一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用
一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物抗体免疫技术领域，具体是指一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 目前广谱抗生素在口腔致病菌的灭杀方面还存在较多缺憾，不仅不能实现特异性 灭杀，而且有可能破坏益生菌，长时间使用的话还可能引起菌群失调，产生耐药菌；化学方 法能够破坏口腔致病菌的结构，引起致病菌的死亡，但是对皮肤黏膜具有刺激作用；物理方 法对口腔致病菌具有杀灭作用，但对人体皮肤黏膜有伤害。
[0003] 卵黄抗体是禽类对特定抗原所产生的相应特异性抗体。卵黄抗体是一种天然存 在、无残留、无毒副作用的免疫球蛋白，是抗生素的替代品。目前高免卵黄液广泛应用于一 些疾病的紧急预防和治疗中。
[0004] 现未见专门杀灭口腔致病菌的抗菌鸡卵黄抗体，且现有的制备鸡卵黄抗体的方 法，是通过混合抗原然后进行免疫，从而获得的抗体，但由于母鸡机体存在较大差异，其能 够分离提取的鸡卵黄抗体对单种菌的灭杀效果无法保证，难以实现工业化生产。
[0005] 现有制备卵黄抗体的方法中，所选取的免疫鸡为经过挑选、检查和进行了某些疫 病的预防接种的健康产蛋母鸡，仍存在一些鸡源性的细菌或/和病毒混存于鸡蛋中，进而 影响鸡蛋中的鸡卵黄抗体，如大肠杆菌、沙门氏菌、鸡减蛋综合征病毒、鸡禽白血病病毒 等，很容易影响到抗体的安全性。目前，一些研宄选用带有毒性的甲醛、二乙烯胺（BEI)及 β -丙内酯（BPL)作灭活剂，对鸡卵黄抗体中外源性病毒具有灭活效果，但对鸡卵黄抗体的 活性有影响，非常不利于鸡卵黄抗体发挥效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种直接作用于人口咽部，可在短时间与口腔致病菌的特 异性病原体结合，能够较长时间有效杀灭特异性口腔致病菌，且安全性能较好，使用人群更 为广泛的抗菌鸡卵黄复合抗体。
[0007] 本发明另一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体的制备方法。
[0008] 本发明还有一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体在抗口腔致病菌方面的应用。
[0009] 本发明通过下述技术方案实现：一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，包括以下 步骤： (1) 分别制备口腔致病菌的免疫抗原，口腔致病菌包括溶血性链球菌、金黄色葡萄球 菌、白色念珠菌、大肠杆菌； (2) 将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原； (3) 分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯 化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液； (4 )各单种菌的抗体原液按照抗体效价检测进行混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄 复合抗体。
[0010] 本发明的制备口腔致病菌菌灭活后，分别稀释、乳化制成各单种菌免疫抗原；用该 抗原注射免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒、蛋黄蛋白分离，取蛋黄，水稀释法提取、离 心分离获得水溶性组分，用硫酸铵提取获得各单种菌鸡卵黄抗体粗提物；将粗提物用缓冲 液溶解后，超滤纯化；将超滤液灭活；根据单价抗体效价检测结果，配制多种菌群口腔卵黄 抗体，经除菌过滤后加适量稳定剂制成溶血性链球金黄色葡萄球菌、白色念珠菌大肠杆菌 卵黄抗体成品。本品每毫升含相应特异病原抗体效价不低于1:16。主要用于人口咽部粘膜 的相应病原体的预防。
[0011] 为了更好的实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（1)中，制备口腔致病菌的免 疫抗原的具体过程为： (1. 1)从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于10%的新鲜 羊血的血平板或沙保培养基； (1. 2)通过患者炎症部位症状判断，并经革兰染色形态观察、梅里埃鉴定仪和16SRNA 全长测序确认，口腔中的主要致病菌包括乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌、大肠杆菌； (1. 3)分别扩大培养上述四种口腔致病菌，并调整细菌浓度为2X IO9; (1. 4)将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0. 5%甲醛溶液灭活24 小时，另一份采用相应物理方法裂解相应的细菌：①大肠杆菌采用超声破碎法；②乙型溶 血性链球菌采用组织裂解仪共振裂解：2mlEP管中加入菌悬液和50-200 μ m玻珠50 μ g，以 25Hz振动5分钟，共振2-3次；③金黄色葡萄球菌采用研磨破碎；④白色念珠菌采用组织匀 浆器裂解； (1. 5)将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌按1 :1比例混合，即得该种口腔致病菌 的免疫抗原； (1. 6)根据步骤（1. 5)所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。
[0012] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（2)中，母鸡具体的免疫过程 为： (2. 1)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏完全佐剂，然后放在组织裂解仪上， 以25Hz的频率共振5分钟，重复两次，对该口腔致病菌的免疫抗原进行乳化，经安全试验、 无菌检验及物理性状检验合格后，制得首次免疫乳化混合液； (2. 2)对健康母鸡进行首次免疫，取初次免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡的翅基 部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生 更好的免疫反应； (2. 3)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏不完全佐剂，按步骤（2. 1)所述制得 免疫乳化混合液； (2. 4)间隔2、4、6、10周时，取免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡进行加强免疫。
[0013] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（3)中，对免疫鸡蛋的蛋黄进 行提取、纯化、分离，获得单种菌抗体原液的具体步骤如下： (3. 1)收集获得免疫的母鸡产下的鸡蛋，将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋 清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量； (3. 2)将蛋黄按比例1 :6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调 pH4. 8~5. 5,2~8°C条件下静置1~24小时； (3. 3)静置后用4000~20000r/min离心，去除沉淀物，取上层清液，在其中加入10%~35% 硫酸铵盐析，充分混匀，过夜沉淀； (3. 4)沉淀完成后，对沉淀物用4000~20000r/min离心脱盐后，取沉淀制得卵黄抗体粗 提物，将硫酸按上清液去除； (3. 5)制得沉淀用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调pH4. 8~5. 5,使其充分溶解， 并保持环境温度2~8°C过夜，取上层清液； (3. 6)制得上清液用截留相对分子量50~100kD超滤膜进行超滤，并进行病毒灭活； (3. 7)灭活后，取其上层清液，剩余悬浊液4000~200(K)r/min离心去沉淀，合并上层清 液，即得单种菌抗体原液，所获得的单种菌抗体原液中鸡卵黄抗体纯度不低于80%。
[0014] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（3. 6)中，病毒灭活过程为，将 需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时。
[0015] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（4)中，对获得单种菌抗体原 液进行效价检测的方法为ELISA法。
[0016] 通过上述方法制备的抗菌鸡卵黄复合抗体，包括抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗 体、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体、抗金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。
[0017] 为了更好地实现本发明，进一步地，对抗菌鸡卵黄复合抗体效价进行检测，其中抗 乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗金黄 色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价多1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价多1 :16。
[0018] 抗菌鸡卵黄复合抗体在制备口腔致病菌感染引起的相关疾病的制剂中的应用。
[0019] 抗菌鸡卵黄复合抗体在制备预防和\或治疗口腔致病菌感染引起的相关疾病的 药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂中的应用。
[0020] 本发明的制备的抗菌鸡卵黄复合抗体的灭菌原理为，不同的口腔致病菌有不同的 特异性抗原，如链球菌属的蛋白质抗原是细胞壁成分，具有型特异性，有M、T、R和S等，M与 致病性有关；白色念珠菌属的蛋白质抗原是细胞壁成分，是甘露糖蛋白片段和能用血清学 方法区别开来的两种白色念珠菌血清型；葡萄球菌属的重要抗原有葡萄球菌A蛋白、磷壁 酸和肽聚糖；大肠埃希菌有菌体〇抗原，鞭毛H抗原，荚膜K抗原和包膜抗原等。
[0021] 使用少数几株乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌免疫 产蛋母鸡，此鸡产生的特异性抗乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆 菌的鸡卵黄抗体就可以不但与免疫的细菌菌株产生特异性抗原一抗体反应，也能够与不同 种和型的具有共同抗原，即共同抗原决定簇的菌株产生抗原一抗体反应。当鸡卵黄抗体与 细菌表面抗原发生抗原一抗体反应时，就能改变细菌表面结构、抑制细菌的一些功能活性、 抑制细菌生长、减少和抑制细菌对细胞的黏附、促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞对 细菌的吞噬和清除。
[0022] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： (1)按本发明方法制取的抗菌鸡卵黄复合抗体主要用于杀灭口腔致病菌 ，制成的试剂 只需在鼻腔、口腔、B因、喉及支气管黏膜局部给药即可，其起效快，用量少，既避免了全身给 药的局限性和副作用，也避免导致局部菌群的失调； (2)本发明中所述的抗菌鸡卵黄复合抗体重点针对乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球 菌、白色念珠菌、大肠杆菌这4种口腔致病菌进行灭杀，该抗菌鸡卵黄复合抗体在杀菌过程 中，不与细菌产生急性毒性反应，属于实际无毒级别； (3 )本发明方法通过获得口腔致病菌的单菌种抗体，使配置的复合抗体可独立发挥抑 杀致病菌的作用，无需补体或与其它免疫细胞配合，不易发生变态反应； (4) 本发明所述的抗菌鸡卵黄复合抗体对口腔致病菌的杀灭效果好，长期使用不会产 生耐药菌株，也不会引起菌群失调； (5) 本发明中所述的抗菌鸡卵黄复合抗体对活体生物的体表和眼球均无刺激性，且较 长时停留在喷涂部位，持续进行杀菌； (6) 通过本发明制备的抗菌鸡卵黄复合抗体的效价较高，一般大于1 :16,因此具有较 好的杀菌效果和更多的抗原结合位点； (7) 本发明采用54~60°C，8~20小时灭活病毒灭活方式，既保持了鸡卵黄抗体的生物活 性，也不会有他毒副物质介入； (8) 本发明中所述方法，对抗体提纯水稀释酸化工艺，使用硫酸铵盐析，应用离心和超 滤等纯化技术，使卵黄抗体纯度不低于80%，使鸡卵黄抗体保持较高的提取效率。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明中方法的流程图； 图2为本发明中抗原免疫注射时间与抗菌鸡卵黄抗体效价趋势图； 图3为本发明中纯化抗菌鸡卵黄抗体的SDS-PAGE分析图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此， 在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替 换和变更，均应包括在本发明的范围内。
[0025] 实施例1 : 本实施例中的制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，如图1所示，包括以下步骤： (1)分别制备口腔致病菌的免疫抗原；制备口腔致病菌的免疫抗原的具体过程为： (1. 1)从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于10%的新鲜 羊血的血平板或沙保培养基； (1. 2)通过患者炎症部位症状判断，并经革兰染色形态观察、梅里埃鉴定仪和16SRNA 全长测序确认，口腔中的主要致病菌包括乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌、大肠杆菌； (1. 3)分别扩大培养上述四种口腔致病菌，并调整细菌浓度为2X IO9; (1. 4)将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0. 5%甲醛溶液灭活24 小时，另一份采用相应物理方法裂解相应的细菌：①大肠杆菌采用超声破碎法；②乙型溶 血性链球菌采用组织裂解仪共振裂解：2mlEP管中加入菌悬液和50-200 μ m玻珠50 μ g，以 25Hz振动5分钟，共振2-3次；③金黄色葡萄球菌采用研磨破碎；④白色念珠菌采用组织匀 浆器裂解； (I. 5)将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌按1 :1比例混合，即得该种口腔致病菌 的免疫抗原； (1. 6)根据步骤（1. 5)所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。
[0026] (2)将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原，母鸡 具体的免疫过程为： (2. 1)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏完全佐剂，然后放在组织裂解仪上， 以25Hz的频率共振5分钟，重复两次，对该口腔致病菌的免疫抗原进行乳化，经安全试验、 无菌检验及物理性状检验合格后，制得首次免疫乳化混合液； (2. 2)对健康母鸡进行首次免疫，取初次免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡的翅基 部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生 更好的免疫反应； (2. 3)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏不完全佐剂，按步骤（2. 1)所述制得 免疫乳化混合液； (2. 4)间隔2、4、6、10周时，取免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡进行加强免疫。
[0027] 如图2所示，随着抗原免疫注射时间增长，抗菌鸡卵黄复合抗体效价呈现节律性， 免疫注射一周效价明显增长。
[0028] (3)分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、 纯化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液；对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化、分离，获得 单种菌抗体原液的具体步骤如下： (3. 1)收集获得免疫的母鸡产下的鸡蛋，将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋 清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量； (3. 2)将蛋黄按比例1 :6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调 pH4. 8~5. 5,2~8°C条件下静置1~24小时； (3. 3)静置后用4000~20000r/min离心，去除沉淀物，取上层清液，在其中加入10%~35% 硫酸铵盐析，充分混匀，过夜沉淀， (3. 4)沉淀完成后，对沉淀物用4000~20000r/min离心脱盐后，取沉淀制得卵黄抗体粗 提物，将硫酸按上清液去除； (3. 5)制得沉淀用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调pH4. 8~5. 5,使其充分溶解， 并保持环境温度2~8°C过夜，取上层清液； (3. 6)制得上清液用截留相对分子量50~100kD超滤膜进行超滤，并进行病毒灭活，病 毒灭活过程为，将需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时； (3. 7)灭活后，取其上层清液，剩余悬浊液4000~200(K)r/min离心去沉淀，合并上层清液， 即得单种菌抗体原液；所提取的单种菌抗体原液纯度，如图3所示，图3中1表示硫酸铵沉 淀的抗菌鸡卵黄抗体，2表示沉淀的抗菌鸡卵黄抗体在经过超滤管纯化，M表示蛋白质标志 物，用硫酸铵法提取的抗菌鸡卵黄抗体浓度较高，且杂带少；经超滤后可以进一步纯化，减 少杂蛋白；所提取蛋白的主要条带的分子量为70KD左右和25KD左右，凝胶成像软件分析抗 菌鸡卵黄抗体纯度分别为85%、94%。
[0029] (4)各单种菌的抗体原液通过ELISA法进行抗体效价检测，根据不同抗体的最终 效价为为乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价1 :32、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体效价1 :32、抗 金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价I :16进行四种菌卵黄 抗体混合，最终制成总蛋白浓度为]~2. 5mg/ml的抗体混合液，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵 黄复合抗体。
[0030] 通过上述的方法制备得到的抗菌鸡卵黄复合抗体，通过ELISA法对抗体效价进 行检测，其中抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体效价 多1 :32、抗金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价多1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价多1 :16。
[0031] 实施例2: 本实施例为验证抗菌鸡卵黄复合抗体对乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄 球菌及大肠杆菌四种口腔致病菌的抑菌性能，做了如下试验： 将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为：用100 μ L滴于对照 样片上或5mL样液内，回收菌数为I X IO4~9X 10 4Cfu/片或ml)。
[0032] 取被试样片（2. 0cmX3. 0cm)或样液（5ml)和对照样片或样液(与试样同质材料， 同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4片(置于灭菌平皿内）或4管。
[0033] 取上述菌悬液，分别在每个被试样片或样液和对照样片或样液上或内滴加 100 μ L，均匀涂布/混合，开始计时，作用2、5、10、20分钟，用无菌镊分别将样片或样液 (0. 5mL)投入含5mL PBS的试管内，充分混勾，作适当稀释，然后取其中2~3个稀释度，分 别吸取0. 5mL，置于两个平皿，用凉至40~45°C的营养琼脂培养基(细菌）或沙氏琼脂培养 基(酵母菌）15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35°C ±2°C培养 48h (细菌）或72h (酵母菌)，对活菌菌落计数。
[0034] 试验结果如下表： 表一抗菌鸡卵黄复合抗体对四种口腔致病菌的抑菌效果
金黄色葡萄球菌阳性对照菌液浓度：3. 85X 104cfu/ml ;白色念珠菌阳性对照菌液浓 度：3. 82X 104cfu/ml ;大肠杆菌阳性对照菌液浓度：1. 89X 104cfu/ml ;乙型溶血性链球菌 阳性对照菌液浓度：3. 48X 104cfu/ml ;阴性对照无菌生长。
[0035] 由上表可知，在上述试验条件下，抗菌鸡卵黄复合抗体原液对乙型溶血性链球菌 原液、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌作用2、5、10、20分钟，平均抑菌率为100%。
[0036] 实施例3 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在生物活体表面的安全性，对获取的抗菌 鸡卵黄复合抗体进行了多次完整皮肤刺激试验。
[0037] 具体试验过程如下： 试验前24h，将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围左、右各约3cmX3cm。试验时将 抗菌鸡卵黄复合抗体原液0. 5ml涂于一侧2. 5cmX 2. 5cm皮肤上，另一侧皮肤作为空白对 照。在涂抹后4h 除去鸡卵黄抗体原液，每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观 察结果，如下表所示， 表二抗菌鸡卵黄复合抗体对家兔多次完整皮肤刺激试验结果
由上表可得，对家兔多次完整皮肤刺激试验结果为无刺激性。
[0038] 本实施例的实验充分证明了，所述的抗菌鸡卵黄复合抗体对生物活体的皮肤表面 没有刺激性，在实际使用中，涂抹在生物活体表面具有很好的安全性。
[0039] 实施例4 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在活体生物眼球表面的安全性，对获取的 抗菌鸡卵黄复合抗体进行了急性眼刺激试验。
[0040] 具体试验过程如下： 取抗菌鸡卵黄复合抗体原液0.1 ml滴入家兔右眼结膜囊内，被动闭合4s，30s后用足 量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的生理盐水冲洗30s，左眼为空白对照。记录滴眼后 111、2411、4811、7211、7(1、14(1和21(1的局部反应。如果7211内未出现刺激反应，或第7(1、第14(1， 眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。试验结果如下表所示， 表三抗菌鸡卵黄复合抗体对家兔眼刺激试验结果
平均评分系指24h、48h、72h评分之和除以观察时间段数3。
[0041] 由上表可知，抗菌鸡卵黄复合抗体原液对家兔急性眼刺激试验结果无刺激性。
[0042] 本实施例的实验充分证明了所述的抗菌鸡卵黄复合抗体，在触及生物活体的眼球 时，对眼球无刺激性，在实际使用中，不用担心因操作不适，导致该抗体溶液进入人眼，而引 发人眼的不适，进一步体现该抗菌鸡卵黄复合抗体在活体应用方面的安全性。
[0043] 实施例5 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在的稳定性，对获取的抗菌鸡卵黄复合抗 体进行了微生物法的稳定性试验。
[0044] 具体试验过程如下： 将抗菌鸡卵黄复合抗体原液的样品放置在37°C的环境中90天后，再使其对白色念珠 菌作用，如下表所示， 表四抗菌鸡卵黄复合抗体存放后对白色念珠菌的抑菌效果
其中阳性对照菌液浓度：3. 56 X IO4 (2. 57 X IO4 -4. 30 X IO4)cfu/ml，阴性对照无菌生 长。
[0045] 由上表可看出，该抗体经37°C放置90天后，原液对白色念珠菌作用2min，平均抑 菌率为100%。
[0046] 实施例6 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体的在活体生物不同部位的停留时间长，对 获取的抗菌鸡卵黄复合抗体进行了药物停留时间小动物成像实验。
[0047] 具体试验过程如下： 调制pH至8. 5-10. 0,将少量荧光染料加入到抗菌鸡卵黄复合抗体原液中，温度为4°C， 垂直混合过夜。然后超滤离心来去除未反应的荧光分子，获得含有荧光分子的抗菌鸡卵黄 复合抗体原液。
[0048] 试验方法：将含有荧光分子抗菌鸡卵黄复合抗体原液制成口腔喷雾。分成三组实 验组：a组：喷雾后禁水8小时，不禁食；b组：喷雾后禁食8小时，不禁水；c组：喷雾后禁水 禁食8小时；皮肤喷涂：背部剔除部分皮毛后进行喷雾。
[0049] 通过小动物成像采集喷雾部位荧光强度，通过荧光强度减弱情况，判断抗菌鸡卵 黄复合抗体原液在喷雾部位的停留时间，口腔喷雾后，不同组别的抗菌鸡卵黄复合抗体原 液的荧光随时间减弱，口腔喷雾后，不同试验组别在口腔的停留时间均能达到8. 5小时，其 中禁食禁水实验组效果比较好。含有荧光分子的抗菌鸡卵黄复合抗体原液在皮肤处停留时 间可长达70多小时。
[0050] 本实施例的实验是为了验证该抗菌鸡卵黄复合抗体喷涂在活体动物表面或者口 腔内，停留的时间均能达到8小时以上，具有较长的保护周期，在实际使用过程中，可以准 确的预测该抗菌鸡卵黄复合抗体的喷涂时间。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里 不再赘述。
[0051] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 分别制备口腔致病菌的免疫抗原； (2) 将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原； (3) 分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯 化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液； (4 )各单种菌的抗体原液按照抗体效价检测进行混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄 复合抗体。2. 根据权利要求1所述一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：所述步骤 (1)中，制备口腔致病菌的免疫抗原的具体过程为： (I. 1)从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于血平板或培 养基； (1. 2)通过患者炎症部位症状判断，并进行细菌验证后，确定口腔中的主要致病菌包括 乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌； (1. 3)分别扩大培养上述口腔致病菌，并调整到适宜浓度； (1. 4)将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0. 5%甲醛溶液灭活24 小时，另一份使口腔致病菌裂解； (1. 5)将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌混合，即得该种口腔致病菌的免疫抗 原； (1. 6)根据步骤（1. 5)所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。3. 根据权利要求2所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：所述步 骤（2)中，母鸡具体的免疫过程为：在口腔致病菌的免疫抗原中加入弗氏完全佐剂，对免疫 抗原进行乳化，经过乳化并检验合格的免疫抗原对健康母鸡进行首次注射，间隔2、4、6、10 周，使用弗氏不完全佐剂乳化的口腔致病菌免疫抗原，并在检验合格后，对健康母鸡进行注 射，加强免疫。4. 根据权利要求1或2或3所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于： 所述步骤（3)中，对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化、分离，获得单种菌抗体原液的具体步骤 如下： (3. 1)收集获得免疫的健康母鸡产下的鸡蛋，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取 重量； (3. 2)将蛋黄加入纯化水稀释匀浆，调至弱酸环境，静置1~24小时； (3. 3)静置后离心，取上层清液进行盐析，等待其沉淀； (3. 4)沉淀完成后，离心，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物； (3. 5)加入弱酸性缓冲液复溶，调节pH令其充分溶解，静置1~24小时后，取上层清液； (3. 6)超滤，并进行病毒灭活； (3. 7)灭活后，取其上层清液，剩余的悬浊液进行离心分离，取上层清液进行合并，即得 单种菌抗体原液。5. 根据权利要求4所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：所述步 骤（3. 6)中，病毒灭活过程为，将需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保 持8~20小时。6. 根据权利要求1或2或3或5所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征 在于：所述步骤（4)中，对获得单种菌抗体原液进行效价检测的方法为ELISA法。7. 根据权利要求1~6任一项所述方法制备的一种抗菌鸡卵黄复合抗体，其特征在于： 包括抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体、抗金黄色葡萄球菌鸡卵 黄抗体、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。8. 根据权利要求7所述的一种抗菌鸡卵黄复合抗体，其特征在于：对抗菌鸡卵黄复合 抗体效价进行检测，其中抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗白色念珠菌鸡卵 黄抗体效价多1 :32、抗金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价多1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效 价彡1 :16〇9. 权利要求1~8任一项所述抗菌鸡卵黄复合抗体在制备口腔致病菌感染引起的疾病 的制剂中的应用。10. 权利要求1~8任一项所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在制备预防和/或治疗口腔致病 菌感染引起的相关疾病的消毒剂、药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用，具体制备方法包括以下步骤：1）分别制备口腔致病菌的免疫抗原；2）分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原；3）收集免疫鸡蛋的蛋黄，并进行提取、纯化、分离，获得各单种菌的抗体原液；4）各单种菌的抗体原液混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄复合抗体。本发明直接作用于人口咽部，可在短时间与口腔致病菌的特异性病原体结合，能够较长时间有效杀灭特异性口腔致病菌，且安全性能较好，使用人群更为广泛的抗菌鸡卵黄复合抗体。
【IPC分类】A23L1/29, A23K1/16, A61K39/40, A23L1/305, C07K16/02, C07K16/12, A01P1/00, A01N47/44, A61P31/04
【公开号】CN104892756
【申请号】CN201510339860
【发明人】林小军, 李燕, 赵涛, 朱玲, 万强, 何珊, 冯梅, 胡方焱, 林烨暄, 叶琳
【申请人】成都安蒂康生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物抗体免疫技术领域，具体是指一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 目前广谱抗生素在口腔致病菌的灭杀方面还存在较多缺憾，不仅不能实现特异性 灭杀，而且有可能破坏益生菌，长时间使用的话还可能引起菌群失调，产生耐药菌；化学方 法能够破坏口腔致病菌的结构，引起致病菌的死亡，但是对皮肤黏膜具有刺激作用；物理方 法对口腔致病菌具有杀灭作用，但对人体皮肤黏膜有伤害。
[0003] 卵黄抗体是禽类对特定抗原所产生的相应特异性抗体。卵黄抗体是一种天然存 在、无残留、无毒副作用的免疫球蛋白，是抗生素的替代品。目前高免卵黄液广泛应用于一 些疾病的紧急预防和治疗中。
[0004] 现未见专门杀灭口腔致病菌的抗菌鸡卵黄抗体，且现有的制备鸡卵黄抗体的方 法，是通过混合抗原然后进行免疫，从而获得的抗体，但由于母鸡机体存在较大差异，其能 够分离提取的鸡卵黄抗体对单种菌的灭杀效果无法保证，难以实现工业化生产。
[0005] 现有制备卵黄抗体的方法中，所选取的免疫鸡为经过挑选、检查和进行了某些疫 病的预防接种的健康产蛋母鸡，仍存在一些鸡源性的细菌或/和病毒混存于鸡蛋中，进而 影响鸡蛋中的鸡卵黄抗体，如大肠杆菌、沙门氏菌、鸡减蛋综合征病毒、鸡禽白血病病毒 等，很容易影响到抗体的安全性。目前，一些研宄选用带有毒性的甲醛、二乙烯胺（BEI)及 β -丙内酯（BPL)作灭活剂，对鸡卵黄抗体中外源性病毒具有灭活效果，但对鸡卵黄抗体的 活性有影响，非常不利于鸡卵黄抗体发挥效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种直接作用于人口咽部，可在短时间与口腔致病菌的特 异性病原体结合，能够较长时间有效杀灭特异性口腔致病菌，且安全性能较好，使用人群更 为广泛的抗菌鸡卵黄复合抗体。
[0007] 本发明另一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体的制备方法。
[0008] 本发明还有一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体在抗口腔致病菌方面的应用。
[0009] 本发明通过下述技术方案实现：一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，包括以下 步骤： (1) 分别制备口腔致病菌的免疫抗原，口腔致病菌包括溶血性链球菌、金黄色葡萄球 菌、白色念珠菌、大肠杆菌； (2) 将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原； (3) 分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯 化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液； (4 )各单种菌的抗体原液按照抗体效价检测进行混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄 复合抗体。
[0010] 本发明的制备口腔致病菌菌灭活后，分别稀释、乳化制成各单种菌免疫抗原；用该 抗原注射免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒、蛋黄蛋白分离，取蛋黄，水稀释法提取、离 心分离获得水溶性组分，用硫酸铵提取获得各单种菌鸡卵黄抗体粗提物；将粗提物用缓冲 液溶解后，超滤纯化；将超滤液灭活；根据单价抗体效价检测结果，配制多种菌群口腔卵黄 抗体，经除菌过滤后加适量稳定剂制成溶血性链球金黄色葡萄球菌、白色念珠菌大肠杆菌 卵黄抗体成品。本品每毫升含相应特异病原抗体效价不低于1:16。主要用于人口咽部粘膜 的相应病原体的预防。
[0011] 为了更好的实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（1)中，制备口腔致病菌的免 疫抗原的具体过程为： (1. 1)从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于10%的新鲜 羊血的血平板或沙保培养基； (1. 2)通过患者炎症部位症状判断，并经革兰染色形态观察、梅里埃鉴定仪和16SRNA 全长测序确认，口腔中的主要致病菌包括乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌、大肠杆菌； (1. 3)分别扩大培养上述四种口腔致病菌，并调整细菌浓度为2X IO9; (1. 4)将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0. 5%甲醛溶液灭活24 小时，另一份采用相应物理方法裂解相应的细菌：①大肠杆菌采用超声破碎法；②乙型溶 血性链球菌采用组织裂解仪共振裂解：2mlEP管中加入菌悬液和50-200 μ m玻珠50 μ g，以 25Hz振动5分钟，共振2-3次；③金黄色葡萄球菌采用研磨破碎；④白色念珠菌采用组织匀 浆器裂解； (1. 5)将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌按1 :1比例混合，即得该种口腔致病菌 的免疫抗原； (1. 6)根据步骤（1. 5)所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。
[0012] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（2)中，母鸡具体的免疫过程 为： (2. 1)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏完全佐剂，然后放在组织裂解仪上， 以25Hz的频率共振5分钟，重复两次，对该口腔致病菌的免疫抗原进行乳化，经安全试验、 无菌检验及物理性状检验合格后，制得首次免疫乳化混合液； (2. 2)对健康母鸡进行首次免疫，取初次免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡的翅基 部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生 更好的免疫反应； (2. 3)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏不完全佐剂，按步骤（2. 1)所述制得 免疫乳化混合液； (2. 4)间隔2、4、6、10周时，取免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡进行加强免疫。
[0013] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（3)中，对免疫鸡蛋的蛋黄进 行提取、纯化、分离，获得单种菌抗体原液的具体步骤如下： (3. 1)收集获得免疫的母鸡产下的鸡蛋，将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋 清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量； (3. 2)将蛋黄按比例1 :6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调 pH4. 8~5. 5,2~8°C条件下静置1~24小时； (3. 3)静置后用4000~20000r/min离心，去除沉淀物，取上层清液，在其中加入10%~35% 硫酸铵盐析，充分混匀，过夜沉淀； (3. 4)沉淀完成后，对沉淀物用4000~20000r/min离心脱盐后，取沉淀制得卵黄抗体粗 提物，将硫酸按上清液去除； (3. 5)制得沉淀用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调pH4. 8~5. 5,使其充分溶解， 并保持环境温度2~8°C过夜，取上层清液； (3. 6)制得上清液用截留相对分子量50~100kD超滤膜进行超滤，并进行病毒灭活； (3. 7)灭活后，取其上层清液，剩余悬浊液4000~200(K)r/min离心去沉淀，合并上层清 液，即得单种菌抗体原液，所获得的单种菌抗体原液中鸡卵黄抗体纯度不低于80%。
[0014] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（3. 6)中，病毒灭活过程为，将 需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时。
[0015] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（4)中，对获得单种菌抗体原 液进行效价检测的方法为ELISA法。
[0016] 通过上述方法制备的抗菌鸡卵黄复合抗体，包括抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗 体、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体、抗金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。
[0017] 为了更好地实现本发明，进一步地，对抗菌鸡卵黄复合抗体效价进行检测，其中抗 乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗金黄 色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价多1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价多1 :16。
[0018] 抗菌鸡卵黄复合抗体在制备口腔致病菌感染引起的相关疾病的制剂中的应用。
[0019] 抗菌鸡卵黄复合抗体在制备预防和\或治疗口腔致病菌感染引起的相关疾病的 药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂中的应用。
[0020] 本发明的制备的抗菌鸡卵黄复合抗体的灭菌原理为，不同的口腔致病菌有不同的 特异性抗原，如链球菌属的蛋白质抗原是细胞壁成分，具有型特异性，有M、T、R和S等，M与 致病性有关；白色念珠菌属的蛋白质抗原是细胞壁成分，是甘露糖蛋白片段和能用血清学 方法区别开来的两种白色念珠菌血清型；葡萄球菌属的重要抗原有葡萄球菌A蛋白、磷壁 酸和肽聚糖；大肠埃希菌有菌体〇抗原，鞭毛H抗原，荚膜K抗原和包膜抗原等。
[0021] 使用少数几株乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌免疫 产蛋母鸡，此鸡产生的特异性抗乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆 菌的鸡卵黄抗体就可以不但与免疫的细菌菌株产生特异性抗原一抗体反应，也能够与不同 种和型的具有共同抗原，即共同抗原决定簇的菌株产生抗原一抗体反应。当鸡卵黄抗体与 细菌表面抗原发生抗原一抗体反应时，就能改变细菌表面结构、抑制细菌的一些功能活性、 抑制细菌生长、减少和抑制细菌对细胞的黏附、促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞对 细菌的吞噬和清除。
[0022] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： (1)按本发明方法制取的抗菌鸡卵黄复合抗体主要用于杀灭口腔致病菌 ，制成的试剂 只需在鼻腔、口腔、B因、喉及支气管黏膜局部给药即可，其起效快，用量少，既避免了全身给 药的局限性和副作用，也避免导致局部菌群的失调； (2)本发明中所述的抗菌鸡卵黄复合抗体重点针对乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球 菌、白色念珠菌、大肠杆菌这4种口腔致病菌进行灭杀，该抗菌鸡卵黄复合抗体在杀菌过程 中，不与细菌产生急性毒性反应，属于实际无毒级别； (3 )本发明方法通过获得口腔致病菌的单菌种抗体，使配置的复合抗体可独立发挥抑 杀致病菌的作用，无需补体或与其它免疫细胞配合，不易发生变态反应； (4) 本发明所述的抗菌鸡卵黄复合抗体对口腔致病菌的杀灭效果好，长期使用不会产 生耐药菌株，也不会引起菌群失调； (5) 本发明中所述的抗菌鸡卵黄复合抗体对活体生物的体表和眼球均无刺激性，且较 长时停留在喷涂部位，持续进行杀菌； (6) 通过本发明制备的抗菌鸡卵黄复合抗体的效价较高，一般大于1 :16,因此具有较 好的杀菌效果和更多的抗原结合位点； (7) 本发明采用54~60°C，8~20小时灭活病毒灭活方式，既保持了鸡卵黄抗体的生物活 性，也不会有他毒副物质介入； (8) 本发明中所述方法，对抗体提纯水稀释酸化工艺，使用硫酸铵盐析，应用离心和超 滤等纯化技术，使卵黄抗体纯度不低于80%，使鸡卵黄抗体保持较高的提取效率。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明中方法的流程图； 图2为本发明中抗原免疫注射时间与抗菌鸡卵黄抗体效价趋势图； 图3为本发明中纯化抗菌鸡卵黄抗体的SDS-PAGE分析图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此， 在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替 换和变更，均应包括在本发明的范围内。
[0025] 实施例1 : 本实施例中的制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，如图1所示，包括以下步骤： (1)分别制备口腔致病菌的免疫抗原；制备口腔致病菌的免疫抗原的具体过程为： (1. 1)从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于10%的新鲜 羊血的血平板或沙保培养基； (1. 2)通过患者炎症部位症状判断，并经革兰染色形态观察、梅里埃鉴定仪和16SRNA 全长测序确认，口腔中的主要致病菌包括乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌、大肠杆菌； (1. 3)分别扩大培养上述四种口腔致病菌，并调整细菌浓度为2X IO9; (1. 4)将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0. 5%甲醛溶液灭活24 小时，另一份采用相应物理方法裂解相应的细菌：①大肠杆菌采用超声破碎法；②乙型溶 血性链球菌采用组织裂解仪共振裂解：2mlEP管中加入菌悬液和50-200 μ m玻珠50 μ g，以 25Hz振动5分钟，共振2-3次；③金黄色葡萄球菌采用研磨破碎；④白色念珠菌采用组织匀 浆器裂解； (I. 5)将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌按1 :1比例混合，即得该种口腔致病菌 的免疫抗原； (1. 6)根据步骤（1. 5)所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。
[0026] (2)将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原，母鸡 具体的免疫过程为： (2. 1)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏完全佐剂，然后放在组织裂解仪上， 以25Hz的频率共振5分钟，重复两次，对该口腔致病菌的免疫抗原进行乳化，经安全试验、 无菌检验及物理性状检验合格后，制得首次免疫乳化混合液； (2. 2)对健康母鸡进行首次免疫，取初次免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡的翅基 部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生 更好的免疫反应； (2. 3)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏不完全佐剂，按步骤（2. 1)所述制得 免疫乳化混合液； (2. 4)间隔2、4、6、10周时，取免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡进行加强免疫。
[0027] 如图2所示，随着抗原免疫注射时间增长，抗菌鸡卵黄复合抗体效价呈现节律性， 免疫注射一周效价明显增长。
[0028] (3)分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、 纯化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液；对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化、分离，获得 单种菌抗体原液的具体步骤如下： (3. 1)收集获得免疫的母鸡产下的鸡蛋，将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋 清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量； (3. 2)将蛋黄按比例1 :6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调 pH4. 8~5. 5,2~8°C条件下静置1~24小时； (3. 3)静置后用4000~20000r/min离心，去除沉淀物，取上层清液，在其中加入10%~35% 硫酸铵盐析，充分混匀，过夜沉淀， (3. 4)沉淀完成后，对沉淀物用4000~20000r/min离心脱盐后，取沉淀制得卵黄抗体粗 提物，将硫酸按上清液去除； (3. 5)制得沉淀用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调pH4. 8~5. 5,使其充分溶解， 并保持环境温度2~8°C过夜，取上层清液； (3. 6)制得上清液用截留相对分子量50~100kD超滤膜进行超滤，并进行病毒灭活，病 毒灭活过程为，将需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时； (3. 7)灭活后，取其上层清液，剩余悬浊液4000~200(K)r/min离心去沉淀，合并上层清液， 即得单种菌抗体原液；所提取的单种菌抗体原液纯度，如图3所示，图3中1表示硫酸铵沉 淀的抗菌鸡卵黄抗体，2表示沉淀的抗菌鸡卵黄抗体在经过超滤管纯化，M表示蛋白质标志 物，用硫酸铵法提取的抗菌鸡卵黄抗体浓度较高，且杂带少；经超滤后可以进一步纯化，减 少杂蛋白；所提取蛋白的主要条带的分子量为70KD左右和25KD左右，凝胶成像软件分析抗 菌鸡卵黄抗体纯度分别为85%、94%。
[0029] (4)各单种菌的抗体原液通过ELISA法进行抗体效价检测，根据不同抗体的最终 效价为为乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价1 :32、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体效价1 :32、抗 金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价I :16进行四种菌卵黄 抗体混合，最终制成总蛋白浓度为]~2. 5mg/ml的抗体混合液，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵 黄复合抗体。
[0030] 通过上述的方法制备得到的抗菌鸡卵黄复合抗体，通过ELISA法对抗体效价进 行检测，其中抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体效价 多1 :32、抗金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价多1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价多1 :16。
[0031] 实施例2: 本实施例为验证抗菌鸡卵黄复合抗体对乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄 球菌及大肠杆菌四种口腔致病菌的抑菌性能，做了如下试验： 将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为：用100 μ L滴于对照 样片上或5mL样液内，回收菌数为I X IO4~9X 10 4Cfu/片或ml)。
[0032] 取被试样片（2. 0cmX3. 0cm)或样液（5ml)和对照样片或样液(与试样同质材料， 同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4片(置于灭菌平皿内）或4管。
[0033] 取上述菌悬液，分别在每个被试样片或样液和对照样片或样液上或内滴加 100 μ L，均匀涂布/混合，开始计时，作用2、5、10、20分钟，用无菌镊分别将样片或样液 (0. 5mL)投入含5mL PBS的试管内，充分混勾，作适当稀释，然后取其中2~3个稀释度，分 别吸取0. 5mL，置于两个平皿，用凉至40~45°C的营养琼脂培养基(细菌）或沙氏琼脂培养 基(酵母菌）15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35°C ±2°C培养 48h (细菌）或72h (酵母菌)，对活菌菌落计数。
[0034] 试验结果如下表： 表一抗菌鸡卵黄复合抗体对四种口腔致病菌的抑菌效果
金黄色葡萄球菌阳性对照菌液浓度：3. 85X 104cfu/ml ;白色念珠菌阳性对照菌液浓 度：3. 82X 104cfu/ml ;大肠杆菌阳性对照菌液浓度：1. 89X 104cfu/ml ;乙型溶血性链球菌 阳性对照菌液浓度：3. 48X 104cfu/ml ;阴性对照无菌生长。
[0035] 由上表可知，在上述试验条件下，抗菌鸡卵黄复合抗体原液对乙型溶血性链球菌 原液、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌作用2、5、10、20分钟，平均抑菌率为100%。
[0036] 实施例3 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在生物活体表面的安全性，对获取的抗菌 鸡卵黄复合抗体进行了多次完整皮肤刺激试验。
[0037] 具体试验过程如下： 试验前24h，将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围左、右各约3cmX3cm。试验时将 抗菌鸡卵黄复合抗体原液0. 5ml涂于一侧2. 5cmX 2. 5cm皮肤上，另一侧皮肤作为空白对 照。在涂抹后4h 除去鸡卵黄抗体原液，每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观 察结果，如下表所示， 表二抗菌鸡卵黄复合抗体对家兔多次完整皮肤刺激试验结果
由上表可得，对家兔多次完整皮肤刺激试验结果为无刺激性。
[0038] 本实施例的实验充分证明了，所述的抗菌鸡卵黄复合抗体对生物活体的皮肤表面 没有刺激性，在实际使用中，涂抹在生物活体表面具有很好的安全性。
[0039] 实施例4 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在活体生物眼球表面的安全性，对获取的 抗菌鸡卵黄复合抗体进行了急性眼刺激试验。
[0040] 具体试验过程如下： 取抗菌鸡卵黄复合抗体原液0.1 ml滴入家兔右眼结膜囊内，被动闭合4s，30s后用足 量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的生理盐水冲洗30s，左眼为空白对照。记录滴眼后 111、2411、4811、7211、7(1、14(1和21(1的局部反应。如果7211内未出现刺激反应，或第7(1、第14(1， 眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。试验结果如下表所示， 表三抗菌鸡卵黄复合抗体对家兔眼刺激试验结果
平均评分系指24h、48h、72h评分之和除以观察时间段数3。
[0041] 由上表可知，抗菌鸡卵黄复合抗体原液对家兔急性眼刺激试验结果无刺激性。
[0042] 本实施例的实验充分证明了所述的抗菌鸡卵黄复合抗体，在触及生物活体的眼球 时，对眼球无刺激性，在实际使用中，不用担心因操作不适，导致该抗体溶液进入人眼，而引 发人眼的不适，进一步体现该抗菌鸡卵黄复合抗体在活体应用方面的安全性。
[0043] 实施例5 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在的稳定性，对获取的抗菌鸡卵黄复合抗 体进行了微生物法的稳定性试验。
[0044] 具体试验过程如下： 将抗菌鸡卵黄复合抗体原液的样品放置在37°C的环境中90天后，再使其对白色念珠 菌作用，如下表所示， 表四抗菌鸡卵黄复合抗体存放后对白色念珠菌的抑菌效果
其中阳性对照菌液浓度：3. 56 X IO4 (2. 57 X IO4 -4. 30 X IO4)cfu/ml，阴性对照无菌生 长。
[0045] 由上表可看出，该抗体经37°C放置90天后，原液对白色念珠菌作用2min，平均抑 菌率为100%。
[0046] 实施例6 : 本实施例为验证所述的抗菌鸡卵黄复合抗体的在活体生物不同部位的停留时间长，对 获取的抗菌鸡卵黄复合抗体进行了药物停留时间小动物成像实验。
[0047] 具体试验过程如下： 调制pH至8. 5-10. 0,将少量荧光染料加入到抗菌鸡卵黄复合抗体原液中，温度为4°C， 垂直混合过夜。然后超滤离心来去除未反应的荧光分子，获得含有荧光分子的抗菌鸡卵黄 复合抗体原液。
[0048] 试验方法：将含有荧光分子抗菌鸡卵黄复合抗体原液制成口腔喷雾。分成三组实 验组：a组：喷雾后禁水8小时，不禁食；b组：喷雾后禁食8小时，不禁水；c组：喷雾后禁水 禁食8小时；皮肤喷涂：背部剔除部分皮毛后进行喷雾。
[0049] 通过小动物成像采集喷雾部位荧光强度，通过荧光强度减弱情况，判断抗菌鸡卵 黄复合抗体原液在喷雾部位的停留时间，口腔喷雾后，不同组别的抗菌鸡卵黄复合抗体原 液的荧光随时间减弱，口腔喷雾后，不同试验组别在口腔的停留时间均能达到8. 5小时，其 中禁食禁水实验组效果比较好。含有荧光分子的抗菌鸡卵黄复合抗体原液在皮肤处停留时 间可长达70多小时。
[0050] 本实施例的实验是为了验证该抗菌鸡卵黄复合抗体喷涂在活体动物表面或者口 腔内，停留的时间均能达到8小时以上，具有较长的保护周期，在实际使用过程中，可以准 确的预测该抗菌鸡卵黄复合抗体的喷涂时间。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里 不再赘述。
[0051] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 分别制备口腔致病菌的免疫抗原； (2) 将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原； (3) 分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯 化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液； (4 )各单种菌的抗体原液按照抗体效价检测进行混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄 复合抗体。2. 根据权利要求1所述一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：所述步骤 (1)中，制备口腔致病菌的免疫抗原的具体过程为： (I. 1)从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于血平板或培 养基； (1. 2)通过患者炎症部位症状判断，并进行细菌验证后，确定口腔中的主要致病菌包括 乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌； (1. 3)分别扩大培养上述口腔致病菌，并调整到适宜浓度； (1. 4)将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0. 5%甲醛溶液灭活24 小时，另一份使口腔致病菌裂解； (1. 5)将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌混合，即得该种口腔致病菌的免疫抗 原； (1. 6)根据步骤（1. 5)所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。3. 根据权利要求2所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：所述步 骤（2)中，母鸡具体的免疫过程为：在口腔致病菌的免疫抗原中加入弗氏完全佐剂，对免疫 抗原进行乳化，经过乳化并检验合格的免疫抗原对健康母鸡进行首次注射，间隔2、4、6、10 周，使用弗氏不完全佐剂乳化的口腔致病菌免疫抗原，并在检验合格后，对健康母鸡进行注 射，加强免疫。4. 根据权利要求1或2或3所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于： 所述步骤（3)中，对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化、分离，获得单种菌抗体原液的具体步骤 如下： (3. 1)收集获得免疫的健康母鸡产下的鸡蛋，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取 重量； (3. 2)将蛋黄加入纯化水稀释匀浆，调至弱酸环境，静置1~24小时； (3. 3)静置后离心，取上层清液进行盐析，等待其沉淀； (3. 4)沉淀完成后，离心，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物； (3. 5)加入弱酸性缓冲液复溶，调节pH令其充分溶解，静置1~24小时后，取上层清液； (3. 6)超滤，并进行病毒灭活； (3. 7)灭活后，取其上层清液，剩余的悬浊液进行离心分离，取上层清液进行合并，即得 单种菌抗体原液。5. 根据权利要求4所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征在于：所述步 骤（3. 6)中，病毒灭活过程为，将需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保 持8~20小时。6. 根据权利要求1或2或3或5所述的一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，其特征 在于：所述步骤（4)中，对获得单种菌抗体原液进行效价检测的方法为ELISA法。7. 根据权利要求1~6任一项所述方法制备的一种抗菌鸡卵黄复合抗体，其特征在于： 包括抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体、抗金黄色葡萄球菌鸡卵 黄抗体、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。8. 根据权利要求7所述的一种抗菌鸡卵黄复合抗体，其特征在于：对抗菌鸡卵黄复合 抗体效价进行检测，其中抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗白色念珠菌鸡卵 黄抗体效价多1 :32、抗金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价多1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效 价彡1 :16〇9. 权利要求1~8任一项所述抗菌鸡卵黄复合抗体在制备口腔致病菌感染引起的疾病 的制剂中的应用。10. 权利要求1~8任一项所述的抗菌鸡卵黄复合抗体在制备预防和/或治疗口腔致病 菌感染引起的相关疾病的消毒剂、药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用，具体制备方法包括以下步骤：1）分别制备口腔致病菌的免疫抗原；2）分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原；3）收集免疫鸡蛋的蛋黄，并进行提取、纯化、分离，获得各单种菌的抗体原液；4）各单种菌的抗体原液混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄复合抗体。本发明直接作用于人口咽部，可在短时间与口腔致病菌的特异性病原体结合，能够较长时间有效杀灭特异性口腔致病菌，且安全性能较好，使用人群更为广泛的抗菌鸡卵黄复合抗体。
【IPC分类】A23L1/29, A23K1/16, A61K39/40, A23L1/305, C07K16/02, C07K16/12, A01P1/00, A01N47/44, A61P31/04
【公开号】CN104892756
【申请号】CN201510339860
【发明人】林小军, 李燕, 赵涛, 朱玲, 万强, 何珊, 冯梅, 胡方焱, 林烨暄, 叶琳
【申请人】成都安蒂康生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
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