一种具有拮抗趋化因子受体cxcr4的活性多肽的及其设计制备和生物医学应用
一种具有拮抗趋化因子受体cxcr4的活性多肽的及其设计制备和生物医学应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有拮抗趋化因子受体CXCR4的活性多肽及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] CXCR4是CXC趋化因子受体家族的一员，总共有356个氨基酸残基。CXCR4是趋化 因子基质细胞衍生因子-I (SDF-1，CXCL12)的特异性受体，与SDF-I结合后使细胞产生趋化 作用。SDF-Ia和CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺 和脾，在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用。
[0003] CXCR4蛋白被发现与多种疾病密切相关。上世纪90年代，研宄人员发现了 HIV病 毒感染的共受体，即CXCR4和CCR5。这两个穿膜蛋白均属于趋化因子受体家族，且与HIV病 毒的入侵有着很大的联系。CXCR4是研宄最多的趋化因子受体之一，主要是它可作为HIV-I 入侵的辅助受体。因此，CXCR4蛋白也被认为是研宄抗HIV药物的重要靶点蛋白。
[0004] CXCR4与SDF-Ia轴可使造血干细胞回溯到骨髓。因此，阻断CXCR4与SDF-Ia的相 互作用可以使得造血干细胞从骨髓中迀移出来，用于治疗非霍杰金淋巴瘤和多发性骨髓瘤 化疗之后的造血功能损伤。
[0005] CXCR4在很多肿瘤组织中被发现过量表达，并且在肿瘤细胞的增殖，侵润，血管增 生，以及转移中起到非常重要的作用。CXCR4在23种不同类型肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞 表达最为普遍的趋化因子受体，并且和患者的预后相关。乳腺癌患者中，CXCR4表达阳性与 患者淋巴结、远处转移相关，而高表达CXCR4的乳房癌患者预后较差。关于结直肠癌的研宄 表明，CXCR4高表达与肿瘤的复发、肝脏转移相关，并且相应患者生存率也较低。另外，在卵 巢癌、黑素瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤等其他肿瘤的研宄中也得到了相似的结果。非小细 胞肺癌患者恶性胸水中肿瘤细胞CXCR4表达阳性，而胸膜间皮细胞则表达SDF-la，CXCR4/ SDF-Ia信号轴可能在非小细胞肺癌胸膜播散过程中起到了一定的作用。因此，CXCR4也是 靶向治疗肿瘤及肿瘤转移的研宄新热点。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种分支多肽及其衍生物的设计、合成和应用，目的之一是提供一 种具有拮抗CXCR4活性的抗艾滋病和相关免疫疾病的先导化合物。
[0007] 本发明所提供的分支多肽结构式为Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp-Lys -Cys-Ala-Leu-Gly-Tyr-Asn-Lys-Arg-Pro-Leu-Pro-Lys (NH2) - ε - (-AAn) 〇 其中，AAn 为 Leu -Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp，或 Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro，或 以上序列通过缺失、加入、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得到的多肽序列。上述 氨基酸为D型氨基酸或L型氨基酸。
[0008] 可在所述多肽的N端或残基侧链上被聚乙二醇化，所述的聚乙二醇分子的分子量 在2, 000到60, 000之间。
[0009] 可在所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行一个或多个羟基 化、羧基化、羰基化、甲基化、乙基化、磷酸化、酯化或糖基化，得到所述分支多肽衍生物。 [0010] 所述的分支多肽可以与酸或碱反应形成药学上可接受的盐类化合物。
[0011] 本发明的另一个目的是提供所述分支多肽及衍生物的应用。
[0012] 所述分支多肽可以用于治疗艾滋病及相关免疫疾病的药物分子。
[0013] 所述分支多肽可以用于进行干细胞动员的药物分子。
[0014] 所述分支多肽可以用于治疗急性髓系白血病的药物分子。
[0015] 与现有发明相比，本发明具有以下优点： 本发明的多肽为分枝状多肽，能显著提高多肽与蛋白的结合效率，具有很强的抗趋化 因子受体CXCR4的作用，表现出较强的抗肿瘤细胞转移和抗HIV-I病毒入侵的作用。且为 D型多肽，生物稳定性好。
【附图说明】
[0016] 图1 :多肽与蛋白结合模式图。
[0017] 图2 :多肽与蛋白结合位点。
[0018] 图3 :DD2多肽HPLC色谱图。
[0019] 图4 :DS1多肽的HPLC色谱图。
[0020] 图5 :DD2多肽MALDI质谱图。
[0021] 图6 :DS1多肽MALDI质谱图。
[0022] 图7 :DD2多肽的亲合活性。
[0023] 图8 :DS1多肽的亲合活性。
[0024] 图9 :DD2多肽的趋化活性。
[0025] 图10 :DS1多肽的趋化活性。
[0026] 图11 :DD2多肽的抗HIV-I病毒活性。
[0027] 图12 :DS1多肽的抗HIV-I病毒活性
[0028] 图13 :DD2多肽抑制细胞内钙流的活性
[0029] 图14 :DS1多肽抑制细胞内钙流的活性
【具体实施方式】 实施例1多肽的设计。
[0031] 多肽设计使用分子动力学模拟的方法来进行。具体是使用SYBYL-X软件包中 Biopolymer模块进行模拟计算，用以预测设计多肽与CXCR4蛋白的结合构象。CXCR4蛋白 模型由已发表的晶体结构所构建（PDB :30DU)。用软件对CXCR4晶体结构进行整理，去掉多 余的配体分子，水分子和其他小分子，对蛋白文件加氢和电荷，并得到mol2文件。多肽分子 的结构经过模拟退火和能量最小化得到能量相对较低的构象。通过手动调整，将多肽分子 移至蛋白分子的表面，并调整二面角避免分子碰撞。在分子动力学模拟的过程中，对多肽和 蛋白的结构进行溶剂化，选取水分子作为溶剂，水分子模型使用TIP3P模型。在Tripos力 场下，分子动力学模拟预先进行lOpsec，使系统温度参数梯度升高至300K。然后，分子动力 学模拟在300K的温度参数下保持lnsec。在分子动力学模拟过程中，只有多肽配体分子和 CXCR4蛋白中ECL的氨基酸残基可以运动，而其他的残基均保持坐标不变。运算结束之后， 使蛋白-多肽配体的系统重新能量最低化，并写入输出文件，并分析模拟过程中能量的变 化以及蛋白-多肽的结合方式。
[0032] 基于已知CXCR4的抑制剂多肽DV1。DVl是由CXCR4的另一个天然配体vMIP-II 的衍生化所得到的。vMIP-II是由人类疱瘆病毒8所编码的一个类趋化因子蛋白，是CXCR4 的天然抑制性配体。同时，vMIP-II也可以和CCR5/CCR3等其他的趋化因子受体结合。根 据对vMIP-II的构效关系研宄发现，vMIP-II的N端21个氨基酸残基的多肽转变为D型氨 基酸时，D型多肽的活性比Vl更强，且具有很好的受体选择性。我们选取该多肽作为设计 新型多肽的一个模板。
[0033] 实施例2多肽的合成和纯化。
[0034] 采用固相合成方法来合成多肽。固相树脂采用TentaGel Amide树脂，通过分离得 到的多肽为C端氨基化的多肽。所有的氨基酸均使用9-芴甲氧羰基（9-Fmoc)保护氨基。 在合成过程中，第一个氨基酸的羧基与固相树脂的活化氨基形成酰胺键，连接在固相上。通 过20%的哌啶80%二甲基甲酰胺（DMF)的脱保护作用，将Fmoc基团脱去，露出氨基，并在 缩合剂DIC(5当量）和H0Bt(5当量）的作用下与下一个氨基酸（5当量）的羧基反应。多 余的反应物和缩合剂在反应后通过用DMF清洗固相树脂而除去。这样，多肽的序列就从C 端到N端一个个连接在固相树脂上面。当最后一个氨基酸连接完毕后，使用多肽分离试剂 使多肽从固相树脂上分离下来。多肽分离试剂使用90%三氟乙酸，5%硫代苯酚和5%的水 经混合后得到。多肽分离试剂同时也能脱掉氨基酸残基上面多余的保护基团。通常，反应 时间为2小时，期间用玻璃棒轻轻搅拌数次，如多肽序列里面有精氨酸等则能观察到树脂 的颜色变成深红色。分离结束后，用空气吹去多余的溶剂至残留1~2mL，使用预冷的乙醚 (IOmL)沉淀多肽30min。沉淀完毕后，使用离心机将多肽收集在试管底部，倒掉上清。沉淀 后的多肽用双蒸水溶解，放置在冻干机中干燥，得到粗品多肽。
[0035] 赖氨酸的4个碳的侧链作为连接桥连接两个多肽模板。赖氨酸的侧链由 Dde (N-[l_ (4,4-dimethyl_2,6-dioxocyclohex-1-ylidene ethyl]))基团保护，脱保护时 使用温和的脱保护剂肼的DMF溶液（2%)。脱保护反应重复3次，每次2min，之后用DMF清 洗树脂并用Kaiser测试检验脱 保护反应是否完成。反应完毕后，赖氨酸的侧链氨基即与新 的氨基酸的羧基反应，得到分枝状的多肽。
[0036] 多肽合成完毕后得到的粗品肽，使用制备型高效液相色谱仪进行纯化。在检测好 的纯化条件进行纯化，收集色谱中出现的色谱峰，并置于冻干机中干燥。干燥后的多肽用 分析型高效液相色谱进行纯度鉴定，并用基质辅助激光解吸/电离质谱检测其分子量来确 认。所有的多肽的纯度均达95%以上。
[0037] 实施例3多肽的亲合活性测试。
[0038] HEK293细胞外源性的插入了 CXCR4的质粒，能够稳定表达CXCR4蛋白。该细胞在 RPMI1640 (10%小牛血清，100IU青霉素，0· lmg/mL链霉素，2mM谷氨酰胺）中培养，并加入 0. 4mg/mL的G418加以筛选。实验之前，HEK293细胞用胰酶消化并收集，用4°C的FACS缓 冲液（0. 5% BSA，0. 05%叠氮化钠的PBS溶液）洗涤两遍，并最终用缓冲液稀释成I X IO7细 胞/mL。细胞被混合均匀后置于锥形孔的96孔板，每孔5 X IO5细胞。一抗（12G5,鼠抗人 CXCR4抗体，1 : 3000)和不同浓度的多肽与细胞在冰上孵育40min后，用FACS缓冲液洗涤 细胞2次。完毕后，加二抗（抗鼠抗体-FITC，I : 250)冰上避光孵育30min。反应完毕后， 用FACS缓冲液洗涤细胞两次。细胞的荧光强度（485EX/528EM)由荧光检测仪（Synergy 2， BioTek)所记录。实验数据是由至少三次独立实验所得到，每次实验均有两次重复。CXCR4 的结合曲线用Sigmoidal dose-response模型所得到，105(|值则由GraphPad Prism 4计算 得出。
[0039] 实施例4多肽的趋化活性测试。
[0040] 本实验所用的细胞是天然表达CXCR4蛋白的SUP-Tl细胞系。SUP-Tl细胞在 RPMI1640(10%小牛血清，100IU青霉素，0. lmg/mL链霉素，2mM谷氨酰胺）中培养，实验开始 前收集细胞，确定细胞密度。SUP-Tl细胞用缓冲液洗涤两次，并稀释成终密度为1. 25 X IO7/ mL的细胞混悬液。将IX IO6的细胞置于Transwell (Corning)的上层孔中。下层孔加入 200uL的缓冲液和SDF-Ia作为促使细胞迀移的趋化物。在抑制剂实验模式中，上层孔中的 细胞在进行细胞迀移之前，与不同浓度的抑制剂预先37°C孵育2hr。孵育后，将上层孔板置 于下层孔中，置于细胞孵育箱中，使细胞迀移3hr。在激活剂实验模式中，下层孔的缓冲液除 了加入SDF-Ia之外，也在平行孔中加入不同浓度的多肽。然后将上层孔板置于下层孔中， 置于细胞孵育箱中，使细胞迀移3hr。孵育结束后，移走上层孔板，在下层孔中加入40uL/孔 的CellTiter Blue (Promoga)，用来定量迀移至下层孔的细胞。实验数据由至少3次独立实 验所得到，每次实验均有2次重复。
[0041] 实施例5多肽的抗HIV-I病毒活性测试。
[0042] 本实验所需要的细胞是Cf2TH-CD4-CXCR4或Cf2Th-CXCR4细胞系。在感染实验之 前，细胞以6X IO3/孔的密度置于96孔板中，并孵育24hr。感染实验当天，将不同浓度的抑 制剂（1~IOOuM)加入病毒中（10000个逆转录酶单位），37°C孵育30min。将细胞中的培养 液移走，加入病毒-抑制剂混合物，在37°C中孵育48hr。孵育结束后，将细胞的培养液移走 并加入细胞裂解液，冻融3次后完全裂解细胞。在细胞裂解物中加入IOOuL荧光素缓冲液 (15mM MgS04，15mM KP04，lmM ATP，lmM DTT)和 50uL 的 D-荧光素钾（lmN，BD Pharmingen)， 并用生物发光酶标仪（EG&G Berthold MicroplateLuminometer LB 96V)记录焚光信号。
[0043] 实施例6多肽对细胞钙流的测试。
[0044] 本实验所用的细胞是SUP-Tl细胞系。实验前收集细胞，给细胞计数以确定细胞密 度，用实验缓冲液（20mM HEPES的HBSS溶液）洗涤细胞，并最终将细胞液稀释成I X 106/mL。 本实验使用Fura-2AM(Molecular Probes)用于追踪1?离子的信号，同时使用丙磺舒作为离 子通道抑制剂阻止细胞将Fura-2AM泵出。当SDF-Ia或CXCR4激活剂与CXCR4结合并触发 信号转导通路时，钙离子从内质网流出，与细胞质内的Fura-2AM结合，形成高强度的荧光 螯合物，被荧光检测仪所检测，以此确定受体是否被激活。CXCR4钙离子内流实验也分为抑 制剂模式和激活剂模式。
[0045] CXCR4激动剂模式：稀释好的细胞悬浊液用Fura-2AM Dye (2uM)与丙磺舒（5uM)染 色，放于37°C的细胞孵育箱中45min，每IOmin混匀一次。染色结束后，用实验缓冲液洗涤 细胞2次。将细胞液加入石英分光液槽中，置入荧光检测仪中，调整波长为340EX/510EM，记 录荧光信号。手动加入不同浓度的SDF-la(50nM)或CXCR4激动剂（IOnM~IOuM)后，观察 是否能够增加荧光强度。
[0046] CXCR4抑制剂模式：细胞处理方法同激动剂模式。在细胞液加入石英分光液槽后， 先加入一定浓度的抑制剂（IOnM~IOuM)，等待120sec，再加入SDF-Ia (50nM)。观察荧光信 号与没有加抑制剂组的差别。 表1本发明中包括的多种分支多肽的序列
a斜体字表示为D型氨基酸
【主权项】
1. 具有CXCR4拮抗活性的分支多肽，其特征在于：所述分支多肽的序列从氨基端到羧 基端的序列如下：Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp-Lys-Cys-Ala-Leu-Gly-Tyr-As n-Lys-Arg-Pr〇-Leu-Pr〇-Lys(NH2)-e- (-AAn)，其中，AAn为Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-A rg-Pro-Asp，或Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro,或以上序列通过缺失、加入、 插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得到的分支多肽序列，上述氨基酸为D型氨基酸 或L型氨基酸，实施例中多肽序列见序列表1。2. 根据权利要求1所述分支多肽，其特征在于：所述分支多肽的N端或残基侧链上被 聚乙二醇化，所述的聚乙二醇分子的分子量在2, 000到60, 000之间。3. -种分支多肽衍生物，是在权利要求1或2所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨 基端或羧基端进行一个或多个羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖 基化所得到的衍生物。4. 一种分支多肽衍生物，是权利要求1、2或3所述的分支多肽的药学上可接受的盐。5. 根据权利要求1-4所述多肽的制备方法，其特征在于： (1) 采用分子动力学模拟的方法，预测多肽的空间构象，并确定多肽的序列； (2) 固相合成方法合成目标多肽，并使用HPLC进行纯化； (3) 检验多肽的生物活性，筛选目标多肽。6. 根据权利要求5所述多肽的制备方法，其特征在于步骤（3)中所述生物活性检测，包 括受体亲和性实验，趋化抑制实验，细胞内钙流实验和抗HIV-I侵入实验。7. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在抗艾滋病和免疫相关疾病中作 为先导药物的应用。8. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在干细胞动员作为先导药物的应 用。9. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在急性髓系白血病中作为先导药 物的应用。10. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在其他CXCR4受体相关疾病中 作为先导药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种设计具有天然趋化因子N端区域的活性多肽。这类活性多肽通过拮抗趋化因子受体的活性，从而抑制HIV-1侵入细胞并感染。本发明还公开了这类活性多肽的设计方法，通过分子动力学模拟，设计合适的连接桥将两个多肽片段连接起来，确定多肽合成序列，固相合成多肽，并最终测试活性多肽的生物学活性。本发明的活性多肽可作为CXCR4受体的拮抗剂，用于治疗艾滋病的先导药物，干细胞动员剂，急性髓系白血病，以及与CXCR4相关的多种疾病的治疗。
【IPC分类】A61K38/17, C07K1/04, A61P37/00, A61P31/18, A61P35/02, A61P35/00, C07K14/435
【公开号】CN104892744
【申请号】CN201510037065
【发明人】不公告发明人
【申请人】徐岩, 黄子为
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年1月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有拮抗趋化因子受体CXCR4的活性多肽及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] CXCR4是CXC趋化因子受体家族的一员，总共有356个氨基酸残基。CXCR4是趋化 因子基质细胞衍生因子-I (SDF-1，CXCL12)的特异性受体，与SDF-I结合后使细胞产生趋化 作用。SDF-Ia和CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺 和脾，在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用。
[0003] CXCR4蛋白被发现与多种疾病密切相关。上世纪90年代，研宄人员发现了 HIV病 毒感染的共受体，即CXCR4和CCR5。这两个穿膜蛋白均属于趋化因子受体家族，且与HIV病 毒的入侵有着很大的联系。CXCR4是研宄最多的趋化因子受体之一，主要是它可作为HIV-I 入侵的辅助受体。因此，CXCR4蛋白也被认为是研宄抗HIV药物的重要靶点蛋白。
[0004] CXCR4与SDF-Ia轴可使造血干细胞回溯到骨髓。因此，阻断CXCR4与SDF-Ia的相 互作用可以使得造血干细胞从骨髓中迀移出来，用于治疗非霍杰金淋巴瘤和多发性骨髓瘤 化疗之后的造血功能损伤。
[0005] CXCR4在很多肿瘤组织中被发现过量表达，并且在肿瘤细胞的增殖，侵润，血管增 生，以及转移中起到非常重要的作用。CXCR4在23种不同类型肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞 表达最为普遍的趋化因子受体，并且和患者的预后相关。乳腺癌患者中，CXCR4表达阳性与 患者淋巴结、远处转移相关，而高表达CXCR4的乳房癌患者预后较差。关于结直肠癌的研宄 表明，CXCR4高表达与肿瘤的复发、肝脏转移相关，并且相应患者生存率也较低。另外，在卵 巢癌、黑素瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤等其他肿瘤的研宄中也得到了相似的结果。非小细 胞肺癌患者恶性胸水中肿瘤细胞CXCR4表达阳性，而胸膜间皮细胞则表达SDF-la，CXCR4/ SDF-Ia信号轴可能在非小细胞肺癌胸膜播散过程中起到了一定的作用。因此，CXCR4也是 靶向治疗肿瘤及肿瘤转移的研宄新热点。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种分支多肽及其衍生物的设计、合成和应用，目的之一是提供一 种具有拮抗CXCR4活性的抗艾滋病和相关免疫疾病的先导化合物。
[0007] 本发明所提供的分支多肽结构式为Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp-Lys -Cys-Ala-Leu-Gly-Tyr-Asn-Lys-Arg-Pro-Leu-Pro-Lys (NH2) - ε - (-AAn) 〇 其中，AAn 为 Leu -Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp，或 Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro，或 以上序列通过缺失、加入、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得到的多肽序列。上述 氨基酸为D型氨基酸或L型氨基酸。
[0008] 可在所述多肽的N端或残基侧链上被聚乙二醇化，所述的聚乙二醇分子的分子量 在2, 000到60, 000之间。
[0009] 可在所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行一个或多个羟基 化、羧基化、羰基化、甲基化、乙基化、磷酸化、酯化或糖基化，得到所述分支多肽衍生物。 [0010] 所述的分支多肽可以与酸或碱反应形成药学上可接受的盐类化合物。
[0011] 本发明的另一个目的是提供所述分支多肽及衍生物的应用。
[0012] 所述分支多肽可以用于治疗艾滋病及相关免疫疾病的药物分子。
[0013] 所述分支多肽可以用于进行干细胞动员的药物分子。
[0014] 所述分支多肽可以用于治疗急性髓系白血病的药物分子。
[0015] 与现有发明相比，本发明具有以下优点： 本发明的多肽为分枝状多肽，能显著提高多肽与蛋白的结合效率，具有很强的抗趋化 因子受体CXCR4的作用，表现出较强的抗肿瘤细胞转移和抗HIV-I病毒入侵的作用。且为 D型多肽，生物稳定性好。
【附图说明】
[0016] 图1 :多肽与蛋白结合模式图。
[0017] 图2 :多肽与蛋白结合位点。
[0018] 图3 :DD2多肽HPLC色谱图。
[0019] 图4 :DS1多肽的HPLC色谱图。
[0020] 图5 :DD2多肽MALDI质谱图。
[0021] 图6 :DS1多肽MALDI质谱图。
[0022] 图7 :DD2多肽的亲合活性。
[0023] 图8 :DS1多肽的亲合活性。
[0024] 图9 :DD2多肽的趋化活性。
[0025] 图10 :DS1多肽的趋化活性。
[0026] 图11 :DD2多肽的抗HIV-I病毒活性。
[0027] 图12 :DS1多肽的抗HIV-I病毒活性
[0028] 图13 :DD2多肽抑制细胞内钙流的活性
[0029] 图14 :DS1多肽抑制细胞内钙流的活性
【具体实施方式】 实施例1多肽的设计。
[0031] 多肽设计使用分子动力学模拟的方法来进行。具体是使用SYBYL-X软件包中 Biopolymer模块进行模拟计算，用以预测设计多肽与CXCR4蛋白的结合构象。CXCR4蛋白 模型由已发表的晶体结构所构建（PDB :30DU)。用软件对CXCR4晶体结构进行整理，去掉多 余的配体分子，水分子和其他小分子，对蛋白文件加氢和电荷，并得到mol2文件。多肽分子 的结构经过模拟退火和能量最小化得到能量相对较低的构象。通过手动调整，将多肽分子 移至蛋白分子的表面，并调整二面角避免分子碰撞。在分子动力学模拟的过程中，对多肽和 蛋白的结构进行溶剂化，选取水分子作为溶剂，水分子模型使用TIP3P模型。在Tripos力 场下，分子动力学模拟预先进行lOpsec，使系统温度参数梯度升高至300K。然后，分子动力 学模拟在300K的温度参数下保持lnsec。在分子动力学模拟过程中，只有多肽配体分子和 CXCR4蛋白中ECL的氨基酸残基可以运动，而其他的残基均保持坐标不变。运算结束之后， 使蛋白-多肽配体的系统重新能量最低化，并写入输出文件，并分析模拟过程中能量的变 化以及蛋白-多肽的结合方式。
[0032] 基于已知CXCR4的抑制剂多肽DV1。DVl是由CXCR4的另一个天然配体vMIP-II 的衍生化所得到的。vMIP-II是由人类疱瘆病毒8所编码的一个类趋化因子蛋白，是CXCR4 的天然抑制性配体。同时，vMIP-II也可以和CCR5/CCR3等其他的趋化因子受体结合。根 据对vMIP-II的构效关系研宄发现，vMIP-II的N端21个氨基酸残基的多肽转变为D型氨 基酸时，D型多肽的活性比Vl更强，且具有很好的受体选择性。我们选取该多肽作为设计 新型多肽的一个模板。
[0033] 实施例2多肽的合成和纯化。
[0034] 采用固相合成方法来合成多肽。固相树脂采用TentaGel Amide树脂，通过分离得 到的多肽为C端氨基化的多肽。所有的氨基酸均使用9-芴甲氧羰基（9-Fmoc)保护氨基。 在合成过程中，第一个氨基酸的羧基与固相树脂的活化氨基形成酰胺键，连接在固相上。通 过20%的哌啶80%二甲基甲酰胺（DMF)的脱保护作用，将Fmoc基团脱去，露出氨基，并在 缩合剂DIC(5当量）和H0Bt(5当量）的作用下与下一个氨基酸（5当量）的羧基反应。多 余的反应物和缩合剂在反应后通过用DMF清洗固相树脂而除去。这样，多肽的序列就从C 端到N端一个个连接在固相树脂上面。当最后一个氨基酸连接完毕后，使用多肽分离试剂 使多肽从固相树脂上分离下来。多肽分离试剂使用90%三氟乙酸，5%硫代苯酚和5%的水 经混合后得到。多肽分离试剂同时也能脱掉氨基酸残基上面多余的保护基团。通常，反应 时间为2小时，期间用玻璃棒轻轻搅拌数次，如多肽序列里面有精氨酸等则能观察到树脂 的颜色变成深红色。分离结束后，用空气吹去多余的溶剂至残留1~2mL，使用预冷的乙醚 (IOmL)沉淀多肽30min。沉淀完毕后，使用离心机将多肽收集在试管底部，倒掉上清。沉淀 后的多肽用双蒸水溶解，放置在冻干机中干燥，得到粗品多肽。
[0035] 赖氨酸的4个碳的侧链作为连接桥连接两个多肽模板。赖氨酸的侧链由 Dde (N-[l_ (4,4-dimethyl_2,6-dioxocyclohex-1-ylidene ethyl]))基团保护，脱保护时 使用温和的脱保护剂肼的DMF溶液（2%)。脱保护反应重复3次，每次2min，之后用DMF清 洗树脂并用Kaiser测试检验脱 保护反应是否完成。反应完毕后，赖氨酸的侧链氨基即与新 的氨基酸的羧基反应，得到分枝状的多肽。
[0036] 多肽合成完毕后得到的粗品肽，使用制备型高效液相色谱仪进行纯化。在检测好 的纯化条件进行纯化，收集色谱中出现的色谱峰，并置于冻干机中干燥。干燥后的多肽用 分析型高效液相色谱进行纯度鉴定，并用基质辅助激光解吸/电离质谱检测其分子量来确 认。所有的多肽的纯度均达95%以上。
[0037] 实施例3多肽的亲合活性测试。
[0038] HEK293细胞外源性的插入了 CXCR4的质粒，能够稳定表达CXCR4蛋白。该细胞在 RPMI1640 (10%小牛血清，100IU青霉素，0· lmg/mL链霉素，2mM谷氨酰胺）中培养，并加入 0. 4mg/mL的G418加以筛选。实验之前，HEK293细胞用胰酶消化并收集，用4°C的FACS缓 冲液（0. 5% BSA，0. 05%叠氮化钠的PBS溶液）洗涤两遍，并最终用缓冲液稀释成I X IO7细 胞/mL。细胞被混合均匀后置于锥形孔的96孔板，每孔5 X IO5细胞。一抗（12G5,鼠抗人 CXCR4抗体，1 : 3000)和不同浓度的多肽与细胞在冰上孵育40min后，用FACS缓冲液洗涤 细胞2次。完毕后，加二抗（抗鼠抗体-FITC，I : 250)冰上避光孵育30min。反应完毕后， 用FACS缓冲液洗涤细胞两次。细胞的荧光强度（485EX/528EM)由荧光检测仪（Synergy 2， BioTek)所记录。实验数据是由至少三次独立实验所得到，每次实验均有两次重复。CXCR4 的结合曲线用Sigmoidal dose-response模型所得到，105(|值则由GraphPad Prism 4计算 得出。
[0039] 实施例4多肽的趋化活性测试。
[0040] 本实验所用的细胞是天然表达CXCR4蛋白的SUP-Tl细胞系。SUP-Tl细胞在 RPMI1640(10%小牛血清，100IU青霉素，0. lmg/mL链霉素，2mM谷氨酰胺）中培养，实验开始 前收集细胞，确定细胞密度。SUP-Tl细胞用缓冲液洗涤两次，并稀释成终密度为1. 25 X IO7/ mL的细胞混悬液。将IX IO6的细胞置于Transwell (Corning)的上层孔中。下层孔加入 200uL的缓冲液和SDF-Ia作为促使细胞迀移的趋化物。在抑制剂实验模式中，上层孔中的 细胞在进行细胞迀移之前，与不同浓度的抑制剂预先37°C孵育2hr。孵育后，将上层孔板置 于下层孔中，置于细胞孵育箱中，使细胞迀移3hr。在激活剂实验模式中，下层孔的缓冲液除 了加入SDF-Ia之外，也在平行孔中加入不同浓度的多肽。然后将上层孔板置于下层孔中， 置于细胞孵育箱中，使细胞迀移3hr。孵育结束后，移走上层孔板，在下层孔中加入40uL/孔 的CellTiter Blue (Promoga)，用来定量迀移至下层孔的细胞。实验数据由至少3次独立实 验所得到，每次实验均有2次重复。
[0041] 实施例5多肽的抗HIV-I病毒活性测试。
[0042] 本实验所需要的细胞是Cf2TH-CD4-CXCR4或Cf2Th-CXCR4细胞系。在感染实验之 前，细胞以6X IO3/孔的密度置于96孔板中，并孵育24hr。感染实验当天，将不同浓度的抑 制剂（1~IOOuM)加入病毒中（10000个逆转录酶单位），37°C孵育30min。将细胞中的培养 液移走，加入病毒-抑制剂混合物，在37°C中孵育48hr。孵育结束后，将细胞的培养液移走 并加入细胞裂解液，冻融3次后完全裂解细胞。在细胞裂解物中加入IOOuL荧光素缓冲液 (15mM MgS04，15mM KP04，lmM ATP，lmM DTT)和 50uL 的 D-荧光素钾（lmN，BD Pharmingen)， 并用生物发光酶标仪（EG&G Berthold MicroplateLuminometer LB 96V)记录焚光信号。
[0043] 实施例6多肽对细胞钙流的测试。
[0044] 本实验所用的细胞是SUP-Tl细胞系。实验前收集细胞，给细胞计数以确定细胞密 度，用实验缓冲液（20mM HEPES的HBSS溶液）洗涤细胞，并最终将细胞液稀释成I X 106/mL。 本实验使用Fura-2AM(Molecular Probes)用于追踪1?离子的信号，同时使用丙磺舒作为离 子通道抑制剂阻止细胞将Fura-2AM泵出。当SDF-Ia或CXCR4激活剂与CXCR4结合并触发 信号转导通路时，钙离子从内质网流出，与细胞质内的Fura-2AM结合，形成高强度的荧光 螯合物，被荧光检测仪所检测，以此确定受体是否被激活。CXCR4钙离子内流实验也分为抑 制剂模式和激活剂模式。
[0045] CXCR4激动剂模式：稀释好的细胞悬浊液用Fura-2AM Dye (2uM)与丙磺舒（5uM)染 色，放于37°C的细胞孵育箱中45min，每IOmin混匀一次。染色结束后，用实验缓冲液洗涤 细胞2次。将细胞液加入石英分光液槽中，置入荧光检测仪中，调整波长为340EX/510EM，记 录荧光信号。手动加入不同浓度的SDF-la(50nM)或CXCR4激动剂（IOnM~IOuM)后，观察 是否能够增加荧光强度。
[0046] CXCR4抑制剂模式：细胞处理方法同激动剂模式。在细胞液加入石英分光液槽后， 先加入一定浓度的抑制剂（IOnM~IOuM)，等待120sec，再加入SDF-Ia (50nM)。观察荧光信 号与没有加抑制剂组的差别。 表1本发明中包括的多种分支多肽的序列
a斜体字表示为D型氨基酸
【主权项】
1. 具有CXCR4拮抗活性的分支多肽，其特征在于：所述分支多肽的序列从氨基端到羧 基端的序列如下：Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp-Lys-Cys-Ala-Leu-Gly-Tyr-As n-Lys-Arg-Pr〇-Leu-Pr〇-Lys(NH2)-e- (-AAn)，其中，AAn为Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-A rg-Pro-Asp，或Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro,或以上序列通过缺失、加入、 插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得到的分支多肽序列，上述氨基酸为D型氨基酸 或L型氨基酸，实施例中多肽序列见序列表1。2. 根据权利要求1所述分支多肽，其特征在于：所述分支多肽的N端或残基侧链上被 聚乙二醇化，所述的聚乙二醇分子的分子量在2, 000到60, 000之间。3. -种分支多肽衍生物，是在权利要求1或2所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨 基端或羧基端进行一个或多个羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖 基化所得到的衍生物。4. 一种分支多肽衍生物，是权利要求1、2或3所述的分支多肽的药学上可接受的盐。5. 根据权利要求1-4所述多肽的制备方法，其特征在于： (1) 采用分子动力学模拟的方法，预测多肽的空间构象，并确定多肽的序列； (2) 固相合成方法合成目标多肽，并使用HPLC进行纯化； (3) 检验多肽的生物活性，筛选目标多肽。6. 根据权利要求5所述多肽的制备方法，其特征在于步骤（3)中所述生物活性检测，包 括受体亲和性实验，趋化抑制实验，细胞内钙流实验和抗HIV-I侵入实验。7. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在抗艾滋病和免疫相关疾病中作 为先导药物的应用。8. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在干细胞动员作为先导药物的应 用。9. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在急性髓系白血病中作为先导药 物的应用。10. 根据权利要求1-4所述多肽作为CXCR4受体拮抗剂在其他CXCR4受体相关疾病中 作为先导药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种设计具有天然趋化因子N端区域的活性多肽。这类活性多肽通过拮抗趋化因子受体的活性，从而抑制HIV-1侵入细胞并感染。本发明还公开了这类活性多肽的设计方法，通过分子动力学模拟，设计合适的连接桥将两个多肽片段连接起来，确定多肽合成序列，固相合成多肽，并最终测试活性多肽的生物学活性。本发明的活性多肽可作为CXCR4受体的拮抗剂，用于治疗艾滋病的先导药物，干细胞动员剂，急性髓系白血病，以及与CXCR4相关的多种疾病的治疗。
【IPC分类】A61K38/17, C07K1/04, A61P37/00, A61P31/18, A61P35/02, A61P35/00, C07K14/435
【公开号】CN104892744
【申请号】CN201510037065
【发明人】不公告发明人
【申请人】徐岩, 黄子为
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年1月26日
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