一种检测宫颈癌标志物-foxp3自身抗体表位氨基酸序列及应用
一种检测宫颈癌标志物-foxp3自身抗体表位氨基酸序列及应用
【专利说明】-种检测宫颈癌标志物-F0XP3自身抗体表位氨基酸序列 及应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于免疫学技术领域，是一种用于制备宫颈癌早期诊断试剂和开发宫颈癌 治疗靶向药物的基础。
【背景技术】
[0003] 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁着妇女的健康。根据世界卫生组 织的统计数据，其发病率仅次于乳腺癌，并成逐年增高和年轻化趋势。每年宫颈癌的新发病 例有46. 6万左右，其中80%的病例发生在发展中国家，死亡病例约有27万。我国每年新发 病例约有10万，占世界新发病例总数近20%，且近年来呈现地区增长及发病年龄提前的现 象，迫切需要识别和发现宫颈癌早期诊断的血清肿瘤标志物，以降低宫颈癌漏诊率和死亡 率。
[0004] 大量研宄表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生抗原表位，在肿瘤 患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的抗原表位。因此，既可以利用抗原 表位检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤抗原表位，但利用肿瘤抗原表位检测肿瘤的 特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者 体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而抗原表 位在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内抗原表位水平明显增高，则表明 体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加 重。
[0005] 近年来的研宄表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5 年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原抗原表位。因此，检测血中肿瘤相关抗原抗原表 位具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方 向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的抗体 检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种肿瘤 相关抗原抗原表位在患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏感度是当 前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的抗原表 位，然后与现有已知的抗原表位组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。
[0006] 叉头状 / 翼状螺旋转录因子 3 (forkhead or winged helix transcription， F0XP3)在组织间质中表达于T细胞核中，在癌细胞中表达于胞浆。人类的F0XP3基因位于 XplL 23,包含11个外显子和10个内含子，cDNA全长为1869 bpi0XP3控制CD4+CD25+Treg 细胞的产生，并且决定其抑制功能。研宄表明无论是胸腺还是外周起源的调节性T细胞 (Treg)都能特异性地表达F0XP3,并主要表达在⑶4+⑶25+ Treg细胞上，是其最具特异性 的标志。Treg细胞的表达抑制其他T细胞的活化，阻碍机体对癌症的免疫监视，抑制肿瘤 细胞抗原的自身抗体发挥有效的免疫反应，以此给肿瘤提供免疫逃逸环境，促进肿瘤发生 发展。F0XP3还直接抑制T细胞的两个关键转录因子一一活化T细胞核因子（NFAT)和核 因子κ B(NF-k B)的活性，二者是T细胞功能和细胞因子表达的决定因素。在癌组织中， F0XP3抑制体内的抗肿瘤免疫反应，使癌细胞发生肿瘤逃逸；另一方面F0XP3作为一种转录 因子，促进了肿瘤的浸润进展和转移。
[0007] 本发明通过自行设计的F0XP3的抗原多肽，检测肿瘤患者血清及血浆中抗原表位 水平并开发相应的试剂，预测肿瘤发生的危险性，并为肿瘤新药研宄提供可靠的数据。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是公开一种肿瘤标志物F0XP3抗原表位。
[0009] 本发明同时公开了 F0XP3抗原表位的用途。
[0010] 本发明提供的一种检测肿瘤标志物F0XP3抗原表位的氨基酸序列为： DRWAILEAPEKQRTLNEAVWTVDELEFRKKRSQ 纯度 >95%, ρΗ>7· 0。
[0011] 本发明所述的F0XP3抗原多肽在制备预测宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
[0012] 本发明利用自行设计的F0XP3蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测宫颈癌患者血 清及血浆中抗F0XP3蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体 内F0XP3蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肿瘤，可以预测宫颈癌发 生与复发的危险性，指导临床医生对宫颈癌的早期诊断。
[0013] F0XP3蛋白质氨基酸序列见Tab. 1
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间 结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲 和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程， 蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。另外，ELISA法的 高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
[0014] 发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不 形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源 性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2个Pro利于肽链 结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原（HLA) 系统的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90%以上 华人群体的HLA二类抗原系统所识别。
[0015] 基于以上抗原设计原则及F0XP3蛋白的生物学特性，本发明利用生物信息学和多 个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了的线性氨基酸序列(见Tab. 1)。加 框部分是多肽片段在蛋白质中的位置。
[0016] F0XP3: forkhead box P3 1-60 mpnprpgkps apslalgpsp gaspswraap kasdllgarg pggtfqgrdl rggahassss 61-120 lnpmppsqlq lstvdahart pvlqvhples pamisltppt tatgvfslka rpglppginv 121-180 aslewvsrep allctfpnps aprkdstlsa vpqssyplla ngvckwpgce kvfeepedfI 181-240 khcqadhlld ekgraqcllq remvqsleqq lvlekeklsa mqahlagkma ltkassvass 241-300 dkgsccivaa gsqgpvvpaw sgpreapdsl favrrhlwgs hgnstfpefI hnmdyfkfhn 301-360 mrppftyatl irwaileape kqrtlneiyh wftrmfaffr nhpatwknai rhnlslhkcf 361-396 vrvesekgav wtvdelefrk krsqrpsrcs nptpgp 由以上蛋白序列可知，FOXP3线性多肽 抗原由33个氨基酸残基组成，共含12个重叠表 位，可检测至少12种单克隆抗体，具有高度的特异性。
[0017] ELISA法检测抗原表位 (1)酶标板设计：每份血浆样本各设人F0XP3抗原多肽双复孔，山羊多肽对照抗原 (gAg)双复孔和阴性对照双复孔（NC)。gAg抗原与人类蛋白质组无同源性，目的是减低非特 异性结合反应的干扰，gAg的工作浓度范围10-2(^g/ml。
[0018] (2)包被：抗原多肽用包被液（ρΗ7· 4 0· OlM PBS/0. l%NaN3)包被于96孔酶标板 (C0STAR，美国），每孔10〇μ1，两条P16抗原多肽混合为包被浓度lPg/ml，gAg包被浓度为 lKg/ml，4°C 过夜。
[0019] (3 ) -抗/血浆孵育：0. 005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用分析液（0. 0IM PBS+1%BSA)将血浆 1:150 稀释，每孔 10〇μ1，37?孵育 I. 5h ; (4)二抗孵育：0.005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用分析液（同前)稀释，取甘油（1:1) 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG (美国，Sigma)抗体5ul (浓度稀释为1:2倍）， 加入分析液45ul (浓度稀释为1:20倍），充分混合后取适量体积，再用分析液稀释1500 倍，达到1:30000的稀释倍数。每孔加10〇μ1，37?孵育Ih;辣根过氧化物酶标记的羊抗 人 IgG ELISA 工作范围：1:20000 ~1:50000。
[0020] (5)显色：0· 005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB) 过氧化物酶的底物（Invtrogen，美国），每孔加10〇μ1，水平摇床室温避光20-30min。
[0021] (6)检测：每孔加5〇μ1 10%H2S04为反应终止液，IOmin内使用酶标仪（BioTeck ELx800,美国）检测OD值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
[0022] 质控各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=0D1_0D2/0D1+0D2， 离散度< 〇. 1，为有效结果；离散度>〇. 1，为无效结果。取100份健康人血清等体积混合作 为质控血（Quality control, QC)，代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血衆孔，以QC血 浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔SD/所有批次QC孔 OD均值〈20%。批内变异CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值〈10%。
[0023] 数据分析；采用SPSS17. 0 for windows进行统计学分析。采用特异结合指数 (Specific binding index，SBI)来判定F0XP3抗原多肽与血衆抗原表位的结合程度，SBI= F0XP3 OD值-NC OD/ gAg OD值-NC OD，NC为各样本的阴性对照。利用?检验分别 比较良性肿瘤、恶性肿瘤与健康对照三组之间SBI值之间的差异，a=0. 05。
[0024] ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏 度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1. 0和 0. 5之间。在AUX). 5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与 特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准 确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算 曲线下面积（AU)，以健康人SBI平均值+2SD判为阳性，判定灵敏度和特异度。
[0025] 本发明应用F0XP3抗原多肽检测到宫颈肿瘤患者血清及血浆中的特异性自身IgG 抗体，并且该反应具有高特异性和高灵敏性。
[0026] F0XP3抗原多肽可用于制备肿瘤早期诊断试剂盒。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1 试剂盒制备 1试剂试剂配制见Tab. 2~9。
[0028]
2操作 (1)包被：工作抗原及参比抗原用包被液稀释至工作浓度，包被于酶标板， 4°C过夜。
[0029] (2)加血浆（一抗）：酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用分析液将血浆稀释至 合适浓度，一般为1:100~1:500,每孔10〇μ1，37°C或室温孵育I. 5h ; (3) 二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3~5遍，利用分析液稀释二抗标准液IgG，每孔加 10〇μ1，25? / 室温孵育 Ih ; (4) 显色：洗涤缓冲液清洗3遍，每孔加10〇μ1底物显色液，室温避光15~30min。
[0030] (5)检测：每孔加5〇μ1终止液，IOmin检测，波长为450nm，参考波长为630nm。
[0031] 实施例2 宫颈癌患者的F0XP3自身IgG抗体检测 1样本收集：收集407名初次确诊为宫颈肿瘤的女性患者，其中宫颈良性肿瘤204例， 恶性肿瘤203例。所有血清样本采集前未经过任何抗癌治疗，并具有全面的临床资料和信 息。同时招募了健康对照组样本154例。临床访谈及影像学检查均排除宫颈肿瘤患病可能。 健康组与肿瘤组在性别、年龄匹配，具有可比性（巧0. 05)。
[0032] 2检测结果:由Tab. 10-11可知，宫颈癌患者血浆中F0XP3抗原多肽的IgG抗体ROC 曲线下面积（AU)为0. 721，灵敏度为21. 6%，特异度为90%。检测了良恶性宫颈癌及健康人 外周血中F0XP3自身抗体的表达情况，实验结果表明宫颈良性肿瘤和恶性肿瘤患者外周血 中F0XP3自身抗体的表达均高于健康人，证明F0XP3自身抗体的检测可以用于宫颈癌的诊 断，是宫颈癌的一种肿瘤标志物之一。
[0033] Tab. 10抗F0XP3的IgG抗体在宫颈癌患者体内和健康对照样本中的表达水平
Tab. 11宫颈癌中抗F0XP3的IgG抗体的ROC曲线分析
【主权项】
1. 宫颈癌肿瘤标志物F0XP3自身抗体的检测表位多肽序列，其特征在于：氨基酸序列 为DRWAILEAPEKQRTLNEAVWTVDELEFRKKRSQ纯度 >95%,pH>7. 0。2. 根据权利要求1所述的宫颈癌肿瘤标志物FOXP3自身抗体检测表位多肽序列在制备 预测宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
【专利摘要】一种检测宫颈癌肿瘤标志物-FOXP3自身抗体的表位多肽及其应用，属于免疫学技术领域，本发明提供了一种免疫应答调节基因FOXP3自身抗体的抗原氨基酸序列。应用FOXP3表位多肽抗原检测宫颈癌良恶性患者血浆中相应的特异性自身抗体，这种自身抗体可作为宫颈癌肿瘤标志物评估宫颈癌发生的危险度。这种抗原表位多肽及其抗体可用于制备宫颈癌早期诊断试剂和开发治疗宫颈癌的靶向药物。
【IPC分类】G01N33/574, C07K14/47
【公开号】CN104892746
【申请号】CN201510251525
【发明人】刘林林
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【专利说明】-种检测宫颈癌标志物-F0XP3自身抗体表位氨基酸序列 及应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于免疫学技术领域，是一种用于制备宫颈癌早期诊断试剂和开发宫颈癌 治疗靶向药物的基础。
【背景技术】
[0003] 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁着妇女的健康。根据世界卫生组 织的统计数据，其发病率仅次于乳腺癌，并成逐年增高和年轻化趋势。每年宫颈癌的新发病 例有46. 6万左右，其中80%的病例发生在发展中国家，死亡病例约有27万。我国每年新发 病例约有10万，占世界新发病例总数近20%，且近年来呈现地区增长及发病年龄提前的现 象，迫切需要识别和发现宫颈癌早期诊断的血清肿瘤标志物，以降低宫颈癌漏诊率和死亡 率。
[0004] 大量研宄表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生抗原表位，在肿瘤 患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的抗原表位。因此，既可以利用抗原 表位检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤抗原表位，但利用肿瘤抗原表位检测肿瘤的 特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者 体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而抗原表 位在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内抗原表位水平明显增高，则表明 体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加 重。
[0005] 近年来的研宄表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5 年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原抗原表位。因此，检测血中肿瘤相关抗原抗原表 位具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方 向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的抗体 检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种肿瘤 相关抗原抗原表位在患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏感度是当 前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的抗原表 位，然后与现有已知的抗原表位组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。
[0006] 叉头状 / 翼状螺旋转录因子 3 (forkhead or winged helix transcription， F0XP3)在组织间质中表达于T细胞核中，在癌细胞中表达于胞浆。人类的F0XP3基因位于 XplL 23,包含11个外显子和10个内含子，cDNA全长为1869 bpi0XP3控制CD4+CD25+Treg 细胞的产生，并且决定其抑制功能。研宄表明无论是胸腺还是外周起源的调节性T细胞 (Treg)都能特异性地表达F0XP3,并主要表达在⑶4+⑶25+ Treg细胞上，是其最具特异性 的标志。Treg细胞的表达抑制其他T细胞的活化，阻碍机体对癌症的免疫监视，抑制肿瘤 细胞抗原的自身抗体发挥有效的免疫反应，以此给肿瘤提供免疫逃逸环境，促进肿瘤发生 发展。F0XP3还直接抑制T细胞的两个关键转录因子一一活化T细胞核因子（NFAT)和核 因子κ B(NF-k B)的活性，二者是T细胞功能和细胞因子表达的决定因素。在癌组织中， F0XP3抑制体内的抗肿瘤免疫反应，使癌细胞发生肿瘤逃逸；另一方面F0XP3作为一种转录 因子，促进了肿瘤的浸润进展和转移。
[0007] 本发明通过自行设计的F0XP3的抗原多肽，检测肿瘤患者血清及血浆中抗原表位 水平并开发相应的试剂，预测肿瘤发生的危险性，并为肿瘤新药研宄提供可靠的数据。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是公开一种肿瘤标志物F0XP3抗原表位。
[0009] 本发明同时公开了 F0XP3抗原表位的用途。
[0010] 本发明提供的一种检测肿瘤标志物F0XP3抗原表位的氨基酸序列为： DRWAILEAPEKQRTLNEAVWTVDELEFRKKRSQ 纯度 >95%, ρΗ>7· 0。
[0011] 本发明所述的F0XP3抗原多肽在制备预测宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
[0012] 本发明利用自行设计的F0XP3蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测宫颈癌患者血 清及血浆中抗F0XP3蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体 内F0XP3蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肿瘤，可以预测宫颈癌发 生与复发的危险性，指导临床医生对宫颈癌的早期诊断。
[0013] F0XP3蛋白质氨基酸序列见Tab. 1
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间 结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲 和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程， 蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。另外，ELISA法的 高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
[0014] 发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不 形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源 性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2个Pro利于肽链 结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原（HLA) 系统的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90%以上 华人群体的HLA二类抗原系统所识别。
[0015] 基于以上抗原设计原则及F0XP3蛋白的生物学特性，本发明利用生物信息学和多 个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了的线性氨基酸序列(见Tab. 1)。加 框部分是多肽片段在蛋白质中的位置。
[0016] F0XP3: forkhead box P3 1-60 mpnprpgkps apslalgpsp gaspswraap kasdllgarg pggtfqgrdl rggahassss 61-120 lnpmppsqlq lstvdahart pvlqvhples pamisltppt tatgvfslka rpglppginv 121-180 aslewvsrep allctfpnps aprkdstlsa vpqssyplla ngvckwpgce kvfeepedfI 181-240 khcqadhlld ekgraqcllq remvqsleqq lvlekeklsa mqahlagkma ltkassvass 241-300 dkgsccivaa gsqgpvvpaw sgpreapdsl favrrhlwgs hgnstfpefI hnmdyfkfhn 301-360 mrppftyatl irwaileape kqrtlneiyh wftrmfaffr nhpatwknai rhnlslhkcf 361-396 vrvesekgav wtvdelefrk krsqrpsrcs nptpgp 由以上蛋白序列可知，FOXP3线性多肽 抗原由33个氨基酸残基组成，共含12个重叠表 位，可检测至少12种单克隆抗体，具有高度的特异性。
[0017] ELISA法检测抗原表位 (1)酶标板设计：每份血浆样本各设人F0XP3抗原多肽双复孔，山羊多肽对照抗原 (gAg)双复孔和阴性对照双复孔（NC)。gAg抗原与人类蛋白质组无同源性，目的是减低非特 异性结合反应的干扰，gAg的工作浓度范围10-2(^g/ml。
[0018] (2)包被：抗原多肽用包被液（ρΗ7· 4 0· OlM PBS/0. l%NaN3)包被于96孔酶标板 (C0STAR，美国），每孔10〇μ1，两条P16抗原多肽混合为包被浓度lPg/ml，gAg包被浓度为 lKg/ml，4°C 过夜。
[0019] (3 ) -抗/血浆孵育：0. 005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用分析液（0. 0IM PBS+1%BSA)将血浆 1:150 稀释，每孔 10〇μ1，37?孵育 I. 5h ; (4)二抗孵育：0.005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用分析液（同前)稀释，取甘油（1:1) 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG (美国，Sigma)抗体5ul (浓度稀释为1:2倍）， 加入分析液45ul (浓度稀释为1:20倍），充分混合后取适量体积，再用分析液稀释1500 倍，达到1:30000的稀释倍数。每孔加10〇μ1，37?孵育Ih;辣根过氧化物酶标记的羊抗 人 IgG ELISA 工作范围：1:20000 ~1:50000。
[0020] (5)显色：0· 005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB) 过氧化物酶的底物（Invtrogen，美国），每孔加10〇μ1，水平摇床室温避光20-30min。
[0021] (6)检测：每孔加5〇μ1 10%H2S04为反应终止液，IOmin内使用酶标仪（BioTeck ELx800,美国）检测OD值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
[0022] 质控各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=0D1_0D2/0D1+0D2， 离散度< 〇. 1，为有效结果；离散度>〇. 1，为无效结果。取100份健康人血清等体积混合作 为质控血（Quality control, QC)，代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血衆孔，以QC血 浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔SD/所有批次QC孔 OD均值〈20%。批内变异CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值〈10%。
[0023] 数据分析；采用SPSS17. 0 for windows进行统计学分析。采用特异结合指数 (Specific binding index，SBI)来判定F0XP3抗原多肽与血衆抗原表位的结合程度，SBI= F0XP3 OD值-NC OD/ gAg OD值-NC OD，NC为各样本的阴性对照。利用?检验分别 比较良性肿瘤、恶性肿瘤与健康对照三组之间SBI值之间的差异，a=0. 05。
[0024] ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏 度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1. 0和 0. 5之间。在AUX). 5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与 特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准 确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算 曲线下面积（AU)，以健康人SBI平均值+2SD判为阳性，判定灵敏度和特异度。
[0025] 本发明应用F0XP3抗原多肽检测到宫颈肿瘤患者血清及血浆中的特异性自身IgG 抗体，并且该反应具有高特异性和高灵敏性。
[0026] F0XP3抗原多肽可用于制备肿瘤早期诊断试剂盒。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1 试剂盒制备 1试剂试剂配制见Tab. 2~9。
[0028]
2操作 (1)包被：工作抗原及参比抗原用包被液稀释至工作浓度，包被于酶标板， 4°C过夜。
[0029] (2)加血浆（一抗）：酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用分析液将血浆稀释至 合适浓度，一般为1:100~1:500,每孔10〇μ1，37°C或室温孵育I. 5h ; (3) 二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3~5遍，利用分析液稀释二抗标准液IgG，每孔加 10〇μ1，25? / 室温孵育 Ih ; (4) 显色：洗涤缓冲液清洗3遍，每孔加10〇μ1底物显色液，室温避光15~30min。
[0030] (5)检测：每孔加5〇μ1终止液，IOmin检测，波长为450nm，参考波长为630nm。
[0031] 实施例2 宫颈癌患者的F0XP3自身IgG抗体检测 1样本收集：收集407名初次确诊为宫颈肿瘤的女性患者，其中宫颈良性肿瘤204例， 恶性肿瘤203例。所有血清样本采集前未经过任何抗癌治疗，并具有全面的临床资料和信 息。同时招募了健康对照组样本154例。临床访谈及影像学检查均排除宫颈肿瘤患病可能。 健康组与肿瘤组在性别、年龄匹配，具有可比性（巧0. 05)。
[0032] 2检测结果:由Tab. 10-11可知，宫颈癌患者血浆中F0XP3抗原多肽的IgG抗体ROC 曲线下面积（AU)为0. 721，灵敏度为21. 6%，特异度为90%。检测了良恶性宫颈癌及健康人 外周血中F0XP3自身抗体的表达情况，实验结果表明宫颈良性肿瘤和恶性肿瘤患者外周血 中F0XP3自身抗体的表达均高于健康人，证明F0XP3自身抗体的检测可以用于宫颈癌的诊 断，是宫颈癌的一种肿瘤标志物之一。
[0033] Tab. 10抗F0XP3的IgG抗体在宫颈癌患者体内和健康对照样本中的表达水平
Tab. 11宫颈癌中抗F0XP3的IgG抗体的ROC曲线分析
【主权项】
1. 宫颈癌肿瘤标志物F0XP3自身抗体的检测表位多肽序列，其特征在于：氨基酸序列 为DRWAILEAPEKQRTLNEAVWTVDELEFRKKRSQ纯度 >95%,pH>7. 0。2. 根据权利要求1所述的宫颈癌肿瘤标志物FOXP3自身抗体检测表位多肽序列在制备 预测宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
【专利摘要】一种检测宫颈癌肿瘤标志物-FOXP3自身抗体的表位多肽及其应用，属于免疫学技术领域，本发明提供了一种免疫应答调节基因FOXP3自身抗体的抗原氨基酸序列。应用FOXP3表位多肽抗原检测宫颈癌良恶性患者血浆中相应的特异性自身抗体，这种自身抗体可作为宫颈癌肿瘤标志物评估宫颈癌发生的危险度。这种抗原表位多肽及其抗体可用于制备宫颈癌早期诊断试剂和开发治疗宫颈癌的靶向药物。
【IPC分类】G01N33/574, C07K14/47
【公开号】CN104892746
【申请号】CN201510251525
【发明人】刘林林
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
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