植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码基因和应用
植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码 基因和应用。
【背景技术】
[0002] 干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此，了解大豆对逆 境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及品种改良的 重要任务之一。
[0003] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生 物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。在干旱、高盐和低温等 环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度 上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能 够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从 而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。
[0004] 蛋白质的生物合成过程是将有机体储藏在DNA分子中的遗传信息转化为蛋白质 的重要纽带，分为起始、延伸和终止三个阶段，每一阶段都有一套独特的蛋白质因子发挥作 用。延伸因子（elongation factor)是参与蛋白翻译延伸的一类重要的蛋白质，它们通过 在核糖体上催化氨基酸链的延伸而推动、控制蛋白质的合成，其中延伸因子EF-Tu是细胞 内与翻译机制有关的蛋白质中含量最高的蛋白，在植物线粒体和质体等细胞的蛋白质合成 延伸阶段发挥着重要的作用。自上个世纪60年代从E. coli细胞中首先分离获得延伸因子 以来，在过去50多年的研究中，发现EF-Tu除了参与蛋白翻译外，在生长信号传导、抗逆性 等方面也表现出非常重要的作用。
[0005] EF-Tu可分为EFl和EF2, EFl介导氨酰-tRNA与核糖体结合，它有4个亚基，分别 为，分别为EF-Ia、[email protected]、[email protected]和EF-1y，1995年4月IUBMB委员会将其重新命名为 分别为eEFlAEFlA、EFlBa、EFlBβ和EFlBγ。EFlA相当于原核生物的EF-Tu，为量甚多， 仅次于肌动蛋白，占蛋白总量的1 % - 2 %，高于EF27倍、核糖体17~35倍，为tRNA总量 的13倍。EF2因子是单体，催化与mRNA相连的核糖体的移动。
[0006] 在植物蛋白质合成延伸过程中，EFlA首先与GTP结合。然后与氨酰基-tRNA结 合形成三元复合物，该三元复合物进入核糖体的氨酰位（A位）。这时EFlA同时与氨酰 基-tRNA · GTP和核糖体发生作用。进入A位后，GTP立即水解成⑶P，EFlA ·⑶P这个二元 复合物就与氨酰基-tRNA解离而释放出来。有研究表明。EFlA能够与新生的肽链结合，而 且能够和在胞质中不能正确折叠的蛋白相互作用并加速这些蛋白的降解.EFlA具有类似 分子伴侣的活性。
[0007] 到目前为止，已在大麦、小麦、玉米、大豆、水稻、甘蔗、油棕、拟南芥、烟草、番茄、荔 枝、苹果、麝香百合、棉花、马铃薯、盐地碱蓬、橡胶等中克隆到EFlA基因。对已克隆的EFlA 研究表明：EFlA的表达受激素、环境胁迫和生育过程等因素诱导。当植物受到外界环境压 力或植物发育的内在信号时，会作出迅速反应，即通过改变EFlA的表达。影响转录水平或 mRNA稳定性，进而调控蛋白质的合成，以适应各种环境条件和植物各个生长发育阶段的需 要。Aguilar等报道，光照可显著提高大豆叶片中的EFlA mRNA水平。光照还明显影响小麦 苗EFlAmRNA的稳定性。创伤、低氧可诱导马铃薯块茎EFlA基因的转录。2. 4-D处理后可 提高转基因烟草中EFlA-GUS嵌合基因的mRNA水平。在甘蔗生长后期喷施乙烯利，可以诱导 EFlA在未成熟莖段持续高水平表达。Bakaldina等通过ommp (omnia mea mecltm pro-to) mRNA降解系统，研究4°C低温和水杨酸钠处理后，小麦、大麦EFlA mRNA的稳定性，结果表 明，品种抗霜冻能力愈强，EFlA mRNA愈稳定。植物受真菌感染后，组织坏死阶段的EFlA表 达水平下降。孙伟等研究结果表明，在不同盐浓度处理、同一盐浓度不同时间处理及双氧 水刺激条件下碱蓬叶中延伸因子EFlA的表达量呈现先减少后增加的趋势，而经聚乙二醇 (PEG)及低温诱导则均呈现上升趋势。李子银等研究表明，水稻幼苗中EFlA的表达明显受 盐胁迫和ABA胁迫所诱导，且ABA胁迫处理对该基因转录的诱导要早于盐胁迫的诱导作用； 此外，干旱（15%PEG6000处理）、冷胁迫（4)和热激（37°C)对水稻延伸因子eEFlA基因的 表达均有明显的诱导作用。EFlA基因的诱导表达可能是对逆境胁迫的一种适应性反应。
[0008] 各种研究表明，EFlA基因是一种非常重要的多功能蛋白，由于植物的逆境耐性 是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提 高。因此，利用一个关键的延伸因子促进多个功能基因的表达，增强植物的抗逆性，已经成 为植物抗逆基因工程的研究热点。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码基因。
[0010] 本发明提供的蛋白质，为一种延伸因子，名称为GmEF13,来源于大豆属大豆 (Glycine max L.)，是如下（a)或（b):
[0011] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0013] 序列表中序列1的氨基酸残基序列是由447个氨基酸残基组成的蛋白质。
[0014] 为了使a)中的GmEF13便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1.标签的序列
[0016]
[0017] 上述1)中的GmEF13可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述1中的GmEF13的编码基因可通过将序列表中序列2的自5'末端第97-1440位碱基所 示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错 义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0019] 上述DNA分子，为如下1) _4)中任一种DNA分子：
[0020] 1)编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子；
[0021] 2)编码区为序列表中序列2自5'末端第97-1440位核苷酸所示的的DNA分子；
[0022] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分 子；
[0023] 4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA 分子。
[0024] 序列2中的cDNA序列由1804个核苷酸组成，开放阅读框架为自5 '端第97至 1440位碱基。
[0025] 上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 I X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0026] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0027] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体，得到表达上述蛋白质的载体。
[0028] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基 因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非 翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前 可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉 米的泛素启动子（Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使 用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这 些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读 框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于 对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在 植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因 (如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆 境筛选转化植株。
[00 29] 在本发明的实施例中，表达载体为PAHCPSK，对应的重组载体为PAHCPSK-GmEF13， PAHCPSK-GmEF13为将上述DNA分子插入PAHCPSK的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将 序列表的序列2自5'端第97至1440位核苷酸所示的DNA片段插入PAHCPSK的Sma I和 SacI酶切识别位点之间得到的重组载体。
[0030] 扩增上述DNA分子或其任意片段的引物对。
[0031] 所述引物对为 GmEF13-PAHCPSK F 和 GmEF13-PAHCPSK R:
[0032] GmEF13-PAHCPSK F :5'-CGGGATCCATGGGTAAGGAAAAGACTCACATC-3' ；
[0033] GmEF13-PAHCPSK R :5'-CCGCTCGAGTCACTTCTTCTTGGCAGCGG-3'。
[0034] 上述的蛋白质、上述的DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组 菌在调节植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。
[0035] 上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温；
[0036] 上述调节植物耐逆性为提高植物耐旱性和/或提高耐高温。
[0037] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0038] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0039] 本发明提供的方法，是将上述DNA分子导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目 的植物的转基因植物。
[0040] 上述方法中，上述DNA分子通过上述重组载体导入所述目的植物；
[0041] 所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温；
[0042] 所述耐旱性体现在PEG胁迫下，所述转基因植物主根长度高于所述目的植物；
[0043] 所述高温性体现在45°C胁迫下，所述转基因植物主根长度高于所述目的植物；
[0044] 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0045] 上述蛋白作为转录因子的应用也是本发明保护的范围。
[0046] 本发明的实验证明，本发明从大豆中克隆得到基因 GmEF13,在干旱、乙烯和油菜素 内酯的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞核中，并且可以特异的调控含有CCAAT-box顺 式元件(核心序列：CCAAT)的基因的转录表达，且本发明的GmEF13可以提高植物的耐旱性， 为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物 育种中发挥重要的作用。
【附图说明】
[0047] 图1为GmEF13与拟南芥氨基酸At5G60390氨基酸序列的同源性比对结果
[0048] 图2为GmEF13受胁迫诱导表达的荧光实时定量（Real-time) PCR图谱
[0049] 图3为分子检测在转基因拟南芥中的目的基因
[0050] 图4为野生型和转基因拟南芥抗旱性比较
[0051] 图5为野生型和转基因拟南芥抗高温比较
【具体实施方式】
[0052] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0053] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0055] 实施例1、基因 GmEF13的获得
[0056] 一、基因 GmNF-YA 15 的获得
[0057] 将水培的生长10天左右的大豆铁丰8号（国家种质资源库，编号ZM242 ;记载在如 下文献中：王彩洁，孙石，吴宝美，常汝镇，韩天富.20世纪40年代以来中国大面积种植大 豆品种的系谱分析。中国油料作物学报。2013,35(3):246 - 252,公众可从中国农业科学 院作物科学研究所获得）四叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80°C保存备用。采用 Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。第一链 cDNA 合 成用反转录酶XL (AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳 检测。
[0058] 通过5'RACE和3'RACE的方法获得大豆GmEF13基因全长序列序列表中的序列2。
[0059] 该序列表中序列2所示的基因命名为GmEF13,其开放阅读框架为自序列表的序列 2的5'端第97位到1440位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为GmEF13,该蛋白的氨基酸序 列为序列表中的序列1，序列1由447个氨基酸残基组成，具有保守的组蛋白折叠基序。
[0060] 上述序列2也可以通过人工合成。
[0061] GmEF13的序列在Genabnk上进行比对，与拟南芥中的蛋白At5G60390具有较高同 源性（图1)，而在大豆中未发现同源蛋白，证明GmEF13蛋白是一个新的蛋白。
[0062] 二、实时荧光定量PCR分析GmEF13的表达特性
[0063] 1、胁迫处理
[0064] 苗龄为10天的铁丰8号幼苗，进行以下处理：
[0065] (1)干旱处理（图2A):将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤 纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速 冻，-80°C保存备用。
[0066] (2)盐渍处理（图2B):将大豆幼苗置于200mM的由NaCl溶液中，光照培养30分 钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80°C保存 备用。
[0067] (3)脱落酸处理（图2C):将大豆幼苗置于100 μ M的脱落酸（ABA)溶液中，光照培 养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备 用。
[0068] (4)低温处理（图2E):将大豆幼苗置于4°C培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小 时、5小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0069] (5)高温处理（图2D):将大豆幼苗置于42°C下，光照培养30分钟、1小时、2小时、 5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0070] (6)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗_80°C冻存作为对照（0小时)。
[0071] 2、mRNA 的分离
[0072] 将上述各处理的大豆幼苗米用Quikprep Micro mRNA Purif ication Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。
[0073] 3、反转录为cDNA
[0074] 将纯化的mRNA反转录为cDNA。
[0075] 4、实时荧光定量PCR
[0076] 将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因3'端非编码区的特异引物对 (F:5' TCAAGTATGCCTGGGTGC3'，R:5' TTTCATCATACCTAGCCTTAGAGT3'）对样品进行 Q-RT-PCR 扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin(F:5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3'，R:5'_ GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3'）做内参。Q-RT-PCR 在 ABI PRISM* 7000 实时荧光定量 PCR 仪 上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)报道的方法， 即计算相对表达量。
[0077] Δ Δ Cj ( xarget Ct. Actin) Time x ^ ^T. Target Act in) TimeO
[0078] Time x表示任意时间点，Timetl表示经actin校正后I倍量的目标基因表达。
[0079] 结果见图3,可以看出GmEF13对干旱和盐渍胁迫有不同程度的响应。
[0080] 实施例2、GmEF13在提高植物的耐逆性中的应用
[0081] 一、转GmEF13拟南芥的获得
[0082] 1、重组载体的构建
[0083] I) GmEF13基因的克隆
[0084] 根据 GmEF13 基因的序列设计引物对（GmEF13-PAHCPSK F 和 GmEF13-PAHCPSK R)， 引物末端分别引入Sma I和SacI酶切识别位点，
[0085] GmEF13-PAHCPSK F :5'-CGGGATCCATGGGTAAGGAAAAGACTCACATC-3' ；
[0086] GmEF13-PAHCPSK R :5'-CCGCTCGAGTCACTTCTTCTTGGCAGCGG-3'。
[0087] 以大豆属大豆铁丰8号（Glycine max L. ) cDNA为模板，用GmEF13-PAHCPSK F和 GmEF13-PAHCPSK R进行PCR扩增，得到大小约1344bp的PCR产物（GmEF13基因）。
[0088] 回收上述PCR产物。
[0089] 2)、重组载体的构建
[0090] ①用限制性内切 酶Sma I和Sac I酶切步骤1回收的PCR产物，回收1344bp酶切 产物；
[0091] ②用限制性内切酶sma I和Sac I酶切PAHCPSK (Clontech公司购买)，回收 1344bp载体骨架；
[0092] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0093] ④将步骤③的连接产物电击转化T0P10菌株(购自北京天根公司)，37°C过夜培养， 挑取阳性克隆提取质粒进行测序。
[0094] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2所示第97-1440位核苷酸所示的的 DNA片段插入载体PAHCPSK的Sma I和Sac I酶切位点之间得到的重组载体，命名为 PAHCPSK-GmEF13〇
[0095] 3、重组农杆菌的获得
[0096] 用重组质粒PAHCPSK-GmEF13基因转化农杆菌C58C1 (北京拜尔迪生物技术公司购 买)，得到重组农杆菌C58Cl/PAHCPSK-GmEF13 (提取质粒送去测序，为PAHCPSK-GmEF13,则 含有该质粒的重组菌为阳性)。
[0097] 4、转GmEF13拟南芥获得
[0098] 1)将3得到的重组农杆菌接种于LB (含50mg/ml利福平，lOOmg/ml卡那霉 素，50mg/ml庆大霉素）液体培养基中，28°C、3000rpm培养约30小时，得到菌液；
[0099] 2)将菌液转至LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素） 中，28°C、300rpm培养约14小时(菌液0D600达到1.5-3. 0);
[0100] 3)收集菌体，4 °C、4000g离心10min，用含10%蔗糖MS液体培养基(含 0· 02%silwet)稀释至 0D600 约为 0· 8-1. O ;
[0101] 4)将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-ο, SALK公司购买，也称为野生型拟南芥）整株 与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆， 侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养， 收获T 1代种子，卡那霉素筛选(浓度为50 μ g/L卡那霉素)阳性植株为T1代再生植株，传代， 直到得到T3代再生植株。
[0102] T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T 2代自交产生的 种子及由它所长成的植株。
[0103] 提取T3R再生植株完整植株的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用引物对 F: 5' -TCAAGTATGCCTGGGTGC-3' ；R: 5' -GTGGTGGAGTCAATGATAAGG-3' ；进行 PCR 扩增。
[0104] 部分样本的结果见图4, M为Marker, col-0为哥伦比亚生态型野生型拟南芥， 0E1-0E3为T3代再生植株。
[0105] 0E1-0E3得到大小为199bp片段的为阳性，即为T3代转GmEF13拟南芥。
[0106] 采用同样的方法将质粒PAHCPSK转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，培 育获得T 3代转空载体拟南芥，采用同样的方法鉴定，未得到199bp片段。
[0107] 二、转基因植物的耐逆性鉴定
[0108] 1、干旱胁迫对萌发率影响
[0109] 将T3代转GmEF13拟南芥的3个株系0E-1、0E-2、0E-3、T 3代转空载体拟南芥和野 生型拟南芥各25粒种子经消毒处理后，用牙签单粒均匀分别点在MS培养基（MSO)和含有 8% (质量百分含量）PEG的MS培养基（4%PEG+MS0)上，用封口膜密封，放4°C放置3天后，移 入23°C，12h光照/8h黑暗，60%相对湿度的培养室中培7d后统计根长，每个处理设三个重 复，结果取平均值。
[0110] 结果如图5所示，可以看出，在不含PEG的MS培养基上，野生型拟南芥和T3代转 GmEF13拟南芥根长无显著差异；而在PEG胁迫下，T3代转GmEF13拟南芥根长高于野生型拟 南芥。
[0111] 统计主根长度，
[0112] MS培养基（MSO)中培养，野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系OE-I、 OE-2、0E-3 的主根长度分别为 3. 59cm、3. 46cm、3. 61cm、3. 88cm ;;
[0113] 在PEG胁迫下野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系0E-l、0E-2、0E-3的 主根长度分别为 I. 37cm、3. 05cm、2. 45cm、2. 71cm ;
[0114] 干旱胁迫处理后，转基因植物主根长度高于野生型，T3代转空载体拟南芥和野生 型拟南芥结果无显著差异。
[0115] 2、耐高温性鉴定
[0116] T3代转GmEF13拟南芥的株系OE-1、OE-2、OE-3、T3代转空载体拟南芥和野生型拟 南芥各25粒种子经消毒处理后，种植在MS培养基上，用封口膜密封，放4°C放置3天后，移 入23°C，12h光照/8h黑暗，60%相对湿度的培养室中培养5d后，用镊子移栽到新的MS培养 基上，分别在正常条件（25°C )和45°C处理2h后在正常条件下生长，每个处理设三个重复， 7d后观察表型。
[0117] 照片见图5。可以看出，在正常条件的MS培养基上，野生型拟南芥和T3代转GmEF13 拟南芥根长无显著差异；而在45°C高温胁迫下，T 3代转GmEF13拟南芥根长高于野生型拟南 芥。
[0118] 统计主根长度，
[0119] 正常条件培养，野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系0E-1、0E-2、0E-3 的主根长度分别为 3. 59cm、3. 46cm、3. 61cm、3. 88cm ;
[0120] 45°C高温胁迫下野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系0Ε-1、0Ε-2、0Ε-3 的主根长度分别为 I. 23cm、L 82cm、2. 20cm、L 67cm ;
[0121] 高温胁迫处理后，转基因植物主根长度高于野生型，T3代转空载体拟南芥和野生 型拟南芥结果无显著差异。
[0122] 从上述实验可以看出，基因 GmEF13可以提高植物的耐旱性和耐高温性。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)-4)中任一 种DNA分子： 1)编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子； 2)编码区为序列表中序列2自5'末端第97-1440位核苷酸所示的的DNA分子； 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子； 4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分 子。4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体，得到表达权利要 求1所述蛋白质的载体。5.扩增权利要求2或3所述DNA分子或其任意片段的引物对。6.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的DNA分子或权利要求4所述的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。8. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述DNA分子导入目的植物中，得 到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述DNA分子通过权利 要求4所述重组载体导入所述目的植物； 所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于： 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
【专利摘要】本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的GmEF13在干旱、高盐和低温的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞核上，并且可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件（核心序列：CCAAT）的基因的转录表达。本发明的GmEF13可以提高植物的耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
【IPC分类】C12N15/11, C07K14/415, A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82
【公开号】CN104892740
【申请号】CN201410079112
【发明人】徐兆师, 马有志, 胡笛, 崔晓玉, 何冠华, 陈明, 李连城
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码 基因和应用。
【背景技术】
[0002] 干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此，了解大豆对逆 境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及品种改良的 重要任务之一。
[0003] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生 物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。在干旱、高盐和低温等 环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度 上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能 够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从 而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。
[0004] 蛋白质的生物合成过程是将有机体储藏在DNA分子中的遗传信息转化为蛋白质 的重要纽带，分为起始、延伸和终止三个阶段，每一阶段都有一套独特的蛋白质因子发挥作 用。延伸因子（elongation factor)是参与蛋白翻译延伸的一类重要的蛋白质，它们通过 在核糖体上催化氨基酸链的延伸而推动、控制蛋白质的合成，其中延伸因子EF-Tu是细胞 内与翻译机制有关的蛋白质中含量最高的蛋白，在植物线粒体和质体等细胞的蛋白质合成 延伸阶段发挥着重要的作用。自上个世纪60年代从E. coli细胞中首先分离获得延伸因子 以来，在过去50多年的研究中，发现EF-Tu除了参与蛋白翻译外，在生长信号传导、抗逆性 等方面也表现出非常重要的作用。
[0005] EF-Tu可分为EFl和EF2, EFl介导氨酰-tRNA与核糖体结合，它有4个亚基，分别 为，分别为EF-Ia、[email protected]、[email protected]和EF-1y，1995年4月IUBMB委员会将其重新命名为 分别为eEFlAEFlA、EFlBa、EFlBβ和EFlBγ。EFlA相当于原核生物的EF-Tu，为量甚多， 仅次于肌动蛋白，占蛋白总量的1 % - 2 %，高于EF27倍、核糖体17~35倍，为tRNA总量 的13倍。EF2因子是单体，催化与mRNA相连的核糖体的移动。
[0006] 在植物蛋白质合成延伸过程中，EFlA首先与GTP结合。然后与氨酰基-tRNA结 合形成三元复合物，该三元复合物进入核糖体的氨酰位（A位）。这时EFlA同时与氨酰 基-tRNA · GTP和核糖体发生作用。进入A位后，GTP立即水解成⑶P，EFlA ·⑶P这个二元 复合物就与氨酰基-tRNA解离而释放出来。有研究表明。EFlA能够与新生的肽链结合，而 且能够和在胞质中不能正确折叠的蛋白相互作用并加速这些蛋白的降解.EFlA具有类似 分子伴侣的活性。
[0007] 到目前为止，已在大麦、小麦、玉米、大豆、水稻、甘蔗、油棕、拟南芥、烟草、番茄、荔 枝、苹果、麝香百合、棉花、马铃薯、盐地碱蓬、橡胶等中克隆到EFlA基因。对已克隆的EFlA 研究表明：EFlA的表达受激素、环境胁迫和生育过程等因素诱导。当植物受到外界环境压 力或植物发育的内在信号时，会作出迅速反应，即通过改变EFlA的表达。影响转录水平或 mRNA稳定性，进而调控蛋白质的合成，以适应各种环境条件和植物各个生长发育阶段的需 要。Aguilar等报道，光照可显著提高大豆叶片中的EFlA mRNA水平。光照还明显影响小麦 苗EFlAmRNA的稳定性。创伤、低氧可诱导马铃薯块茎EFlA基因的转录。2. 4-D处理后可 提高转基因烟草中EFlA-GUS嵌合基因的mRNA水平。在甘蔗生长后期喷施乙烯利，可以诱导 EFlA在未成熟莖段持续高水平表达。Bakaldina等通过ommp (omnia mea mecltm pro-to) mRNA降解系统，研究4°C低温和水杨酸钠处理后，小麦、大麦EFlA mRNA的稳定性，结果表 明，品种抗霜冻能力愈强，EFlA mRNA愈稳定。植物受真菌感染后，组织坏死阶段的EFlA表 达水平下降。孙伟等研究结果表明，在不同盐浓度处理、同一盐浓度不同时间处理及双氧 水刺激条件下碱蓬叶中延伸因子EFlA的表达量呈现先减少后增加的趋势，而经聚乙二醇 (PEG)及低温诱导则均呈现上升趋势。李子银等研究表明，水稻幼苗中EFlA的表达明显受 盐胁迫和ABA胁迫所诱导，且ABA胁迫处理对该基因转录的诱导要早于盐胁迫的诱导作用； 此外，干旱（15%PEG6000处理）、冷胁迫（4)和热激（37°C)对水稻延伸因子eEFlA基因的 表达均有明显的诱导作用。EFlA基因的诱导表达可能是对逆境胁迫的一种适应性反应。
[0008] 各种研究表明，EFlA基因是一种非常重要的多功能蛋白，由于植物的逆境耐性 是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提 高。因此，利用一个关键的延伸因子促进多个功能基因的表达，增强植物的抗逆性，已经成 为植物抗逆基因工程的研究热点。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码基因。
[0010] 本发明提供的蛋白质，为一种延伸因子，名称为GmEF13,来源于大豆属大豆 (Glycine max L.)，是如下（a)或（b):
[0011] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0013] 序列表中序列1的氨基酸残基序列是由447个氨基酸残基组成的蛋白质。
[0014] 为了使a)中的GmEF13便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1.标签的序列
[0016]
[0017] 上述1)中的GmEF13可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述1中的GmEF13的编码基因可通过将序列表中序列2的自5'末端第97-1440位碱基所 示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错 义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0019] 上述DNA分子，为如下1) _4)中任一种DNA分子：
[0020] 1)编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子；
[0021] 2)编码区为序列表中序列2自5'末端第97-1440位核苷酸所示的的DNA分子；
[0022] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分 子；
[0023] 4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA 分子。
[0024] 序列2中的cDNA序列由1804个核苷酸组成，开放阅读框架为自5 '端第97至 1440位碱基。
[0025] 上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 I X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0026] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0027] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体，得到表达上述蛋白质的载体。
[0028] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基 因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非 翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前 可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉 米的泛素启动子（Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使 用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这 些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读 框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于 对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在 植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因 (如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆 境筛选转化植株。
[00 29] 在本发明的实施例中，表达载体为PAHCPSK，对应的重组载体为PAHCPSK-GmEF13， PAHCPSK-GmEF13为将上述DNA分子插入PAHCPSK的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将 序列表的序列2自5'端第97至1440位核苷酸所示的DNA片段插入PAHCPSK的Sma I和 SacI酶切识别位点之间得到的重组载体。
[0030] 扩增上述DNA分子或其任意片段的引物对。
[0031] 所述引物对为 GmEF13-PAHCPSK F 和 GmEF13-PAHCPSK R:
[0032] GmEF13-PAHCPSK F :5'-CGGGATCCATGGGTAAGGAAAAGACTCACATC-3' ；
[0033] GmEF13-PAHCPSK R :5'-CCGCTCGAGTCACTTCTTCTTGGCAGCGG-3'。
[0034] 上述的蛋白质、上述的DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组 菌在调节植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。
[0035] 上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温；
[0036] 上述调节植物耐逆性为提高植物耐旱性和/或提高耐高温。
[0037] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0038] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0039] 本发明提供的方法，是将上述DNA分子导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目 的植物的转基因植物。
[0040] 上述方法中，上述DNA分子通过上述重组载体导入所述目的植物；
[0041] 所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温；
[0042] 所述耐旱性体现在PEG胁迫下，所述转基因植物主根长度高于所述目的植物；
[0043] 所述高温性体现在45°C胁迫下，所述转基因植物主根长度高于所述目的植物；
[0044] 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0045] 上述蛋白作为转录因子的应用也是本发明保护的范围。
[0046] 本发明的实验证明，本发明从大豆中克隆得到基因 GmEF13,在干旱、乙烯和油菜素 内酯的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞核中，并且可以特异的调控含有CCAAT-box顺 式元件(核心序列：CCAAT)的基因的转录表达，且本发明的GmEF13可以提高植物的耐旱性， 为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物 育种中发挥重要的作用。
【附图说明】
[0047] 图1为GmEF13与拟南芥氨基酸At5G60390氨基酸序列的同源性比对结果
[0048] 图2为GmEF13受胁迫诱导表达的荧光实时定量（Real-time) PCR图谱
[0049] 图3为分子检测在转基因拟南芥中的目的基因
[0050] 图4为野生型和转基因拟南芥抗旱性比较
[0051] 图5为野生型和转基因拟南芥抗高温比较
【具体实施方式】
[0052] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0053] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0055] 实施例1、基因 GmEF13的获得
[0056] 一、基因 GmNF-YA 15 的获得
[0057] 将水培的生长10天左右的大豆铁丰8号（国家种质资源库，编号ZM242 ;记载在如 下文献中：王彩洁，孙石，吴宝美，常汝镇，韩天富.20世纪40年代以来中国大面积种植大 豆品种的系谱分析。中国油料作物学报。2013,35(3):246 - 252,公众可从中国农业科学 院作物科学研究所获得）四叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80°C保存备用。采用 Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。第一链 cDNA 合 成用反转录酶XL (AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳 检测。
[0058] 通过5'RACE和3'RACE的方法获得大豆GmEF13基因全长序列序列表中的序列2。
[0059] 该序列表中序列2所示的基因命名为GmEF13,其开放阅读框架为自序列表的序列 2的5'端第97位到1440位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为GmEF13,该蛋白的氨基酸序 列为序列表中的序列1，序列1由447个氨基酸残基组成，具有保守的组蛋白折叠基序。
[0060] 上述序列2也可以通过人工合成。
[0061] GmEF13的序列在Genabnk上进行比对，与拟南芥中的蛋白At5G60390具有较高同 源性（图1)，而在大豆中未发现同源蛋白，证明GmEF13蛋白是一个新的蛋白。
[0062] 二、实时荧光定量PCR分析GmEF13的表达特性
[0063] 1、胁迫处理
[0064] 苗龄为10天的铁丰8号幼苗，进行以下处理：
[0065] (1)干旱处理（图2A):将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤 纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速 冻，-80°C保存备用。
[0066] (2)盐渍处理（图2B):将大豆幼苗置于200mM的由NaCl溶液中，光照培养30分 钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80°C保存 备用。
[0067] (3)脱落酸处理（图2C):将大豆幼苗置于100 μ M的脱落酸（ABA)溶液中，光照培 养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备 用。
[0068] (4)低温处理（图2E):将大豆幼苗置于4°C培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小 时、5小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0069] (5)高温处理（图2D):将大豆幼苗置于42°C下，光照培养30分钟、1小时、2小时、 5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0070] (6)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗_80°C冻存作为对照（0小时)。
[0071] 2、mRNA 的分离
[0072] 将上述各处理的大豆幼苗米用Quikprep Micro mRNA Purif ication Kit (Pharmacia)进行 mRNA 的分离。
[0073] 3、反转录为cDNA
[0074] 将纯化的mRNA反转录为cDNA。
[0075] 4、实时荧光定量PCR
[0076] 将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因3'端非编码区的特异引物对 (F:5' TCAAGTATGCCTGGGTGC3'，R:5' TTTCATCATACCTAGCCTTAGAGT3'）对样品进行 Q-RT-PCR 扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin(F:5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3'，R:5'_ GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3'）做内参。Q-RT-PCR 在 ABI PRISM* 7000 实时荧光定量 PCR 仪 上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)报道的方法， 即计算相对表达量。
[0077] Δ Δ Cj ( xarget Ct. Actin) Time x ^ ^T. Target Act in) TimeO
[0078] Time x表示任意时间点，Timetl表示经actin校正后I倍量的目标基因表达。
[0079] 结果见图3,可以看出GmEF13对干旱和盐渍胁迫有不同程度的响应。
[0080] 实施例2、GmEF13在提高植物的耐逆性中的应用
[0081] 一、转GmEF13拟南芥的获得
[0082] 1、重组载体的构建
[0083] I) GmEF13基因的克隆
[0084] 根据 GmEF13 基因的序列设计引物对（GmEF13-PAHCPSK F 和 GmEF13-PAHCPSK R)， 引物末端分别引入Sma I和SacI酶切识别位点，
[0085] GmEF13-PAHCPSK F :5'-CGGGATCCATGGGTAAGGAAAAGACTCACATC-3' ；
[0086] GmEF13-PAHCPSK R :5'-CCGCTCGAGTCACTTCTTCTTGGCAGCGG-3'。
[0087] 以大豆属大豆铁丰8号（Glycine max L. ) cDNA为模板，用GmEF13-PAHCPSK F和 GmEF13-PAHCPSK R进行PCR扩增，得到大小约1344bp的PCR产物（GmEF13基因）。
[0088] 回收上述PCR产物。
[0089] 2)、重组载体的构建
[0090] ①用限制性内切 酶Sma I和Sac I酶切步骤1回收的PCR产物，回收1344bp酶切 产物；
[0091] ②用限制性内切酶sma I和Sac I酶切PAHCPSK (Clontech公司购买)，回收 1344bp载体骨架；
[0092] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0093] ④将步骤③的连接产物电击转化T0P10菌株(购自北京天根公司)，37°C过夜培养， 挑取阳性克隆提取质粒进行测序。
[0094] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2所示第97-1440位核苷酸所示的的 DNA片段插入载体PAHCPSK的Sma I和Sac I酶切位点之间得到的重组载体，命名为 PAHCPSK-GmEF13〇
[0095] 3、重组农杆菌的获得
[0096] 用重组质粒PAHCPSK-GmEF13基因转化农杆菌C58C1 (北京拜尔迪生物技术公司购 买)，得到重组农杆菌C58Cl/PAHCPSK-GmEF13 (提取质粒送去测序，为PAHCPSK-GmEF13,则 含有该质粒的重组菌为阳性)。
[0097] 4、转GmEF13拟南芥获得
[0098] 1)将3得到的重组农杆菌接种于LB (含50mg/ml利福平，lOOmg/ml卡那霉 素，50mg/ml庆大霉素）液体培养基中，28°C、3000rpm培养约30小时，得到菌液；
[0099] 2)将菌液转至LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素） 中，28°C、300rpm培养约14小时(菌液0D600达到1.5-3. 0);
[0100] 3)收集菌体，4 °C、4000g离心10min，用含10%蔗糖MS液体培养基(含 0· 02%silwet)稀释至 0D600 约为 0· 8-1. O ;
[0101] 4)将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-ο, SALK公司购买，也称为野生型拟南芥）整株 与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆， 侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养， 收获T 1代种子，卡那霉素筛选(浓度为50 μ g/L卡那霉素)阳性植株为T1代再生植株，传代， 直到得到T3代再生植株。
[0102] T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T 2代自交产生的 种子及由它所长成的植株。
[0103] 提取T3R再生植株完整植株的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用引物对 F: 5' -TCAAGTATGCCTGGGTGC-3' ；R: 5' -GTGGTGGAGTCAATGATAAGG-3' ；进行 PCR 扩增。
[0104] 部分样本的结果见图4, M为Marker, col-0为哥伦比亚生态型野生型拟南芥， 0E1-0E3为T3代再生植株。
[0105] 0E1-0E3得到大小为199bp片段的为阳性，即为T3代转GmEF13拟南芥。
[0106] 采用同样的方法将质粒PAHCPSK转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，培 育获得T 3代转空载体拟南芥，采用同样的方法鉴定，未得到199bp片段。
[0107] 二、转基因植物的耐逆性鉴定
[0108] 1、干旱胁迫对萌发率影响
[0109] 将T3代转GmEF13拟南芥的3个株系0E-1、0E-2、0E-3、T 3代转空载体拟南芥和野 生型拟南芥各25粒种子经消毒处理后，用牙签单粒均匀分别点在MS培养基（MSO)和含有 8% (质量百分含量）PEG的MS培养基（4%PEG+MS0)上，用封口膜密封，放4°C放置3天后，移 入23°C，12h光照/8h黑暗，60%相对湿度的培养室中培7d后统计根长，每个处理设三个重 复，结果取平均值。
[0110] 结果如图5所示，可以看出，在不含PEG的MS培养基上，野生型拟南芥和T3代转 GmEF13拟南芥根长无显著差异；而在PEG胁迫下，T3代转GmEF13拟南芥根长高于野生型拟 南芥。
[0111] 统计主根长度，
[0112] MS培养基（MSO)中培养，野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系OE-I、 OE-2、0E-3 的主根长度分别为 3. 59cm、3. 46cm、3. 61cm、3. 88cm ;;
[0113] 在PEG胁迫下野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系0E-l、0E-2、0E-3的 主根长度分别为 I. 37cm、3. 05cm、2. 45cm、2. 71cm ;
[0114] 干旱胁迫处理后，转基因植物主根长度高于野生型，T3代转空载体拟南芥和野生 型拟南芥结果无显著差异。
[0115] 2、耐高温性鉴定
[0116] T3代转GmEF13拟南芥的株系OE-1、OE-2、OE-3、T3代转空载体拟南芥和野生型拟 南芥各25粒种子经消毒处理后，种植在MS培养基上，用封口膜密封，放4°C放置3天后，移 入23°C，12h光照/8h黑暗，60%相对湿度的培养室中培养5d后，用镊子移栽到新的MS培养 基上，分别在正常条件（25°C )和45°C处理2h后在正常条件下生长，每个处理设三个重复， 7d后观察表型。
[0117] 照片见图5。可以看出，在正常条件的MS培养基上，野生型拟南芥和T3代转GmEF13 拟南芥根长无显著差异；而在45°C高温胁迫下，T 3代转GmEF13拟南芥根长高于野生型拟南 芥。
[0118] 统计主根长度，
[0119] 正常条件培养，野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系0E-1、0E-2、0E-3 的主根长度分别为 3. 59cm、3. 46cm、3. 61cm、3. 88cm ;
[0120] 45°C高温胁迫下野生型拟南芥WT、T3代转GmEF13拟南芥的株系0Ε-1、0Ε-2、0Ε-3 的主根长度分别为 I. 23cm、L 82cm、2. 20cm、L 67cm ;
[0121] 高温胁迫处理后，转基因植物主根长度高于野生型，T3代转空载体拟南芥和野生 型拟南芥结果无显著差异。
[0122] 从上述实验可以看出，基因 GmEF13可以提高植物的耐旱性和耐高温性。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)-4)中任一 种DNA分子： 1)编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子； 2)编码区为序列表中序列2自5'末端第97-1440位核苷酸所示的的DNA分子； 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子； 4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分 子。4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体，得到表达权利要 求1所述蛋白质的载体。5.扩增权利要求2或3所述DNA分子或其任意片段的引物对。6.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的DNA分子或权利要求4所述的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。8. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述DNA分子导入目的植物中，得 到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述DNA分子通过权利 要求4所述重组载体导入所述目的植物； 所述耐逆性为耐旱性和/或耐高温。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于： 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
【专利摘要】本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmEF13及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的GmEF13在干旱、高盐和低温的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞核上，并且可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件（核心序列：CCAAT）的基因的转录表达。本发明的GmEF13可以提高植物的耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
【IPC分类】C12N15/11, C07K14/415, A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82
【公开号】CN104892740
【申请号】CN201410079112
【发明人】徐兆师, 马有志, 胡笛, 崔晓玉, 何冠华, 陈明, 李连城
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日
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