骤2.将3. Ilg Fmoc-DAla-OH, 1. 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1. 58 mL N, N-二 异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分钟。活 化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到树脂的 反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液 中搅拌30分钟以除去Fmoc。Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗绦，并准 备用于步骤3偶联。
[0033] 步骤 3.将 3. 37 g Fmoc-Pro-OH, 1. 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1. 58 mL N, N-二 异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分钟。活 化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到树脂的 反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液 中搅拌30分钟以除去Fmoc。Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗绦，并准 备用于步骤4偶联。
[0034] 步骤 4.将 6. 48 g Fmoc-Arg (Pbf)-OH, 1. 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1. 58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤5偶联。
[0035] 步骤 5.将 3. 53 g Fmoc-Leu-OH, L 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 L 58 mL N, N-二 异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分钟。活 化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到树脂的 反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液 中搅拌30分钟以除去Fmoc。Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗绦，并准 备用于步骤6偶联。
[0036] 步骤 6.将 3.97 g Fmoc-D-Cit-OH, 1.35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1.58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行I - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分 钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤 7偶联。
[0037] 步骤 7.将 4.59 g Fmoc-Tyr(tBu)-〇H, 1.35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1.58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤8偶联。
[0038] 步骤 8.将 3. 83 g Fmoc-Ser(tBu)-〇H, L 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 L 58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤9偶联。
[0039] 步骤 9.将 3.88 g Fmoc-D3Pal-OH, 1.35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 1.58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树 脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤10偶联。
[0040] 步骤 10.将 2. 53 g Fmoc-D4Cpa-OH, L 35 g 1-羟基苯并三氮唑，和 L 58 mL N，N-二异丙基碳化二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0 - 10摄氏度活化20分 钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，然后2. 2 mL N-甲基吗啡啉也被加入到 树脂的反应器中。偶联反应进行1 - 4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬 浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20%哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc。 Fmoc去保护后，将树脂用N，N-二甲基甲酰胺彻底洗 涤，并准备用于步骤11偶联。
[0041] 步骤11.在步骤10得到的肽树脂中（340 mg，0.1 mmol)加入Ac-D-2Nal-OH (78 mg，0. 3 mmol)和1-羟基苯并三氮挫（41 mg，0. 3 mmol)的N, N-二甲基甲酰胺溶液。然后 加入N，N-二异丙基碳化二亚胺（47微升，0.3 mmol)，偶联反应在0 - 5摄氏度下进行1 -4小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤五 次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，该树脂然后进行三氟醋酸切割。
[0042] 三氟醋酸切割及侧链去保护：将干燥后的肽树脂悬浮在三氟醋酸切割液中三氟 醋酸：水（95:5，10 ml/g树脂），在室温下切割2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中 沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。粗肽的产率为89. 4%，高效液相色 谱纯度为81. 8%。通过高效液相色谱分析在粗产物中未检测到[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂 质。
[0043] 纯化，盐交换：将西曲瑞克粗肽溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系 C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。
[0044] 冻干：盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸西曲瑞克产物 (最终产物的高效液相色谱见附图2)。最终产品的纯度为99%，收率为40%。
[0045] 实施例2。
[0046] 按实施例1中步骤1至步骤10的方法合成九肽树脂，然后连接Ac-D-2Nal_0H。
[0047] 在步骤 10 得到的九肽树脂中（340 mg，0.1 mmol)加入 Ac-D-2Nal-OH (78 mg，0. 3 mmol)和邻（7-氮杂苯并三唑-1-基)-l，l，3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU) (114 mg，0. 3 mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液。然后加入N，N-二异丙基乙胺（52微升，0.3 mmol)，偶联 反应在0 - 5摄氏度下进行1 - 4小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过 滤并用N，N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，该树脂然后进行三 氟醋酸切割。
[0048] 三氟醋酸切割：将干燥后的肽树脂悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸：水 (95:5，10 ml/g树脂），在室温下切割2. 5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗 肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。粗肽的产率为83. 1%。通过高效液相色谱分析 在粗产物中未检测到[D-Cit(Ac)] -西曲瑞克杂质。
[0049] 纯化，盐交换：将西曲瑞克粗肽溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系 C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。
[0050] 冻干：盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸西曲瑞克产物。 最终产品的纯度为99 %，收率为36 %。
【主权项】
1. 一种制备西曲瑞克的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：a)以氨基树脂为 固相载体，通过固相合成法依次偶联西曲瑞克序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，最后一 个氨基酸的连接采用Ac-D-2Nal-0H，制备得到侧链部分保护或全保护的西曲瑞克肽树脂； b)使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护。2. 根据权利要求1所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于在a)步骤中使用肽偶联 剂和/或偶联添加剂。3. 根据权利要求1至2之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于该方法还包括对 产物的纯化步骤。4. 根据权利要求1至3之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于固相合成中采用 了侧链无保护的Fmoc-D-Cit-OH。5. 根据权利要求1至4之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于固相 合成法依次偶联的氨基酸为：Fmoc-D-Ala-〇H，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg (Pbf)-OH， Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Cit-〇H, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-D-3Pal-〇H, Fmoc-D-Phe(4-C1)-OH，Ac-D-2Nal-OH。6. 根据权利要求I至5之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于所述偶联反应中 氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的1 一 4倍，偶联反应温度为0 - 30 °C。7. 根据权利要求1至6之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于固相合成中 Ac-D-2Nal-0H偶联反应温度为0 - 20 °C。8. 根据权利要求2至7之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于肽偶联剂是以 下中的一种或多种：邻（7-氮杂苯并三唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)， 邻（苯并三唑-1-基）_1，1，3,3_四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU)，邻（苯并三唑-1-基）-1， 1，3, 3-四甲基四氟硼酸脲鑰（TBTU)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基） 鱗（B0P)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基鱗（PyBOP)，N，N_? (2-氧 代-3-噁唑烷基）膦酰二氯（BOP-Cl)，六氟磷酸溴-三-吡咯烷基鱗（PyBroP)，氯甲酸异 丁酯（IBCF)，1，3_二环己基碳二亚胺（DCC)，1，3_二异丙基-碳二亚胺（DIC)，1-(二甲基 氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（WS⑶I)，N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉 (EEDQ)，氯甲酸异丙酯（IPCF)，2-(5-降冰片烯-2, 3-二甲酰亚胺基)-1，1，3, 3-四甲基四氟 硼酸脲鑰（TNTU)，丙基膦酸酐（PPAA)和2-琥珀酰亚胺基_1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲 鑰（TSTU);肽偶联添加剂选自1-羟基-IH-苯并三唑（HOBt), 6-氯-1-羟基-IH-苯并三唑 (6-(：1-1108〇，3-羟基-1，2,3-苯并三嗪-4(311)-酮〇1008〇，2-肟氰乙酸乙酯（(^ 7111&)， 1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt);-种优选的偶联剂是1，3-二异丙基-碳二亚胺（DIC)， 偶联反应时间为0. 5 - 4小时。9. 根据权利要求1至8之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于脱去Fmoc使用体 积比5-30%六氢吡啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，洗脱时间为15 - 30分钟。10. 根据权利要求1至9之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于步骤b)中所述 的酸解切割剂为三氟醋酸的溶液，三氟醋酸的比例为80-97%体积比；0 - 30 °C切肽反 应1. 5 - 3小时，过滤，滤液加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤，干燥，获得西曲瑞克粗 品。11. 根据权利要求3至10之一所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于产物纯化步骤 采用C18或C8柱色谱分离纯化，流动相为0. 05%-0. 5%盐酸或磷酸或三氟醋酸的水溶液和 乙腈溶液，用液相色谱仪跟踪收集所需要的产品馏分，检测波长为220nm;样品峰合并后 换盐以及冷冻干燥得到醋酸西曲瑞克。12. 根据权利要求1至11所述的制备西曲瑞克的方法，其特征在于该方法合成的西曲 瑞克中不含[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质。13. -种制备西曲瑞克可药用盐的方法，其特征在于按照权利要求1至12之一所述的 方法制备西曲瑞克，之后将其制成可药用盐。14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述的西曲瑞克可药用盐为醋酸西曲瑞 克。15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于通过对所述的西曲瑞克进行醋酸转盐， 冻干，获得醋酸西曲瑞克。
【专利摘要】本发明公开了一种西曲瑞克的固相合成方法，该方法完全避免了D-瓜氨酸侧链乙酰化的[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克有毒杂质。本发明方法以氨基树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次连接西曲瑞克序列中相对应的Fmoc-氨基酸，经缩合反应及脱保护反应，得到全保护西曲瑞克肽树脂；再进行酸解切割和乙醚沉降，得到西曲瑞克粗肽；经色谱纯化、醋酸转盐以及冷冻干燥得到醋酸西曲瑞克。本发明选用Ac-D-2Nal-OH作为最末位氨基酸的连接，以避免乙酰化封端。本发明工艺既可以采用固相合成也可以采用液相合成，工艺副产物少，易于分离纯化。所得最终的醋酸西曲瑞克产物纯度高达99％，收率高达40％，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
【IPC分类】C07K7/23, C07K1/06, C07K1/04
【公开号】CN104892732
【申请号】CN201510332163
【发明人】李湘, 徐琪, 魏忠勇
【申请人】中肽生化有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
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