植物耐逆性相关蛋白GmNF-YA15及其编码基因和应用
植物耐逆性相关蛋白GmNF-YA15及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YA15及其编 码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此，了解大豆对逆 境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及品种改良的 重要任务之一。
[0003] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生 物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
[0004] 在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平 上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱 导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因 的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁 迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋 白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等）合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物； 第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白 激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
[0005] 转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发 生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活 或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控 区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等 作用的影响。
[0006] 目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯应答兀件结合蛋白，ethylene responsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP (basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF (CCAAT binding factor)类转 录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇（Trp cluster)的MYB家族。这些转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其 它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。NF-Y是一类结合顺 式作用元件CCAAT-box的转录因子，特异的识别并结合许多真核生物组成型、诱导性和细 胞周期依赖性基因的启动子或增强子中的顺式作用元件CCAAT-box，进而在转录水平调 控这些基因的表达。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个不同亚基组成的杂合三聚体。 NF-YB和NF-YC的组蛋白折叠基序（HFM)相互作用使之形成二聚体，然后结合NF-YA形成 异源三聚体的NF-Y复合物，从而结合CCAAT-box，调节其靶基因的转录。NF-YA至少有两 个结构域用于蛋白质的结合：富含谷氨酰胺的结构域（Q-rich domain)和一个亚基相互作 用的结构域（subunit interaction domain)。NF-YB也有两个蛋白结合的结构域：组蛋白 折叠基序（histone-fold motif)和 TATA 结合蛋白（TATA-binding protein)结合结构域 (TBP-binding domain)。NF-YC有三个蛋白质的结合结构域：组蛋白折叠基序，TBP结合结 构域以及富含谷氨酰胺的结构域。NF-YA和NF-YC的结构氨基酸序列与组蛋白折叠基序同 源，NF-YB与H2B组蛋白折叠基序相关，而NF-YC于H2A组蛋白折叠基序相关，该基序由三 个α螺旋和两个环组成，负责H2A/H2B二聚体的形成。
[0007] 目前，在植物中关于NF-Y转录因子的功能的报道较少，都在干旱胁迫中起重要的 作用（Nelson et al，2007XNelson等认为，与拟南芥AtNF-YBl转录因子同源的ZmNF-YB2， 在缺水的条件下过表达ZmNF-YB2的转基因玉米可以明显增强抗旱性，由于ZmNF-YB2可 以是多个与植物干旱有关参数发生改变，包括叶绿素含量、气口导度、叶片温度、减少萎 蔫和维持光合作用，从而提高抗旱性（Nelson, Peter P. Repetti, Tom R. Adams, Jingrui Wu, 2007)。Wen-Xue Li, Youko Oono等的研究证实，AtNF_YA5的表达受到干旱和ABA处理 的诱导。对其启动子GUS分析表明部分诱导反应发生在转录水平。NF-YA5有一个靶位点 miR169,在干旱条件下，miR169表达受到抑制。NF-YA5在微管组织和保卫细胞有很高的表 达，因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已 经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmNF_YA15及其编码基因。
[0009] 本发明提供的蛋白质，为结合CCAAT-box的核转录因子蛋白，名称为GmNF_YA15， 来源于大豆属大豆（Glycine max L·)，是如下（a)或（b):
[0010] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0012] 序列表中序列1的氨基酸残基序列是由217个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基 端第123 - 148位氨基酸残基序列为与NFYB/C互作区域，自氨基端第162 - 188位氨基酸 残基序列为可能的核定位信号区，自氨基端第123 - 183位氨基酸残基序列为保守的NF-YA 结构域。
[0013] 为了使a)中的GmNF_YA15便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0014] 表1.标签的序列
[0015]
[0016] 上述1)中的GmNF-YA15可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 至|J。上述1中的GmNF-YA15的编码基因可通过将序列表中序列2的自Y末端第150-803 位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱 基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0017] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0018] 上述DNA分子，为如下1) -5)中任一种DNA分子：
[0019] 1)编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子；
[0020] 2)编码区为序列2自5'末端第147至803位核苷酸所示的DNA分子；
[0021] 3)编码区为序列2自5'末端第150至803位核苷酸所示的DNA分子；
[0022] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性和/或抗氧 化性相关蛋白的DNA分子；
[0023] 5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性和/或抗 氧化性相关蛋白的DNA分子。
[0024] 上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 I X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0025] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0026] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体，得到表达上述蛋白质的载体。
[0027] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基 因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非 翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前 可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉 米的泛素启动子（Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使 用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这 些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读 框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于 对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在 植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因 (如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆 境筛选转化植株。
[0028] 在本发明的实施例中，表达载体为YEP-GAP，对应的重组载体为 YEP-GAP-GmNF-YA15，YEP-GAP-GmNF-YA15为将上述DNA分子插入YEP-G AP的多克隆位点得 到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第150至803位核苷酸所示的DNA片段插 入YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组载体；
[0029] 表达载体为 pBI121，对应的重组载体为 pBI121-GmNF-YA15，pBI121-GmNF-YA15 为 将上述DNA分子插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5' 端第150至803位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的Sma I和SacI酶切识别位点之间 得到的重组载体。
[0030] 扩增上述DNA分子或其任意片段的引物对。
[0031] 所述引物对为 GmNF-YA15-BI 和 GmNF-YA15-XI 或 GmNF-YA15-121F 和 GmNF-YAl5-12IR ：
[0032] GmNF-YA15-BI :5'-CGCGGATCCATGGTTTGGACAGTGT-3'
[0033] GmNF-YA15-XI :5'-CCGCTCGAGTTAGGATGCCCTATCT-3'
[0034] GmNF-YA15-121F :5'-TCCCCCGGGATGGTTTGGACAGTGTTACGTG-3' ；
[0035] GmNF-YA15-121R :5'-GCCGAGCTCTTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；
[0036] 上述的蛋白质、上述的DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组 菌在调节植物耐逆性或调节植物抗氧化性中的应用也是本发明保护的范围。
[0037] 上述应用中，所述调节植物耐逆性为提高植物耐逆性；所述调节植物抗氧化性为 提高植物抗氧化性；
[0038] 上述应用中,所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；
[0039] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0040] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0041] 本发明提供的方法，是将上述DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转 基因植物的耐逆性和/或抗氧化性高于所述目的植物。
[0042] 上述方法中，上述DNA分子通过上述重组载体导入所述目的植物；
[0043] 所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；
[0044] 所述耐盐性体现在NaCl胁迫下，所述转基因植物的主根长度大于所述目的植物；
[0045] 所述耐旱性体现在PEG胁迫下，所述转基因植物的主根长度大于所述目的植物；
[0046] 所述抗氧化性体现在H2O2胁迫下，所述转基因植物的主根长度大于所述目的植 物。
[0047] 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0048] 上述蛋白作为转录因子的应用也是本发明保护的范围。
[0049] 本发明的实验证明，本发明从大豆中克隆得到基因 GmNF_YA15,其在甘露醇、 盐、旱、双氧水和ABA的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞质中，可以特异的调控含有 CCAAT-box顺式元件(核心序列：CCAAT)的基因的转录表达，且本发明的GmNF-YA15可以提 高植物的耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和 耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
【附图说明】
[0050] 图1为GmNF-YA15与拟南芥氨基酸AtNF-YA5氨基酸序列的同源性比对结果
[0051] 图2为GmNF-YA15受胁迫诱导表达的荧光实时定量（Real-time) PCR图谱
[0052] 图3为GmNF_YA15在洋葱表皮细胞中的定位结果
[0053] 图4为分子检测在转基因拟南芥中的目的基因
[0054] 图5为野生型拟南芥和转GmNFYA-15拟南芥抗盐性、抗旱性与抗氧化性比较。
【具体实施方式】
[0055] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0056] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0058] 实施例1、基因 GmNF-YA15的获得
[0059] 一、基因 GmNF-YA 15 的获得
[0060] 将沙土中生长20天左右的大豆铁丰8号（国家种质资源库，编号ZM242 ;记载在如 下文献中：王彩洁，孙石，吴宝美，常汝镇，韩天富.20世纪40年代以来中国大面积种植大 豆品种的系谱分析。中国油料作物学报。2013,35(3):246 - 252,公众可从中国农业科学 院作物科学研究所获得）四叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80°C保存备用。采用 Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。第一链 cDNA 合 成用反转录酶XL (AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳 检测。
[0061] 通过5' RACE和3' RACE的方法获得大豆CCAAT-box的核转录因子C族基因全长 序列序列表中的序列2。
[0062] 该序列表中序列2所示的基因命名为GmNF_YA15,其开放阅读框架为自序列表的 序列2的5'端第150位到803位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为GmNF-YA15,该蛋白的 氨基酸序列为序列表中的序列1，序列1由218个氨基酸残基组成，具有保守的组蛋白折叠 基序。
[0063] 上述序列2也可以通过人工合成。
[0064] GmNF-YA15的序列在Genabnk上进行比对，与拟南芥中的蛋白AtNF-YCll具有较高 同源性（图1)，而在大豆中未发现同源蛋白，证明GmNF-YA15蛋白是一个新的蛋白。
[0065] 二、实时荧光定量PCR分析GmNF-YA15的表达特性
[0066] 1、胁迫处理
[0067] 苗龄为10天的铁丰8号幼苗，进行以下处理：
[0068] (1)干旱处理（图2A):将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤 纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速 冻，-80°C保存备用。
[0069] (2)高盐处理（图2B):将大豆幼苗置于200mM的由NaCl溶液中，光照培养30分 钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80°c保存 备用。
[0070] (3)高温处理（图2C):将大豆幼苗置于42°C下，光照培养30分钟、1小时、2小时、 5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0071] (4)脱落酸处理（图2D):将大豆幼苗置于100 μ M的脱落酸（ABA)溶液中，光照培 养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备 用。
[0072] (5)低温处理（图2E):将大豆幼苗置于4°C培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小 时、5小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0073] (6)双氧水处理（图2F):将小麦幼苗置于20mM的双氧水溶液中，光照培养30分钟、 1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻后一 80°C保存备用。
[0074] (7)伤害处理（图2G):将大豆幼苗用剪刀减去叶子顶端，光照培养30分钟、1小时、 2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0075] (8)甘露醇处理（图2H):将大豆幼苗置于300mM的甘露醇（Mannitol)溶液中，光 照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保 存备用。
[0076] (9)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗_80°C冻存作为对照（0小时)。
[0077] 2、mRNA 的分离
[0078] 将上述各处理的大豆幼苗米用Quikprep Micro mRNA Purif ication Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。
[0079] 3、反转录为cDNA
[0080] 将纯化的mRNA反转录为cDNA。
[0081] 4、实时荧光定量PCR
[0082] 将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因特异引物对 (Q-RT-GmNF-YA15F ：5'-GTCAATGTACAGTATGCAGCACC-3' ；Q-RT-GmNF-YAI5R ： 5' -TGATTTGTCAGCTGATGCCA-3'）对样品进行Q-RT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应 答情况，以 actin (Q-RT-ActinF :5'-ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT-3' ；Q-RT-Q-RT-ActinR: 5' -CTGTTGGAAGGTGCTGAG-3'）做内参。Q-RT-PCR 在ABl PRIStf 7000 实时荧光定量 PCR 仪 上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)报道的方法， 即计算相对表达量。
[0083] Δ Δ Cj ( xarget Ct. Actin) Time x ^ ^T. Target 〇Τ· Actin) TimeO
[0084] Time x表示任意时间点，Timetl表示经actin校正后I倍量的目标基因表达。
[0085] 结果见图2,在干旱处理下，GmNF-YA15的表达量随着脱水时间的延长而逐渐变 高，至脱水处理2h表达量达到对照的2. 3±0. 33倍，至脱水处理12h表达量达到对照的 8. 03±0. 78倍，至脱水 处理24h表达量又开始下调，见图2A。在高盐处理下，GmNF-YA15的 表达量在处理2h时，表达量瞬时表达到对照的8. 2±0. 33倍，之后表达量又瞬时下调，见图 2B〇
[0086] 在高温处理下，GmNF-YA15的表达量随着高温时间的延长缓慢变高，至处理12h表 达量达到对照的2. 2±0. 30倍，之后表达量又开始慢慢下调，见图2C。
[0087] 在激素 ABA处理下，GmNF-YA15的表达量无显著的变化趋势，见图2D。
[0088] 在低温处理下，GmNF-YA15的表达量持续缓慢下调，见图2E。
[0089] 在双氧水处理下，GmNF-YA15的表达量在0. 5h瞬时表达到对照的7. 2±0. 37倍， 之后表达量又瞬时下调，在2h表达量达到对照的10. 4±0. 31倍，之后表达量又稍微下调， 见图2F。
[0090] 在伤害处理下，GmNF-YA15的表达量在处理Ih时，表达量瞬时表达到对照的 0. 19±0. 13倍，之后表达量又缓慢上调，到12h时，恢复到最初表达水平，见图2G。
[0091] 在甘露醇处理下，GmNF-YA15的表达量在处理5h时，表达量瞬时表达到对照的 4. 2±0. 23倍，在处理24h时，表达量瞬时表达到对照的6. 4±0. 36倍，表达量持续缓慢上调 趋势，见图2H。二、GmNF-YA15亚细胞定位分析
[0092] 1、材料准备：
[0093] 在9cm培养皿上铺一薄层MS培养基，撕下后内表面朝上，平铺于MS培养基中心， 直径在3cm范围内，25°C预培养4h。
[0094] 2、金粉的处理：
[0095] 取IOOmg直径为I. 0 μ M的金粉放入I. 5ml离心管中，加入1ml无水乙醇，充分振 荡3min，以12000rpm离心Imin,去上清，再加入1ml无菌水充分混匀后，以12000rpm离心， 重复上述步骤3次。最后，将金粉悬浮于Iml超纯水中，一 20°C保存备用。
[0096] 3、亚细胞定位重组载体的构建
[0097] ①根据GmNF-YA15基因的序列设计引物GmNF-YA15-BI和GmNF-YA15-XI，引物末端 分别引入PstI和BamHI酶切位点。
[0098] GFP-GmNF-YA15F :5' -AAACTGCAGATGGTTTGGACAGTGT-3'
[0099] GFP-GmNF-YA15R :5' -CGCGGATCCGGATGCCCTATCTGAT-3'。
[0100] ②用限制性内切酶PstI和BamHI酶切步骤1回收的PCR扩增产物，回收669bp的 酶切产物；用限制性内切酶PstI和BamHI酶切表达载体16318GFP，回收大约4kbp的载体 骨架；
[0101] ③将步骤②的酶切产物和步骤的载体骨架连接；
[0102] ④将步骤③的连接产物冻融法转化大肠杆菌菌株(购自Tiangen公司），37°C过夜 培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序；
[0103] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第150-800位核苷酸所示 的DNA片段插入载体16318GFP的PstI和BamHI酶切位点之间得到的重组载体，命名为 16318GFP-GmNF-YA15。
[0104] 4、制备微粒子弹：
[0105] 3 μ g重组质粒DNA( 16318GFP-GmNF-YA15与16318GFP空载体)分别单独加入直径 为 I. 0 μ M 的金粉悬液 6 μ l(50mg/ml)，0· IM 亚精胺（spermidine)4 μ 1，2· 5M CaCl26 μ 1，将 金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。 12000rpm离心IOs (指转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μ 1无水乙醇，粗振荡 后(打散金粉）12000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20 μ 1无水乙醇悬浮沉淀，点膜。
[0106] 5、基因枪轰击受体材料：
[0107] ①选用一定压力的可裂膜(本实验用llOOpsi)，与轰击膜一起，在70%的酒精中浸 泡1~2h，取出晾干；
[0108] ②金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；
[0109] ③取20 μ 1上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不 要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上； [0110] ④将上述载体固定圈安装到发射装置上；
[0111] ⑤将可裂膜安装到气体加速管下端；
[0112] ⑥将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；
[0113] ⑦抽真空指针到26In/Hg ;
[0114] ⑧放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破 开；
[0115] ⑨气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合 体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；
[0116] ⑩将轰击好的洋葱表皮细胞放入25°C培养箱中，暗培养16~24h后在激光共聚焦 显微镜下观察。
[0117] 6、洋葱表皮细胞镜检：
[0118] 将基因枪轰击、暗培养16_24h之后的洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微 镜（Bio-Rad MicroRadiance) (Laser scanning confocal microscopy, LSMC)观察 GFP (绿 色荧光蛋白）荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex=488nm，Em=525±15nm， Power=10%，Zoom7,中速扫描，Frame512X512。软件为 ??ΜΕ-COURSE 和 PH0T0SH0P5. 0。
[0119] 结果如图3所示，A :GmNF-YA15定位于细胞核中；B :16318hGFP空载体对照定位于 细胞膜与核中。
[0120] 实施例2、GmNF-YA15作为转录因子中的应用
[0121] 用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如下：将CCAAT顺式作用 元件和突变体CCAAT顺式作用元件分别构建到pHISi-Ι载体和pLacZi载体的基本启动子 Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因（His3、LacZ和URA3)。当连 接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP (不含激活功能)分别转化到连有CCAAT 顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体CCAAT顺式作 用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的CCAAT顺式作用元件的酵母细胞 中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能， 激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激 活功能。
[0122] 表达载体YEP-GAP:中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文 献 Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Two transcription factors, DREBland DREB2, with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively, in Arabidopsis, Plant Celll998Aug;10(8):1391-1406。
[0123] Yro液体培养基：细菌培养用酵母抽提物（BactO-Yeast Extract) 10g/L，细菌培 养用胰化蛋白胨（Bacto-Peptone) 20g/L，调节pH至5. 8,121°C /15min灭菌，降至60°C以 后加入40%的Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0124] SD/HisYUraVTrp-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源（Yeast nitrogen base) 6.7g/L，营养缺陷型混合物（drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml，琼脂粉 (Bacteriological agar)20g/L，调节 pH 至 5. 8,121°C /15min 灭菌，降至 60°C后加入 40% Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0125] 营养缺陷型混合物（Drop-out mix) : (10X ) :L_Isoleucine (异亮氨酸）300mg/L， L-Valine (纟颜氨酸)1500mg/L，L-Adenine (腺噪呤)200mg/L，L-Arginine (精氨酸)200mg/L, L-Histidine Hcl monohydrate (组氨酸)200mg/L，L-Leucine (亮氨酸）1000mg/L，L-Lysine Hcl (赖氨酸）3〇Omg/L，L-Methionine (甲硫氨酸）2〇Omg/L，L-Phenylalanine (苯丙氨酸） 500mg/L，L-Threonine (苏氛酸）2000mg/L，L-Tyrosine (酿氛酸）300mg/L。
[0126] lXPEG/LiAc ：50% PEG33508ml, IOXTE bufferlml, 10XLiAclml0
[0127] IOXTE Buffer :100mM Tris-Hcl, IOmM EDTA、pH=7. 5,121°C高压灭菌，室温保存。
[0128] ΙΧΤΕ/LiAc :10XTE bufferlml，lOXLiAclml，ddH208ml。
[0129] Z Buffer =Na2HPO4 · 7H2016. lg/L, NaH2PO4 · H205. 5g/L, KC10. 75g/L, MgSO4 · 7H200. 246g/L，调节 pH 至 7. 0，121°C /15min 灭菌，4°C保存。
[0130] X-gal 储存液（X-gal Stock Solution):用 N, N-dimethyl-formamide (DMF)溶解 X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20°C贮存。
[0131] 含有 X-gal 的 Z buffer 缓冲液 100ml (Z buffer with X-gal)，现用现配： Z buffer98ml, β-疏基乙醇（β-mercaptoethanol) 0.27ml，X-gal 储存液（X-gal stocksolution) L 67ml〇
[0132] IOXLiAc :100Mm Tris-Hcl, IOOmM EDTA，pH=7. 5。121°C高压灭菌、室温保存。
[0133] 一、重组载体的构建
[0134] I、GmNF-YA 15 基因的获得
[0135] 根据GmNF-YA15基因的序列设计引物GmNF-YA15-BI和GmNF-YA15-XI，引物末端分 别引入BamHI和XhoI酶切位点。
[0136] GmNF-YA15-BI :5'-CGCGGATCCATGGTTTGGACAGTGT-3'
[0137] GmNF-YA15-XI :5'-CCGCTCGAGTTAGGATGCCCTATCT-3'
[0138] 以大豆品种铁丰8号的整个植株的cDNA为模板，用引物GmNF-YA15-BI和 GmNF-YA15 - XI 进行 PCR 扩增。
[0139] 得到672bp左右的PCR扩增产物。
[0140] 回收PCR扩增产物。
[0141] 2、重组载体的构建
[0142] ①用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切步骤1回收的PCR扩增产物，回收672bp的 酶切产物；
[0143] ②用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切表达载体YEP-GAP，回收的载体骨架；
[0144] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0145] ④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(购自Clontech公司），37°C过夜培 养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序；
[0146] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第150-803位核苷酸所示 的DNA片段插入载体YEP-GAP的BamHI和Xho I酶切位点之间得到的重组载体，命名为 YEP-GAP-GmNF-YA15〇
[0147] 二、GmNF_YA15的体内结合特异性和激活特性的验证
[0148] 1、酵母报道子的构建
[0149] (1)正常双重酵母报道子的构建
[0150] DNA 片段 A (含 4 个 CCAAT 元件）：
[0151] 5' -GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3' 。
[0152] 将 DNA 片段 A 构建到 pHis-1 载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司）的Pminms3启动子上游，得到重组载体pHis-1-CCAAT，用Xho I和Nco I内切酶将 pHi s-1-CCAAT载体切成线状。
[0153] 将 DNA 片段 A 构建到 pLacZi 载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司）PCTa启动子上游，得到重组载体pLacZi-CCAAT，用Xho I和Nco I内切酶分别将 PLacZi-CCAAT载体切成线状。
[0154] 先将线状pHis-1-CCAAT载体转化到酵母细胞（YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech公司）内，获得能在SD/Hisl咅养基上正常生长的酵母转化子 (Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复CCAAT 元件的线状PLacZi-CCAAT载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His_/Ura_培养基 上，选择获得含有PHis-I-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报道子。
[0155] (2)突变体双重酵母报道子的构建
[0156] DNA 片段 B (含 4 个 CCAAT 元件的突变体 TTTTA) : 5 ' -GAATTC-TTTTA-TTTTA-TTTTA-TTTTA-GTCGAC-3' 。
[0157] 用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤（1)，得到突变体双重酵母报道子。
[0158] 2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析
[0159] ⑴分别接种上述1获得的含有pHis-1-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报 道子和突变体双重酵母报道子到Iml YH)液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬 浮液转至含有50ml YH)液体培养基的三角瓶中，30°C /250rpm摇过夜，测0D600=1. 7-1. 8 (计数约4X107个/mL);
[0160] ⑵取30ml步骤（1)过夜培养物接到300ml新鲜的YH)培养基中，30°C /250rpm培 养，约3小时（至0D600=0. 5±0. 1)，室温1000 g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积 I X TE 悬浮，1000g/5min 离心；
[0161] ⑶吸弃上清，用I. 5ml新鲜配制的ΙΧΤΕ/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；
[0162] ⑷取出0.1 ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0. 1 μ g由一制备的重组载 体 YEP-GAP-GmNF-YA15、0.1 mg ssDNA (鲑鱼精 DNA，SiTaa)、0. 6mlPEG/LiAc 高速振荡 1 分 钟，30°C /200rpm振荡培养30分钟；
[0163] (5)加入70ul DMSO (siTaa#D8779)，轻轻倒置混匀，42°C热激30分钟，其间轻轻振 荡，冰浴2分钟，室温1000 g离心5min ;
[0164] (6)吸弃上清，加入0· 5mllXTE buffer悬浮细胞；
[0165] (7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、15mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp -选择 性培养基上画线培养。
[0166] (8)平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以 便做对照分析。
[0167] ⑶颠倒放置于培养箱中，30〇C培养3 - 4天。
[0168] (1Φ结果发现在0mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp_的培养基平板上正常的酵母 报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/ L3-AT的SD/HiS_/Ura7Trp_的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母 报道子被抑止没有生长。
[0169] 3、半乳糖苷酶活性检测
[0170] ⑴从0mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp_的培养基平板上分别挑取正常的酵母报 道子和突变的酵母报道子菌落。转至Yro液体培养基中，于3〇°c振荡培养，待长至对数生长 后期，取I. 5ml菌液，3000rpm离心30s ;
[0171] ⑵弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻lOmin，取出使其自然融解，加 50ul Z/X-gal溶液，30°C温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母 报道子在12h内没有变化，仍为白色。
[0172] 说明转录因子GmNF_YA15能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了 GmNF-YA15的体内结合特异性和激活功能， GmNF-YA15为转录因子。
[0173] 实施例3、GmNF_YA15在提高植物的耐逆性中的应用
[0174] 一、转GmNF_YA15拟南芥的获得
[0175] 1、重组载体的构建
[0176] I) GmNF_YA15 基因的克隆
[0177] 根据 GmNF-YA 15 基因的序列设计引物对（GmNF-YA15-12IF 和 GmNF-YA15-121R)，弓 I 物末端分别引入Sma I和SacI酶切识别位点，
[0178] GmNF-YA15-121F :5'-TCCCCCGGGATGGTTTGGACAGTGTTACGTG-3' ；
[0179] GmNF-YA15-121R :5'-GCCGAGCTCTTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；
[0180] 以大豆属大豆（Glycine max L.)(铁丰8号）cDNA为模板，用GmNF-YA15-121F和 GmNF-YA15-121R进行PCR扩增，得到大小约IKb的PCR产物（GmNF-YA15基因）。
[0181] 回收上述PCR产物。
[0182] 2)、重组载体的构建
[0183] ①用限制性内切酶Sma I和SacI酶切步骤1回收的PCR产物，回收672bp酶切产 物；
[0184] ②用限制性内切酶sma I和SacI酶切pBI121 (Clontech公司购买)，回收672bp 载体骨架；
[0185] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0186] ④将步骤③的连接产物电击转化TOPlO菌株(购自北京天根公司)，37°C过夜培养， 挑取阳性克隆提取质粒进行测序。
[0187] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第150-803位核苷酸所示 的DNA片段插入载体pBI121的Sma I和SacI酶切位点之间得到的重组载体，命名 为 pBI12I-GmNF-YAl5。
[0188] 3、重组农杆菌的获得
[0189] 用重组质粒pBI121-GmNF-YA15基因转化农杆菌C58C1 (北京拜尔迪生物 技术公司购买)，得到重组农杆菌C58Cl/pBI121-GmNF-YA15 (提取质粒送去测序，为 pB1121-GmNF-YA 15，则含有该质粒的重组菌为阳性)。
[0190] 4、转GmNF-YA15拟南芥获得
[0191] 1)将3得到的重组农杆菌接种于LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉 素，50mg/ml庆大霉素）液体培养基中，28°C、3000rpm培养约30小时，得到菌液；
[0192] 2)将菌液转至LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素 ，50mg/ml庆大霉素） 中，28°C、300rpm培养约14小时(菌液0D600达到1.5-3. 0);
[0193] 3)收集菌体，4 °C、4000g离心10min，用含10%蔗糖MS液体培养基(含 0· 02%silwet)稀释至 0D600 约为 0· 8-1. O ;
[0194] 4)将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-O, SALK公司购买，也称为野生型拟南芥）整株 与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆， 侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养， 收获T 1代种子，卡那霉素筛选(浓度为50 μ g/L卡那霉素)阳性植株为T1代再生植株，传代， 直到得到T3代再生植株。
[0195] T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T 2代自交产生的 种子及由它所长成的植株。
[0196] 提取T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用引物对： F: 5' -ATGGTTTGGACAGTGTTACGTG ;R: 5' -TTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；进行 PCR 扩增，部分 样本结果如图4A所示，P为Plasmid, M为Marker, C为哥伦比亚生态型拟南芥Col-0, L1-L3 为T3代再生植株，H为H2O ;得到654bp为阳性。
[0197] 提取T3代再生植株的整个植株的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用引物对： F: 5' -ATGGTTTGGACAGTGTTACGTG ;R: 5' -TTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；进行 PCR 扩增。
[0198] 部分样本的结果见图4B，P为Plasmid, M为Marker, C为哥伦比亚生态型拟南芥 Col-0, L1-L3为T3代再生植株，H为H2O ;得到大小为915bp片段的为阳性。
[0199] 上述DNA和cDNA水平上鉴定均为阳性的即为T3代转GmNF-YA15拟南芥。
[0200] 采用同样的方法将质粒pBI121转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，培育 获得T 3代转空载体拟南芥，采用同样的方法鉴定，未得到915bp片段。
[0201] 二、转基因植物的耐逆性鉴定
[0202] 1、耐盐性鉴定
[0203] 分别将 T3 代转 GmNF-YA15 拟南芥株系 GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、 T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥(各60株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果 取平均值。
[0204] 为评价过表达GmNF_YA15因植株种子苗期耐盐性的效果。
[0205] 将 T3 代转 GmNF-YA15 拟南芥株系 GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、T3 代 转空载体拟南芥和野生型拟南芥(WT)种子萌发4d后挑取生长状态一致的幼苗（图5A)，转 移到含有150mM NaCl的1/2MS培养基上坚直培养14天，观察表型、拍照并统计主根长。
[0206] 照片见图5B。
[0207] 野生型拟南芥Col-O的主根长为3. 62cm ;
[0208] GmNF-YA15-l 的主根长为 5. 80cm ;
[0209] GmNF-YA15-2 的主根长为 5. 82cm ;
[0210] GmNF-YA15-3 的主根长为 5. 85cm。
[0211] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0212] 说明基因 GmNF_YA15具有耐盐性。
[0213] 2、抗氧化性鉴定
[0214] 为评价过表达GmNF-YA15因植株种子苗期抗氧化性地效果。将T3代转GmNF-YA15 拟南芥株系GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、T 3代转空载体拟南芥和野生型拟南 芥（WT)种子(各60株）进行抗氧化性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。
[0215] T3 代转 GmNF-YA15 拟南芥株系 GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、T3 代转 空载体拟南芥和野生型拟南芥种子萌发4d后挑取生长状态一致的幼苗，转移到含有7mM H2O 2的1/2MS培养基上坚直培养14d。观察表型、拍照并统计主根长。
[0216] 照片见图5C。
[0217] 野生型拟南芥Col-O的主根长为2. 91cm ;
[0218] GmNF-YA15-l 的主根长为 5. 42cm ;
[0219] GmNF-YA15-2 的主根长为 5. 36cm ;
[0220] GmNF-YA15-3 的主根长为 5. 38cm。
[0221] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0222] 说明基因 GmNF-YA 15具有抗氧化性。
[0223] 3、耐旱性鉴定
[0224] 为评价过表达GmNF_YA15因植株种子苗期抗氧化性地效果。将通过4°C生长一致 处理3d的拟南芥对照植株和转基因植株，萌发4d后挑取生长状态一致的幼苗，转移到含 有4%PEG的1/2MS培养基上坚直培养14d，观察表型、拍照并统计主根长。设置三次重复实 验，结果取平均值。
[0225] 照片见图
[0226] 野生型拟南芥Col-O的主根长为2. 30cm ;
[0227] GmNF-YA15_l 的主根长为 4. 22cm ;
[0228] GmNF-YA15_2 的主根长为 4. 22cm ;
[0229] GmNF-YA15_3 的主根长为 4. 22cm。
[0230] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0231] 说明基因 GmNF_YA15具有耐旱性。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与植物耐逆性和/或抗氧化性相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1) -4)中任一 种DNA分子： 1) 编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子； 2) 编码区为序列2自5'末端第150至803位核苷酸所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性和/或抗氧化性相关蛋 白的DNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性和/或抗氧化性相 关蛋白的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体，得到表达权利要 求1所述蛋白质的载体。5. 扩增权利要求2或3所述DNA分子或其任意片段的引物对。6. 权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的DNA分子或权利要求4所述的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性或调节植物抗氧化性中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。8. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述DNA分子导入目的植物中，得 到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性和/或抗氧化性高于所述目的植物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述DNA分子通过权利 要求4所述重组载体导入所述目的植物； 所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性； 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。10. 权利要求1所述蛋白作为转录因子的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YA15及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明从大豆中克隆得到基因GmNF-YA15，其在甘露醇、盐、旱、双氧水和ABA的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞质中，可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件的基因的转录表达，且本发明的GmNF-YA15可以提高植物的耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29, C07K14/415, C12N15/11
【公开号】CN104892737
【申请号】CN201410078461
【发明人】徐兆师, 马有志, 冯志娟, 郑炜君, 陈明, 李连城
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YA15及其编 码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此，了解大豆对逆 境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及品种改良的 重要任务之一。
[0003] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生 物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
[0004] 在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平 上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱 导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因 的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁 迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋 白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等）合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物； 第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白 激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
[0005] 转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发 生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活 或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控 区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等 作用的影响。
[0006] 目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯应答兀件结合蛋白，ethylene responsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP (basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF (CCAAT binding factor)类转 录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇（Trp cluster)的MYB家族。这些转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其 它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。NF-Y是一类结合顺 式作用元件CCAAT-box的转录因子，特异的识别并结合许多真核生物组成型、诱导性和细 胞周期依赖性基因的启动子或增强子中的顺式作用元件CCAAT-box，进而在转录水平调 控这些基因的表达。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个不同亚基组成的杂合三聚体。 NF-YB和NF-YC的组蛋白折叠基序（HFM)相互作用使之形成二聚体，然后结合NF-YA形成 异源三聚体的NF-Y复合物，从而结合CCAAT-box，调节其靶基因的转录。NF-YA至少有两 个结构域用于蛋白质的结合：富含谷氨酰胺的结构域（Q-rich domain)和一个亚基相互作 用的结构域（subunit interaction domain)。NF-YB也有两个蛋白结合的结构域：组蛋白 折叠基序（histone-fold motif)和 TATA 结合蛋白（TATA-binding protein)结合结构域 (TBP-binding domain)。NF-YC有三个蛋白质的结合结构域：组蛋白折叠基序，TBP结合结 构域以及富含谷氨酰胺的结构域。NF-YA和NF-YC的结构氨基酸序列与组蛋白折叠基序同 源，NF-YB与H2B组蛋白折叠基序相关，而NF-YC于H2A组蛋白折叠基序相关，该基序由三 个α螺旋和两个环组成，负责H2A/H2B二聚体的形成。
[0007] 目前，在植物中关于NF-Y转录因子的功能的报道较少，都在干旱胁迫中起重要的 作用（Nelson et al，2007XNelson等认为，与拟南芥AtNF-YBl转录因子同源的ZmNF-YB2， 在缺水的条件下过表达ZmNF-YB2的转基因玉米可以明显增强抗旱性，由于ZmNF-YB2可 以是多个与植物干旱有关参数发生改变，包括叶绿素含量、气口导度、叶片温度、减少萎 蔫和维持光合作用，从而提高抗旱性（Nelson, Peter P. Repetti, Tom R. Adams, Jingrui Wu, 2007)。Wen-Xue Li, Youko Oono等的研究证实，AtNF_YA5的表达受到干旱和ABA处理 的诱导。对其启动子GUS分析表明部分诱导反应发生在转录水平。NF-YA5有一个靶位点 miR169,在干旱条件下，miR169表达受到抑制。NF-YA5在微管组织和保卫细胞有很高的表 达，因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已 经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmNF_YA15及其编码基因。
[0009] 本发明提供的蛋白质，为结合CCAAT-box的核转录因子蛋白，名称为GmNF_YA15， 来源于大豆属大豆（Glycine max L·)，是如下（a)或（b):
[0010] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0012] 序列表中序列1的氨基酸残基序列是由217个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基 端第123 - 148位氨基酸残基序列为与NFYB/C互作区域，自氨基端第162 - 188位氨基酸 残基序列为可能的核定位信号区，自氨基端第123 - 183位氨基酸残基序列为保守的NF-YA 结构域。
[0013] 为了使a)中的GmNF_YA15便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0014] 表1.标签的序列
[0015]
[0016] 上述1)中的GmNF-YA15可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 至|J。上述1中的GmNF-YA15的编码基因可通过将序列表中序列2的自Y末端第150-803 位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱 基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0017] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0018] 上述DNA分子，为如下1) -5)中任一种DNA分子：
[0019] 1)编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子；
[0020] 2)编码区为序列2自5'末端第147至803位核苷酸所示的DNA分子；
[0021] 3)编码区为序列2自5'末端第150至803位核苷酸所示的DNA分子；
[0022] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性和/或抗氧 化性相关蛋白的DNA分子；
[0023] 5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性和/或抗 氧化性相关蛋白的DNA分子。
[0024] 上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 I X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0025] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0026] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体，得到表达上述蛋白质的载体。
[0027] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基 因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非 翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前 可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉 米的泛素启动子（Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使 用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这 些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读 框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于 对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在 植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因 (如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆 境筛选转化植株。
[0028] 在本发明的实施例中，表达载体为YEP-GAP，对应的重组载体为 YEP-GAP-GmNF-YA15，YEP-GAP-GmNF-YA15为将上述DNA分子插入YEP-G AP的多克隆位点得 到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第150至803位核苷酸所示的DNA片段插 入YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组载体；
[0029] 表达载体为 pBI121，对应的重组载体为 pBI121-GmNF-YA15，pBI121-GmNF-YA15 为 将上述DNA分子插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5' 端第150至803位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的Sma I和SacI酶切识别位点之间 得到的重组载体。
[0030] 扩增上述DNA分子或其任意片段的引物对。
[0031] 所述引物对为 GmNF-YA15-BI 和 GmNF-YA15-XI 或 GmNF-YA15-121F 和 GmNF-YAl5-12IR ：
[0032] GmNF-YA15-BI :5'-CGCGGATCCATGGTTTGGACAGTGT-3'
[0033] GmNF-YA15-XI :5'-CCGCTCGAGTTAGGATGCCCTATCT-3'
[0034] GmNF-YA15-121F :5'-TCCCCCGGGATGGTTTGGACAGTGTTACGTG-3' ；
[0035] GmNF-YA15-121R :5'-GCCGAGCTCTTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；
[0036] 上述的蛋白质、上述的DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组 菌在调节植物耐逆性或调节植物抗氧化性中的应用也是本发明保护的范围。
[0037] 上述应用中，所述调节植物耐逆性为提高植物耐逆性；所述调节植物抗氧化性为 提高植物抗氧化性；
[0038] 上述应用中,所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；
[0039] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0040] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0041] 本发明提供的方法，是将上述DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转 基因植物的耐逆性和/或抗氧化性高于所述目的植物。
[0042] 上述方法中，上述DNA分子通过上述重组载体导入所述目的植物；
[0043] 所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；
[0044] 所述耐盐性体现在NaCl胁迫下，所述转基因植物的主根长度大于所述目的植物；
[0045] 所述耐旱性体现在PEG胁迫下，所述转基因植物的主根长度大于所述目的植物；
[0046] 所述抗氧化性体现在H2O2胁迫下，所述转基因植物的主根长度大于所述目的植 物。
[0047] 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0048] 上述蛋白作为转录因子的应用也是本发明保护的范围。
[0049] 本发明的实验证明，本发明从大豆中克隆得到基因 GmNF_YA15,其在甘露醇、 盐、旱、双氧水和ABA的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞质中，可以特异的调控含有 CCAAT-box顺式元件(核心序列：CCAAT)的基因的转录表达，且本发明的GmNF-YA15可以提 高植物的耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和 耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
【附图说明】
[0050] 图1为GmNF-YA15与拟南芥氨基酸AtNF-YA5氨基酸序列的同源性比对结果
[0051] 图2为GmNF-YA15受胁迫诱导表达的荧光实时定量（Real-time) PCR图谱
[0052] 图3为GmNF_YA15在洋葱表皮细胞中的定位结果
[0053] 图4为分子检测在转基因拟南芥中的目的基因
[0054] 图5为野生型拟南芥和转GmNFYA-15拟南芥抗盐性、抗旱性与抗氧化性比较。
【具体实施方式】
[0055] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0056] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0058] 实施例1、基因 GmNF-YA15的获得
[0059] 一、基因 GmNF-YA 15 的获得
[0060] 将沙土中生长20天左右的大豆铁丰8号（国家种质资源库，编号ZM242 ;记载在如 下文献中：王彩洁，孙石，吴宝美，常汝镇，韩天富.20世纪40年代以来中国大面积种植大 豆品种的系谱分析。中国油料作物学报。2013,35(3):246 - 252,公众可从中国农业科学 院作物科学研究所获得）四叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80°C保存备用。采用 Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。第一链 cDNA 合 成用反转录酶XL (AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳 检测。
[0061] 通过5' RACE和3' RACE的方法获得大豆CCAAT-box的核转录因子C族基因全长 序列序列表中的序列2。
[0062] 该序列表中序列2所示的基因命名为GmNF_YA15,其开放阅读框架为自序列表的 序列2的5'端第150位到803位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为GmNF-YA15,该蛋白的 氨基酸序列为序列表中的序列1，序列1由218个氨基酸残基组成，具有保守的组蛋白折叠 基序。
[0063] 上述序列2也可以通过人工合成。
[0064] GmNF-YA15的序列在Genabnk上进行比对，与拟南芥中的蛋白AtNF-YCll具有较高 同源性（图1)，而在大豆中未发现同源蛋白，证明GmNF-YA15蛋白是一个新的蛋白。
[0065] 二、实时荧光定量PCR分析GmNF-YA15的表达特性
[0066] 1、胁迫处理
[0067] 苗龄为10天的铁丰8号幼苗，进行以下处理：
[0068] (1)干旱处理（图2A):将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤 纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速 冻，-80°C保存备用。
[0069] (2)高盐处理（图2B):将大豆幼苗置于200mM的由NaCl溶液中，光照培养30分 钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80°c保存 备用。
[0070] (3)高温处理（图2C):将大豆幼苗置于42°C下，光照培养30分钟、1小时、2小时、 5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0071] (4)脱落酸处理（图2D):将大豆幼苗置于100 μ M的脱落酸（ABA)溶液中，光照培 养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备 用。
[0072] (5)低温处理（图2E):将大豆幼苗置于4°C培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小 时、5小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0073] (6)双氧水处理（图2F):将小麦幼苗置于20mM的双氧水溶液中，光照培养30分钟、 1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻后一 80°C保存备用。
[0074] (7)伤害处理（图2G):将大豆幼苗用剪刀减去叶子顶端，光照培养30分钟、1小时、 2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0075] (8)甘露醇处理（图2H):将大豆幼苗置于300mM的甘露醇（Mannitol)溶液中，光 照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保 存备用。
[0076] (9)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗_80°C冻存作为对照（0小时)。
[0077] 2、mRNA 的分离
[0078] 将上述各处理的大豆幼苗米用Quikprep Micro mRNA Purif ication Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。
[0079] 3、反转录为cDNA
[0080] 将纯化的mRNA反转录为cDNA。
[0081] 4、实时荧光定量PCR
[0082] 将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因特异引物对 (Q-RT-GmNF-YA15F ：5'-GTCAATGTACAGTATGCAGCACC-3' ；Q-RT-GmNF-YAI5R ： 5' -TGATTTGTCAGCTGATGCCA-3'）对样品进行Q-RT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应 答情况，以 actin (Q-RT-ActinF :5'-ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT-3' ；Q-RT-Q-RT-ActinR: 5' -CTGTTGGAAGGTGCTGAG-3'）做内参。Q-RT-PCR 在ABl PRIStf 7000 实时荧光定量 PCR 仪 上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)报道的方法， 即计算相对表达量。
[0083] Δ Δ Cj ( xarget Ct. Actin) Time x ^ ^T. Target 〇Τ· Actin) TimeO
[0084] Time x表示任意时间点，Timetl表示经actin校正后I倍量的目标基因表达。
[0085] 结果见图2,在干旱处理下，GmNF-YA15的表达量随着脱水时间的延长而逐渐变 高，至脱水处理2h表达量达到对照的2. 3±0. 33倍，至脱水处理12h表达量达到对照的 8. 03±0. 78倍，至脱水 处理24h表达量又开始下调，见图2A。在高盐处理下，GmNF-YA15的 表达量在处理2h时，表达量瞬时表达到对照的8. 2±0. 33倍，之后表达量又瞬时下调，见图 2B〇
[0086] 在高温处理下，GmNF-YA15的表达量随着高温时间的延长缓慢变高，至处理12h表 达量达到对照的2. 2±0. 30倍，之后表达量又开始慢慢下调，见图2C。
[0087] 在激素 ABA处理下，GmNF-YA15的表达量无显著的变化趋势，见图2D。
[0088] 在低温处理下，GmNF-YA15的表达量持续缓慢下调，见图2E。
[0089] 在双氧水处理下，GmNF-YA15的表达量在0. 5h瞬时表达到对照的7. 2±0. 37倍， 之后表达量又瞬时下调，在2h表达量达到对照的10. 4±0. 31倍，之后表达量又稍微下调， 见图2F。
[0090] 在伤害处理下，GmNF-YA15的表达量在处理Ih时，表达量瞬时表达到对照的 0. 19±0. 13倍，之后表达量又缓慢上调，到12h时，恢复到最初表达水平，见图2G。
[0091] 在甘露醇处理下，GmNF-YA15的表达量在处理5h时，表达量瞬时表达到对照的 4. 2±0. 23倍，在处理24h时，表达量瞬时表达到对照的6. 4±0. 36倍，表达量持续缓慢上调 趋势，见图2H。二、GmNF-YA15亚细胞定位分析
[0092] 1、材料准备：
[0093] 在9cm培养皿上铺一薄层MS培养基，撕下后内表面朝上，平铺于MS培养基中心， 直径在3cm范围内，25°C预培养4h。
[0094] 2、金粉的处理：
[0095] 取IOOmg直径为I. 0 μ M的金粉放入I. 5ml离心管中，加入1ml无水乙醇，充分振 荡3min，以12000rpm离心Imin,去上清，再加入1ml无菌水充分混匀后，以12000rpm离心， 重复上述步骤3次。最后，将金粉悬浮于Iml超纯水中，一 20°C保存备用。
[0096] 3、亚细胞定位重组载体的构建
[0097] ①根据GmNF-YA15基因的序列设计引物GmNF-YA15-BI和GmNF-YA15-XI，引物末端 分别引入PstI和BamHI酶切位点。
[0098] GFP-GmNF-YA15F :5' -AAACTGCAGATGGTTTGGACAGTGT-3'
[0099] GFP-GmNF-YA15R :5' -CGCGGATCCGGATGCCCTATCTGAT-3'。
[0100] ②用限制性内切酶PstI和BamHI酶切步骤1回收的PCR扩增产物，回收669bp的 酶切产物；用限制性内切酶PstI和BamHI酶切表达载体16318GFP，回收大约4kbp的载体 骨架；
[0101] ③将步骤②的酶切产物和步骤的载体骨架连接；
[0102] ④将步骤③的连接产物冻融法转化大肠杆菌菌株(购自Tiangen公司），37°C过夜 培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序；
[0103] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第150-800位核苷酸所示 的DNA片段插入载体16318GFP的PstI和BamHI酶切位点之间得到的重组载体，命名为 16318GFP-GmNF-YA15。
[0104] 4、制备微粒子弹：
[0105] 3 μ g重组质粒DNA( 16318GFP-GmNF-YA15与16318GFP空载体)分别单独加入直径 为 I. 0 μ M 的金粉悬液 6 μ l(50mg/ml)，0· IM 亚精胺（spermidine)4 μ 1，2· 5M CaCl26 μ 1，将 金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。 12000rpm离心IOs (指转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μ 1无水乙醇，粗振荡 后(打散金粉）12000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20 μ 1无水乙醇悬浮沉淀，点膜。
[0106] 5、基因枪轰击受体材料：
[0107] ①选用一定压力的可裂膜(本实验用llOOpsi)，与轰击膜一起，在70%的酒精中浸 泡1~2h，取出晾干；
[0108] ②金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；
[0109] ③取20 μ 1上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不 要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上； [0110] ④将上述载体固定圈安装到发射装置上；
[0111] ⑤将可裂膜安装到气体加速管下端；
[0112] ⑥将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；
[0113] ⑦抽真空指针到26In/Hg ;
[0114] ⑧放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破 开；
[0115] ⑨气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合 体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；
[0116] ⑩将轰击好的洋葱表皮细胞放入25°C培养箱中，暗培养16~24h后在激光共聚焦 显微镜下观察。
[0117] 6、洋葱表皮细胞镜检：
[0118] 将基因枪轰击、暗培养16_24h之后的洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微 镜（Bio-Rad MicroRadiance) (Laser scanning confocal microscopy, LSMC)观察 GFP (绿 色荧光蛋白）荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex=488nm，Em=525±15nm， Power=10%，Zoom7,中速扫描，Frame512X512。软件为 ??ΜΕ-COURSE 和 PH0T0SH0P5. 0。
[0119] 结果如图3所示，A :GmNF-YA15定位于细胞核中；B :16318hGFP空载体对照定位于 细胞膜与核中。
[0120] 实施例2、GmNF-YA15作为转录因子中的应用
[0121] 用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如下：将CCAAT顺式作用 元件和突变体CCAAT顺式作用元件分别构建到pHISi-Ι载体和pLacZi载体的基本启动子 Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因（His3、LacZ和URA3)。当连 接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP (不含激活功能)分别转化到连有CCAAT 顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体CCAAT顺式作 用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的CCAAT顺式作用元件的酵母细胞 中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能， 激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激 活功能。
[0122] 表达载体YEP-GAP:中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文 献 Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Two transcription factors, DREBland DREB2, with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively, in Arabidopsis, Plant Celll998Aug;10(8):1391-1406。
[0123] Yro液体培养基：细菌培养用酵母抽提物（BactO-Yeast Extract) 10g/L，细菌培 养用胰化蛋白胨（Bacto-Peptone) 20g/L，调节pH至5. 8,121°C /15min灭菌，降至60°C以 后加入40%的Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0124] SD/HisYUraVTrp-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源（Yeast nitrogen base) 6.7g/L，营养缺陷型混合物（drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml，琼脂粉 (Bacteriological agar)20g/L，调节 pH 至 5. 8,121°C /15min 灭菌，降至 60°C后加入 40% Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0125] 营养缺陷型混合物（Drop-out mix) : (10X ) :L_Isoleucine (异亮氨酸）300mg/L， L-Valine (纟颜氨酸)1500mg/L，L-Adenine (腺噪呤)200mg/L，L-Arginine (精氨酸)200mg/L, L-Histidine Hcl monohydrate (组氨酸)200mg/L，L-Leucine (亮氨酸）1000mg/L，L-Lysine Hcl (赖氨酸）3〇Omg/L，L-Methionine (甲硫氨酸）2〇Omg/L，L-Phenylalanine (苯丙氨酸） 500mg/L，L-Threonine (苏氛酸）2000mg/L，L-Tyrosine (酿氛酸）300mg/L。
[0126] lXPEG/LiAc ：50% PEG33508ml, IOXTE bufferlml, 10XLiAclml0
[0127] IOXTE Buffer :100mM Tris-Hcl, IOmM EDTA、pH=7. 5,121°C高压灭菌，室温保存。
[0128] ΙΧΤΕ/LiAc :10XTE bufferlml，lOXLiAclml，ddH208ml。
[0129] Z Buffer =Na2HPO4 · 7H2016. lg/L, NaH2PO4 · H205. 5g/L, KC10. 75g/L, MgSO4 · 7H200. 246g/L，调节 pH 至 7. 0，121°C /15min 灭菌，4°C保存。
[0130] X-gal 储存液（X-gal Stock Solution):用 N, N-dimethyl-formamide (DMF)溶解 X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20°C贮存。
[0131] 含有 X-gal 的 Z buffer 缓冲液 100ml (Z buffer with X-gal)，现用现配： Z buffer98ml, β-疏基乙醇（β-mercaptoethanol) 0.27ml，X-gal 储存液（X-gal stocksolution) L 67ml〇
[0132] IOXLiAc :100Mm Tris-Hcl, IOOmM EDTA，pH=7. 5。121°C高压灭菌、室温保存。
[0133] 一、重组载体的构建
[0134] I、GmNF-YA 15 基因的获得
[0135] 根据GmNF-YA15基因的序列设计引物GmNF-YA15-BI和GmNF-YA15-XI，引物末端分 别引入BamHI和XhoI酶切位点。
[0136] GmNF-YA15-BI :5'-CGCGGATCCATGGTTTGGACAGTGT-3'
[0137] GmNF-YA15-XI :5'-CCGCTCGAGTTAGGATGCCCTATCT-3'
[0138] 以大豆品种铁丰8号的整个植株的cDNA为模板，用引物GmNF-YA15-BI和 GmNF-YA15 - XI 进行 PCR 扩增。
[0139] 得到672bp左右的PCR扩增产物。
[0140] 回收PCR扩增产物。
[0141] 2、重组载体的构建
[0142] ①用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切步骤1回收的PCR扩增产物，回收672bp的 酶切产物；
[0143] ②用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切表达载体YEP-GAP，回收的载体骨架；
[0144] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0145] ④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(购自Clontech公司），37°C过夜培 养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序；
[0146] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第150-803位核苷酸所示 的DNA片段插入载体YEP-GAP的BamHI和Xho I酶切位点之间得到的重组载体，命名为 YEP-GAP-GmNF-YA15〇
[0147] 二、GmNF_YA15的体内结合特异性和激活特性的验证
[0148] 1、酵母报道子的构建
[0149] (1)正常双重酵母报道子的构建
[0150] DNA 片段 A (含 4 个 CCAAT 元件）：
[0151] 5' -GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3' 。
[0152] 将 DNA 片段 A 构建到 pHis-1 载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司）的Pminms3启动子上游，得到重组载体pHis-1-CCAAT，用Xho I和Nco I内切酶将 pHi s-1-CCAAT载体切成线状。
[0153] 将 DNA 片段 A 构建到 pLacZi 载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司）PCTa启动子上游，得到重组载体pLacZi-CCAAT，用Xho I和Nco I内切酶分别将 PLacZi-CCAAT载体切成线状。
[0154] 先将线状pHis-1-CCAAT载体转化到酵母细胞（YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech公司）内，获得能在SD/Hisl咅养基上正常生长的酵母转化子 (Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复CCAAT 元件的线状PLacZi-CCAAT载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His_/Ura_培养基 上，选择获得含有PHis-I-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报道子。
[0155] (2)突变体双重酵母报道子的构建
[0156] DNA 片段 B (含 4 个 CCAAT 元件的突变体 TTTTA) : 5 ' -GAATTC-TTTTA-TTTTA-TTTTA-TTTTA-GTCGAC-3' 。
[0157] 用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤（1)，得到突变体双重酵母报道子。
[0158] 2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析
[0159] ⑴分别接种上述1获得的含有pHis-1-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报 道子和突变体双重酵母报道子到Iml YH)液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬 浮液转至含有50ml YH)液体培养基的三角瓶中，30°C /250rpm摇过夜，测0D600=1. 7-1. 8 (计数约4X107个/mL);
[0160] ⑵取30ml步骤（1)过夜培养物接到300ml新鲜的YH)培养基中，30°C /250rpm培 养，约3小时（至0D600=0. 5±0. 1)，室温1000 g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积 I X TE 悬浮，1000g/5min 离心；
[0161] ⑶吸弃上清，用I. 5ml新鲜配制的ΙΧΤΕ/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；
[0162] ⑷取出0.1 ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0. 1 μ g由一制备的重组载 体 YEP-GAP-GmNF-YA15、0.1 mg ssDNA (鲑鱼精 DNA，SiTaa)、0. 6mlPEG/LiAc 高速振荡 1 分 钟，30°C /200rpm振荡培养30分钟；
[0163] (5)加入70ul DMSO (siTaa#D8779)，轻轻倒置混匀，42°C热激30分钟，其间轻轻振 荡，冰浴2分钟，室温1000 g离心5min ;
[0164] (6)吸弃上清，加入0· 5mllXTE buffer悬浮细胞；
[0165] (7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、15mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp -选择 性培养基上画线培养。
[0166] (8)平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以 便做对照分析。
[0167] ⑶颠倒放置于培养箱中，30〇C培养3 - 4天。
[0168] (1Φ结果发现在0mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp_的培养基平板上正常的酵母 报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/ L3-AT的SD/HiS_/Ura7Trp_的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母 报道子被抑止没有生长。
[0169] 3、半乳糖苷酶活性检测
[0170] ⑴从0mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp_的培养基平板上分别挑取正常的酵母报 道子和突变的酵母报道子菌落。转至Yro液体培养基中，于3〇°c振荡培养，待长至对数生长 后期，取I. 5ml菌液，3000rpm离心30s ;
[0171] ⑵弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻lOmin，取出使其自然融解，加 50ul Z/X-gal溶液，30°C温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母 报道子在12h内没有变化，仍为白色。
[0172] 说明转录因子GmNF_YA15能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了 GmNF-YA15的体内结合特异性和激活功能， GmNF-YA15为转录因子。
[0173] 实施例3、GmNF_YA15在提高植物的耐逆性中的应用
[0174] 一、转GmNF_YA15拟南芥的获得
[0175] 1、重组载体的构建
[0176] I) GmNF_YA15 基因的克隆
[0177] 根据 GmNF-YA 15 基因的序列设计引物对（GmNF-YA15-12IF 和 GmNF-YA15-121R)，弓 I 物末端分别引入Sma I和SacI酶切识别位点，
[0178] GmNF-YA15-121F :5'-TCCCCCGGGATGGTTTGGACAGTGTTACGTG-3' ；
[0179] GmNF-YA15-121R :5'-GCCGAGCTCTTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；
[0180] 以大豆属大豆（Glycine max L.)(铁丰8号）cDNA为模板，用GmNF-YA15-121F和 GmNF-YA15-121R进行PCR扩增，得到大小约IKb的PCR产物（GmNF-YA15基因）。
[0181] 回收上述PCR产物。
[0182] 2)、重组载体的构建
[0183] ①用限制性内切酶Sma I和SacI酶切步骤1回收的PCR产物，回收672bp酶切产 物；
[0184] ②用限制性内切酶sma I和SacI酶切pBI121 (Clontech公司购买)，回收672bp 载体骨架；
[0185] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0186] ④将步骤③的连接产物电击转化TOPlO菌株(购自北京天根公司)，37°C过夜培养， 挑取阳性克隆提取质粒进行测序。
[0187] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第150-803位核苷酸所示 的DNA片段插入载体pBI121的Sma I和SacI酶切位点之间得到的重组载体，命名 为 pBI12I-GmNF-YAl5。
[0188] 3、重组农杆菌的获得
[0189] 用重组质粒pBI121-GmNF-YA15基因转化农杆菌C58C1 (北京拜尔迪生物 技术公司购买)，得到重组农杆菌C58Cl/pBI121-GmNF-YA15 (提取质粒送去测序，为 pB1121-GmNF-YA 15，则含有该质粒的重组菌为阳性)。
[0190] 4、转GmNF-YA15拟南芥获得
[0191] 1)将3得到的重组农杆菌接种于LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉 素，50mg/ml庆大霉素）液体培养基中，28°C、3000rpm培养约30小时，得到菌液；
[0192] 2)将菌液转至LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素 ，50mg/ml庆大霉素） 中，28°C、300rpm培养约14小时(菌液0D600达到1.5-3. 0);
[0193] 3)收集菌体，4 °C、4000g离心10min，用含10%蔗糖MS液体培养基(含 0· 02%silwet)稀释至 0D600 约为 0· 8-1. O ;
[0194] 4)将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-O, SALK公司购买，也称为野生型拟南芥）整株 与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆， 侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养， 收获T 1代种子，卡那霉素筛选(浓度为50 μ g/L卡那霉素)阳性植株为T1代再生植株，传代， 直到得到T3代再生植株。
[0195] T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T 2代自交产生的 种子及由它所长成的植株。
[0196] 提取T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用引物对： F: 5' -ATGGTTTGGACAGTGTTACGTG ;R: 5' -TTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；进行 PCR 扩增，部分 样本结果如图4A所示，P为Plasmid, M为Marker, C为哥伦比亚生态型拟南芥Col-0, L1-L3 为T3代再生植株，H为H2O ;得到654bp为阳性。
[0197] 提取T3代再生植株的整个植株的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用引物对： F: 5' -ATGGTTTGGACAGTGTTACGTG ;R: 5' -TTAGGATGCCCTATCTGATGAAG-3' ；进行 PCR 扩增。
[0198] 部分样本的结果见图4B，P为Plasmid, M为Marker, C为哥伦比亚生态型拟南芥 Col-0, L1-L3为T3代再生植株，H为H2O ;得到大小为915bp片段的为阳性。
[0199] 上述DNA和cDNA水平上鉴定均为阳性的即为T3代转GmNF-YA15拟南芥。
[0200] 采用同样的方法将质粒pBI121转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，培育 获得T 3代转空载体拟南芥，采用同样的方法鉴定，未得到915bp片段。
[0201] 二、转基因植物的耐逆性鉴定
[0202] 1、耐盐性鉴定
[0203] 分别将 T3 代转 GmNF-YA15 拟南芥株系 GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、 T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥(各60株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果 取平均值。
[0204] 为评价过表达GmNF_YA15因植株种子苗期耐盐性的效果。
[0205] 将 T3 代转 GmNF-YA15 拟南芥株系 GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、T3 代 转空载体拟南芥和野生型拟南芥(WT)种子萌发4d后挑取生长状态一致的幼苗（图5A)，转 移到含有150mM NaCl的1/2MS培养基上坚直培养14天，观察表型、拍照并统计主根长。
[0206] 照片见图5B。
[0207] 野生型拟南芥Col-O的主根长为3. 62cm ;
[0208] GmNF-YA15-l 的主根长为 5. 80cm ;
[0209] GmNF-YA15-2 的主根长为 5. 82cm ;
[0210] GmNF-YA15-3 的主根长为 5. 85cm。
[0211] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0212] 说明基因 GmNF_YA15具有耐盐性。
[0213] 2、抗氧化性鉴定
[0214] 为评价过表达GmNF-YA15因植株种子苗期抗氧化性地效果。将T3代转GmNF-YA15 拟南芥株系GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、T 3代转空载体拟南芥和野生型拟南 芥（WT)种子(各60株）进行抗氧化性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。
[0215] T3 代转 GmNF-YA15 拟南芥株系 GmNF-YA15-l、GmNF-YA15-2、GmNF-YA15-3、T3 代转 空载体拟南芥和野生型拟南芥种子萌发4d后挑取生长状态一致的幼苗，转移到含有7mM H2O 2的1/2MS培养基上坚直培养14d。观察表型、拍照并统计主根长。
[0216] 照片见图5C。
[0217] 野生型拟南芥Col-O的主根长为2. 91cm ;
[0218] GmNF-YA15-l 的主根长为 5. 42cm ;
[0219] GmNF-YA15-2 的主根长为 5. 36cm ;
[0220] GmNF-YA15-3 的主根长为 5. 38cm。
[0221] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0222] 说明基因 GmNF-YA 15具有抗氧化性。
[0223] 3、耐旱性鉴定
[0224] 为评价过表达GmNF_YA15因植株种子苗期抗氧化性地效果。将通过4°C生长一致 处理3d的拟南芥对照植株和转基因植株，萌发4d后挑取生长状态一致的幼苗，转移到含 有4%PEG的1/2MS培养基上坚直培养14d，观察表型、拍照并统计主根长。设置三次重复实 验，结果取平均值。
[0225] 照片见图
[0226] 野生型拟南芥Col-O的主根长为2. 30cm ;
[0227] GmNF-YA15_l 的主根长为 4. 22cm ;
[0228] GmNF-YA15_2 的主根长为 4. 22cm ;
[0229] GmNF-YA15_3 的主根长为 4. 22cm。
[0230] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0231] 说明基因 GmNF_YA15具有耐旱性。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与植物耐逆性和/或抗氧化性相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1) -4)中任一 种DNA分子： 1) 编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子； 2) 编码区为序列2自5'末端第150至803位核苷酸所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性和/或抗氧化性相关蛋 白的DNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性和/或抗氧化性相 关蛋白的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体，得到表达权利要 求1所述蛋白质的载体。5. 扩增权利要求2或3所述DNA分子或其任意片段的引物对。6. 权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的DNA分子或权利要求4所述的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性或调节植物抗氧化性中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。8. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述DNA分子导入目的植物中，得 到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性和/或抗氧化性高于所述目的植物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述DNA分子通过权利 要求4所述重组载体导入所述目的植物； 所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性； 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。10. 权利要求1所述蛋白作为转录因子的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YA15及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明从大豆中克隆得到基因GmNF-YA15，其在甘露醇、盐、旱、双氧水和ABA的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞质中，可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件的基因的转录表达，且本发明的GmNF-YA15可以提高植物的耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29, C07K14/415, C12N15/11
【公开号】CN104892737
【申请号】CN201410078461
【发明人】徐兆师, 马有志, 冯志娟, 郑炜君, 陈明, 李连城
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日
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