人类松弛素-2衍生物以及由其制备人类松弛素-2的方法
人类松弛素-2衍生物以及由其制备人类松弛素-2的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及人类松弛素_2衍生物以及由其制备人 类松弛素-2的方法。
【背景技术】
[0002] 人类松弛素-2,通常简称为RLN2,药物名称也被命名为Relaxin，即松弛肽，是人 体内发现的一种多肽激素。人类松弛素-2由两条链组成，A链含24个氨基酸且存在链内 二硫键，B链含29个氨基酸，A链与B链通过两个二硫键相连，其结构式如下：
[0004] 近年来的一系列研究发现，人类松弛素-2对心力衰竭等心血管疾病具有显著的 治疗作用，能够扩张体循环血管、扩张肾脏血管并增加动脉顺应性。美国专利US5166191A 已经公开了人类松弛素用于治疗心血管疾病，尤其是急性和慢性心力衰竭的方法专利。
[0005] 人类松弛素_2的制备方法国内外均有报道，其中Erika E. Bullesbach和 Christian Schwabe公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法(参见Erika E. Bullesbach and Christian Schwabe: "Totalsynthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phasepeptide synthesis and site-directed chain combination，'，the Journal of Biological Chemistry, 1991,第 266 卷，第 17 期，第 10754-10761页)。在该方法中，松弛素-2的A链采用Fmoc法合成，B链采用Boc法合成， 合成过程需要采用HF处理两次，并且需要三步进行链的组合，不同的二硫键采用不同的保 护基、不同的脱保护剂，因此操作极其复杂，并且产率很低，以使用的人类松弛素-2的B链 计算，总产率仅为1.4%。可以认为，从经济学上讲，其在大规模生产中不可接受。
[0006] 2010年，Kostas K. Barlos等公开了一种人类松弛素-2的化学合成方法(参见 Kostas K. Barlos等："An optimized chemical synthesis of human relaxin-2，'，Journal of P印tide Science, 2010,第16卷，第4期，第200-211页)。在该方法中，松弛素-2的A 链和B链均采用Fmoc法合成，二硫键的形成采用随机组合法，各个半胱氨酸的侧链采用同 一保护基。这一方法可提高松弛素-2的产率，但产率也仅为48%，且松弛素-2的B链的合 成工艺复杂，不利于工业化生产。
[0007] CN102180964A公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法，松弛素-2的A链和B 链均采用Fmoc法合成，但氨基酸侧链采用特殊基团保护，不同半胱氨酸侧链采用交叉保护 基。然而，此类保护基团不易脱除，工业化有一定难度。
[0008] 目前，单链小分子多肽的合成技术已经成熟。虽然松弛素-2的A链和B链的固相 合成已经可以得到较好的收率，但是将A链和B链链接制备松弛素-2的固相合成方法的收 率仍然较低。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，通过各个半胱氨酸的侧链采用常用的不 同侧链保护基，通过不同氧化方法得到人类松弛素-2的A链衍生物和B链衍生物，从而制 备人类松弛素-2。该方法操作简单、设备要求低，易于工业化生产。
[0010] 为此，本发明一方面提供了人类松弛素_2的A链衍生物A-1，其具有如下所示的结 构，
[0011] pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr -Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH0
[0012] 该衍生物A-I的制备方法，包括如下步骤：
[0013] 1、Fmoc-Cys (Trt) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Cys (Trt)-树脂，其中树脂优选为 2-CTC树脂；
[0014] 2、Fmoc-Cys(Trt)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸， 获得A链肽树脂；
[0015] 3、A链肽树脂经裂解反应，获得A链衍生物A-I。
[0016] 本发明另一方面提供了人类松弛素-2的A链衍生物A-2,其具有如下所示的结构，
[0018] 该衍生物A-2的制备方法，包括如下步骤：
[0019] 1、按照上述方法制备A链衍生物A-I;
[0020] 2、A链衍生物A-I经氧化获得A链衍生物A-2。
[0021] 本发明另一方面提供了人类松弛素_2的A链衍生物A-3,其具有如下所示的结构，
L0023」 该佑生物A-3的制备万法，包括如卜步骤：
[0024] 1、按照上述方法制备A链衍生物A-2;
[0025] 2、A链衍生物A-2与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得A链衍生物A-3。
[0026] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物A-I的步骤2中，所述的Fmoc保护 基团的其他氛基酸分别为 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc-Arg(pbf)-〇H、Fmoc-Lys(boc)-〇H、Fmoc-Thr (tbu)-〇H、 Fmoc-Cys (Trt)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Val-〇H> Fmoc-His (trt)-〇H> Fmoc-Cys (Acm)-〇H> Fmoc-Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Lys (boc)-〇H、Fmoc-Asn (trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tbu)-〇H、Fmoc-Tyr(tbu)-〇H、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-〇H。
[0027] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物A-I的步骤3中，采用的裂解液为TFA :ΡΗ0Η:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0028] 本发明另一方面提供了人类松弛素-2的B链衍生物B-1，其具有如下所示的结构，
[0029] H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Va I-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH
[0030] 该衍生物B-I的制备方法，包括如下步骤：
[0031] 1、Fmoc-Ser (tbu) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Ser (tbu)-树脂，其中树脂优选为 wang树脂；
[0032] 2、Fmoc-Ser (tbu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸， 获得B链肽树脂；
[0033] 3、B链肽树脂经裂解反应，获得B链衍生物B-I。
[0034] 本发明另一方面提供了人类松弛素_2的B链衍生物B-2,其具有如下所示的结构，
[0036] 该衍生物Β-2的制备方法，包括如下步骤：
[0037] 1、按照上述方法制备B链衍生物B-I;
[0038] 2、B链衍生物B-I与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得B链衍生物Β-2。
[0039] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物B-I的步骤2中，所述的Fmoc保护 基团的其他氨基酸分别为 Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -0Η、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu) -OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH>Fmoc-Gly - 0H>Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
[0040] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物B-I的步骤3中，采用的裂解液为TFA :PHOH:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0041] 本发明另一方面提供了一种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤：
[0042] 1、按照上述方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-2 ;
[0043] 2、按照上述方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-2 ;
[0044] 3、将步骤1制备的B链衍生物B-2与步骤2制备的A链衍生物A-2反应，获得具 有如下所示的A-B:
[0045]
[0046] 4、步骤3获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品；
[0047] 5、步骤4获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯 品。
[0048] 本发明另一方面还提供了另外一种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤：
[0049] 1、按照上述方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-3 ;
[0050] 2、按照上述方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-I ;
[0051] 3、将步骤1制备的A链衍生物A-3与步骤2制备的B链衍生物B-I反应，获得具 有如下所示的A-B:
[0052]
[0053] 4、步骤3获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品 ；
[0054] 5、步骤4获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯 品。
[0055] 在本发明优选的实施方案中，在上述制备人类松弛素-2的方法中，步骤4所述的 氧化采用碘作为氧化剂。
[0056] 由上述描述可知，与现有技术相比，本发明的人类松弛素-2的A链衍生物中一对 二硫键采用自然氧化法，并且采用PySSPy活化巯基，便于形成第二对二硫键，最后采用碘 氧化形成第三对二硫键，成功避免了一步自然氧化法易产生错位的二硫键。并且本发明采 用简单、常用的巯基保护基，避免了采用Stbu等需要特殊切割试剂的巯基保护基，更有利 于工业化生产。本发明采用的巯基保护基和氧化方法具体如下：
[0057] 1、人类松弛素-2的A链中第10、15和24位的Cys采用Trt或Mmt以及TFA可切 割的保护基团，第11位的Cys采用Acm保护基团。
[0058] 2、人类松弛素-2的A链衍生物A-I采用自然氧化法氧化第10位和第15位的二 硫键，获得A链衍生物A-2。
[0059] 3、人类松弛素-2的B链中第23位的Cys采用Trt或Mmt以及TFA可切割的保护 基团，第11位的Cys采用Acm保护基团。
[0060] 4、采用PySSPy活化A链衍生物A-2中的第24位Cys的巯基或活化B链衍生物 B-I中的第24位Cys的巯基。
【附图说明】
[0061] 图1 :实施例1制备得到的A链衍生物A-I的肽谱图；
[0062] 图2 :实施例1制备得到的A链衍生物A-2的肽谱图；
[0063] 图3 :实施例2制备得到的B链衍生物B-I的肽谱图；
[0064] 图4 :实施例3制备得到的B链衍生物B-2的肽谱图；
[0065] 图5 :实施例4制备得到的A链衍生物A-3的肽谱图；
[0066] 图6 :实施例3和4制备得到的人类松弛肽-2的精肽谱图。
【具体实施方式】
[0067] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0068] 本发明所使用的缩写的含义列于下表中。
[0069]
[0070]
[0071 ] 实施例1 :A链衍生物的合成
[0072] UFmoc-Cys(Trt)-树脂的制备
[0073] 以2-CTC-树脂为载体，2-CTC树脂100g (替代度为0. 8mmol/g)，加入到反应柱中， 用干燥的二氯甲烷（DCM)溶涨30分钟以上，环境温度控制在-30°C至_20°C。
[0074] 称取 Fmoc-Cys (Trt)-OH (46. 8g，80mmol)，用 DCM 溶解后冰浴条件下加入 DIPEA (20. 7g，160mmol)，活化5分钟后加入到反应柱中，环境温度控制在-30°C至_20°C，40分钟 后反应结束，树脂分别用DMF洗涤三次，用封闭液DIPEA:甲醇：DCM=1:2:17 (v:v)封闭三 次，每次3min。封闭液体积按4. Oml/克树脂计算。再加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分 钟，减压干燥得到1128?111〇(3-078(1'竹)-2-(：1'(：树脂，替代度为0.18111111 〇1/^。
[0075] 2、偶联A链获得A链肽树脂
[0076] 将步骤 1 中制备的 112g(20mmol)Fmoc-Cys(Trt)-2-CTC 树月旨，用 N，N-二 甲基酰胺（DMF)溶涨30分钟以上，用适量的20%哌啶/DMF溶液（DBLK)脱Fmoc得 到H-Cys (Trt) -2-CTC树脂。进行程序反应，依次进行缩合反应连接Fmoc-Phe-〇H、 Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Arg (pbf)-〇H、 Fmoc-Lys (boc)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-His(trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys (boc)-OH、 Fmoc-Asn (trt)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Ser (tbu)-OH、 Fmoc-Tyr (tbu) -〇H、Fmoc_Leu-〇H 和 pGlu-OH，获得 pGlu-Leu-Tyr (tbu) -Ser (tbu) -Ala-Leu -Ala-Asn(trt)-Lys(boc)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-His(trt)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(tbu)-L ys (boc) -Arg (pbf) -Ser (tbu) -Leu-Ala-Arg (pbf) -Phe-Cys (trt)-树脂，其中每次缩合反应 中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为（3-5) : 1，每次缩合反应中PYBOP 用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1:1 ;得到235g肽树脂。
[0077] 3、裂解A链肽树脂获得A链衍生物A-1
[0078] 将步骤2中获得的235g肽树脂，加入裂解液2400ml (TFA: PHOH: PHSME: EDT: H20=80 :5:5:2. 5:5)，室温搅拌4小时后过滤，收集滤液，树脂再用少量的TFA洗涤2次，合并滤液， 加入到无水乙醚中沉淀，离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到58g A链衍生物A-1，即 pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg -Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH，纯度为 68. 5%。
[0079] 4、自然氧化获得A链衍生物A-2
[0080] 将步骤3中获得的58g A链衍生物A-I用2. 9L水和2. 9L腈搅拌溶解，用氨水将 pH调至8. 1-8. 5,室温氧化5个小时以上，采用HPLC监控直至氧化完全。反应完全后减压 浓缩得到3. OL A链衍生物A-2水溶液。
[0081]
[0082] 实施例2 :B链衍生物的合成
[0083] 1、Fmoc-Ser (tbu)-树脂的制备
[0084] 以wang树脂为载体，称取替代度为90g( 0. 8mmoI/g)的Wang树脂，加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取Fmoc-Ser (tbu) -OH( 27. 5g，72_〇1 )、 Η0ΒΤ(9· 7g，72mmol)和 DMAP(0. 8g，7. 2mmol)用 DMF 溶解，冰水浴下加入 DIC(9. 3g，72mmol) 活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后,加入吡啶（114g, 1440mmol)和乙酸 酐（147g，1440mmol)封闭 12 小时。用 DMF 洗漆 6 次，得到 100gFmoc-Ser (tbu) -Wang 树脂， 替代度为〇. 20mmol/g。
[0085] 2、偶联B链获得B链肽树脂
[0086] 将步骤1中制备的100g(20mmol)Fmoc-Ser(tbu)-Wang树脂，加入固相反应柱中， 用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Ser (tbu) -Wang树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保 护，依次完成 Fmoc_Trp(Boc)-〇H、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Gly--OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-IIe_0H、 Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Gly - OH、Fmoc-Cys (Acm) - OH、 Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 的偶联，获得 H-Asp (OtBu) -Ser (tbu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu ( OtBu)-Val-Ile-Lys(boc)-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-A Ia-Gln (trt)-1Ie-Ala-IIe-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(tbu)-Thr (tbu)-Trp (Boc)-Ser (tbu)-树脂，每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为（3-5) :1，每次 缩合反应中PYBOP用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1: 1，获得280g肽树脂。 [0087] 3、裂解B链肽树脂获得B链衍生物B-1
[0088] 将步骤2中获得的280g肽树脂，加入裂解液2800ml (TFA: PHOH: PHSME: EDT: H20=80 :5:5:2. 5:5)，室温搅拌4小时后过滤，收集滤液，树脂再用少量的TFA洗涤2次，合并滤液， 加入到无水乙醚中沉淀，离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到70g B链衍生物B-1，即 H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Al a-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-〇H，纯度为 62. 5%。
[0089] 实施例3 :人 类松弛素-2的合成
[0090] I、B链衍生物B-I与PySSPy反应获得B链衍生物B-2
[0091] 将实施例2中获得的B链衍生物B-1，用2. 8L0.1 M NH4HCO3溶解，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g，20mmol)，搅拌1小时，获得B链衍生物B-2溶液，即：
[0092]
[0093] 2、B链衍生物B-2与A链衍生物A-2反应，获得A-B
[0094] 将步骤1中获得的B链衍生物B-2溶液加入到实施例1中 制备的A链衍生物A-2水溶液中，室温搅拌2小时，获得A-B，即：
[0095] 3、碘氧化A-B，获得人类松弛素 -2粗品
[0096] 将碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步骤2制备的溶液中，室温搅拌2 小时，得到人类松弛素-2的粗品溶液，即：
[0097]
[0098] 4、RP-HPLC纯化，获得人类松弛素-2精肽
[0099] 将步骤3中制备的人类松弛素-2粗品，旋干甲醇，过滤，采用Waters600RP_HPLC 系统，波长230nm，色谱柱为50 X 250mm反相C18柱，常规0. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目 的峰馏分，得到纯度大于98. 5%的精肽。将精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系统，色谱柱 为50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓 缩，冻干得到人类松弛素-2精肽36g，HPLC大于纯度98. 5%，总收率为30% (以起始20mmol 计算)。
[0100] 实施例4 :人类松弛素-2的合成
[0101 ] I、A链衍生物A-2与PySSPy反应获得A链衍生物A-3
[0102] 将实施例1获得的A链衍生物A-2，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g， 20mmol )，搅拌1小时，获得A链衍生物A-3溶液，即：
[0103]
[0104] 2、A链衍生物A-3与B链衍生物B-I反应，获得A-B
[0105] 将实施例2中制备的70g B链衍生物B-I用2. 5L水溶解，将步骤1中制备的A链 衍生物A-3溶液加入到B链衍生物B-I溶液中，室温搅拌2小时，获得A-B，即：
[0106]
[0107] 3、碘氧化A-B，获得人类松弛素-2粗品
[0108] 将碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步骤2制备的溶液中，室温搅拌2 小时，得到人类松弛素-2的粗品溶液，即：
[0109]
[0110] 4、RP-HPLC纯化，获得人类松弛素-2精肽
[0111] 将步骤3中制备的人类松弛素-2粗品，旋干甲醇，过滤，采用Waters600RP-HPLC 系统，波长230nm，色谱柱为50 X 250mm反相C18柱，常规0. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目 的峰馏分，得到纯度大于98. 5%的精肽。将精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系统，色谱柱 为50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓 缩，冻干得到人类松弛素-2精肽40g，HPLC大于纯度98. 5%，总收率为33% (以起始20mmol 计算)。
【主权项】
1. 人类松弛素-2的A链衍生物A-1，其具有如下所示的结构， pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys -Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH02. 制备权利要求1所述的A链衍生物A-I的方法，包括如下步骤： 1. Fmoc-Cys (Trt) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Cys (Trt)-树脂，其中树脂优选为2-CTC 树脂； 2. Fmoc-Cys (Trt)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得 A链肽树脂； 3. A链肽树脂经裂解反应，获得A链衍生物A-I。3. 人类松弛素-2的A链衍生物A-2,其具有如下所示的结构，4. 制备权利要求3所述的A链衍生物A-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求2所述的方法制备A链衍生物A-I; 2. A链衍生物A-I经氧化获得A链衍生物A-2。5. 人类松弛素-2的A链衍生物A-3,其具有如下所示的结构，6. 制备权利要求5所述的A链衍生物A-3的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求4所述的方法制备A链衍生物A-2 ; 2. A链衍生物A-2与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得A链衍生物A-3。7. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的Fmoc保护基团的其他氨基酸分 别为 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、 Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Lys(boc)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His (trt)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Lys (boc)-OH、Fmoc-Asn (trt)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Ser(tbu) -OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-OH。8. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤3)中采用的裂解液为TFA:PHOH:PHSME:EDT: H20=80:5:5:2.5:5 (v:v)〇9. 人类松弛素-2的B链衍生物B-1，其具有如下所示的结构， H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Ar g-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH10. 制备权利要求9所述的B链衍生物B-I的方法，包括如下步骤： 1. Fmoc-Ser (tbu)-OH和树脂反应，获得Fmoc-Ser (tbu)-树脂，其中树脂优选为wang 树脂； 2. Fmoc-Ser (tbu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得 B链肽树脂； 3. B链肽树脂经裂解反应，获得B链衍生物B-I。11. 人类松弛素-2的B链衍生物B-2,其具有如下所示的结构，12. 制备权利要求11所述的B链衍生物B-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求10所述的方法制备B链衍生物B-I; 2. B链衍生物B-I与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得B链衍生物B-2。13. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤2)所述的Fmoc保护基团的其他氨基 酸分别为 Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc_Met-〇H、 Fmoc-Gly--OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Ile_OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-IIe_OH、 Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Glu(OtBu) --OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Gly - OH、Fmoc-Cys(Acm) - OH、 Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu(OtBu)- OH、Fmoc-Glu (OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。14. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤3)中采用的裂解液为TFA:PHOH:PHSME:ED T:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇15. -种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求12所述的方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-2 ; 2) 按照权利要求4所述的方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-2 ; 3) 将步骤1)制备的B链衍生物B-2与步骤2)制备的A链衍生物A-2反应，获得具有 如下所示的A-B:4) 步骤3)获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品； 5) 步骤4)获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯品。16. -种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求6所述的方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-3 ; 2) 按照权利要求10所述的方法制备人类松弛素_2的B链衍生物B-I ; 3) 将步骤1)制备的A链衍生物A-3与步骤2)制备的B链衍生物B-I反应，获得具有 如下所示的A-B:4) 步骤3)获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品； 5) 步骤4)获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯品。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中步骤4)所述的氧化采用碘作为氧化剂。
【专利摘要】本发明属于药物合成技术领域，公开了人类松弛素-2的A链衍生物和B链衍生物以及由上述衍生物制备人类松弛素-2的方法，其中A链衍生物中的一对二硫键采用自然氧化法，并且采用PySSPy活化巯基，便于形成第二对二硫键，最后采用碘氧化形成第三对二硫键，成功避免了一步自然氧化法易产生错位的二硫键。此外，本发明采用简单、常用的巯基保护基，避免了采用Stbu等需要特殊切割试剂的巯基保护基，更有利于工业化生产。
【IPC分类】C07K1/04, C07K14/575, C07K1/06
【公开号】CN104892748
【申请号】CN201410076755
【发明人】肖庆, 潘俊锋, 马亚平, 袁建成
【申请人】深圳翰宇药业股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及人类松弛素_2衍生物以及由其制备人 类松弛素-2的方法。
【背景技术】
[0002] 人类松弛素-2,通常简称为RLN2,药物名称也被命名为Relaxin，即松弛肽，是人 体内发现的一种多肽激素。人类松弛素-2由两条链组成，A链含24个氨基酸且存在链内 二硫键，B链含29个氨基酸，A链与B链通过两个二硫键相连，其结构式如下：
[0004] 近年来的一系列研究发现，人类松弛素-2对心力衰竭等心血管疾病具有显著的 治疗作用，能够扩张体循环血管、扩张肾脏血管并增加动脉顺应性。美国专利US5166191A 已经公开了人类松弛素用于治疗心血管疾病，尤其是急性和慢性心力衰竭的方法专利。
[0005] 人类松弛素_2的制备方法国内外均有报道，其中Erika E. Bullesbach和 Christian Schwabe公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法(参见Erika E. Bullesbach and Christian Schwabe: "Totalsynthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phasepeptide synthesis and site-directed chain combination，'，the Journal of Biological Chemistry, 1991,第 266 卷，第 17 期，第 10754-10761页)。在该方法中，松弛素-2的A链采用Fmoc法合成，B链采用Boc法合成， 合成过程需要采用HF处理两次，并且需要三步进行链的组合，不同的二硫键采用不同的保 护基、不同的脱保护剂，因此操作极其复杂，并且产率很低，以使用的人类松弛素-2的B链 计算，总产率仅为1.4%。可以认为，从经济学上讲，其在大规模生产中不可接受。
[0006] 2010年，Kostas K. Barlos等公开了一种人类松弛素-2的化学合成方法(参见 Kostas K. Barlos等："An optimized chemical synthesis of human relaxin-2，'，Journal of P印tide Science, 2010,第16卷，第4期，第200-211页)。在该方法中，松弛素-2的A 链和B链均采用Fmoc法合成，二硫键的形成采用随机组合法，各个半胱氨酸的侧链采用同 一保护基。这一方法可提高松弛素-2的产率，但产率也仅为48%，且松弛素-2的B链的合 成工艺复杂，不利于工业化生产。
[0007] CN102180964A公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法，松弛素-2的A链和B 链均采用Fmoc法合成，但氨基酸侧链采用特殊基团保护，不同半胱氨酸侧链采用交叉保护 基。然而，此类保护基团不易脱除，工业化有一定难度。
[0008] 目前，单链小分子多肽的合成技术已经成熟。虽然松弛素-2的A链和B链的固相 合成已经可以得到较好的收率，但是将A链和B链链接制备松弛素-2的固相合成方法的收 率仍然较低。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，通过各个半胱氨酸的侧链采用常用的不 同侧链保护基，通过不同氧化方法得到人类松弛素-2的A链衍生物和B链衍生物，从而制 备人类松弛素-2。该方法操作简单、设备要求低，易于工业化生产。
[0010] 为此，本发明一方面提供了人类松弛素_2的A链衍生物A-1，其具有如下所示的结 构，
[0011] pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr -Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH0
[0012] 该衍生物A-I的制备方法，包括如下步骤：
[0013] 1、Fmoc-Cys (Trt) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Cys (Trt)-树脂，其中树脂优选为 2-CTC树脂；
[0014] 2、Fmoc-Cys(Trt)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸， 获得A链肽树脂；
[0015] 3、A链肽树脂经裂解反应，获得A链衍生物A-I。
[0016] 本发明另一方面提供了人类松弛素-2的A链衍生物A-2,其具有如下所示的结构，
[0018] 该衍生物A-2的制备方法，包括如下步骤：
[0019] 1、按照上述方法制备A链衍生物A-I;
[0020] 2、A链衍生物A-I经氧化获得A链衍生物A-2。
[0021] 本发明另一方面提供了人类松弛素_2的A链衍生物A-3,其具有如下所示的结构，
L0023」 该佑生物A-3的制备万法，包括如卜步骤：
[0024] 1、按照上述方法制备A链衍生物A-2;
[0025] 2、A链衍生物A-2与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得A链衍生物A-3。
[0026] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物A-I的步骤2中，所述的Fmoc保护 基团的其他氛基酸分别为 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc-Arg(pbf)-〇H、Fmoc-Lys(boc)-〇H、Fmoc-Thr (tbu)-〇H、 Fmoc-Cys (Trt)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Val-〇H> Fmoc-His (trt)-〇H> Fmoc-Cys (Acm)-〇H> Fmoc-Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Lys (boc)-〇H、Fmoc-Asn (trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tbu)-〇H、Fmoc-Tyr(tbu)-〇H、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-〇H。
[0027] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物A-I的步骤3中，采用的裂解液为TFA :ΡΗ0Η:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0028] 本发明另一方面提供了人类松弛素-2的B链衍生物B-1，其具有如下所示的结构，
[0029] H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Va I-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH
[0030] 该衍生物B-I的制备方法，包括如下步骤：
[0031] 1、Fmoc-Ser (tbu) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Ser (tbu)-树脂，其中树脂优选为 wang树脂；
[0032] 2、Fmoc-Ser (tbu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸， 获得B链肽树脂；
[0033] 3、B链肽树脂经裂解反应，获得B链衍生物B-I。
[0034] 本发明另一方面提供了人类松弛素_2的B链衍生物B-2,其具有如下所示的结构，
[0036] 该衍生物Β-2的制备方法，包括如下步骤：
[0037] 1、按照上述方法制备B链衍生物B-I;
[0038] 2、B链衍生物B-I与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得B链衍生物Β-2。
[0039] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物B-I的步骤2中，所述的Fmoc保护 基团的其他氨基酸分别为 Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -0Η、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu) -OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH>Fmoc-Gly - 0H>Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
[0040] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物B-I的步骤3中，采用的裂解液为TFA :PHOH:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0041] 本发明另一方面提供了一种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤：
[0042] 1、按照上述方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-2 ;
[0043] 2、按照上述方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-2 ;
[0044] 3、将步骤1制备的B链衍生物B-2与步骤2制备的A链衍生物A-2反应，获得具 有如下所示的A-B:
[0045]
[0046] 4、步骤3获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品；
[0047] 5、步骤4获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯 品。
[0048] 本发明另一方面还提供了另外一种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤：
[0049] 1、按照上述方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-3 ;
[0050] 2、按照上述方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-I ;
[0051] 3、将步骤1制备的A链衍生物A-3与步骤2制备的B链衍生物B-I反应，获得具 有如下所示的A-B:
[0052]
[0053] 4、步骤3获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品 ；
[0054] 5、步骤4获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯 品。
[0055] 在本发明优选的实施方案中，在上述制备人类松弛素-2的方法中，步骤4所述的 氧化采用碘作为氧化剂。
[0056] 由上述描述可知，与现有技术相比，本发明的人类松弛素-2的A链衍生物中一对 二硫键采用自然氧化法，并且采用PySSPy活化巯基，便于形成第二对二硫键，最后采用碘 氧化形成第三对二硫键，成功避免了一步自然氧化法易产生错位的二硫键。并且本发明采 用简单、常用的巯基保护基，避免了采用Stbu等需要特殊切割试剂的巯基保护基，更有利 于工业化生产。本发明采用的巯基保护基和氧化方法具体如下：
[0057] 1、人类松弛素-2的A链中第10、15和24位的Cys采用Trt或Mmt以及TFA可切 割的保护基团，第11位的Cys采用Acm保护基团。
[0058] 2、人类松弛素-2的A链衍生物A-I采用自然氧化法氧化第10位和第15位的二 硫键，获得A链衍生物A-2。
[0059] 3、人类松弛素-2的B链中第23位的Cys采用Trt或Mmt以及TFA可切割的保护 基团，第11位的Cys采用Acm保护基团。
[0060] 4、采用PySSPy活化A链衍生物A-2中的第24位Cys的巯基或活化B链衍生物 B-I中的第24位Cys的巯基。
【附图说明】
[0061] 图1 :实施例1制备得到的A链衍生物A-I的肽谱图；
[0062] 图2 :实施例1制备得到的A链衍生物A-2的肽谱图；
[0063] 图3 :实施例2制备得到的B链衍生物B-I的肽谱图；
[0064] 图4 :实施例3制备得到的B链衍生物B-2的肽谱图；
[0065] 图5 :实施例4制备得到的A链衍生物A-3的肽谱图；
[0066] 图6 :实施例3和4制备得到的人类松弛肽-2的精肽谱图。
【具体实施方式】
[0067] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0068] 本发明所使用的缩写的含义列于下表中。
[0069]
[0070]
[0071 ] 实施例1 :A链衍生物的合成
[0072] UFmoc-Cys(Trt)-树脂的制备
[0073] 以2-CTC-树脂为载体，2-CTC树脂100g (替代度为0. 8mmol/g)，加入到反应柱中， 用干燥的二氯甲烷（DCM)溶涨30分钟以上，环境温度控制在-30°C至_20°C。
[0074] 称取 Fmoc-Cys (Trt)-OH (46. 8g，80mmol)，用 DCM 溶解后冰浴条件下加入 DIPEA (20. 7g，160mmol)，活化5分钟后加入到反应柱中，环境温度控制在-30°C至_20°C，40分钟 后反应结束，树脂分别用DMF洗涤三次，用封闭液DIPEA:甲醇：DCM=1:2:17 (v:v)封闭三 次，每次3min。封闭液体积按4. Oml/克树脂计算。再加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分 钟，减压干燥得到1128?111〇(3-078(1'竹)-2-(：1'(：树脂，替代度为0.18111111 〇1/^。
[0075] 2、偶联A链获得A链肽树脂
[0076] 将步骤 1 中制备的 112g(20mmol)Fmoc-Cys(Trt)-2-CTC 树月旨，用 N，N-二 甲基酰胺（DMF)溶涨30分钟以上，用适量的20%哌啶/DMF溶液（DBLK)脱Fmoc得 到H-Cys (Trt) -2-CTC树脂。进行程序反应，依次进行缩合反应连接Fmoc-Phe-〇H、 Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Arg (pbf)-〇H、 Fmoc-Lys (boc)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-His(trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys (boc)-OH、 Fmoc-Asn (trt)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Ser (tbu)-OH、 Fmoc-Tyr (tbu) -〇H、Fmoc_Leu-〇H 和 pGlu-OH，获得 pGlu-Leu-Tyr (tbu) -Ser (tbu) -Ala-Leu -Ala-Asn(trt)-Lys(boc)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-His(trt)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(tbu)-L ys (boc) -Arg (pbf) -Ser (tbu) -Leu-Ala-Arg (pbf) -Phe-Cys (trt)-树脂，其中每次缩合反应 中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为（3-5) : 1，每次缩合反应中PYBOP 用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1:1 ;得到235g肽树脂。
[0077] 3、裂解A链肽树脂获得A链衍生物A-1
[0078] 将步骤2中获得的235g肽树脂，加入裂解液2400ml (TFA: PHOH: PHSME: EDT: H20=80 :5:5:2. 5:5)，室温搅拌4小时后过滤，收集滤液，树脂再用少量的TFA洗涤2次，合并滤液， 加入到无水乙醚中沉淀，离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到58g A链衍生物A-1，即 pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg -Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH，纯度为 68. 5%。
[0079] 4、自然氧化获得A链衍生物A-2
[0080] 将步骤3中获得的58g A链衍生物A-I用2. 9L水和2. 9L腈搅拌溶解，用氨水将 pH调至8. 1-8. 5,室温氧化5个小时以上，采用HPLC监控直至氧化完全。反应完全后减压 浓缩得到3. OL A链衍生物A-2水溶液。
[0081]
[0082] 实施例2 :B链衍生物的合成
[0083] 1、Fmoc-Ser (tbu)-树脂的制备
[0084] 以wang树脂为载体，称取替代度为90g( 0. 8mmoI/g)的Wang树脂，加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取Fmoc-Ser (tbu) -OH( 27. 5g，72_〇1 )、 Η0ΒΤ(9· 7g，72mmol)和 DMAP(0. 8g，7. 2mmol)用 DMF 溶解，冰水浴下加入 DIC(9. 3g，72mmol) 活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后,加入吡啶（114g, 1440mmol)和乙酸 酐（147g，1440mmol)封闭 12 小时。用 DMF 洗漆 6 次，得到 100gFmoc-Ser (tbu) -Wang 树脂， 替代度为〇. 20mmol/g。
[0085] 2、偶联B链获得B链肽树脂
[0086] 将步骤1中制备的100g(20mmol)Fmoc-Ser(tbu)-Wang树脂，加入固相反应柱中， 用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Ser (tbu) -Wang树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保 护，依次完成 Fmoc_Trp(Boc)-〇H、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Gly--OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-IIe_0H、 Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Gly - OH、Fmoc-Cys (Acm) - OH、 Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 的偶联，获得 H-Asp (OtBu) -Ser (tbu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu ( OtBu)-Val-Ile-Lys(boc)-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-A Ia-Gln (trt)-1Ie-Ala-IIe-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(tbu)-Thr (tbu)-Trp (Boc)-Ser (tbu)-树脂，每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为（3-5) :1，每次 缩合反应中PYBOP用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1: 1，获得280g肽树脂。 [0087] 3、裂解B链肽树脂获得B链衍生物B-1
[0088] 将步骤2中获得的280g肽树脂，加入裂解液2800ml (TFA: PHOH: PHSME: EDT: H20=80 :5:5:2. 5:5)，室温搅拌4小时后过滤，收集滤液，树脂再用少量的TFA洗涤2次，合并滤液， 加入到无水乙醚中沉淀，离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到70g B链衍生物B-1，即 H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Al a-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-〇H，纯度为 62. 5%。
[0089] 实施例3 :人 类松弛素-2的合成
[0090] I、B链衍生物B-I与PySSPy反应获得B链衍生物B-2
[0091] 将实施例2中获得的B链衍生物B-1，用2. 8L0.1 M NH4HCO3溶解，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g，20mmol)，搅拌1小时，获得B链衍生物B-2溶液，即：
[0092]
[0093] 2、B链衍生物B-2与A链衍生物A-2反应，获得A-B
[0094] 将步骤1中获得的B链衍生物B-2溶液加入到实施例1中 制备的A链衍生物A-2水溶液中，室温搅拌2小时，获得A-B，即：
[0095] 3、碘氧化A-B，获得人类松弛素 -2粗品
[0096] 将碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步骤2制备的溶液中，室温搅拌2 小时，得到人类松弛素-2的粗品溶液，即：
[0097]
[0098] 4、RP-HPLC纯化，获得人类松弛素-2精肽
[0099] 将步骤3中制备的人类松弛素-2粗品，旋干甲醇，过滤，采用Waters600RP_HPLC 系统，波长230nm，色谱柱为50 X 250mm反相C18柱，常规0. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目 的峰馏分，得到纯度大于98. 5%的精肽。将精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系统，色谱柱 为50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓 缩，冻干得到人类松弛素-2精肽36g，HPLC大于纯度98. 5%，总收率为30% (以起始20mmol 计算)。
[0100] 实施例4 :人类松弛素-2的合成
[0101 ] I、A链衍生物A-2与PySSPy反应获得A链衍生物A-3
[0102] 将实施例1获得的A链衍生物A-2，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g， 20mmol )，搅拌1小时，获得A链衍生物A-3溶液，即：
[0103]
[0104] 2、A链衍生物A-3与B链衍生物B-I反应，获得A-B
[0105] 将实施例2中制备的70g B链衍生物B-I用2. 5L水溶解，将步骤1中制备的A链 衍生物A-3溶液加入到B链衍生物B-I溶液中，室温搅拌2小时，获得A-B，即：
[0106]
[0107] 3、碘氧化A-B，获得人类松弛素-2粗品
[0108] 将碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步骤2制备的溶液中，室温搅拌2 小时，得到人类松弛素-2的粗品溶液，即：
[0109]
[0110] 4、RP-HPLC纯化，获得人类松弛素-2精肽
[0111] 将步骤3中制备的人类松弛素-2粗品，旋干甲醇，过滤，采用Waters600RP-HPLC 系统，波长230nm，色谱柱为50 X 250mm反相C18柱，常规0. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目 的峰馏分，得到纯度大于98. 5%的精肽。将精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系统，色谱柱 为50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓 缩，冻干得到人类松弛素-2精肽40g，HPLC大于纯度98. 5%，总收率为33% (以起始20mmol 计算)。
【主权项】
1. 人类松弛素-2的A链衍生物A-1，其具有如下所示的结构， pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys -Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH02. 制备权利要求1所述的A链衍生物A-I的方法，包括如下步骤： 1. Fmoc-Cys (Trt) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Cys (Trt)-树脂，其中树脂优选为2-CTC 树脂； 2. Fmoc-Cys (Trt)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得 A链肽树脂； 3. A链肽树脂经裂解反应，获得A链衍生物A-I。3. 人类松弛素-2的A链衍生物A-2,其具有如下所示的结构，4. 制备权利要求3所述的A链衍生物A-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求2所述的方法制备A链衍生物A-I; 2. A链衍生物A-I经氧化获得A链衍生物A-2。5. 人类松弛素-2的A链衍生物A-3,其具有如下所示的结构，6. 制备权利要求5所述的A链衍生物A-3的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求4所述的方法制备A链衍生物A-2 ; 2. A链衍生物A-2与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得A链衍生物A-3。7. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的Fmoc保护基团的其他氨基酸分 别为 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、 Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Lys(boc)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His (trt)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Lys (boc)-OH、Fmoc-Asn (trt)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Ser(tbu) -OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-OH。8. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤3)中采用的裂解液为TFA:PHOH:PHSME:EDT: H20=80:5:5:2.5:5 (v:v)〇9. 人类松弛素-2的B链衍生物B-1，其具有如下所示的结构， H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Ar g-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH10. 制备权利要求9所述的B链衍生物B-I的方法，包括如下步骤： 1. Fmoc-Ser (tbu)-OH和树脂反应，获得Fmoc-Ser (tbu)-树脂，其中树脂优选为wang 树脂； 2. Fmoc-Ser (tbu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得 B链肽树脂； 3. B链肽树脂经裂解反应，获得B链衍生物B-I。11. 人类松弛素-2的B链衍生物B-2,其具有如下所示的结构，12. 制备权利要求11所述的B链衍生物B-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求10所述的方法制备B链衍生物B-I; 2. B链衍生物B-I与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得B链衍生物B-2。13. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤2)所述的Fmoc保护基团的其他氨基 酸分别为 Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc_Met-〇H、 Fmoc-Gly--OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Ile_OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-IIe_OH、 Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Glu(OtBu) --OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Gly - OH、Fmoc-Cys(Acm) - OH、 Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu(OtBu)- OH、Fmoc-Glu (OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。14. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤3)中采用的裂解液为TFA:PHOH:PHSME:ED T:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇15. -种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求12所述的方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-2 ; 2) 按照权利要求4所述的方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-2 ; 3) 将步骤1)制备的B链衍生物B-2与步骤2)制备的A链衍生物A-2反应，获得具有 如下所示的A-B:4) 步骤3)获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品； 5) 步骤4)获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯品。16. -种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤： 1) 按照权利要求6所述的方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-3 ; 2) 按照权利要求10所述的方法制备人类松弛素_2的B链衍生物B-I ; 3) 将步骤1)制备的A链衍生物A-3与步骤2)制备的B链衍生物B-I反应，获得具有 如下所示的A-B:4) 步骤3)获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品； 5) 步骤4)获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯品。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中步骤4)所述的氧化采用碘作为氧化剂。
【专利摘要】本发明属于药物合成技术领域，公开了人类松弛素-2的A链衍生物和B链衍生物以及由上述衍生物制备人类松弛素-2的方法，其中A链衍生物中的一对二硫键采用自然氧化法，并且采用PySSPy活化巯基，便于形成第二对二硫键，最后采用碘氧化形成第三对二硫键，成功避免了一步自然氧化法易产生错位的二硫键。此外，本发明采用简单、常用的巯基保护基，避免了采用Stbu等需要特殊切割试剂的巯基保护基，更有利于工业化生产。
【IPC分类】C07K1/04, C07K14/575, C07K1/06
【公开号】CN104892748
【申请号】CN201410076755
【发明人】肖庆, 潘俊锋, 马亚平, 袁建成
【申请人】深圳翰宇药业股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
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