一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用
一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，具体涉及一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种常见的以高血糖为特征的终身性代谢疾病，近年来随着各国社会经济的发展和居民生活方式的改变，肥胖人群和糖尿病患病人数迅速增加，糖尿病也已成为21世纪世界范围内的一种流行病。在中国，糖尿病患病人数现已高达1.14亿，成为继肿瘤和心脑血管疾病之后的第三个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病，糖尿病高并发症的发生导致高致残率和高致死率，给家庭和社会带来沉重的负担。
[0003]胰岛素治疗是控制血糖和治疗糖尿病的重要手段。随着临床用药的不同需求和胰岛素技术的不断发展，人们开发出了具有不同作用时效的胰岛素类似物，如速效胰岛素类似物门冬胰岛素和赖脯胰岛素，长效胰岛素类似物甘精胰岛素和地特胰岛素，长效胰岛素是口服药物失效时联合治疗的首选用药。
[0004]德谷胰岛素是一种新型超长效胰岛素，其分子结构特点是去掉人胰岛素B链30位苏氨酸，通过I个谷氨酸分子将16碳脂肪二酸侧链连接在B29位赖氨酸残基(参见专利TO2005012347)，其作用特点是半衰期长，体内作用时间超过42小时，并且低血糖发生率低，具有平稳的药代动力学特点，可以持久、平稳、长期降糖。
[0005]结晶是原料药生产的重要环节，而结晶后的德谷胰岛素具有均一的晶型，颗粒大，沉降快，易与上清分离，冷冻干燥时间短，更适合工业化生产；并且以固态晶体形式存在的德谷胰岛素，相比较于不定形固体粉末以及溶液状态的形式，对于产品稳定性、贮存性能等均更有优势。因此，迫切需要研宄德谷胰岛素的结晶工艺。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种德谷胰岛素结晶的制备方法。该制备方法可大规模地制备高质量和高收率的德谷胰岛素-锌结晶。该晶体具有稳定的固体分子形式，颗粒大，沉降快，易与上清分离，冷冻干燥时间短，生产效率高，易于放大工业生产。
[0007]本发明的另一目的在于提供所述德谷胰岛素结晶的制备方法的应用。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种德谷胰岛素结晶的制备方法，包括如下步骤:在0.05?0.27M组氨酸体系，并且含体积百分比8?15%有机溶剂的条件下，从含有德谷胰岛素、锌离子、酚类物质及盐的结晶液中，在PH值为6.5?8条件下使德谷胰岛素结晶，得到德谷胰岛素结晶。
[0009]所述的德谷胰岛素结晶的制备方法，优选包含如下步骤:
[0010](I)配制含有0.05?0.27M组氨酸、I?8g/L德谷胰岛素、体积百分比为8?15%的有机溶剂、质量体积百分比为0.2?0.5%的酚类物质、0.3?2.4M盐的结晶液；[0011 ] (2)调节结晶液pH值至6.5?8，加入锌离子，锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计；结晶；
[0012](3)然后在2?8°C条件下静置结晶，获得稳定的德谷胰岛素结晶。
[0013]步骤(I)和步骤⑵宜在I?30°C条件下进行，优选为10?30°C，更优选为20?28 °C，最优选为25 °C。
[0014]德谷胰岛素因修饰脂肪酸侧链与其他胰岛素差异较大，所以结晶较为困难，结晶过程中组氨酸的加入以及PH值的调节是影响结晶效果的关键因素。
[0015]所述的组氨酸是德谷胰岛素形成结晶的关键因素之一。在没有组氨酸的条件下，德谷胰岛素只能形成细小晶体颗粒，固液分离慢，不适合工业生产。发明人经大量的实验研宄发现，只有当结晶液中存在有0.05?0.27M组氨酸，德谷胰岛素才能形成稳定的晶体，沉降快，生产效率高，易于放大到工业生产。分析可能原因是:(1)和其它胰岛素一样，德谷胰岛素在锌离子作用下形成六聚体结构:T6、T3R3和R6，其物理及化学稳定性:R6 >> T3R3>>T6 (Rahuel-Clermont et al.1997) ; (2)在苯酚的作用下，德谷胰岛素六聚体趋向形成T3R3和R6构象；(3)在组氨酸的作用下，德谷胰岛素分子形成均一稳定的R6构象，通过调节结晶体系中的有机溶剂浓度、酚浓度、锌离子比例、盐浓度和pH，德谷胰岛素-锌R6六聚体堆积成稳定均一的晶体结构。
[0016]所述的pH值也是德谷胰岛素形成结晶的关键因素之一。由于德谷胰岛素的等电点介于PH4.5?5.0，本发明中结晶的条件是pH6.5?8.0，优选pH6.7?7.3，能形成粒径更大和结构更规则的结晶。本发明结晶液的PH值可通过使用酸和碱进行调节，优选使用醋酸和氨水进行调节。
[0017]所述的有机溶剂降低了结晶液中德谷胰岛素的溶解度，促使德谷胰岛素结晶的形成，因此结晶液中有机溶剂的浓度不宜低于8% (体积/体积)，同时，如果有机溶剂的浓度过高，又会增加蛋白质的溶解度，引起蛋白质重新溶解，因此结晶液中有机溶剂的浓度也不宜超过15% (体积/体积)。在本发明中，所述有机溶剂为任何本领域技术人员所公知的易溶于水的有机溶剂，如乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇等，其中优选的有机溶剂为乙腈。
[0018]所述的德谷胰岛素可以为干燥/冻干固体粉末或纯化收集的液体样品中的一种；其制备方法可参照专利W02005012347中披露的方法进行；所述的德谷胰岛素在所述的结晶液中的浓度为I?8g/L，优选为1.35?5.lg/L。
[0019]所述的盐是指易溶于水的强电解质盐，包含但不局限于氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、醋酸钱、硫酸钱等，优选氯化钠，浓度为0.3?2.4M，优选为1.2?2.4M。
[0020]所述的锌离子以锌盐形式加入，例如但不局限于氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌、硫酸锌等，优选为醋酸锌。锌离子的用量优选按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计，优选为(2?9):3。如果锌化合物的浓度过低会使德谷胰岛素结晶不完全，如果锌化合物浓度过高，会使结晶的颗粒变小，甚至形成无定形沉淀。
[0021]所述的酚类物质是指能够提供酚羟基的物质，如但不局限于间苯二酚、苯酚、甲酚、间甲酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯等，优选为苯酚；浓度为质量体积比0.2?0.5%，更优选为质量体积比0.2?0.22%。
[0022]步骤(2)中所述的结晶可在I?30°C条件下进行，优选为10?30°C，更优选为20?28°C进行，从而增加结晶前的溶解度。
[0023]步骤(2)中所述的结晶的时间优选为3?6小时。
[0024]步骤(2)中所述的结晶优选于搅拌状态下进行。
[0025]所述的搅拌速度优选为60?120r/min，更优选为100r/min。
[0026]步骤(3)中所述的结晶可在I?30°C下进行，优选为在2?8°C，从而提高德谷胰岛素结晶收率。
[0027]步骤(3)中所述的结晶的时间优选为14?22小时。
[0028]在工业化生产过程中，为了使德谷胰岛素更纯，可以选择重结晶工艺，为了降低结晶中的其他溶剂含量，也可以采取水洗结晶的方法。
[0029]所述德谷胰岛素结晶的制备方法在工业化制备德谷胰岛素结晶中进行应用。
[0030]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0031](I)本发明提供了一种新的组氨酸结晶体系，该结晶体系克服了应用其它胰岛素结晶体系不能使德谷胰岛素结晶的缺陷。
[0032](2)本发明结晶方法的实施生产效率高，稳定性好，适合于德谷胰岛素的工业化生产。
【附图说明】
[0033]图1是实施例1制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0034]图2是实施例2制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0035]图3是实施例3制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0036]图4是实施例4制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0037]图5是实施例5制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0038]图6是实施例6制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0039]图7是实施例7实验A制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0040]图8是实施例7实验B制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0041]图9是实施例7实验C制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0043]材料
[0044]德谷胰岛素:参考文献申请号为“W02005012347”、名称为“NOVEL INSULINDERIVATIVES”的专利申请中实施例4的方法进行制备；
[0045]组氨酸来源于阿拉丁化学试剂有限公司，批号:H1414079 ;
[0046]乙酸锌来源于广东光华化学厂有限公司，批号:120813 ;
[0047]水饱和酚来源于北京拜尔迪生物科技公司，批号:3105376 ;
[0048]乙酸来源于西陇化工股份有限公司，批号:1410171 ;
[0049]氯化钠来源于西陇化工股份有限公司，批号:114050249 ;
[0050]乙酸铵来源于西陇化工股份有限公司，批号:1406011 ;
[0051]氨水来源于西陇化工股份有限公司，批号:1301071 ;
[0052]乙腈来源于天津市康科德科技有限公司，批号51408084 ;
[0053]其余试剂至少为分析纯。
[0054]实施例1
[0055]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素3.72g/L，醋酸钱 0.063mol/L，乙腈 8% (v/v)，间苯二酸 0.22% (w/v)，醋酸锌 0.4mmol/L(与德谷胰岛素的摩尔比为6:4)，组氨酸0.2mol/L，氯化钠1.2mol/Lo
[0056]制备过程如下:
[0057]①制备浓度为12.4g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为27% (v/v)的乙腈，浓度为0.21mol/L的醋酸钱，用氨水调节pH值至7.5。
[0058]②制备A溶液，其中含有0.2mol/L组氨酸和1.65mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH值至7.0。
[0059]③取30ml上述德谷胰岛素溶液装于250ml三角瓶，再往其中依次加入30ml的纯化水、0.22g间苯二酚、1.86g组氨酸和3.16g氯化钠，溶解完全后加入40ml A溶液，用3M醋酸调PH值至7.0，最后加入80 μ I浓度为0.5Μ的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，室温25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，可见均一性较好，晶体形状规则，如图1所示。
[0060]实施例2
[0061]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素2g/L，醋酸钱0.063mol/L，乙腈10% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌0.2mmol/L(与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6 )，组氨酸0.2mol/L，氯化钠1.3mol/Lo
[0062]制备过程如下:
[0063]①制备浓度为6.67g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为33% (v/v)的乙腈，浓度为0.21mol/L的醋酸钱，用氨水调节pH值至7.5。
[0064]②制备A溶液，其中含有0.2mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH值至 7.0o
[0065]③取150ml上述德谷胰岛素溶液装于500ml三角瓶，依次加入150ml的纯化水和Ig水饱和酸并混匀，然后再加入9.3g组氨酸和15.78g氯化钠，溶解完全后加入200ml A溶液，用3M醋酸调pH至7.1，，最后加入200 μ I浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，可见均一性较好，晶体形状规则，如图2所示。
[0066]实施例3
[0067]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素1.35g/L，醋酸钱 0.105mol/L，乙醇 15% (v/v)，苯酸 0.2% (w/v)，醋酸锌 0.145mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6)，组氨酸0.2mol/L，氯化钠2.4mol/L。
[0068]制备过程如下:
[0069]①制备浓度为2.7g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30% (v/v)的乙醇，浓度为0.21mol/L的醋酸钱，用氨水调节pH值至7.5。
[0070]②取150ml上述德谷胰岛素溶液装于500ml三角瓶，依次加入150ml的纯化水和0.6g水饱和酸，混匀，然后再加入9.3g组氨酸和42.08g氯化钠，溶解完全后用3M醋酸调pH至6.7，加入87 μ I浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，放大160倍，均一性较差的不规则晶体，如图3所示。
[0071]实施例4
[0072]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素5.1g/L，醋酸钱0.063mol/L，乙醇9% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌0.55mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6)，组氨酸0.2mol/L，氯化钠1.3mol/Lo
[0073]制备过程如下:
[0074]①制备A溶液，其中含有0.2mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH至7.0。
[0075]②制备浓度为17g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30% (v/v)的乙醇，浓度为0.21mol/L的醋酸铵，用氨水调节pH值至7.5。
[0076]③取365ml上述德谷胰岛素溶液装于2L三角瓶，依次加入365ml的纯化水和2.43g水饱和酚并混匀，然后再加入22.63g组氨酸和38.40g氯化钠，溶解完全后加入487mlA溶液，用3M醋酸调pH至7.0，最后加入1.334ml浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，放大160倍，可见均一性较好，颗粒较小的晶体。如图4所示。
[0077]实施例5
[0078]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素3.38g/L，醋酸钱0.063mol/L，异丙醇9% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌1.64mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为18:6)，组氨酸0.27mol/L，氯化钠1.3mol/L0
[0079]制备过程如下:
[0080]①制备A溶液，其中含有0.27mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH至 7.0o
[0081]②制备浓度为11.28g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30% (v/v)的异丙醇，浓度为0.21mol/L的醋酸铵，用氨水调节pH值至7.5。
[0082]③取255ml上述德谷胰岛素溶液装于IL三角瓶，依次加入255ml的纯化水和1.7g水饱和酚，混匀，然后再加入21.34g组氨酸和26.82g，溶解完全后加入340ml A溶液，用3M醋酸调PH至7.3，最后加入2.784ml浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，放大160倍，颗粒较大，但是晶体形状不规则，如图5所示。
[0083]实施例6
[0084]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素3.72g/L，醋酸钱0.063mol/L，乙腈9% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌0.4mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6)，组氨酸0.05mol/L，氯化钠1.3mol/Lo
[0085]制备过程如下:
[0086]①制备浓度为12.4g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30%的乙腈，浓度为0.21mol/L的醋酸铵，用氨水调节pH值至7.5。
[0087]②制备A溶液，其中含有0.05mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH值至7.0。
[0088]③取150ml上述德谷胰岛素溶液装于500ml三角瓶，依次加入150ml的纯化水和Ig水饱和酚，混匀，然后再加入2.325g组氨酸和15.78g，溶解完全后加入200ml A溶液，用3M醋酸调pH至7.3，最后加入400 μ I浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，可见颗粒较大的晶体，如图6所示。
[0089]实例7
[0090]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:
[0091]实验A按照公开号为CN102219851A、名称为甘精胰岛素结晶的制备方法的中国发明专利中的实施例1制备50mL结晶体系，含有德谷胰岛素3.5g/L，乙腈20 %，乙酸0.7M，乙酸钠 0.5M，苯酚 0.4%,氯化锌 120mg/L，ρΗ7.9。
[0092]实验B按照如下制备过程制备得到:将德谷胰岛素加乙腈水溶液，2Μ氢氧化钠溶液调节PH值至8.6，溶解完全，待用；配制盐溶液:二水合柠檬酸三钠、乙酸铵、氯化钠、苯酚水溶液和水混合均匀，2M氢氧化钠溶液调节pH值至8.6，并加至德谷胰岛素溶液中，混匀；最后加入乙酸锌溶液，2M盐酸调节pH值至8.1 ;放置摇床100转/分钟，15°C条件下结晶3h，然后转移至2°C条件下静置结晶15h。其中，各成分的浓度如下:德谷胰岛素3.2g/L，乙腈7 % (v/v)，二水合柠檬酸三钠0.1M，乙酸铵0.05M，氯化钠0.2M，苯酚0.05 % (w/v)，锌离子与德谷胰岛素的摩尔比为3:1，pH8.1o
[0093]实验C按照实例2的组分和含量配制。
[0094]结果:实验A德谷胰岛素只能形成絮状沉淀，未能形成规则的晶体(如图7)。结果实验B德谷胰岛素仍不能形成结晶，仍以无定形沉淀形式存在(如图8)。实验C德谷胰岛素能够形成规则的，颗粒较大的晶体(如图9)。
[0095]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包括如下步骤:在0.05?0.27M组氨酸体系，并且含体积百分比8?15%有机溶剂的条件下，从含有德谷胰岛素、锌离子、酚类物质及盐的结晶液中，在pH值为6.5?8条件下使德谷胰岛素结晶，得到德谷胰岛素结晶；所述有机溶剂为易溶于水的有机溶剂。2.根据权利要求1所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包含如下步骤:(1)配制含有0.05?0.27M组氨酸、1?8g/L德谷胰岛素、体积百分比为8?15%的有机溶剂、质量体积百分比为0.2?0.5%的酚类物质、0.3?2.4M盐的结晶液；(2)调节结晶液pH值至6.5?8，加入锌离子，锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计；结晶；(3)然后在2?8°C条件下静置结晶，获得稳定的德谷胰岛素结晶。3.根据权利要求2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:步骤(1)和步骤(2)在1?30°C条件下进行。4.根据权利要求2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的结晶的条件为于20?28°C在搅拌状态下进行，结晶时间为3?6小时；步骤(3)中所述的结晶的条件为于2?8°C静置结晶14?22小时。5.根据权利要求1所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的德谷胰岛素在所述的结晶液中的浓度为1?8g/L ；所述的盐的浓度为0.3?2.4M ;所述的锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计；所述的酚类物质在所述的结晶液中的浓度为质量体积比0.2?0.5%。6.根据权利要求5所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的德谷胰岛素在所述的结晶液中的浓度为1.35?5.lg/L ；所述的盐的浓度为1.2?2.4M ;所述的锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?9):3计；所述的酚类物质在所述的结晶液中的浓度为质量体积比0.2?0.22%。7.根据权利要求1或2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的pH值为6.7 ?7.3o8.根据权利要求1或2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述有机溶剂为乙腈、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种；所述的盐为氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、醋酸铵和硫酸铵中的至少一种；所述的锌离子以锌盐形式加入，锌盐为氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌和硫酸锌中的至少一种；所述的酚类物质为间苯二酚、苯酚、甲酚、间甲酚、对羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸甲酯中的至少一种。9.根据权利要求1或2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:还包括水洗结晶的步骤。10.权利要求1?9任一项所述德谷胰岛素结晶的制备方法的应用，其特征在于:所述德谷胰岛素结晶的制备方法用于工业化制备德谷胰岛素结晶。
【专利摘要】本发明公开了一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用。本发明通过在0.05～0.27M组氨酸体系，并且含体积百分比8～15％有机溶剂的条件下，从含有德谷胰岛素、锌离子、酚类物质及盐的结晶液中，在pH值为6.5～8条件下使德谷胰岛素结晶，得到德谷胰岛素结晶。该制备方法生产效率高，稳定性好，因此，可用于工业化制备德谷胰岛素结晶。
【IPC分类】C07K14/62
【公开号】CN104892749
【申请号】CN201510334795
【发明人】张伟, 周小江, 曹春来, 肖拥军, 周翠, 林影
【申请人】珠海联邦制药股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，具体涉及一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种常见的以高血糖为特征的终身性代谢疾病，近年来随着各国社会经济的发展和居民生活方式的改变，肥胖人群和糖尿病患病人数迅速增加，糖尿病也已成为21世纪世界范围内的一种流行病。在中国，糖尿病患病人数现已高达1.14亿，成为继肿瘤和心脑血管疾病之后的第三个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病，糖尿病高并发症的发生导致高致残率和高致死率，给家庭和社会带来沉重的负担。
[0003]胰岛素治疗是控制血糖和治疗糖尿病的重要手段。随着临床用药的不同需求和胰岛素技术的不断发展，人们开发出了具有不同作用时效的胰岛素类似物，如速效胰岛素类似物门冬胰岛素和赖脯胰岛素，长效胰岛素类似物甘精胰岛素和地特胰岛素，长效胰岛素是口服药物失效时联合治疗的首选用药。
[0004]德谷胰岛素是一种新型超长效胰岛素，其分子结构特点是去掉人胰岛素B链30位苏氨酸，通过I个谷氨酸分子将16碳脂肪二酸侧链连接在B29位赖氨酸残基(参见专利TO2005012347)，其作用特点是半衰期长，体内作用时间超过42小时，并且低血糖发生率低，具有平稳的药代动力学特点，可以持久、平稳、长期降糖。
[0005]结晶是原料药生产的重要环节，而结晶后的德谷胰岛素具有均一的晶型，颗粒大，沉降快，易与上清分离，冷冻干燥时间短，更适合工业化生产；并且以固态晶体形式存在的德谷胰岛素，相比较于不定形固体粉末以及溶液状态的形式，对于产品稳定性、贮存性能等均更有优势。因此，迫切需要研宄德谷胰岛素的结晶工艺。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种德谷胰岛素结晶的制备方法。该制备方法可大规模地制备高质量和高收率的德谷胰岛素-锌结晶。该晶体具有稳定的固体分子形式，颗粒大，沉降快，易与上清分离，冷冻干燥时间短，生产效率高，易于放大工业生产。
[0007]本发明的另一目的在于提供所述德谷胰岛素结晶的制备方法的应用。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种德谷胰岛素结晶的制备方法，包括如下步骤:在0.05?0.27M组氨酸体系，并且含体积百分比8?15%有机溶剂的条件下，从含有德谷胰岛素、锌离子、酚类物质及盐的结晶液中，在PH值为6.5?8条件下使德谷胰岛素结晶，得到德谷胰岛素结晶。
[0009]所述的德谷胰岛素结晶的制备方法，优选包含如下步骤:
[0010](I)配制含有0.05?0.27M组氨酸、I?8g/L德谷胰岛素、体积百分比为8?15%的有机溶剂、质量体积百分比为0.2?0.5%的酚类物质、0.3?2.4M盐的结晶液；[0011 ] (2)调节结晶液pH值至6.5?8，加入锌离子，锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计；结晶；
[0012](3)然后在2?8°C条件下静置结晶，获得稳定的德谷胰岛素结晶。
[0013]步骤(I)和步骤⑵宜在I?30°C条件下进行，优选为10?30°C，更优选为20?28 °C，最优选为25 °C。
[0014]德谷胰岛素因修饰脂肪酸侧链与其他胰岛素差异较大，所以结晶较为困难，结晶过程中组氨酸的加入以及PH值的调节是影响结晶效果的关键因素。
[0015]所述的组氨酸是德谷胰岛素形成结晶的关键因素之一。在没有组氨酸的条件下，德谷胰岛素只能形成细小晶体颗粒，固液分离慢，不适合工业生产。发明人经大量的实验研宄发现，只有当结晶液中存在有0.05?0.27M组氨酸，德谷胰岛素才能形成稳定的晶体，沉降快，生产效率高，易于放大到工业生产。分析可能原因是:(1)和其它胰岛素一样，德谷胰岛素在锌离子作用下形成六聚体结构:T6、T3R3和R6，其物理及化学稳定性:R6 >> T3R3>>T6 (Rahuel-Clermont et al.1997) ; (2)在苯酚的作用下，德谷胰岛素六聚体趋向形成T3R3和R6构象；(3)在组氨酸的作用下，德谷胰岛素分子形成均一稳定的R6构象，通过调节结晶体系中的有机溶剂浓度、酚浓度、锌离子比例、盐浓度和pH，德谷胰岛素-锌R6六聚体堆积成稳定均一的晶体结构。
[0016]所述的pH值也是德谷胰岛素形成结晶的关键因素之一。由于德谷胰岛素的等电点介于PH4.5?5.0，本发明中结晶的条件是pH6.5?8.0，优选pH6.7?7.3，能形成粒径更大和结构更规则的结晶。本发明结晶液的PH值可通过使用酸和碱进行调节，优选使用醋酸和氨水进行调节。
[0017]所述的有机溶剂降低了结晶液中德谷胰岛素的溶解度，促使德谷胰岛素结晶的形成，因此结晶液中有机溶剂的浓度不宜低于8% (体积/体积)，同时，如果有机溶剂的浓度过高，又会增加蛋白质的溶解度，引起蛋白质重新溶解，因此结晶液中有机溶剂的浓度也不宜超过15% (体积/体积)。在本发明中，所述有机溶剂为任何本领域技术人员所公知的易溶于水的有机溶剂，如乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇等，其中优选的有机溶剂为乙腈。
[0018]所述的德谷胰岛素可以为干燥/冻干固体粉末或纯化收集的液体样品中的一种；其制备方法可参照专利W02005012347中披露的方法进行；所述的德谷胰岛素在所述的结晶液中的浓度为I?8g/L，优选为1.35?5.lg/L。
[0019]所述的盐是指易溶于水的强电解质盐，包含但不局限于氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、醋酸钱、硫酸钱等，优选氯化钠，浓度为0.3?2.4M，优选为1.2?2.4M。
[0020]所述的锌离子以锌盐形式加入，例如但不局限于氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌、硫酸锌等，优选为醋酸锌。锌离子的用量优选按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计，优选为(2?9):3。如果锌化合物的浓度过低会使德谷胰岛素结晶不完全，如果锌化合物浓度过高，会使结晶的颗粒变小，甚至形成无定形沉淀。
[0021]所述的酚类物质是指能够提供酚羟基的物质，如但不局限于间苯二酚、苯酚、甲酚、间甲酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯等，优选为苯酚；浓度为质量体积比0.2?0.5%，更优选为质量体积比0.2?0.22%。
[0022]步骤(2)中所述的结晶可在I?30°C条件下进行，优选为10?30°C，更优选为20?28°C进行，从而增加结晶前的溶解度。
[0023]步骤(2)中所述的结晶的时间优选为3?6小时。
[0024]步骤(2)中所述的结晶优选于搅拌状态下进行。
[0025]所述的搅拌速度优选为60?120r/min，更优选为100r/min。
[0026]步骤(3)中所述的结晶可在I?30°C下进行，优选为在2?8°C，从而提高德谷胰岛素结晶收率。
[0027]步骤(3)中所述的结晶的时间优选为14?22小时。
[0028]在工业化生产过程中，为了使德谷胰岛素更纯，可以选择重结晶工艺，为了降低结晶中的其他溶剂含量，也可以采取水洗结晶的方法。
[0029]所述德谷胰岛素结晶的制备方法在工业化制备德谷胰岛素结晶中进行应用。
[0030]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0031](I)本发明提供了一种新的组氨酸结晶体系，该结晶体系克服了应用其它胰岛素结晶体系不能使德谷胰岛素结晶的缺陷。
[0032](2)本发明结晶方法的实施生产效率高，稳定性好，适合于德谷胰岛素的工业化生产。
【附图说明】
[0033]图1是实施例1制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0034]图2是实施例2制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0035]图3是实施例3制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0036]图4是实施例4制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0037]图5是实施例5制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0038]图6是实施例6制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0039]图7是实施例7实验A制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0040]图8是实施例7实验B制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
[0041]图9是实施例7实验C制备的德谷胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0043]材料
[0044]德谷胰岛素:参考文献申请号为“W02005012347”、名称为“NOVEL INSULINDERIVATIVES”的专利申请中实施例4的方法进行制备；
[0045]组氨酸来源于阿拉丁化学试剂有限公司，批号:H1414079 ;
[0046]乙酸锌来源于广东光华化学厂有限公司，批号:120813 ;
[0047]水饱和酚来源于北京拜尔迪生物科技公司，批号:3105376 ;
[0048]乙酸来源于西陇化工股份有限公司，批号:1410171 ;
[0049]氯化钠来源于西陇化工股份有限公司，批号:114050249 ;
[0050]乙酸铵来源于西陇化工股份有限公司，批号:1406011 ;
[0051]氨水来源于西陇化工股份有限公司，批号:1301071 ;
[0052]乙腈来源于天津市康科德科技有限公司，批号51408084 ;
[0053]其余试剂至少为分析纯。
[0054]实施例1
[0055]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素3.72g/L，醋酸钱 0.063mol/L，乙腈 8% (v/v)，间苯二酸 0.22% (w/v)，醋酸锌 0.4mmol/L(与德谷胰岛素的摩尔比为6:4)，组氨酸0.2mol/L，氯化钠1.2mol/Lo
[0056]制备过程如下:
[0057]①制备浓度为12.4g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为27% (v/v)的乙腈，浓度为0.21mol/L的醋酸钱，用氨水调节pH值至7.5。
[0058]②制备A溶液，其中含有0.2mol/L组氨酸和1.65mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH值至7.0。
[0059]③取30ml上述德谷胰岛素溶液装于250ml三角瓶，再往其中依次加入30ml的纯化水、0.22g间苯二酚、1.86g组氨酸和3.16g氯化钠，溶解完全后加入40ml A溶液，用3M醋酸调PH值至7.0，最后加入80 μ I浓度为0.5Μ的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，室温25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，可见均一性较好，晶体形状规则，如图1所示。
[0060]实施例2
[0061]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素2g/L，醋酸钱0.063mol/L，乙腈10% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌0.2mmol/L(与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6 )，组氨酸0.2mol/L，氯化钠1.3mol/Lo
[0062]制备过程如下:
[0063]①制备浓度为6.67g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为33% (v/v)的乙腈，浓度为0.21mol/L的醋酸钱，用氨水调节pH值至7.5。
[0064]②制备A溶液，其中含有0.2mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH值至 7.0o
[0065]③取150ml上述德谷胰岛素溶液装于500ml三角瓶，依次加入150ml的纯化水和Ig水饱和酸并混匀，然后再加入9.3g组氨酸和15.78g氯化钠，溶解完全后加入200ml A溶液，用3M醋酸调pH至7.1，，最后加入200 μ I浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，可见均一性较好，晶体形状规则，如图2所示。
[0066]实施例3
[0067]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素1.35g/L，醋酸钱 0.105mol/L，乙醇 15% (v/v)，苯酸 0.2% (w/v)，醋酸锌 0.145mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6)，组氨酸0.2mol/L，氯化钠2.4mol/L。
[0068]制备过程如下:
[0069]①制备浓度为2.7g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30% (v/v)的乙醇，浓度为0.21mol/L的醋酸钱，用氨水调节pH值至7.5。
[0070]②取150ml上述德谷胰岛素溶液装于500ml三角瓶，依次加入150ml的纯化水和0.6g水饱和酸，混匀，然后再加入9.3g组氨酸和42.08g氯化钠，溶解完全后用3M醋酸调pH至6.7，加入87 μ I浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，放大160倍，均一性较差的不规则晶体，如图3所示。
[0071]实施例4
[0072]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素5.1g/L，醋酸钱0.063mol/L，乙醇9% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌0.55mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6)，组氨酸0.2mol/L，氯化钠1.3mol/Lo
[0073]制备过程如下:
[0074]①制备A溶液，其中含有0.2mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH至7.0。
[0075]②制备浓度为17g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30% (v/v)的乙醇，浓度为0.21mol/L的醋酸铵，用氨水调节pH值至7.5。
[0076]③取365ml上述德谷胰岛素溶液装于2L三角瓶，依次加入365ml的纯化水和2.43g水饱和酚并混匀，然后再加入22.63g组氨酸和38.40g氯化钠，溶解完全后加入487mlA溶液，用3M醋酸调pH至7.0，最后加入1.334ml浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，放大160倍，可见均一性较好，颗粒较小的晶体。如图4所示。
[0077]实施例5
[0078]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素3.38g/L，醋酸钱0.063mol/L，异丙醇9% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌1.64mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为18:6)，组氨酸0.27mol/L，氯化钠1.3mol/L0
[0079]制备过程如下:
[0080]①制备A溶液，其中含有0.27mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH至 7.0o
[0081]②制备浓度为11.28g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30% (v/v)的异丙醇，浓度为0.21mol/L的醋酸铵，用氨水调节pH值至7.5。
[0082]③取255ml上述德谷胰岛素溶液装于IL三角瓶，依次加入255ml的纯化水和1.7g水饱和酚，混匀，然后再加入21.34g组氨酸和26.82g，溶解完全后加入340ml A溶液，用3M醋酸调PH至7.3，最后加入2.784ml浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，放大160倍，颗粒较大，但是晶体形状不规则，如图5所示。
[0083]实施例6
[0084]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:德谷胰岛素3.72g/L，醋酸钱0.063mol/L，乙腈9% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸锌0.4mmol/L (与德谷胰岛素的含量摩尔比为4:6)，组氨酸0.05mol/L，氯化钠1.3mol/Lo
[0085]制备过程如下:
[0086]①制备浓度为12.4g/L的德谷胰岛素溶液，其中含浓度为30%的乙腈，浓度为0.21mol/L的醋酸铵，用氨水调节pH值至7.5。
[0087]②制备A溶液，其中含有0.05mol/L组氨酸和1.9mol/L氯化钠，用3M醋酸调pH值至7.0。
[0088]③取150ml上述德谷胰岛素溶液装于500ml三角瓶，依次加入150ml的纯化水和Ig水饱和酚，混匀，然后再加入2.325g组氨酸和15.78g，溶解完全后加入200ml A溶液，用3M醋酸调pH至7.3，最后加入400 μ I浓度为0.5mol/L的醋酸锌溶液，结晶开始。将装有结晶液的三角瓶放在摇床上转速100r/min，25°C结晶3h，将其降温至4°C静置，继续结晶20h。然后取少量混悬进行镜检，可见颗粒较大的晶体，如图6所示。
[0089]实例7
[0090]制备德谷胰岛素结晶液，该结晶液所含的组分和浓度分别为:
[0091]实验A按照公开号为CN102219851A、名称为甘精胰岛素结晶的制备方法的中国发明专利中的实施例1制备50mL结晶体系，含有德谷胰岛素3.5g/L，乙腈20 %，乙酸0.7M，乙酸钠 0.5M，苯酚 0.4%,氯化锌 120mg/L，ρΗ7.9。
[0092]实验B按照如下制备过程制备得到:将德谷胰岛素加乙腈水溶液，2Μ氢氧化钠溶液调节PH值至8.6，溶解完全，待用；配制盐溶液:二水合柠檬酸三钠、乙酸铵、氯化钠、苯酚水溶液和水混合均匀，2M氢氧化钠溶液调节pH值至8.6，并加至德谷胰岛素溶液中，混匀；最后加入乙酸锌溶液，2M盐酸调节pH值至8.1 ;放置摇床100转/分钟，15°C条件下结晶3h，然后转移至2°C条件下静置结晶15h。其中，各成分的浓度如下:德谷胰岛素3.2g/L，乙腈7 % (v/v)，二水合柠檬酸三钠0.1M，乙酸铵0.05M，氯化钠0.2M，苯酚0.05 % (w/v)，锌离子与德谷胰岛素的摩尔比为3:1，pH8.1o
[0093]实验C按照实例2的组分和含量配制。
[0094]结果:实验A德谷胰岛素只能形成絮状沉淀，未能形成规则的晶体(如图7)。结果实验B德谷胰岛素仍不能形成结晶，仍以无定形沉淀形式存在(如图8)。实验C德谷胰岛素能够形成规则的，颗粒较大的晶体(如图9)。
[0095]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包括如下步骤:在0.05?0.27M组氨酸体系，并且含体积百分比8?15%有机溶剂的条件下，从含有德谷胰岛素、锌离子、酚类物质及盐的结晶液中，在pH值为6.5?8条件下使德谷胰岛素结晶，得到德谷胰岛素结晶；所述有机溶剂为易溶于水的有机溶剂。2.根据权利要求1所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包含如下步骤:(1)配制含有0.05?0.27M组氨酸、1?8g/L德谷胰岛素、体积百分比为8?15%的有机溶剂、质量体积百分比为0.2?0.5%的酚类物质、0.3?2.4M盐的结晶液；(2)调节结晶液pH值至6.5?8，加入锌离子，锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计；结晶；(3)然后在2?8°C条件下静置结晶，获得稳定的德谷胰岛素结晶。3.根据权利要求2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:步骤(1)和步骤(2)在1?30°C条件下进行。4.根据权利要求2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的结晶的条件为于20?28°C在搅拌状态下进行，结晶时间为3?6小时；步骤(3)中所述的结晶的条件为于2?8°C静置结晶14?22小时。5.根据权利要求1所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的德谷胰岛素在所述的结晶液中的浓度为1?8g/L ；所述的盐的浓度为0.3?2.4M ;所述的锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?15):3计；所述的酚类物质在所述的结晶液中的浓度为质量体积比0.2?0.5%。6.根据权利要求5所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的德谷胰岛素在所述的结晶液中的浓度为1.35?5.lg/L ；所述的盐的浓度为1.2?2.4M ;所述的锌离子的用量按锌离子与德谷胰岛素按摩尔比(2?9):3计；所述的酚类物质在所述的结晶液中的浓度为质量体积比0.2?0.22%。7.根据权利要求1或2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述的pH值为6.7 ?7.3o8.根据权利要求1或2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:所述有机溶剂为乙腈、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种；所述的盐为氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、醋酸铵和硫酸铵中的至少一种；所述的锌离子以锌盐形式加入，锌盐为氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌和硫酸锌中的至少一种；所述的酚类物质为间苯二酚、苯酚、甲酚、间甲酚、对羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸甲酯中的至少一种。9.根据权利要求1或2所述德谷胰岛素结晶的制备方法，其特征在于:还包括水洗结晶的步骤。10.权利要求1?9任一项所述德谷胰岛素结晶的制备方法的应用，其特征在于:所述德谷胰岛素结晶的制备方法用于工业化制备德谷胰岛素结晶。
【专利摘要】本发明公开了一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用。本发明通过在0.05～0.27M组氨酸体系，并且含体积百分比8～15％有机溶剂的条件下，从含有德谷胰岛素、锌离子、酚类物质及盐的结晶液中，在pH值为6.5～8条件下使德谷胰岛素结晶，得到德谷胰岛素结晶。该制备方法生产效率高，稳定性好，因此，可用于工业化制备德谷胰岛素结晶。
【IPC分类】C07K14/62
【公开号】CN104892749
【申请号】CN201510334795
【发明人】张伟, 周小江, 曹春来, 肖拥军, 周翠, 林影
【申请人】珠海联邦制药股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
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