抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv及其应用
抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体 2F-scFv，及其在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面、检测B型肉毒毒素酶方面的应用， 还涉及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F- SCFv的底物。
【背景技术】
[0002] 肉毒毒素可导致人及动物肉毒中毒，其感染剂量极低，从灵长类动物实验中得出， 最低致死剂量（LD50)为lng/kg，因此，它已被美国疾病控制和预防中心指定为对人类的威 胁类似于炭疽的生物武器。导致肉毒中毒的原因大致分为四个类型，一、成人肉毒中毒。二、 婴儿感染性肉毒中毒。三、伤口感染性肉毒中毒。
[0003] 肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到 环境或培养液中，这种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 kDa到900 kDa。 前体毒素通常以复合体的形式存在，由神经毒素（Bont)，由一个或多个能够包围和保护毒 素的非毒性蛋白组成，包括血凝素（HA)，非毒素非血凝素（NTNH)。临床上所说的肉毒毒素 通常指具有神经毒性作用的神经毒素部分。
[0004] 肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在七种血清型（A、B、C、D、E、F、G、），尽管七种 血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是它们有着相近的分子量和相似 结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肽组成，蛋白质成熟时通过细菌介导的蛋白 酶将150kDa的单链多肽切割裂解成两个不相等的多肽片段，两个片段由一个二硫键连接， 形成一个分子量为50kDa的轻链片段（LC)和一个分子量为IOOkDa的重链片段（HC)。其中 轻链有一个催化功能域，重链包含分子量均为50kDa的两个功能域，N端部分为跨膜域，C 端部分为神经节苷脂结合域。单独的轻链和重链均无毒性，只有双链才具有生物学毒性。
[0005] 轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锌离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释 放。肉毒毒素的活性区埋藏（~20 A深)于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状 神经毒素的活性位点包括一个单一的锌原子，这个锌原子历来被认为有功能，但是不起结 构性作用。可以通过用金属螯合剂去除锌，但是通过在二级结构上加入游离的锌原子来重 新获得锌，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当 于原来的30%。位于轻链中心有一个高度保守的锌结合模块HExxH (X是任意的氨基酸)序 列。HExxH序列中含有一个由3个组氨酸整合的锌离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性 蛋白水解活性，这个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。
[0006] 在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉 毒毒素轻链上的His 222，Glu223和His226残基共同组成了锌结合模块HExxH序列的一 部分，并且在协调活性区锌（His 222和His226)和一个水分子（Glu223残基）的作用机制 中起了直接的作用。Glu261是协调锌的第三配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机 理与嗜热菌蛋白酶是相似的，这是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也 是相似的。从Glu223到Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素 失去了催化活性。通过对肉毒毒素结构分析表明，A、B型肉毒毒素中与作用机制相关的关 键氨基酸残基是相同的。与突触泡蛋白结合的B型肉毒毒素的晶体结构表明，Arg369和 Tyr372残基位于接近被毒素裂解的肽键。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显 降低，但是不影响锌结合和底物结合，人们提出，这些残基在过渡态稳定中发挥了作用。
[0007] 另外，在LC活性中心还有一些氨基酸残基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。 它们的功能主要是维持和稳定轻链活性中心的结构和/或它与被结合底物的相对位置，以 此保证轻链最佳的酶解能力。
[0008] LC通过二硫键与HC的N端连接。在二硫键存在的状态下，毒素重链HN结构域形 成一条loop结构，将深陷于轻链表面裂缝中的Zn 2+催化部位遮蔽住，从而不表现酶活性。在 双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现锌离子内肽酶活性，催化 部位能够容纳底物16个氨基酸残基。催化部位的锌离子除同4个组氨酸残基的咪唑环、1 个结合于保守谷氨酸的水分子形成配位键外，还与另一分子的谷氨酸羧基形成配位键，1个 色氨酸分子很可能也参与锌离子的配位。毒素轻链的这种独特锌离子配位形式、空间结构 与其他所有已知的金属蛋白酶的三维结构都不同，应当属于一个新型的金属蛋白酶家族。
[0009] 肉毒毒素的致病机理 1、靶细胞的识别与结合 前体毒素进入胃肠道，在消化过程中，非毒素组分对神经毒素起到保护作用，使其不会 受到各种消化酶和胃酸的侵蚀。由于分子量过大，毒素分子不是以扩散的方式，而是以"内 凹"和细胞摄入的方式通过肠粘膜上皮屏障，而不会破坏胃肠道。然后进入小肠中，在小肠 的微碱性环境下，前提毒素中的神经毒素解离出来，进入血液及淋巴循环，在运动神经和交 感神经处发挥其毒性作用。尽管神经毒素可侵入不同的组织和器官，但不能穿透血脑屏 障，其惟一的亲和靶点是外周胆碱能神经末梢。在胆碱能神经末梢，毒素的轻链能够抑制 神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接头处的释放，导致肌肉麻痹。在这一毒性作用过程中，神经 毒素的各功能域都有参与，具体的过程可分为三个阶段。
[0010] 靶细胞的结合与内化 在靶细胞的识别与结合这一过程中，肉毒毒素重链的结合域发挥了作用。结合域能够 识别胆碱能神经末梢，并与其发生特异性结合。结合域结合到运动神经元的神经节苷脂和 位于末端神经细胞膜表面小结上的蛋白受体，特别是具有亲和力的GDlb，GTlb和GQlb类 神经节苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖组成的神经节苷脂连接到神经酰胺。通过对神经节 苷脂分布及对其亲和结合力的研宄，可以确定，神经节苷脂不是唯一能促进肉毒毒素结合 的分子，而双受体模型的提出表明，在发生内化作用前，肉毒毒素就已经结合到了蛋白受体 上。尽管有一些证据表明，突触结合蛋白可能参与了 A、B和E型的内化作用，但是梭菌属家 族每一个成员的受体，还没有完全确定。每个毒素与其蛋白共受体都是特异性同源的，B型 肉毒毒素与唾液酸乳糖的混合物就与肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神经毒素与神经节苷 脂结合的一个〃锁和钥匙〃原理。这个观察成功说明了一个观点，那就是神经节苷脂结合 使肉毒毒素靠近蛋白受体，促进了毒素的识别和内化。
[0011] 一旦结合到神经元表面，母体分子裂解，重链和轻链通过锌原子结合到达神经元 细胞膜，并且被内化进入细胞囊泡，形成一个包裹着毒素分子的酸性小囊泡。即内化过程。 这一受体介导的内吞过程与时间，温度及突触活动均有关。
[0012] 2、易位 肉毒毒素的轻链必须从囊泡小室或者胞内体中出来，并且在H链N-末端作用下的通过 膜运输能够成功进入细胞溶质的靶蛋白，这一过程是称为轻链易位。
[0013] 与其它梭菌毒素一样，肉毒毒素进入细胞内的酸性小泡后，会因 pH的变化而发生 结构重组。尽管进入突触小泡和胞内小泡是显而易见，但是肉毒毒素易位进入胞内小泡的 特性尚未断然确定。PH的降低使肉毒毒素结构发生变化，从而导致其在分子中有较大的疏 水性，并且增加了脂双层的渗透性。这样毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双层内，一旦 嵌入，就会在磷脂双层和PC12膜上形成离子通道。这个通道是具有选择性的，分子量大的 分子无法通过，所以目前普遍认为毒素轻链可以通过离子通道从小泡腔内转运到神经细胞 胞质。据此有三种轻链跨膜转运假说模型，即管道模型（tunnel model)，裂缝模型（cleft model)和裂解模型（lysis model)。其中裂缝模型理论认为，在低pH时，蛋白质的分子构 想发生了改变，此时HC可形成一个亲水性的裂隙，并且在轻链穿膜过程中将其亲水表面包 围。在此模式中形成了亲水性和疏水性的相互作用。轻链的羧基端因为二硫键与重链氨基 端相连而最先进入到胞质。实现易位后，由于胞质的pH高于酸性小泡，使轻链结构重新折 叠，重新回到具有催化活性。
[0014] 在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域发生构象上的变化，最终跨越人工膜形成 离子通道，并且在体内PH的环境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成 的离子通道与白喉毒素形成的相似，并且也是只在低PH下形成。肉毒毒素离子通道只允许 阳离子通过，但是可以在体外阻止氯喹。然而对于小孔径离子通道的研宄，我们尚未清楚肉 毒毒素形成的通道是不是毒素轻链进入细胞溶质的必经之路。数据显示，在低PH下轻链的 结构有一个戏剧性的变化，就是可能产生一个选择性的LC结构并且更适合于易位。尽管这 在体内还没被证实，但是通过低PH诱导结构变化是完全可逆的。
[0015] 肉毒毒素能够在神经传递发挥作用，就必须通过蛋白水解使LC与HN接头处暴露 的表面产生缺口，从而使非活性的单链分子量为150-kDa的毒素活化。少数的细菌和组织 蛋白酶能够实现这个裂解反应，并产生有活性的双链神经毒素。产生切口后，轻链和重链仍 然通过非共价键相互作用，并且由一个单一的二硫键连接。这种链间的二硫键（A型肉毒毒 素中的Cys430 - Cys454)的减少是轻链活化的第二阶段，这是轻链自由进入运动神经元胞 质溶胶和与底物间相互作用必不可少的阶段。正如前面提到的，在低PH情况下，轻链有一 个戏剧性的变化。这种结构的变化有助于易位带(如果在易位点HN域确实是靠近轻链）的 重组和导致轻链的最终活化。神经元信号转导通路可以与肉毒毒素-LC活动密切联系在一 起的。因此，轻链活化的完成最终可能是发生在胞质溶胶中的，紧接着从低PH的小室中易 位。
[0016] 3、抑制神经递质释放 神经小结处有突触小囊泡，其中包含乙酰胆碱，它是能穿过神经肌肉接头刺激肌肉收 缩的一种神经递质。该乙酰胆碱的小囊泡被一个叫做SNARE复合体的蛋白聚合物所结合。 为了穿过神经肌肉交界处实现信号的传递，突触前神经小结中的乙酰胆碱小囊泡必须被释 放到突触间隙中。在这里，神经递质在肌肉板上结合到特定受体上，触发离子通道打开，从 而导致相邻横纹肌的去极化和收缩。乙酰胆碱的释放，需要有SNA RE蛋白的参与，它能够介 导突触小泡与神经元细胞膜的融合。
[0017] SNARE复合体蛋白参与突触小泡上质膜融合，而肉毒毒素轻链的作用是阻碍胞吐 作用。更具体地说，就是在肌肉接头处，神经毒素通过切割SNARE蛋白（乙酰胆碱分子胞吐 作用所必须的物质）阻断了囊泡内容物释放到细胞外环境中，抑制乙酰胆碱的释放，从而抑 制神经传递。据证实，单独的SNARE蛋白裂解不会妨碍SNARE复合体形成，但是却会导致非 功能性复合物在Ca 2+内流和融合之间的耦合被破坏。毒素在抑制神经递质释放时，需要Ca2+ 的参与，而在突触末梢Ca 2+浓度增加会影响肉毒毒素的作用效果。
[0018] 轻链作为锌肽链内切酶蛋白切割致使SNARE复合物不稳定，成为非功能性，从而 抑制乙酰胆碱释放到突触间隙。囊泡释放到突触间隙的数量越少，动作电位传播的概率就 越低，从而引起肌肉纤维的收缩。结果导致肌肉自身的化学去神经术而引起弛缓性麻痹。现 有研宄表明SNARE复合物由VAMP、SNAP-25和syntaxin三种蛋白质组成，下表所示为不同 类型的肉毒毒素的靶蛋白及其切割位点。
[0019] 噬菌体展示技术的基本原理是把外源DNA插入噬菌体编码外壳蛋白pin或 PVIiI的基因中，使外源DNA片断对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋 白（fusion protein)，呈现在噬菌体表面。噬菌体展示技术的显著优点是：建立了基因型 (genotype)和表型（phenotype)之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。将外源蛋 白或多肽表达于噬菌体表面，就可根据其性质利用它与其他生物或非生物物质的亲和性对 含目的基因的菌体进行筛选。以菌体抗体库的筛选为例，将Fab (fragment antigen binding)表达在菌体表面，以相应的抗原为亲和性配体筛选，可以快速高效地从大量克 隆中筛选表达特异性抗体的噬菌体。因此，用噬菌体展示技术制备高亲和性抗体与传统的 杂交瘤单克隆抗体技术相比具有明显的优势。
[0020] 噬菌体抗体在膜表面表达，是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融 合蛋白而完成。其特点是"它既可识别相应的抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进行再 扩增"。利用其可再扩增的特性，以靶抗原通过亲和吸附-洗脱-扩增，可筛选到靶分子的配 体肽链。再经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终便获得高亲和力的特异性抗体。噬 菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤：淘筛和鉴定。淘筛是将噬菌体抗体库与选择用的抗 原共同孵育，通过几轮洗脱，收集结合的噬菌体。将获得的噬菌体感染细菌并扩增，再进行 下一轮的淘筛。经几轮淘筛后，便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株。 鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株。即将淘筛出的噬菌体感染细 菌、铺板、挑选，即可得到高特异性单克隆菌株。
[0021] 从噬菌体抗体库中筛选表达特异性抗体的噬菌体的经典方法主要有两种：（1)将 纯抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体， 洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。（2)将抗原与生物素基团相 连，再将其固定在包被有streptavidin的顺磁珠上对菌体进行筛选。两种方法中均需加 脱脂牛奶（或BSA，其效果较差）封闭未被抗原占据的位点，以避免噬菌体非特异性的结合。 对于前一方法，回收与抗原特异性结合的噬菌体可用碱性溶液（如三乙基胺，（triethy- Iamine)或酸性溶液（如甘氨酸一盐酸，glycine_HCl)洗脱，或用可溶的抗原或半抗原洗 脱；对于后一方法，用二巯基苏糖醇（dithiothretOl，DTT)通过破坏抗原与生物素之间的 二硫键来洗脱。回收的噬菌体感染宿主菌，增殖后进行下一轮筛选。一般经过3-5轮这样 的筛选可得到表达高亲和性的目的抗体的克隆。每一轮筛选都需要进行检测，以证实筛选 的有效性。
[0022] 英国 MRC HGMP 资源中心创建的 Human Single Fold scFv Libraries I+J ( Tomlinson I + J)是当今成熟的全人源噬菌体抗体库，其库容超过IO8全人源噬菌体单链 抗体，本研宄利用该噬菌体库淘选特异性抗B型肉毒毒素单链抗体，并对阳性单链抗体进 行系统分析，以期创制B型肉毒毒素中毒治疗抗体类药物奠定物质基础。
[0023] 本发明人通过对肉毒毒素的作用机理的了解及研宄，确定肉毒毒素能够引起人畜 共患病，且主要攻击体内的神经突触系统，其致病机理为，肉毒毒素通过其重链C端结构域 结合于胆碱能神经元的突触前膜，形成毒素受体复合物内化进入细胞囊泡，然后轻链锌内 肽酶酶活性区从细胞内的酸性空间释放进入细胞质。一旦从囊泡中释放出来，轻链通过切 害J SNARE复合物蛋白来阻止乙酰胆碱的释放，引起肌肉麻痹。因此轻链为主要的致病部位。 目前，国内外关于A型肉毒毒素的报道已相对比较全面，但关于B型肉毒毒素的研宄报道相 对较少，同时缺乏B型肉毒毒素治疗方法和药物，这样就造成了一旦有人罹患B型肉毒中 毒，将无法及时进行正确治疗的境况。抗体是治疗肉毒中毒最有效的方法，但目前研宄或有 限使用的异源性血清抗体存在着许多缺点，如引起免疫反应或传染疾病等，导致无法推广 应用。由于此类抗体分子量较大，难于穿透细胞膜，针对已经进入细胞的毒素轻链则无治疗 效果，因此本发明旨在克隆表达B型肉毒毒素，通过重组蛋白在人源化抗体库中筛选中和 性人源化单链抗体，为研制抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定基 础。
【发明内容】
[0024] 本发明的目的是为解决异源性血清抗体在治疗B型肉毒毒素中毒，存在引起免疫 反应或传染疾病的问题，而提供一种全人源的单链抗体ScFv，抗B型肉毒毒素酶活性的人 源单链抗体2F-scFv。
[0025] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFV，其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。
[0026] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-SCFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
[0027] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-SCFv在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒 药物方面的应用。
[0028] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F_scFv在检测B型肉毒毒素方面的应 用。
[0029] 本发明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFV，它是利用 人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体的底物 GFP-HIS6-SNAP25 (62)-VAMP (57)-C，人源化抗B型肉毒毒素酶活性抗体库中筛选出来的， 亲和常数为（5. 35±0. 903) X 105L/mol，为生产抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测 B型肉毒毒素奠定了基础。
【附图说明】
[0030] 图1为双酶切pMD-IOT-Bont-B质粒电泳结果；I. EcoR I和Nde I双酶切质粒 pMD-19T-Bont-B ； 2. DNA marker DL2000〇
[0031] 图 2 为 PCR 鉴定重组质粒 PET-28a-BontB 结果图；I. DNA marker DL2000 ; 2. 3. 4.均为BontB区域PCR扩增产物。
[0032] 图3为双酶切重组质粒PET-28a-BontB鉴定结果；其中：1· 2.均为EcoR I和 Nde I 双酶切质粒 PET-28a-BontB 3. DNA marker DL2000 ; 图4为重组蛋白表达形式鉴定其中：1.未诱导菌超声沉淀；2.诱导菌超声沉淀；3.未 诱导菌超声上清；4.诱导菌超声上清国5:诱导的全菌体；6.蛋白质Marker ; 图5为重组蛋白SDS-PAGE结果分析；其中：1.蛋白质marker ;2.初步纯化的目的蛋 白；3.最终纯化的目的蛋白； 图6重组质粒PET-28a -GFP的双酶切鉴定（NcoI和BamHI);其中1:质粒PET_28a -GFP 的双酶切产物；M : DNA marker DL2000 ; 图 7 质粒 PET-28a-GFP-SV 的双酶切产物；M :DNA marker DL5000 ; 图8纯化后2F-scFv SDS-PAGE结果分析；I:流穿2:55%硫酸铵原样3:纯化后scFv。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1:B型肉毒毒素轻链基因的合成 根据Genbank报道的B型肉毒毒素全基因序列，设计并合成轻链基因，同时插入EcoRI 和恥6 1酶切位点，将基因片段克隆入？1?-191'仰(^〇1'，转化入舅109中。
[0034] 实施例2:B型肉毒毒素轻链基因与PET_28a载体连接 利用内切酶EcoR 1和Nde I双酶切质粒pMD-19T-Bont-B，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳 分析，结果见图2所示，可见到大小约为1335的目的基因 BontB，与预期的大小相符； 将EcoRI和Nde I双酶切的载体PET-28a大片段与目的基因 BontB小片段回收，并用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒PET-28a-BontB，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗 性的琼脂糖平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提 取质粒。
[0035] 通过合成插入EcoRI和Nde I酶切位点的B型肉毒毒素轻链基因序列，为其设计引 物，上游引物标为Pl，下游引物标为P2。
[0036] Pl (23bp) :5' CATATgCCAgTTACAATAAATAA-3' P2 (23bp) :5' gAATTCTCATTTAACACTTTTAC-3' 以重组质粒PET-28a-BontB为模板，Pl和P2为引物进行扩增反应，得到的PCR产物， 经琼脂糖凝胶电泳鉴定分析，（见图3); 用限制性内切酶和EcoR I和Nde I进行双酶切鉴定，并进行序列的测定。可见质粒经 双酶切后，PCR扩增目的条带后，在1335bp上均有目的基因带(见图4)，证明目的基因 BontB 基因已经连接到载体上，成功的构建了重组质粒PET-28a-BontB。
[0037] 实施例3:重组蛋白PET-28a-BontB表达产物的SDS-PAGE结果分析 将重组质粒PET-2 8a-BontB转化表达菌-大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导表达后， SDS-PAGE结果显示：重组蛋白PET-28a-BontB在50KD左右处有一明显表达带，大小与理论 值相符；见图5 ; 将重组蛋白表达菌裂解液上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，其中上清与沉淀的比例 为1:10,结果显示，目的蛋白绝大多数在上清中，沉淀中相应位置也存在少量目的蛋白，认 为通过诱导条件的优化，在适宜的诱导环境下能够以可溶形式表达，见图5。
[0038] 实施例4:重组蛋白PET-28a_BontB的纯化 重组蛋白的初步纯化：大量制备细菌，诱导表达重组蛋白，可溶性蛋白先进行DEAE阴 离子交换层析柱，并收集流川峰，再进行属螯合层析Cu2+柱，收集200mM咪唑洗脱的目的蛋 白。
[0039] 用 Thrombin 酶切除 His-Tag 重组蛋白的二次纯化：酶切后的蛋白进行属螯合层析Cu2+柱，收集250mM咪唑洗脱的 目的蛋白。收集的蛋白经SDS-PAGE结果分析，如图，可在50KD左右处有一明显条带，且纯 化效率可达90%以上，见图5。
[0040] 实施例5:全人源抗Bont-B-scFv抗体的筛选 纯化的重组蛋白为抗原包被于96孔酶标板上，4°C过夜。次日弃上清，用2%的Mi Ik-PBS 3 7 °C封闭2 h，加入噬菌体抗体库，滴度为1. 0 X 1013，室温下剧烈晃动孵育6 0 m i η，静置 60min。后弃去液体，用含0. l%Twenn-20的PBS洗涤10次，洗涤后将每孔中残留的液体轻 轻拍干，每孔加入5〇μL洗脱液（5mg/mL的胰酶-PBS)，室温下剧烈晃动lOmin，洗脱噬菌体， 收集4 °C保存。
[0041] 用洗脱下的噬菌体侵染E. coli TG1，并涂布于TYE平板上(含lOOPg/mLAmp和1% 的葡萄糖）37°C过夜培养。利用辅助噬菌体KM13扩增噬菌体库，通过PEG/NaCl回收噬菌 体。重复以上过程3次，共4轮筛选，收集筛选的噬菌体库。
[0042] 实施例6:Bomt-B活性检测底物一GFP-SV的基因构建与纯化 根据GenBank 中登录的SNAPE25、VAMP基因序列，设计并合成 HIS6-SNAPE62-EcoRI-VAMP57C-TAA基因，同时在基因两端分别插入BamHI和Hind III酶切位 点，合成重组质粒PMD19-T- SV。
[0043] 根据绿色荧光蛋白GFP基因，设计一对特异性引物， 上游引物 Pl: 5' -CATGccATGGTGAGCAAGGGCG-3' 下游引物 P2: 5' -GCGGATCCcttgtacagCTCGTCCATG-3' 以Pl和P2为引物，GFP质粒为模板，PCR扩增GFP基因，利用内切酶NcoI、BamHI双酶 切载体pET-28a和720bp PCR回收产物，，以T4DNA连接酶连接pET-28a和GFP基因片段， 连接产物转化感受态E. coli JM109,次日挑取单菌落，提取质粒。对其进行PCR、双酶切 以及测序鉴定，得出GFP成功克隆到pET-28a中，并未发生碱基丢失和突变，成功构建载体 pET-28a-GFP。
[0044] 用内切酶Hind III和BamHI对合成的重组质粒pMD19-T-SV和重组表达质粒 pET-28a-GFP双酶切，分别回收393bp小片段和pET-28a-GFP载体大片段，以T4DNA连接酶 连接。连接产物（pET-28a-GFP-SV)转化感受态E.coliJM109，涂布Kan(50μg/ml)的LB 平板上，37°C培养过夜。次日挑取单菌落，提取质粒，经双酶切和测序鉴定后，得出SV基因 成功插入到pET-28a-GFP载体中，成功构建pET-28a-GFP-SV表达载体。
[0045] 将重组质粒pET-28a-GFP-SV转化表达菌-大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导表达， 确定了最佳的表达方式：LB培养基，37°C，3 h。超声破碎菌体后经SDS-PAGE电泳检测，确 定目的蛋白绝大多数在上清中，故目的蛋白以可溶形式表达。
[0046] 重组蛋白GFP-SV的纯化，重组蛋白表达菌体经超声裂解，先后经过DEAE阴离子交 换层析，金属螯合层析，Q阳离子交换层析，获得纯度在90%以上的纯品GFP-SV。热原质检 测<20EU/mg，满足蛋白性质研宄的需要。
[0047] 实施例7:抗Bont-B-scFv阳性菌株鉴定 筛选后的噬菌体侵染凡HB2151，诱导表达后，利用ELISA鉴定，置酶标仪测定OD 值(波长为490nm)，每个样品做双孔测定，取OD平均值。以2%MiIk-PBS为阴性对照，阳性克 隆菌株确定标准为：OD值为阴性对照的3倍以上，共获得200株阳性克隆菌株。
[0048] 阳性菌株生物活性检测，将GFP-SV用包被液稀释，每孔包被3(^g于检测板 (Pierce Maleimide Activated 96-well Plates, Black, 15153)中，4 °C 过夜，用 Wash buffer洗涤3次，将200株阳性菌株，诱导表达离心后，将100μL上清和4 Pg Bont-B混匀， 加入到检测板中，37°C作用2h，每份样品做双孔测定，再用Wash buffer洗涤3次，在多功能 酶标仪上检测荧光强度，得出3株活性较好的菌株。按照Tomlinson I+J试剂盒上的pIT-2 载体的基因序列，合成两条特异性PCR引物扩增scFv全基因片段。
[0049] Pl LMB3: 5' 一CAG GAA ACA GCT ATG AC-3， P2 pHEN: 5' 一CTA TGC GGC CCC ATT CA-3' 经检测3株阳性菌株，均能够出现明显900bp条带，含有完整的scFv。
[0050] 测序鉴定其序列并经Blast数据库分析得出：得出3株阳性菌株均为人源单链抗 体，分析如下： 3A-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC IMKYL LPTA AAGL LLLAA CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA Q PAMA E V QLL ES GGG L V CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT QPGGSLRLS CAA SG FTF CDR-Hl AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG S SYAMSff V R QA PG KG LE CDR-H2 TGG GTC TCA AAT ATT TCT TCT AAT GGT AAT GCT ACA GCT TAC GCA GAC TCC GTG W V SN I S S N G N A T AY ADSV AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG KGR FT I SRN NSKN T L YL CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA QMNS L RA ED TA VYY CAK CDR-H3 TAT ACT TAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG YTYA FD Y ff G QGT LVTVS Linker AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG S GG GGSGG GG SGG GG S T GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC D IQ MTQ SP S SL SA SVGD AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT CDR-Ll RVTIT CRASQS I SSYLN TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT TAT GCA W_ Y Q QK PGK A P KL L I YYA CDR-L2 TCC AAT TTG CAA AGC GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG SNLQS GVPSRFSGSGSG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TDFT LT IS S LQPED FATY CDR-L3 TAC TGT CAA CAG GAT TCT TAT ACT CCT TCT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG Y CQQD SYT PST F G QGT K GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA VEI KR AA AH HHHHHG A A GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG EQKLIS EE DLNGAA 2F-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG I MK YLL P TA A AGL LLL A GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG A QPA MA EVQ LL ES GGGL CDR-Hl GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TC C TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC VQPGGSLRLS C AA SGFT TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG FS SYA MS ff VRQA P G KGL CDR-H2 GAG TGG GTC TCA TCT ATT GCT TCT ACT GGT TCT AAT ACA GCT TAC GCA GAC TCC EffVS S I A STGSNTAY ADS GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT V K GR FTI SR N NSKN TLY CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG L QMN S LRA E DT AVYY C_A. CDR-H3 AAA GGT ACT GGT ACT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC KGTG TF DYffG QG T LVTV Linker TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG S S GG GGSGG G GS GG GGS ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA T D I QMTQ S PS SLS ASVG CDR-Ll GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA DRV TI T CRA S QS I S SYL AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTA ATC TAT ACT N_W_YQQ KP G KAP K L L I Y T CDR-L2 GCA TCC TAC TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT ASYLQS G V PS RFS GS GS GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA GT DFT LT I SS LQ PE DFA CDR-L3 ACT TAC TAC TGT CAA CAG GCT ACT ACT AGT CCT TAT ACG TTC GGC CAA GGG TYY CQ Q ATT SP YTF G Q G ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG TKVEIKRAAAHHHHHHG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG AAE QK LIS E ED L NGAA 4C-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC IM KYLL PTA A AGLLLLAA CAG CCG GCC ATG GCT GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA QP A MAEVQ L LES GGG L V CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT QP G GS L RLS CAA SGFT F CDR-Hl AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG S SYAMS ff V R QAPGK G LE CDR-H2 TGG GTC TCA GGT ATT TCT CCT ATG GGT ACT CGT ACA TCG TAC GCA GAC TCC WVS G I SP MGT RTS Y ADS GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT V K GR FT I SRD N SK NT LY CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG LQMNS LRA E DT AVYY C_A. CDR-H3 AAA AAT GCT AAT GGG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC KNANGF DYffG QGT LVT V Linker TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG S SGGG G SG GGG SGG GG S ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA TD I QMTQ SP S SL SASV G CDR-Ll GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA DRVT I T CRA S Q SI S SYL AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGG N_W_ Y Q Q K PG KA PK L L I Y R CDR-L2 GCA TCC GTT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT ASV LQS GVP S RFS GSG S GAG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ETD FT L TI S S LQP E DFA CDR-L3 ACT TAC TAC TGT CAA CAG CGG AGT CGG CCG CCT ATT ACG TTC GGC CAA GGG TYY CQQRSRPPITFG Q G ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG TKVE I K RA AAHHHHHHG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG AAE QKL I SE E DLNGA A 实施例8:抗Bont-B-scFv纯化以及抗体亲和常数KD值测定 3株强阳性克隆菌株在37°C培养，至0D600到0. 9,加入诱导剂30°C培养过夜（16h)，过 夜培养物4°C，3500 X g离心30min，上清为表达的scFv，大小为31000。诱导上清先后经过 55%饱和度硫酸铵沉淀和rProtein-A亲和层析后，得到纯度在90%以上的样品。
[0051] 利用非竞争酶免疫法测定2F、4C和3A单链抗体的亲和常数，分别以4 Pg/mL、 2Pg/mL、lPg/mL和0· 5 Pg/mL包被Bont-B，将单链抗体浓度调整到KT6 mol/L，倍比稀释 1:2~1:512,用1:5000倍稀释的Protein A-HRP抗体作为二抗，OPD显色，测定0D490nm吸 光值，每个样品做双孔测定，取OD平均值。根据抗原抗体结合反应的S形曲线图，能够求解 出在不同抗原浓度下板书吸光值的抗体浓度，带入到公式KA= (n-l)/2(nAb'-Ab)计算亲 和常数，其中Ab'和Ab表示当抗原为Ag'和Ag时，产生半数吸光值的抗体浓度（mol/L)， n=Ag/Ag'，当n=2时可以得到3个KA值，n=4时可得2个KA值，n=8时得1个KA值，把六个 KA值取平均数就是最终的亲和常数数值。
[0052] 从表看出4C单链抗体的亲和常数为（4. 38±0.445) X IO5LAiol，3A的亲和常数 为（5. 35 ±0.903) X 105L/mol，2F 为（L 146 ±0.525) X 106L/mol。
[0053]
【主权项】
1. 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFV，其碱基序列如序列表SEQIDNO. 7 所示。2. 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-SCFv，其氨基酸序列如序列表SEQID NO. 8所示。3. 权利要求1所述的抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv在生产治疗B型 肉毒毒素酶中毒药物方面的应用。4. 权利要求1所述的抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv在检测B型肉毒 毒素方面的应用。
【专利摘要】本发明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体的底物GFP-HIS6-SNAP25（62）-VAMP（57）-C，人源化抗B型肉毒毒素酶活性抗体库中筛选出来的，亲和常数为（1.146±0.525）×106L/mol，为生产抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定了基础。
【IPC分类】G01N33/68, A61P39/02, A61K39/40, C12N15/13, C07K16/12
【公开号】CN104892754
【申请号】CN201510153140
【发明人】张国利, 田园, 刘雪, 于佳, 李玉洁, 刘雨玲, 岳玉环, 吴广谋, 李爽, 史飞, 赵鑫, 徐艳玲, 张培培
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月2日
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体 2F-scFv，及其在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面、检测B型肉毒毒素酶方面的应用， 还涉及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F- SCFv的底物。
【背景技术】
[0002] 肉毒毒素可导致人及动物肉毒中毒，其感染剂量极低，从灵长类动物实验中得出， 最低致死剂量（LD50)为lng/kg，因此，它已被美国疾病控制和预防中心指定为对人类的威 胁类似于炭疽的生物武器。导致肉毒中毒的原因大致分为四个类型，一、成人肉毒中毒。二、 婴儿感染性肉毒中毒。三、伤口感染性肉毒中毒。
[0003] 肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到 环境或培养液中，这种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 kDa到900 kDa。 前体毒素通常以复合体的形式存在，由神经毒素（Bont)，由一个或多个能够包围和保护毒 素的非毒性蛋白组成，包括血凝素（HA)，非毒素非血凝素（NTNH)。临床上所说的肉毒毒素 通常指具有神经毒性作用的神经毒素部分。
[0004] 肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在七种血清型（A、B、C、D、E、F、G、），尽管七种 血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是它们有着相近的分子量和相似 结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肽组成，蛋白质成熟时通过细菌介导的蛋白 酶将150kDa的单链多肽切割裂解成两个不相等的多肽片段，两个片段由一个二硫键连接， 形成一个分子量为50kDa的轻链片段（LC)和一个分子量为IOOkDa的重链片段（HC)。其中 轻链有一个催化功能域，重链包含分子量均为50kDa的两个功能域，N端部分为跨膜域，C 端部分为神经节苷脂结合域。单独的轻链和重链均无毒性，只有双链才具有生物学毒性。
[0005] 轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锌离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释 放。肉毒毒素的活性区埋藏（~20 A深)于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状 神经毒素的活性位点包括一个单一的锌原子，这个锌原子历来被认为有功能，但是不起结 构性作用。可以通过用金属螯合剂去除锌，但是通过在二级结构上加入游离的锌原子来重 新获得锌，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当 于原来的30%。位于轻链中心有一个高度保守的锌结合模块HExxH (X是任意的氨基酸)序 列。HExxH序列中含有一个由3个组氨酸整合的锌离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性 蛋白水解活性，这个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。
[0006] 在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉 毒毒素轻链上的His 222，Glu223和His226残基共同组成了锌结合模块HExxH序列的一 部分，并且在协调活性区锌（His 222和His226)和一个水分子（Glu223残基）的作用机制 中起了直接的作用。Glu261是协调锌的第三配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机 理与嗜热菌蛋白酶是相似的，这是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也 是相似的。从Glu223到Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素 失去了催化活性。通过对肉毒毒素结构分析表明，A、B型肉毒毒素中与作用机制相关的关 键氨基酸残基是相同的。与突触泡蛋白结合的B型肉毒毒素的晶体结构表明，Arg369和 Tyr372残基位于接近被毒素裂解的肽键。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显 降低，但是不影响锌结合和底物结合，人们提出，这些残基在过渡态稳定中发挥了作用。
[0007] 另外，在LC活性中心还有一些氨基酸残基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。 它们的功能主要是维持和稳定轻链活性中心的结构和/或它与被结合底物的相对位置，以 此保证轻链最佳的酶解能力。
[0008] LC通过二硫键与HC的N端连接。在二硫键存在的状态下，毒素重链HN结构域形 成一条loop结构，将深陷于轻链表面裂缝中的Zn 2+催化部位遮蔽住，从而不表现酶活性。在 双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现锌离子内肽酶活性，催化 部位能够容纳底物16个氨基酸残基。催化部位的锌离子除同4个组氨酸残基的咪唑环、1 个结合于保守谷氨酸的水分子形成配位键外，还与另一分子的谷氨酸羧基形成配位键，1个 色氨酸分子很可能也参与锌离子的配位。毒素轻链的这种独特锌离子配位形式、空间结构 与其他所有已知的金属蛋白酶的三维结构都不同，应当属于一个新型的金属蛋白酶家族。
[0009] 肉毒毒素的致病机理 1、靶细胞的识别与结合 前体毒素进入胃肠道，在消化过程中，非毒素组分对神经毒素起到保护作用，使其不会 受到各种消化酶和胃酸的侵蚀。由于分子量过大，毒素分子不是以扩散的方式，而是以"内 凹"和细胞摄入的方式通过肠粘膜上皮屏障，而不会破坏胃肠道。然后进入小肠中，在小肠 的微碱性环境下，前提毒素中的神经毒素解离出来，进入血液及淋巴循环，在运动神经和交 感神经处发挥其毒性作用。尽管神经毒素可侵入不同的组织和器官，但不能穿透血脑屏 障，其惟一的亲和靶点是外周胆碱能神经末梢。在胆碱能神经末梢，毒素的轻链能够抑制 神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接头处的释放，导致肌肉麻痹。在这一毒性作用过程中，神经 毒素的各功能域都有参与，具体的过程可分为三个阶段。
[0010] 靶细胞的结合与内化 在靶细胞的识别与结合这一过程中，肉毒毒素重链的结合域发挥了作用。结合域能够 识别胆碱能神经末梢，并与其发生特异性结合。结合域结合到运动神经元的神经节苷脂和 位于末端神经细胞膜表面小结上的蛋白受体，特别是具有亲和力的GDlb，GTlb和GQlb类 神经节苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖组成的神经节苷脂连接到神经酰胺。通过对神经节 苷脂分布及对其亲和结合力的研宄，可以确定，神经节苷脂不是唯一能促进肉毒毒素结合 的分子，而双受体模型的提出表明，在发生内化作用前，肉毒毒素就已经结合到了蛋白受体 上。尽管有一些证据表明，突触结合蛋白可能参与了 A、B和E型的内化作用，但是梭菌属家 族每一个成员的受体，还没有完全确定。每个毒素与其蛋白共受体都是特异性同源的，B型 肉毒毒素与唾液酸乳糖的混合物就与肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神经毒素与神经节苷 脂结合的一个〃锁和钥匙〃原理。这个观察成功说明了一个观点，那就是神经节苷脂结合 使肉毒毒素靠近蛋白受体，促进了毒素的识别和内化。
[0011] 一旦结合到神经元表面，母体分子裂解，重链和轻链通过锌原子结合到达神经元 细胞膜，并且被内化进入细胞囊泡，形成一个包裹着毒素分子的酸性小囊泡。即内化过程。 这一受体介导的内吞过程与时间，温度及突触活动均有关。
[0012] 2、易位 肉毒毒素的轻链必须从囊泡小室或者胞内体中出来，并且在H链N-末端作用下的通过 膜运输能够成功进入细胞溶质的靶蛋白，这一过程是称为轻链易位。
[0013] 与其它梭菌毒素一样，肉毒毒素进入细胞内的酸性小泡后，会因 pH的变化而发生 结构重组。尽管进入突触小泡和胞内小泡是显而易见，但是肉毒毒素易位进入胞内小泡的 特性尚未断然确定。PH的降低使肉毒毒素结构发生变化，从而导致其在分子中有较大的疏 水性，并且增加了脂双层的渗透性。这样毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双层内，一旦 嵌入，就会在磷脂双层和PC12膜上形成离子通道。这个通道是具有选择性的，分子量大的 分子无法通过，所以目前普遍认为毒素轻链可以通过离子通道从小泡腔内转运到神经细胞 胞质。据此有三种轻链跨膜转运假说模型，即管道模型（tunnel model)，裂缝模型（cleft model)和裂解模型（lysis model)。其中裂缝模型理论认为，在低pH时，蛋白质的分子构 想发生了改变，此时HC可形成一个亲水性的裂隙，并且在轻链穿膜过程中将其亲水表面包 围。在此模式中形成了亲水性和疏水性的相互作用。轻链的羧基端因为二硫键与重链氨基 端相连而最先进入到胞质。实现易位后，由于胞质的pH高于酸性小泡，使轻链结构重新折 叠，重新回到具有催化活性。
[0014] 在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域发生构象上的变化，最终跨越人工膜形成 离子通道，并且在体内PH的环境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成 的离子通道与白喉毒素形成的相似，并且也是只在低PH下形成。肉毒毒素离子通道只允许 阳离子通过，但是可以在体外阻止氯喹。然而对于小孔径离子通道的研宄，我们尚未清楚肉 毒毒素形成的通道是不是毒素轻链进入细胞溶质的必经之路。数据显示，在低PH下轻链的 结构有一个戏剧性的变化，就是可能产生一个选择性的LC结构并且更适合于易位。尽管这 在体内还没被证实，但是通过低PH诱导结构变化是完全可逆的。
[0015] 肉毒毒素能够在神经传递发挥作用，就必须通过蛋白水解使LC与HN接头处暴露 的表面产生缺口，从而使非活性的单链分子量为150-kDa的毒素活化。少数的细菌和组织 蛋白酶能够实现这个裂解反应，并产生有活性的双链神经毒素。产生切口后，轻链和重链仍 然通过非共价键相互作用，并且由一个单一的二硫键连接。这种链间的二硫键（A型肉毒毒 素中的Cys430 - Cys454)的减少是轻链活化的第二阶段，这是轻链自由进入运动神经元胞 质溶胶和与底物间相互作用必不可少的阶段。正如前面提到的，在低PH情况下，轻链有一 个戏剧性的变化。这种结构的变化有助于易位带(如果在易位点HN域确实是靠近轻链）的 重组和导致轻链的最终活化。神经元信号转导通路可以与肉毒毒素-LC活动密切联系在一 起的。因此，轻链活化的完成最终可能是发生在胞质溶胶中的，紧接着从低PH的小室中易 位。
[0016] 3、抑制神经递质释放 神经小结处有突触小囊泡，其中包含乙酰胆碱，它是能穿过神经肌肉接头刺激肌肉收 缩的一种神经递质。该乙酰胆碱的小囊泡被一个叫做SNARE复合体的蛋白聚合物所结合。 为了穿过神经肌肉交界处实现信号的传递，突触前神经小结中的乙酰胆碱小囊泡必须被释 放到突触间隙中。在这里，神经递质在肌肉板上结合到特定受体上，触发离子通道打开，从 而导致相邻横纹肌的去极化和收缩。乙酰胆碱的释放，需要有SNA RE蛋白的参与，它能够介 导突触小泡与神经元细胞膜的融合。
[0017] SNARE复合体蛋白参与突触小泡上质膜融合，而肉毒毒素轻链的作用是阻碍胞吐 作用。更具体地说，就是在肌肉接头处，神经毒素通过切割SNARE蛋白（乙酰胆碱分子胞吐 作用所必须的物质）阻断了囊泡内容物释放到细胞外环境中，抑制乙酰胆碱的释放，从而抑 制神经传递。据证实，单独的SNARE蛋白裂解不会妨碍SNARE复合体形成，但是却会导致非 功能性复合物在Ca 2+内流和融合之间的耦合被破坏。毒素在抑制神经递质释放时，需要Ca2+ 的参与，而在突触末梢Ca 2+浓度增加会影响肉毒毒素的作用效果。
[0018] 轻链作为锌肽链内切酶蛋白切割致使SNARE复合物不稳定，成为非功能性，从而 抑制乙酰胆碱释放到突触间隙。囊泡释放到突触间隙的数量越少，动作电位传播的概率就 越低，从而引起肌肉纤维的收缩。结果导致肌肉自身的化学去神经术而引起弛缓性麻痹。现 有研宄表明SNARE复合物由VAMP、SNAP-25和syntaxin三种蛋白质组成，下表所示为不同 类型的肉毒毒素的靶蛋白及其切割位点。
[0019] 噬菌体展示技术的基本原理是把外源DNA插入噬菌体编码外壳蛋白pin或 PVIiI的基因中，使外源DNA片断对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋 白（fusion protein)，呈现在噬菌体表面。噬菌体展示技术的显著优点是：建立了基因型 (genotype)和表型（phenotype)之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。将外源蛋 白或多肽表达于噬菌体表面，就可根据其性质利用它与其他生物或非生物物质的亲和性对 含目的基因的菌体进行筛选。以菌体抗体库的筛选为例，将Fab (fragment antigen binding)表达在菌体表面，以相应的抗原为亲和性配体筛选，可以快速高效地从大量克 隆中筛选表达特异性抗体的噬菌体。因此，用噬菌体展示技术制备高亲和性抗体与传统的 杂交瘤单克隆抗体技术相比具有明显的优势。
[0020] 噬菌体抗体在膜表面表达，是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融 合蛋白而完成。其特点是"它既可识别相应的抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进行再 扩增"。利用其可再扩增的特性，以靶抗原通过亲和吸附-洗脱-扩增，可筛选到靶分子的配 体肽链。再经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终便获得高亲和力的特异性抗体。噬 菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤：淘筛和鉴定。淘筛是将噬菌体抗体库与选择用的抗 原共同孵育，通过几轮洗脱，收集结合的噬菌体。将获得的噬菌体感染细菌并扩增，再进行 下一轮的淘筛。经几轮淘筛后，便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株。 鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株。即将淘筛出的噬菌体感染细 菌、铺板、挑选，即可得到高特异性单克隆菌株。
[0021] 从噬菌体抗体库中筛选表达特异性抗体的噬菌体的经典方法主要有两种：（1)将 纯抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体， 洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。（2)将抗原与生物素基团相 连，再将其固定在包被有streptavidin的顺磁珠上对菌体进行筛选。两种方法中均需加 脱脂牛奶（或BSA，其效果较差）封闭未被抗原占据的位点，以避免噬菌体非特异性的结合。 对于前一方法，回收与抗原特异性结合的噬菌体可用碱性溶液（如三乙基胺，（triethy- Iamine)或酸性溶液（如甘氨酸一盐酸，glycine_HCl)洗脱，或用可溶的抗原或半抗原洗 脱；对于后一方法，用二巯基苏糖醇（dithiothretOl，DTT)通过破坏抗原与生物素之间的 二硫键来洗脱。回收的噬菌体感染宿主菌，增殖后进行下一轮筛选。一般经过3-5轮这样 的筛选可得到表达高亲和性的目的抗体的克隆。每一轮筛选都需要进行检测，以证实筛选 的有效性。
[0022] 英国 MRC HGMP 资源中心创建的 Human Single Fold scFv Libraries I+J ( Tomlinson I + J)是当今成熟的全人源噬菌体抗体库，其库容超过IO8全人源噬菌体单链 抗体，本研宄利用该噬菌体库淘选特异性抗B型肉毒毒素单链抗体，并对阳性单链抗体进 行系统分析，以期创制B型肉毒毒素中毒治疗抗体类药物奠定物质基础。
[0023] 本发明人通过对肉毒毒素的作用机理的了解及研宄，确定肉毒毒素能够引起人畜 共患病，且主要攻击体内的神经突触系统，其致病机理为，肉毒毒素通过其重链C端结构域 结合于胆碱能神经元的突触前膜，形成毒素受体复合物内化进入细胞囊泡，然后轻链锌内 肽酶酶活性区从细胞内的酸性空间释放进入细胞质。一旦从囊泡中释放出来，轻链通过切 害J SNARE复合物蛋白来阻止乙酰胆碱的释放，引起肌肉麻痹。因此轻链为主要的致病部位。 目前，国内外关于A型肉毒毒素的报道已相对比较全面，但关于B型肉毒毒素的研宄报道相 对较少，同时缺乏B型肉毒毒素治疗方法和药物，这样就造成了一旦有人罹患B型肉毒中 毒，将无法及时进行正确治疗的境况。抗体是治疗肉毒中毒最有效的方法，但目前研宄或有 限使用的异源性血清抗体存在着许多缺点，如引起免疫反应或传染疾病等，导致无法推广 应用。由于此类抗体分子量较大，难于穿透细胞膜，针对已经进入细胞的毒素轻链则无治疗 效果，因此本发明旨在克隆表达B型肉毒毒素，通过重组蛋白在人源化抗体库中筛选中和 性人源化单链抗体，为研制抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定基 础。
【发明内容】
[0024] 本发明的目的是为解决异源性血清抗体在治疗B型肉毒毒素中毒，存在引起免疫 反应或传染疾病的问题，而提供一种全人源的单链抗体ScFv，抗B型肉毒毒素酶活性的人 源单链抗体2F-scFv。
[0025] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFV，其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。
[0026] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-SCFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
[0027] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-SCFv在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒 药物方面的应用。
[0028] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F_scFv在检测B型肉毒毒素方面的应 用。
[0029] 本发明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFV，它是利用 人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体的底物 GFP-HIS6-SNAP25 (62)-VAMP (57)-C，人源化抗B型肉毒毒素酶活性抗体库中筛选出来的， 亲和常数为（5. 35±0. 903) X 105L/mol，为生产抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测 B型肉毒毒素奠定了基础。
【附图说明】
[0030] 图1为双酶切pMD-IOT-Bont-B质粒电泳结果；I. EcoR I和Nde I双酶切质粒 pMD-19T-Bont-B ； 2. DNA marker DL2000〇
[0031] 图 2 为 PCR 鉴定重组质粒 PET-28a-BontB 结果图；I. DNA marker DL2000 ; 2. 3. 4.均为BontB区域PCR扩增产物。
[0032] 图3为双酶切重组质粒PET-28a-BontB鉴定结果；其中：1· 2.均为EcoR I和 Nde I 双酶切质粒 PET-28a-BontB 3. DNA marker DL2000 ; 图4为重组蛋白表达形式鉴定其中：1.未诱导菌超声沉淀；2.诱导菌超声沉淀；3.未 诱导菌超声上清；4.诱导菌超声上清国5:诱导的全菌体；6.蛋白质Marker ; 图5为重组蛋白SDS-PAGE结果分析；其中：1.蛋白质marker ;2.初步纯化的目的蛋 白；3.最终纯化的目的蛋白； 图6重组质粒PET-28a -GFP的双酶切鉴定（NcoI和BamHI);其中1:质粒PET_28a -GFP 的双酶切产物；M : DNA marker DL2000 ; 图 7 质粒 PET-28a-GFP-SV 的双酶切产物；M :DNA marker DL5000 ; 图8纯化后2F-scFv SDS-PAGE结果分析；I:流穿2:55%硫酸铵原样3:纯化后scFv。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1:B型肉毒毒素轻链基因的合成 根据Genbank报道的B型肉毒毒素全基因序列，设计并合成轻链基因，同时插入EcoRI 和恥6 1酶切位点，将基因片段克隆入？1?-191'仰(^〇1'，转化入舅109中。
[0034] 实施例2:B型肉毒毒素轻链基因与PET_28a载体连接 利用内切酶EcoR 1和Nde I双酶切质粒pMD-19T-Bont-B，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳 分析，结果见图2所示，可见到大小约为1335的目的基因 BontB，与预期的大小相符； 将EcoRI和Nde I双酶切的载体PET-28a大片段与目的基因 BontB小片段回收，并用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒PET-28a-BontB，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗 性的琼脂糖平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提 取质粒。
[0035] 通过合成插入EcoRI和Nde I酶切位点的B型肉毒毒素轻链基因序列，为其设计引 物，上游引物标为Pl，下游引物标为P2。
[0036] Pl (23bp) :5' CATATgCCAgTTACAATAAATAA-3' P2 (23bp) :5' gAATTCTCATTTAACACTTTTAC-3' 以重组质粒PET-28a-BontB为模板，Pl和P2为引物进行扩增反应，得到的PCR产物， 经琼脂糖凝胶电泳鉴定分析，（见图3); 用限制性内切酶和EcoR I和Nde I进行双酶切鉴定，并进行序列的测定。可见质粒经 双酶切后，PCR扩增目的条带后，在1335bp上均有目的基因带(见图4)，证明目的基因 BontB 基因已经连接到载体上，成功的构建了重组质粒PET-28a-BontB。
[0037] 实施例3:重组蛋白PET-28a-BontB表达产物的SDS-PAGE结果分析 将重组质粒PET-2 8a-BontB转化表达菌-大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导表达后， SDS-PAGE结果显示：重组蛋白PET-28a-BontB在50KD左右处有一明显表达带，大小与理论 值相符；见图5 ; 将重组蛋白表达菌裂解液上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，其中上清与沉淀的比例 为1:10,结果显示，目的蛋白绝大多数在上清中，沉淀中相应位置也存在少量目的蛋白，认 为通过诱导条件的优化，在适宜的诱导环境下能够以可溶形式表达，见图5。
[0038] 实施例4:重组蛋白PET-28a_BontB的纯化 重组蛋白的初步纯化：大量制备细菌，诱导表达重组蛋白，可溶性蛋白先进行DEAE阴 离子交换层析柱，并收集流川峰，再进行属螯合层析Cu2+柱，收集200mM咪唑洗脱的目的蛋 白。
[0039] 用 Thrombin 酶切除 His-Tag 重组蛋白的二次纯化：酶切后的蛋白进行属螯合层析Cu2+柱，收集250mM咪唑洗脱的 目的蛋白。收集的蛋白经SDS-PAGE结果分析，如图，可在50KD左右处有一明显条带，且纯 化效率可达90%以上，见图5。
[0040] 实施例5:全人源抗Bont-B-scFv抗体的筛选 纯化的重组蛋白为抗原包被于96孔酶标板上，4°C过夜。次日弃上清，用2%的Mi Ik-PBS 3 7 °C封闭2 h，加入噬菌体抗体库，滴度为1. 0 X 1013，室温下剧烈晃动孵育6 0 m i η，静置 60min。后弃去液体，用含0. l%Twenn-20的PBS洗涤10次，洗涤后将每孔中残留的液体轻 轻拍干，每孔加入5〇μL洗脱液（5mg/mL的胰酶-PBS)，室温下剧烈晃动lOmin，洗脱噬菌体， 收集4 °C保存。
[0041] 用洗脱下的噬菌体侵染E. coli TG1，并涂布于TYE平板上(含lOOPg/mLAmp和1% 的葡萄糖）37°C过夜培养。利用辅助噬菌体KM13扩增噬菌体库，通过PEG/NaCl回收噬菌 体。重复以上过程3次，共4轮筛选，收集筛选的噬菌体库。
[0042] 实施例6:Bomt-B活性检测底物一GFP-SV的基因构建与纯化 根据GenBank 中登录的SNAPE25、VAMP基因序列，设计并合成 HIS6-SNAPE62-EcoRI-VAMP57C-TAA基因，同时在基因两端分别插入BamHI和Hind III酶切位 点，合成重组质粒PMD19-T- SV。
[0043] 根据绿色荧光蛋白GFP基因，设计一对特异性引物， 上游引物 Pl: 5' -CATGccATGGTGAGCAAGGGCG-3' 下游引物 P2: 5' -GCGGATCCcttgtacagCTCGTCCATG-3' 以Pl和P2为引物，GFP质粒为模板，PCR扩增GFP基因，利用内切酶NcoI、BamHI双酶 切载体pET-28a和720bp PCR回收产物，，以T4DNA连接酶连接pET-28a和GFP基因片段， 连接产物转化感受态E. coli JM109,次日挑取单菌落，提取质粒。对其进行PCR、双酶切 以及测序鉴定，得出GFP成功克隆到pET-28a中，并未发生碱基丢失和突变，成功构建载体 pET-28a-GFP。
[0044] 用内切酶Hind III和BamHI对合成的重组质粒pMD19-T-SV和重组表达质粒 pET-28a-GFP双酶切，分别回收393bp小片段和pET-28a-GFP载体大片段，以T4DNA连接酶 连接。连接产物（pET-28a-GFP-SV)转化感受态E.coliJM109，涂布Kan(50μg/ml)的LB 平板上，37°C培养过夜。次日挑取单菌落，提取质粒，经双酶切和测序鉴定后，得出SV基因 成功插入到pET-28a-GFP载体中，成功构建pET-28a-GFP-SV表达载体。
[0045] 将重组质粒pET-28a-GFP-SV转化表达菌-大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导表达， 确定了最佳的表达方式：LB培养基，37°C，3 h。超声破碎菌体后经SDS-PAGE电泳检测，确 定目的蛋白绝大多数在上清中，故目的蛋白以可溶形式表达。
[0046] 重组蛋白GFP-SV的纯化，重组蛋白表达菌体经超声裂解，先后经过DEAE阴离子交 换层析，金属螯合层析，Q阳离子交换层析，获得纯度在90%以上的纯品GFP-SV。热原质检 测<20EU/mg，满足蛋白性质研宄的需要。
[0047] 实施例7:抗Bont-B-scFv阳性菌株鉴定 筛选后的噬菌体侵染凡HB2151，诱导表达后，利用ELISA鉴定，置酶标仪测定OD 值(波长为490nm)，每个样品做双孔测定，取OD平均值。以2%MiIk-PBS为阴性对照，阳性克 隆菌株确定标准为：OD值为阴性对照的3倍以上，共获得200株阳性克隆菌株。
[0048] 阳性菌株生物活性检测，将GFP-SV用包被液稀释，每孔包被3(^g于检测板 (Pierce Maleimide Activated 96-well Plates, Black, 15153)中，4 °C 过夜，用 Wash buffer洗涤3次，将200株阳性菌株，诱导表达离心后，将100μL上清和4 Pg Bont-B混匀， 加入到检测板中，37°C作用2h，每份样品做双孔测定，再用Wash buffer洗涤3次，在多功能 酶标仪上检测荧光强度，得出3株活性较好的菌株。按照Tomlinson I+J试剂盒上的pIT-2 载体的基因序列，合成两条特异性PCR引物扩增scFv全基因片段。
[0049] Pl LMB3: 5' 一CAG GAA ACA GCT ATG AC-3， P2 pHEN: 5' 一CTA TGC GGC CCC ATT CA-3' 经检测3株阳性菌株，均能够出现明显900bp条带，含有完整的scFv。
[0050] 测序鉴定其序列并经Blast数据库分析得出：得出3株阳性菌株均为人源单链抗 体，分析如下： 3A-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC IMKYL LPTA AAGL LLLAA CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA Q PAMA E V QLL ES GGG L V CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT QPGGSLRLS CAA SG FTF CDR-Hl AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG S SYAMSff V R QA PG KG LE CDR-H2 TGG GTC TCA AAT ATT TCT TCT AAT GGT AAT GCT ACA GCT TAC GCA GAC TCC GTG W V SN I S S N G N A T AY ADSV AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG KGR FT I SRN NSKN T L YL CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA QMNS L RA ED TA VYY CAK CDR-H3 TAT ACT TAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG YTYA FD Y ff G QGT LVTVS Linker AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG S GG GGSGG GG SGG GG S T GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC D IQ MTQ SP S SL SA SVGD AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT CDR-Ll RVTIT CRASQS I SSYLN TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT TAT GCA W_ Y Q QK PGK A P KL L I YYA CDR-L2 TCC AAT TTG CAA AGC GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG SNLQS GVPSRFSGSGSG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TDFT LT IS S LQPED FATY CDR-L3 TAC TGT CAA CAG GAT TCT TAT ACT CCT TCT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG Y CQQD SYT PST F G QGT K GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA VEI KR AA AH HHHHHG A A GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG EQKLIS EE DLNGAA 2F-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG I MK YLL P TA A AGL LLL A GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG A QPA MA EVQ LL ES GGGL CDR-Hl GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TC C TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC VQPGGSLRLS C AA SGFT TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG FS SYA MS ff VRQA P G KGL CDR-H2 GAG TGG GTC TCA TCT ATT GCT TCT ACT GGT TCT AAT ACA GCT TAC GCA GAC TCC EffVS S I A STGSNTAY ADS GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT V K GR FTI SR N NSKN TLY CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG L QMN S LRA E DT AVYY C_A. CDR-H3 AAA GGT ACT GGT ACT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC KGTG TF DYffG QG T LVTV Linker TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG S S GG GGSGG G GS GG GGS ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA T D I QMTQ S PS SLS ASVG CDR-Ll GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA DRV TI T CRA S QS I S SYL AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTA ATC TAT ACT N_W_YQQ KP G KAP K L L I Y T CDR-L2 GCA TCC TAC TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT ASYLQS G V PS RFS GS GS GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA GT DFT LT I SS LQ PE DFA CDR-L3 ACT TAC TAC TGT CAA CAG GCT ACT ACT AGT CCT TAT ACG TTC GGC CAA GGG TYY CQ Q ATT SP YTF G Q G ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG TKVEIKRAAAHHHHHHG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG AAE QK LIS E ED L NGAA 4C-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC IM KYLL PTA A AGLLLLAA CAG CCG GCC ATG GCT GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA QP A MAEVQ L LES GGG L V CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT QP G GS L RLS CAA SGFT F CDR-Hl AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG S SYAMS ff V R QAPGK G LE CDR-H2 TGG GTC TCA GGT ATT TCT CCT ATG GGT ACT CGT ACA TCG TAC GCA GAC TCC WVS G I SP MGT RTS Y ADS GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT V K GR FT I SRD N SK NT LY CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG LQMNS LRA E DT AVYY C_A. 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[0051] 利用非竞争酶免疫法测定2F、4C和3A单链抗体的亲和常数，分别以4 Pg/mL、 2Pg/mL、lPg/mL和0· 5 Pg/mL包被Bont-B，将单链抗体浓度调整到KT6 mol/L，倍比稀释 1:2~1:512,用1:5000倍稀释的Protein A-HRP抗体作为二抗，OPD显色，测定0D490nm吸 光值，每个样品做双孔测定，取OD平均值。根据抗原抗体结合反应的S形曲线图，能够求解 出在不同抗原浓度下板书吸光值的抗体浓度，带入到公式KA= (n-l)/2(nAb'-Ab)计算亲 和常数，其中Ab'和Ab表示当抗原为Ag'和Ag时，产生半数吸光值的抗体浓度（mol/L)， n=Ag/Ag'，当n=2时可以得到3个KA值，n=4时可得2个KA值，n=8时得1个KA值，把六个 KA值取平均数就是最终的亲和常数数值。
[0052] 从表看出4C单链抗体的亲和常数为（4. 38±0.445) X IO5LAiol，3A的亲和常数 为（5. 35 ±0.903) X 105L/mol，2F 为（L 146 ±0.525) X 106L/mol。
[0053]
【主权项】
1. 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFV，其碱基序列如序列表SEQIDNO. 7 所示。2. 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-SCFv，其氨基酸序列如序列表SEQID NO. 8所示。3. 权利要求1所述的抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv在生产治疗B型 肉毒毒素酶中毒药物方面的应用。4. 权利要求1所述的抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv在检测B型肉毒 毒素方面的应用。
【专利摘要】本发明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体2F-scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体的底物GFP-HIS6-SNAP25（62）-VAMP（57）-C，人源化抗B型肉毒毒素酶活性抗体库中筛选出来的，亲和常数为（1.146±0.525）×106L/mol，为生产抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定了基础。
【IPC分类】G01N33/68, A61P39/02, A61K39/40, C12N15/13, C07K16/12
【公开号】CN104892754
【申请号】CN201510153140
【发明人】张国利, 田园, 刘雪, 于佳, 李玉洁, 刘雨玲, 岳玉环, 吴广谋, 李爽, 史飞, 赵鑫, 徐艳玲, 张培培
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月2日
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