一种检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用
一种检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 大黄酸（Rhein)是常用中药材大黄（Rhein Radix et Rhizoma)的主要活性成分 之一，具有抗炎、抗肿瘤、肾脏保护等多种药理活性。目前，大黄酸检测方法有薄层色谱法、 高效液相色谱法和毛细管电泳法等。
[0003] 酶联免疫吸附检测法具有操作简便、灵敏度高、通量高、检测快速、成本低廉等特 点，在中药材的品质鉴定等方面已经获得了广泛的应用，但大黄酸的免疫检测方法还未见 报道，加上市场上所售大黄质量参差不齐，所以建立一种简便、快速、高通量的大黄酸免疫 检测方法具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种抗大黄酸的单克隆抗体。
[0005] 本发明提供的抗大黄酸的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 10582的杂交瘤细 胞株产生的。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一株分泌抗大黄酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 RH1F8。
[0007] 本发明提供的分泌抗大黄酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株RH1F8的保藏号为 CGMCC No. 10582。
[0008] 本发明保护保藏号为CGMCC No. 10582的杂交瘤细胞株RH1F8,保藏号为CGMCC No. 10582的杂交瘤细胞株RH1F8的分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞株已于 2015年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCCJft 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC No. 10582。
[0009] 本发明还有一个目的是提供上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8的用途。
[0010] 本发明提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测或辅助检 测待测样品中大黄酸含量的试剂或试剂盒中的应用。
[0011] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8在检测或辅助检测 待测样品中大黄酸含量中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测或辅助 检测待测样品中大黄酸含量的胶体金试纸条中的应用。
[0013] 本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶 联免疫试剂盒。
[0014] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒包括独 立包装的上述单克隆抗体。
[0015] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒还可含 有分别为独立包装的大黄酸标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；
[0016] 所述大黄酸标准品可为大黄酸或由所述大黄酸配制成的一系列不同浓度的大 黄酸溶液；所述一系列不同浓度的大黄酸溶液的浓度具体可为：〇. 5ng/mL、0. 25ng/mL、 0· 125ng/mL、0. 0625ng/mL、0. 03125ng/mL、0. 015625ng/mL 和 0· 0078125ng/mL，所述大黄酸 溶液的溶剂具体可为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2HP0 4、KH2POjP NaCl，溶质Na2HP04、KH 2POjP NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和 0· 14M，pH 值为 7. 5 ;
[0017] 所述标记酶具体可为辣根过氧化物酶。
[0018] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒还可含 有分别为独立包装的包被缓冲液和/或洗涤液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和/或 封闭液；
[0019] 所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2COjP NaHCO 3;溶质Na 20)3和NaHCO 3在所 述包被缓冲液中的浓度分别为〇. OlM和0. 04M ;所述包被缓冲液的pH值为9. 6 ;
[0020] 所述洗涤液的溶剂为水，溶质为Na2HPCV KH2P04、NaCl和吐温-20 ;溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和吐温-20在所述洗涤液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1% (体 积百分含量）；所述洗涤液的pH值为7. 5 ;
[0021] 所述底物缓冲液的溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4;溶质柠檬酸三钠和 Na2HPO4在所述底物缓冲液中的浓度分别为0.0 lM和0. 03M ;所述底物缓冲液的pH值为 5. 5 ；
[0022] 所述终止缓冲液为2M的硫酸水溶液；
[0023] 所述封闭液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2P04、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度分别为0· 02Μ、0· 0015Μ、0· 14M和3% (质量 百分含量）；所述封闭液的pH值为7. 5。
[0024] 上述酶联免疫试剂盒中，所述样品为大黄；所述大黄具体为掌叶大黄、唐古特大 黄、药用大黄、土大黄或华北大黄。
[0025] 上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量中的应用也属于 本发明的保护范围。
[0026] 上述应用中，所述样品为大黄；所述大黄具体为掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、 土大黄或华北大黄。
[0027] 本发明提供了一种检测大黄酸的的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的抗大黄酸的 单克隆抗体是以大黄酸-OVA(大黄酸和卵清白蛋白的偶联物）为包被抗原，通过间接竞争 ELISA方法对杂交瘤细胞RH1F8进行筛选得到的。通过实验证明：本发明所提供抗大黄酸 的单克隆抗体特异性强，与芦荟大黄素的交叉反应率为27. 039% ;与大黄素的交叉反应率 为0. 887% ;与大黄酚的交叉反应率为0. 114% ;与大黄素甲醚的交叉反应率为0. 310% ;与 番泻苷A的交叉反应率为0.005% ;与番泻苷B和土大黄苷无交叉反应。利用该单克隆抗 体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测样品中大黄酸，线性检测范 围在0. 02~0. llng/mL，具有快速、灵敏的优点。
【附图说明】
[0028] 图1为大黄酸化学结构。
[0029] 图2为间接竞争ELISA中大黄酸的抑制曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 弗氏完全佐剂是Sigma公司的产品，产品目录号为F5881。
[0033] 弗氏不完全佐剂是Sigma公司的产品，产品目录号为F5506。
[0034] 包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na2COjP NaHCO 3;溶质Na 20)3和NaHCO 3在包被缓冲 液中的浓度分别为0.0 lM和0. 04M ;pH值为9. 6。
[0035] 洗涤液：溶剂为水，溶质为 Na2HP04、KH2P04、NaCl 和吐温-20 ;溶质 Na2HP04、KH2P04、 NaCl和吐温-20在洗涤液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1 % (体积百分含 量）；pH值为7. 5。
[0036] 样品稀释液：溶剂为水，溶质为Na2HPO4、KH 2POjP NaCl、吐温-20和明胶；溶质 Na2HP04、KH2POjP NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M ;所述 吐温-20在所述样品稀释液中的体积百分含量为0. 1 % ;所述明胶在所述样品稀释液中的 质量百分含量为〇. 5%。
[0037] 底物缓冲液：溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4;溶质柠檬酸三钠和Na 2ΗΡ04 在底物缓冲液中的浓度分别为〇. OlM和0. 03M ;pH值为5. 5。
[0038] 终止缓冲液：浓度为2M的硫酸水溶液。
[0039] 封闭液：溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P0 4、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、KH2P0 4、 NaCl和脱脂牛奶在封闭液中的浓度分别为0.02M、0.0015M、0. 14M和3% (质量百分含量）； pH值为7. 5。
[0040] PBS 缓冲液：溶剂为水，溶质为 Na2HP04、KH2P0# NaCl，溶质 Na 2ΗΡ04、ΚΗ2Ρ04和 NaCl 在PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M ;pH值为7. 5。
[0041] Bal b/C小白鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
[0042] SP2/0骨髓瘤细胞购自中国兽医药品监察所。
[0043] 实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗大黄酸单克隆抗体的制备
[0044] -、大黄酸-BSA免疫原和大黄酸-OVA包被原的合成
[0045] 1、大黄酸标准品（购自中国食品药品检定研宄院，产品目录编号为110757,化学 结构式见图1)5. 2mg，溶解于3mL N，N-二甲基甲酰胺（购自Sigma公司，产品目录编号为 D4551)中，常温下磁力搅拌，得到大黄酸标准品溶液。
[0046] 2、向步骤1中的大黄酸标准品溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺（购自Sigma公司， 产品目录编号为56480)4. 2mg，避光搅拌反应30min后；再加入7. 5mg二环己基碳二亚胺 (购自Sigma公司，产品目录编号为D3128)，4°C搅拌反应4h，离心（3000g、5min)，取上清 液。
[0047] 3、将20mg BSA(牛血清白蛋白，购自Sigma公司，产品目录编号为A4737)和20mg 〇VA(鸡卵清白蛋白，购自Sigma公司，产品目录编号为A5503)分别溶解于2mL PBS缓冲液 中，离心，分别取上清液（BSA蛋白质溶液和OVA蛋 白质溶液），并将上清液分成两等份。
[0048] 4、将步骤2的上清液分别逐滴加入到步骤3的BSA蛋白质溶液和OVA蛋白质溶液 中，4°C搅拌反应12h后，装入透析袋，PBS透析3天，透析后分别得到大黄酸-BSA免疫原溶 液（4mg/mL)和大黄酸-OVA包被原溶液（4mg/mL)。
[0049] 二、动物免疫
[0050] 1、以8-10周龄的Bal b/C小白鼠作为实验动物。
[0051] 2、基础免疫：将lmg/mL的大黄酸-BSA经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全 佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背 部皮下多点注射Bal b/C小白鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.1 mg抗原。
[0052] 3、加强免疫：基础免疫2周后，取ImL lmg/mL的大黄酸-BSA，加入ImL弗氏不完 全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的免疫原采用腹腔及 背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.1 mg抗原。
[0053] 三、细胞融合和克隆化
[0054] 加强免疫每隔10天一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第7天，从小鼠眼眶 采血，测定抗体效价，效价的定义为OD值为1时的血清稀释倍数。待效价大于1:8000后， 选择血清效价最佳的小鼠（效价为I :80000)，取脾细胞，按9 :1 (数量配比）比例与SP2/0 骨髓瘤细胞融合；采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用间接竞争 ELISA测定抗体效价，用大黄酸标准品溶液筛选分泌抗体效价高的单克隆细胞株，选择能 识别大黄酸标准品溶液的单克隆抗体，最后筛选得到稳定分泌抗大黄酸抗体的单克隆杂交 瘤细胞株，命名为RH1F8,该杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞 株已于2015年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 10582。
[0055] 上述间接竞争ELISA测定抗体效价的方法如下：
[0056] 1)包被：在96孔酶标板中加入100 μ L 250ng/mL的大黄酸-OVA溶液，37°C包被3 小时，用洗涤液洗涤4次。
[0057] 2)封闭：封闭液150 μ L/孔，在37 °C湿盒中封闭Ih，弃封闭液，洗涤3次。
[0058] 3)加样品：抑制孔加入预先配置好的标准品（100ng/mL) 50 μ L，空白孔加入50 μ L 样品稀释液。
[0059] 4)加抗体：将不同稀释倍数的增量培养法得到的单抗加至酶标板中，置湿盒中 37°C条件下30min，洗板4次。
[0060] 5)加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(购自Jackson公司，商品目录号为 79556) (0. lmg/mL)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0061] 6)显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 μ L 30% H2O2，将底 物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色10min。用酶标仪492nm处测定各孔的OD值， 部分结果见表1。表1中，2G2、2G12和3G2分别代表筛选过程中加入的细胞培养板不同孔中 的杂交瘤细胞，抑制率（％) = [(空白孔OD值一抑制孔OD值）/空白孔OD值]X100%。
[0062] 表1、间接竞争ELISA法筛选杂交瘤细胞的结果
[0063]
[0064] 吸光值越大，说明抗体对抗原的亲和力越高；识别率越高，说明抗体的特异性越 好。从表1的数据可以看出，2G12的识别率最高，达87. 2%，同时与包被原的亲和力也比较 高，选取2G12的杂交瘤细胞继续进行筛选，最后得到分泌抗体特异性好、亲和力高的杂交 瘤细胞株RH1F8。
[0065] 四、细胞冻存和复苏
[0066] 用冻存液将杂交瘤细胞株RH1F8CGMCC No. 10582制成I X IO6个/mL的细胞悬液， 在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后移 入培养瓶内培养。
[0067] 五、单克隆抗体的制备与纯化
[0068] 1、增量培养法
[0069] 细胞培养基的制备方法：向DMEM培养基中添加小牛血清（购自GIBC0BRL，产品目 录号为26170-043)和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20% (质量百分含量），碳酸氢钠的 终浓度为〇. 2% (质量百分含量），pH为7. 4。
[0070] 将杂交瘤细胞株RH1F8CGMCC No. 10582置于上述细胞培养基中，37°C培养2天，用 于制备单克隆抗体溶液。
[0071] 2、腹水制备
[0072] Bal b/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油（0. 2mL/只）。7天后腹腔注射上述杂交瘤细 胞株RH1F8CGMCC No. 10582 (IO6个/只）。7天后采集腹水，用饱和硫酸铵法对腹水进行纯 化，得到抗大黄酸的单克隆抗体，纯化后的腹水_20°C保存。
[0073] 上述饱和硫酸铵纯化腹水方法具体步骤如下：
[0074] 1)室温下将腹水与等体积的PBS溶液混合。搅拌状态下逐滴加入等体积饱和硫 酸铵（即使硫酸铵浓度达到50% )，4°C静置2h后，4°C 3000g离心15min，弃上清，取沉淀。 所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2P0# NaCl，溶质Na 2HP04、KH2P〇dP NaCl在 所述PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02Μ、0. 0015Μ和0. 14Μ，pH值为7. 5。所述饱和硫酸铵 溶液的溶剂为水，溶质为（NH4)2SO4，浓度为4. 10M，pH为7. 2。
[0075] 2)向所得沉淀中加入原腹水量2倍体积的PBS溶液，充分溶解，逐滴加入一半PBS 体积的饱和硫酸铵（即饱和硫酸铵浓度达到33% )，4°C静置2h后，4°C 3000g离心15min， 弃上清，取沉淀。
[0076] 3)沉淀用原腹水一半体积的PBS溶液溶解，4°C透析2天，每6h更换一次透析液。 透析完成后，冷冻干燥，_40°C保存。所述透析液为PBS缓冲液。
[0077] 六、单克隆抗体的鉴定
[0078] 采用单克隆抗体类型检测试剂盒（购自Sigma，产品编号为IS02-1KT)对步骤五中 的2得到的单克隆抗体溶液中的单克隆抗体的亚型进行检测。
[0079] 结果表明：步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗体的亚型为IgGl型。
[0080] 实施例2、利用间接竞争性ELISA法测定单克隆抗体的交叉反应
[0081] 大黄药材中的主要游离蒽醌类成分为大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟 大黄素5种，且《中国药典》中也以此5种成分做为大黄药材的指标性成分，此外大黄中还含 有番泻苷A、番泻苷B等黄酮类成分；土大黄苷是用于大黄药材真伪鉴定的主要特征成分。 因此本实验中测定了单克隆抗体与大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素、番泻 苷A、番泻苷B和土大黄苷的交叉反应。具体步骤如下：
[0082] 1、包被：取96孔酶标板，采用大黄酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；大黄酸-OVA 溶液的浓度为62. 5ng/mL ;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0083] 2、加样品：分别在每孔中加入50 μ L的下述化合物溶液：大黄酸溶液、大黄素溶 液、大黄素甲醚溶液、大黄酚溶液、芦荟大黄素溶液、番泻苷A溶液、番泻苷B溶液和土大黄 苷溶液，上述化合物溶液的溶剂均为样品稀释液。其中，大黄酸溶液浓度分别为：〇. 5ng/ mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、0. 03125ng/mL、0. 015625ng/mL、0. 0078125ng/ mL 和 0· 00390625ng/mL ;芦荟大黄素溶液浓度分别为：2ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/ mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、0. 03125ng/mL 和 0· 015625ng/mL ;大黄素溶液浓度分别为： 20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL、0. 3125ng/mL 和 0· 15625ng/ mL ;大黄酷溶液浓度分别为：20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/ mL、0. 3125ng/mL 和 0· 15625ng/mL ;大黄素甲醚溶液浓度分别为：1000ng/mL、500ng/mL、 125ng/mL、62. 5ng/mL、31. 25ng/mL、15. 625ng/mL、7. 8125ng/mL 和 3. 90625ng/mL ;番泻昔 A 溶液浓度分别为 40000ng/mL、20000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/ mL、625ng/mL 和 312. 5ng/mL ;番泻苷 B 溶液浓度分别为 40000ng/mL、20000ng/mL、10000ng/ mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL 和 312. 5ng/mL ;土大黄昔溶液浓度分另lj 为 40000ng/mL、20000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL 和 312. 5ng/mL ;对照孔为50 μ L的样品稀释液。
[0084] 3、加抗体：每孔加入50 μ L实施例1的步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗 体的稀释液（250ng/mL);每种稀释液设置三个复孔；置湿盒中37°C条件下30min，洗板4 次。
[0085] 4、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，购自J ackson公司，商品目 录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0086] 5、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加 4 μ L 30% H2O2，将 底物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0087] 6、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0088] 以化合物溶液浓度为横坐标，ODADtl (0D值表示含有化合物时的吸光值，ODtl表示 不含有化合物时的吸光值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件分别计算大黄酸、大黄素、大 黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素、番泻苷A、番泻苷B和土大黄苷的IC5tl值，按下列公式计算 交叉反应率：交叉反应率（％) = (IC5tl(大黄酸）/IC5(l(大黄酸类似物））X100%。
[0089] 结果如表2所示：抗大黄酸的单克隆抗体对芦荟大黄素的交叉反应率为 27. 039% ;对大黄素的交叉反应率为0.887% ;对大黄酚的交叉反应率为0. 114% ;对大黄 素甲醚的交叉反应率为0. 310% ;对番泻苷A的交叉反应率为0. 005% ;对番泻苷B和土大 黄苷无交叉反应，说明本发明的单克隆抗体特异性强。
[0090] 表2、抗大黄酸的单克隆抗体与大黄酸及其结构类似化合物的交叉反应率
[0091]
[0092] 实施例3、单克隆抗体的灵敏度检测
[0093] 通过间接竞争ELISA实验建立标准曲线，并确定检测灵敏度为0. 04ng/mL，线性检 测范围在0. 02~0. llng/mL。具体方法如下：
[0094] 1、包被：取96孔酶标板，采用大黄酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；大黄酸-OVA 溶液的浓度为62. 5ng/mL ;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0095] 2、加标准品洛液和样品洛液：每孔加入50 μ L大黄酸标准品洛液和待测样品 溶液，大黄酸标准品溶液浓度依次为：〇· 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、 0.031251^/11^、0.015625叩/11^、0.00781251^/11^和0.003906251^/11^ ;对照孔为5(^1^的样 品稀释液。
[0096] 3、加抗体：每孔加入50 μ L实施例1的步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗 体的稀释液（用样品稀释液稀释成500ng/mL);置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0097] 4、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，购自Jackson公司，商品目 录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0098] 5、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 yL 30% H2O2，将底 物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0099] 6、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0100] 7、绘制标准曲线：以不同浓度的大黄酸标准品溶液为横坐标，B/BJB表示含有大 黄酸时的OD值，Btl表示对照孔时的OD值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件绘制标准曲 线。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图2所示。标准曲线方 程为 y = 〇· 05023+(0. 96399-0. 05023) Λ?+(χ/0· 046Γ1. 8303) (R2= 0· 99118)。
[0101] 8、由所建立的标准曲线，定义BziBtl数值为0. 5时对应的大黄酸标准品浓度为检测 灵敏度（即〇. 〇4ng/mL)，定义BziBtl数值分别为0. 2和0. 8时所对应的大黄酸标准品浓度范 围为该检测方法的线性检测范围（即0. 02~0. llng/mL)。
[0102] 实施例4、检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用
[0103] 一、试剂盒的制备
[0104] 本发明的检测大黄酸的酶联免疫试剂盒由大黄酸-OVA溶液（包被原）、抗大黄酸 的单克隆抗体、羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP、包被缓冲液、洗涤液、标准品溶液、底物缓冲液和 终止缓冲液和封闭液组成。其中，大黄酸-OVA溶液为实施例1中的步骤一制备得到的；抗 大黄酸的单克隆抗体为实施例1的步骤五中的2制备得到的。
[0105] 二、抗大黄酸的单克隆抗体在检测样品中大黄酸含量上的应用
[0106] 使用步骤一所述的试剂盒分别对待测样品：掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、土 大黄、华北大黄（来源于中国食品药品检定研宄院）中的大黄酸含量进行检测，具体步骤如 下：
[0107] 1、将待测样品粉碎，经甲醇超声提取，得到提取液；向提取液中加适量样品稀释 液，得到待测样品溶液。
[0108] 2、包被：取96孔酶标板，采用大黄酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；大黄酸-OVA 溶液的浓度为62. 5ng/mL ;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0109] 3、加标准品溶液和样品溶液：每孔加入50 μ L大黄酸标准品溶液和待测样品 溶液，大黄酸标准品溶液浓度依次为：〇· 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、 0.031251^/11^、0.015625叩/11^、0.00781251^/11^和0.003906251^/11^ ;对照孔为5(^1^的样 品稀释液。
[0110] 4、加抗体：每孔加入50 μ L实施例1的步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗 体的稀释液（用样品稀释液稀释成500ng/mL);置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0111] 5、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(0. lmg/mL，购自Jackson公司，商品 目录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0112] 6、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 yL 30% H2O2，将底 物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0113] 7、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0114] 8、绘制标准曲线：以不同浓度的大黄酸标准品溶液为横坐标，B/BJB表示含有大 黄酸时的OD值，B tl表示对照孔时的OD值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件绘制标准曲 线。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图2所示。标准曲线方 程为 y = 〇· 05023+(0. 96399-0. 05023) Λ?+(χ/0· 046Γ1. 8303) (R2= 0· 99118)。
[0115] 9、将待测样品的B/^代入标准曲线中，根据标准曲线方程计算得到待测样品中大 黄酸的含量。
[0116] 掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、土大黄、华北大黄中的大黄酸含量的检测结果 如表3所示。其中，掌叶大黄中大黄酸的含量为0. 653±0. 071mg/g ;唐古特大黄中大黄酸 的含量为3. 587±0. 065mg/g ;药用大黄中大黄酸的含量为I. 200±0. 054mg/g ;土大黄中大 黄酸的含量为〇. 708±0. 009mg/g ;华北大黄中的大黄酸含量为0. 042±0. 005mg/g。
[0117] 表3、大黄样品中大黄酸含量检测结果
[0118]
【主权项】
1. 抗大黄酸的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo. 10582的杂交瘤细胞株产生的。2. -株分泌抗大黄酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株RH1F8,其保藏号为CGMCC No.10582。3. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测 或辅助检测待测样品中大黄酸含量的试剂或试剂盒中的应用。4. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株RH1F8在检测或辅 助检测待测样品中大黄酸含量中的应用。5. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测 或辅助检测待测样品中大黄酸含量的胶体金试纸条中的应用。6. -种检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒，包括独立包装的权 利要求1所述的单克隆抗体。7. 根据权利要求6所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述样品为大黄；所述大黄具 体为掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、土大黄或华北大黄。8. 权利要求6或7所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量中 的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述样品为大黄；所述大黄具体为掌叶大 黄、唐古特大黄、药用大黄、土大黄或华北大黄。
【专利摘要】本发明公开了一种检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用。本发明的试剂盒所使用的抗大黄酸的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株RH1F8分泌产生的。通过实验证明：本发明所提供抗大黄酸的单克隆抗体特异性强，与芦荟大黄素的交叉反应率为27.039％；与大黄素的交叉反应率为0.887％；与大黄酚的交叉反应率为0.114％；与大黄素甲醚的交叉反应率为0.310％；与番泻苷A的交叉反应率为0.005％；与番泻苷B和土大黄苷无交叉反应。利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测样品中大黄酸，线性检测范围在0.02～0.11ng/mL，具有快速、灵敏的优点。CGMCC No.1058220150415
【IPC分类】C12N5/20, G01N33/577, C07K16/16
【公开号】CN104892757
【申请号】CN201510246118
【发明人】黄璐琦, 张波, 南铁贵, 袁媛, 詹志来, 康利平
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 大黄酸（Rhein)是常用中药材大黄（Rhein Radix et Rhizoma)的主要活性成分 之一，具有抗炎、抗肿瘤、肾脏保护等多种药理活性。目前，大黄酸检测方法有薄层色谱法、 高效液相色谱法和毛细管电泳法等。
[0003] 酶联免疫吸附检测法具有操作简便、灵敏度高、通量高、检测快速、成本低廉等特 点，在中药材的品质鉴定等方面已经获得了广泛的应用，但大黄酸的免疫检测方法还未见 报道，加上市场上所售大黄质量参差不齐，所以建立一种简便、快速、高通量的大黄酸免疫 检测方法具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种抗大黄酸的单克隆抗体。
[0005] 本发明提供的抗大黄酸的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 10582的杂交瘤细 胞株产生的。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一株分泌抗大黄酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 RH1F8。
[0007] 本发明提供的分泌抗大黄酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株RH1F8的保藏号为 CGMCC No. 10582。
[0008] 本发明保护保藏号为CGMCC No. 10582的杂交瘤细胞株RH1F8,保藏号为CGMCC No. 10582的杂交瘤细胞株RH1F8的分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞株已于 2015年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCCJft 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC No. 10582。
[0009] 本发明还有一个目的是提供上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8的用途。
[0010] 本发明提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测或辅助检 测待测样品中大黄酸含量的试剂或试剂盒中的应用。
[0011] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8在检测或辅助检测 待测样品中大黄酸含量中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测或辅助 检测待测样品中大黄酸含量的胶体金试纸条中的应用。
[0013] 本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶 联免疫试剂盒。
[0014] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒包括独 立包装的上述单克隆抗体。
[0015] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒还可含 有分别为独立包装的大黄酸标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；
[0016] 所述大黄酸标准品可为大黄酸或由所述大黄酸配制成的一系列不同浓度的大 黄酸溶液；所述一系列不同浓度的大黄酸溶液的浓度具体可为：〇. 5ng/mL、0. 25ng/mL、 0· 125ng/mL、0. 0625ng/mL、0. 03125ng/mL、0. 015625ng/mL 和 0· 0078125ng/mL，所述大黄酸 溶液的溶剂具体可为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2HP0 4、KH2POjP NaCl，溶质Na2HP04、KH 2POjP NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和 0· 14M，pH 值为 7. 5 ;
[0017] 所述标记酶具体可为辣根过氧化物酶。
[0018] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒还可含 有分别为独立包装的包被缓冲液和/或洗涤液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和/或 封闭液；
[0019] 所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2COjP NaHCO 3;溶质Na 20)3和NaHCO 3在所 述包被缓冲液中的浓度分别为〇. OlM和0. 04M ;所述包被缓冲液的pH值为9. 6 ;
[0020] 所述洗涤液的溶剂为水，溶质为Na2HPCV KH2P04、NaCl和吐温-20 ;溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和吐温-20在所述洗涤液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1% (体 积百分含量）；所述洗涤液的pH值为7. 5 ;
[0021] 所述底物缓冲液的溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4;溶质柠檬酸三钠和 Na2HPO4在所述底物缓冲液中的浓度分别为0.0 lM和0. 03M ;所述底物缓冲液的pH值为 5. 5 ；
[0022] 所述终止缓冲液为2M的硫酸水溶液；
[0023] 所述封闭液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2P04、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度分别为0· 02Μ、0· 0015Μ、0· 14M和3% (质量 百分含量）；所述封闭液的pH值为7. 5。
[0024] 上述酶联免疫试剂盒中，所述样品为大黄；所述大黄具体为掌叶大黄、唐古特大 黄、药用大黄、土大黄或华北大黄。
[0025] 上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量中的应用也属于 本发明的保护范围。
[0026] 上述应用中，所述样品为大黄；所述大黄具体为掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、 土大黄或华北大黄。
[0027] 本发明提供了一种检测大黄酸的的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的抗大黄酸的 单克隆抗体是以大黄酸-OVA(大黄酸和卵清白蛋白的偶联物）为包被抗原，通过间接竞争 ELISA方法对杂交瘤细胞RH1F8进行筛选得到的。通过实验证明：本发明所提供抗大黄酸 的单克隆抗体特异性强，与芦荟大黄素的交叉反应率为27. 039% ;与大黄素的交叉反应率 为0. 887% ;与大黄酚的交叉反应率为0. 114% ;与大黄素甲醚的交叉反应率为0. 310% ;与 番泻苷A的交叉反应率为0.005% ;与番泻苷B和土大黄苷无交叉反应。利用该单克隆抗 体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测样品中大黄酸，线性检测范 围在0. 02~0. llng/mL，具有快速、灵敏的优点。
【附图说明】
[0028] 图1为大黄酸化学结构。
[0029] 图2为间接竞争ELISA中大黄酸的抑制曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 弗氏完全佐剂是Sigma公司的产品，产品目录号为F5881。
[0033] 弗氏不完全佐剂是Sigma公司的产品，产品目录号为F5506。
[0034] 包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na2COjP NaHCO 3;溶质Na 20)3和NaHCO 3在包被缓冲 液中的浓度分别为0.0 lM和0. 04M ;pH值为9. 6。
[0035] 洗涤液：溶剂为水，溶质为 Na2HP04、KH2P04、NaCl 和吐温-20 ;溶质 Na2HP04、KH2P04、 NaCl和吐温-20在洗涤液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1 % (体积百分含 量）；pH值为7. 5。
[0036] 样品稀释液：溶剂为水，溶质为Na2HPO4、KH 2POjP NaCl、吐温-20和明胶；溶质 Na2HP04、KH2POjP NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M ;所述 吐温-20在所述样品稀释液中的体积百分含量为0. 1 % ;所述明胶在所述样品稀释液中的 质量百分含量为〇. 5%。
[0037] 底物缓冲液：溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4;溶质柠檬酸三钠和Na 2ΗΡ04 在底物缓冲液中的浓度分别为〇. OlM和0. 03M ;pH值为5. 5。
[0038] 终止缓冲液：浓度为2M的硫酸水溶液。
[0039] 封闭液：溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P0 4、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、KH2P0 4、 NaCl和脱脂牛奶在封闭液中的浓度分别为0.02M、0.0015M、0. 14M和3% (质量百分含量）； pH值为7. 5。
[0040] PBS 缓冲液：溶剂为水，溶质为 Na2HP04、KH2P0# NaCl，溶质 Na 2ΗΡ04、ΚΗ2Ρ04和 NaCl 在PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M ;pH值为7. 5。
[0041] Bal b/C小白鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
[0042] SP2/0骨髓瘤细胞购自中国兽医药品监察所。
[0043] 实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗大黄酸单克隆抗体的制备
[0044] -、大黄酸-BSA免疫原和大黄酸-OVA包被原的合成
[0045] 1、大黄酸标准品（购自中国食品药品检定研宄院，产品目录编号为110757,化学 结构式见图1)5. 2mg，溶解于3mL N，N-二甲基甲酰胺（购自Sigma公司，产品目录编号为 D4551)中，常温下磁力搅拌，得到大黄酸标准品溶液。
[0046] 2、向步骤1中的大黄酸标准品溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺（购自Sigma公司， 产品目录编号为56480)4. 2mg，避光搅拌反应30min后；再加入7. 5mg二环己基碳二亚胺 (购自Sigma公司，产品目录编号为D3128)，4°C搅拌反应4h，离心（3000g、5min)，取上清 液。
[0047] 3、将20mg BSA(牛血清白蛋白，购自Sigma公司，产品目录编号为A4737)和20mg 〇VA(鸡卵清白蛋白，购自Sigma公司，产品目录编号为A5503)分别溶解于2mL PBS缓冲液 中，离心，分别取上清液（BSA蛋白质溶液和OVA蛋 白质溶液），并将上清液分成两等份。
[0048] 4、将步骤2的上清液分别逐滴加入到步骤3的BSA蛋白质溶液和OVA蛋白质溶液 中，4°C搅拌反应12h后，装入透析袋，PBS透析3天，透析后分别得到大黄酸-BSA免疫原溶 液（4mg/mL)和大黄酸-OVA包被原溶液（4mg/mL)。
[0049] 二、动物免疫
[0050] 1、以8-10周龄的Bal b/C小白鼠作为实验动物。
[0051] 2、基础免疫：将lmg/mL的大黄酸-BSA经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全 佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背 部皮下多点注射Bal b/C小白鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.1 mg抗原。
[0052] 3、加强免疫：基础免疫2周后，取ImL lmg/mL的大黄酸-BSA，加入ImL弗氏不完 全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的免疫原采用腹腔及 背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.1 mg抗原。
[0053] 三、细胞融合和克隆化
[0054] 加强免疫每隔10天一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第7天，从小鼠眼眶 采血，测定抗体效价，效价的定义为OD值为1时的血清稀释倍数。待效价大于1:8000后， 选择血清效价最佳的小鼠（效价为I :80000)，取脾细胞，按9 :1 (数量配比）比例与SP2/0 骨髓瘤细胞融合；采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用间接竞争 ELISA测定抗体效价，用大黄酸标准品溶液筛选分泌抗体效价高的单克隆细胞株，选择能 识别大黄酸标准品溶液的单克隆抗体，最后筛选得到稳定分泌抗大黄酸抗体的单克隆杂交 瘤细胞株，命名为RH1F8,该杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞 株已于2015年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 10582。
[0055] 上述间接竞争ELISA测定抗体效价的方法如下：
[0056] 1)包被：在96孔酶标板中加入100 μ L 250ng/mL的大黄酸-OVA溶液，37°C包被3 小时，用洗涤液洗涤4次。
[0057] 2)封闭：封闭液150 μ L/孔，在37 °C湿盒中封闭Ih，弃封闭液，洗涤3次。
[0058] 3)加样品：抑制孔加入预先配置好的标准品（100ng/mL) 50 μ L，空白孔加入50 μ L 样品稀释液。
[0059] 4)加抗体：将不同稀释倍数的增量培养法得到的单抗加至酶标板中，置湿盒中 37°C条件下30min，洗板4次。
[0060] 5)加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(购自Jackson公司，商品目录号为 79556) (0. lmg/mL)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0061] 6)显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 μ L 30% H2O2，将底 物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色10min。用酶标仪492nm处测定各孔的OD值， 部分结果见表1。表1中，2G2、2G12和3G2分别代表筛选过程中加入的细胞培养板不同孔中 的杂交瘤细胞，抑制率（％) = [(空白孔OD值一抑制孔OD值）/空白孔OD值]X100%。
[0062] 表1、间接竞争ELISA法筛选杂交瘤细胞的结果
[0063]
[0064] 吸光值越大，说明抗体对抗原的亲和力越高；识别率越高，说明抗体的特异性越 好。从表1的数据可以看出，2G12的识别率最高，达87. 2%，同时与包被原的亲和力也比较 高，选取2G12的杂交瘤细胞继续进行筛选，最后得到分泌抗体特异性好、亲和力高的杂交 瘤细胞株RH1F8。
[0065] 四、细胞冻存和复苏
[0066] 用冻存液将杂交瘤细胞株RH1F8CGMCC No. 10582制成I X IO6个/mL的细胞悬液， 在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后移 入培养瓶内培养。
[0067] 五、单克隆抗体的制备与纯化
[0068] 1、增量培养法
[0069] 细胞培养基的制备方法：向DMEM培养基中添加小牛血清（购自GIBC0BRL，产品目 录号为26170-043)和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20% (质量百分含量），碳酸氢钠的 终浓度为〇. 2% (质量百分含量），pH为7. 4。
[0070] 将杂交瘤细胞株RH1F8CGMCC No. 10582置于上述细胞培养基中，37°C培养2天，用 于制备单克隆抗体溶液。
[0071] 2、腹水制备
[0072] Bal b/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油（0. 2mL/只）。7天后腹腔注射上述杂交瘤细 胞株RH1F8CGMCC No. 10582 (IO6个/只）。7天后采集腹水，用饱和硫酸铵法对腹水进行纯 化，得到抗大黄酸的单克隆抗体，纯化后的腹水_20°C保存。
[0073] 上述饱和硫酸铵纯化腹水方法具体步骤如下：
[0074] 1)室温下将腹水与等体积的PBS溶液混合。搅拌状态下逐滴加入等体积饱和硫 酸铵（即使硫酸铵浓度达到50% )，4°C静置2h后，4°C 3000g离心15min，弃上清，取沉淀。 所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2P0# NaCl，溶质Na 2HP04、KH2P〇dP NaCl在 所述PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02Μ、0. 0015Μ和0. 14Μ，pH值为7. 5。所述饱和硫酸铵 溶液的溶剂为水，溶质为（NH4)2SO4，浓度为4. 10M，pH为7. 2。
[0075] 2)向所得沉淀中加入原腹水量2倍体积的PBS溶液，充分溶解，逐滴加入一半PBS 体积的饱和硫酸铵（即饱和硫酸铵浓度达到33% )，4°C静置2h后，4°C 3000g离心15min， 弃上清，取沉淀。
[0076] 3)沉淀用原腹水一半体积的PBS溶液溶解，4°C透析2天，每6h更换一次透析液。 透析完成后，冷冻干燥，_40°C保存。所述透析液为PBS缓冲液。
[0077] 六、单克隆抗体的鉴定
[0078] 采用单克隆抗体类型检测试剂盒（购自Sigma，产品编号为IS02-1KT)对步骤五中 的2得到的单克隆抗体溶液中的单克隆抗体的亚型进行检测。
[0079] 结果表明：步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗体的亚型为IgGl型。
[0080] 实施例2、利用间接竞争性ELISA法测定单克隆抗体的交叉反应
[0081] 大黄药材中的主要游离蒽醌类成分为大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟 大黄素5种，且《中国药典》中也以此5种成分做为大黄药材的指标性成分，此外大黄中还含 有番泻苷A、番泻苷B等黄酮类成分；土大黄苷是用于大黄药材真伪鉴定的主要特征成分。 因此本实验中测定了单克隆抗体与大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素、番泻 苷A、番泻苷B和土大黄苷的交叉反应。具体步骤如下：
[0082] 1、包被：取96孔酶标板，采用大黄酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；大黄酸-OVA 溶液的浓度为62. 5ng/mL ;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0083] 2、加样品：分别在每孔中加入50 μ L的下述化合物溶液：大黄酸溶液、大黄素溶 液、大黄素甲醚溶液、大黄酚溶液、芦荟大黄素溶液、番泻苷A溶液、番泻苷B溶液和土大黄 苷溶液，上述化合物溶液的溶剂均为样品稀释液。其中，大黄酸溶液浓度分别为：〇. 5ng/ mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、0. 03125ng/mL、0. 015625ng/mL、0. 0078125ng/ mL 和 0· 00390625ng/mL ;芦荟大黄素溶液浓度分别为：2ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/ mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、0. 03125ng/mL 和 0· 015625ng/mL ;大黄素溶液浓度分别为： 20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL、0. 3125ng/mL 和 0· 15625ng/ mL ;大黄酷溶液浓度分别为：20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/ mL、0. 3125ng/mL 和 0· 15625ng/mL ;大黄素甲醚溶液浓度分别为：1000ng/mL、500ng/mL、 125ng/mL、62. 5ng/mL、31. 25ng/mL、15. 625ng/mL、7. 8125ng/mL 和 3. 90625ng/mL ;番泻昔 A 溶液浓度分别为 40000ng/mL、20000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/ mL、625ng/mL 和 312. 5ng/mL ;番泻苷 B 溶液浓度分别为 40000ng/mL、20000ng/mL、10000ng/ mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL 和 312. 5ng/mL ;土大黄昔溶液浓度分另lj 为 40000ng/mL、20000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL 和 312. 5ng/mL ;对照孔为50 μ L的样品稀释液。
[0084] 3、加抗体：每孔加入50 μ L实施例1的步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗 体的稀释液（250ng/mL);每种稀释液设置三个复孔；置湿盒中37°C条件下30min，洗板4 次。
[0085] 4、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，购自J ackson公司，商品目 录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0086] 5、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加 4 μ L 30% H2O2，将 底物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0087] 6、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0088] 以化合物溶液浓度为横坐标，ODADtl (0D值表示含有化合物时的吸光值，ODtl表示 不含有化合物时的吸光值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件分别计算大黄酸、大黄素、大 黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素、番泻苷A、番泻苷B和土大黄苷的IC5tl值，按下列公式计算 交叉反应率：交叉反应率（％) = (IC5tl(大黄酸）/IC5(l(大黄酸类似物））X100%。
[0089] 结果如表2所示：抗大黄酸的单克隆抗体对芦荟大黄素的交叉反应率为 27. 039% ;对大黄素的交叉反应率为0.887% ;对大黄酚的交叉反应率为0. 114% ;对大黄 素甲醚的交叉反应率为0. 310% ;对番泻苷A的交叉反应率为0. 005% ;对番泻苷B和土大 黄苷无交叉反应，说明本发明的单克隆抗体特异性强。
[0090] 表2、抗大黄酸的单克隆抗体与大黄酸及其结构类似化合物的交叉反应率
[0091]
[0092] 实施例3、单克隆抗体的灵敏度检测
[0093] 通过间接竞争ELISA实验建立标准曲线，并确定检测灵敏度为0. 04ng/mL，线性检 测范围在0. 02~0. llng/mL。具体方法如下：
[0094] 1、包被：取96孔酶标板，采用大黄酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；大黄酸-OVA 溶液的浓度为62. 5ng/mL ;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0095] 2、加标准品洛液和样品洛液：每孔加入50 μ L大黄酸标准品洛液和待测样品 溶液，大黄酸标准品溶液浓度依次为：〇· 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、 0.031251^/11^、0.015625叩/11^、0.00781251^/11^和0.003906251^/11^ ;对照孔为5(^1^的样 品稀释液。
[0096] 3、加抗体：每孔加入50 μ L实施例1的步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗 体的稀释液（用样品稀释液稀释成500ng/mL);置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0097] 4、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，购自Jackson公司，商品目 录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0098] 5、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 yL 30% H2O2，将底 物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0099] 6、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0100] 7、绘制标准曲线：以不同浓度的大黄酸标准品溶液为横坐标，B/BJB表示含有大 黄酸时的OD值，Btl表示对照孔时的OD值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件绘制标准曲 线。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图2所示。标准曲线方 程为 y = 〇· 05023+(0. 96399-0. 05023) Λ?+(χ/0· 046Γ1. 8303) (R2= 0· 99118)。
[0101] 8、由所建立的标准曲线，定义BziBtl数值为0. 5时对应的大黄酸标准品浓度为检测 灵敏度（即〇. 〇4ng/mL)，定义BziBtl数值分别为0. 2和0. 8时所对应的大黄酸标准品浓度范 围为该检测方法的线性检测范围（即0. 02~0. llng/mL)。
[0102] 实施例4、检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用
[0103] 一、试剂盒的制备
[0104] 本发明的检测大黄酸的酶联免疫试剂盒由大黄酸-OVA溶液（包被原）、抗大黄酸 的单克隆抗体、羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP、包被缓冲液、洗涤液、标准品溶液、底物缓冲液和 终止缓冲液和封闭液组成。其中，大黄酸-OVA溶液为实施例1中的步骤一制备得到的；抗 大黄酸的单克隆抗体为实施例1的步骤五中的2制备得到的。
[0105] 二、抗大黄酸的单克隆抗体在检测样品中大黄酸含量上的应用
[0106] 使用步骤一所述的试剂盒分别对待测样品：掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、土 大黄、华北大黄（来源于中国食品药品检定研宄院）中的大黄酸含量进行检测，具体步骤如 下：
[0107] 1、将待测样品粉碎，经甲醇超声提取，得到提取液；向提取液中加适量样品稀释 液，得到待测样品溶液。
[0108] 2、包被：取96孔酶标板，采用大黄酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；大黄酸-OVA 溶液的浓度为62. 5ng/mL ;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0109] 3、加标准品溶液和样品溶液：每孔加入50 μ L大黄酸标准品溶液和待测样品 溶液，大黄酸标准品溶液浓度依次为：〇· 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL、0. 0625ng/mL、 0.031251^/11^、0.015625叩/11^、0.00781251^/11^和0.003906251^/11^ ;对照孔为5(^1^的样 品稀释液。
[0110] 4、加抗体：每孔加入50 μ L实施例1的步骤五中的2得到的抗大黄酸的单克隆抗 体的稀释液（用样品稀释液稀释成500ng/mL);置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0111] 5、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(0. lmg/mL，购自Jackson公司，商品 目录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0112] 6、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 yL 30% H2O2，将底 物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0113] 7、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0114] 8、绘制标准曲线：以不同浓度的大黄酸标准品溶液为横坐标，B/BJB表示含有大 黄酸时的OD值，B tl表示对照孔时的OD值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件绘制标准曲 线。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图2所示。标准曲线方 程为 y = 〇· 05023+(0. 96399-0. 05023) Λ?+(χ/0· 046Γ1. 8303) (R2= 0· 99118)。
[0115] 9、将待测样品的B/^代入标准曲线中，根据标准曲线方程计算得到待测样品中大 黄酸的含量。
[0116] 掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、土大黄、华北大黄中的大黄酸含量的检测结果 如表3所示。其中，掌叶大黄中大黄酸的含量为0. 653±0. 071mg/g ;唐古特大黄中大黄酸 的含量为3. 587±0. 065mg/g ;药用大黄中大黄酸的含量为I. 200±0. 054mg/g ;土大黄中大 黄酸的含量为〇. 708±0. 009mg/g ;华北大黄中的大黄酸含量为0. 042±0. 005mg/g。
[0117] 表3、大黄样品中大黄酸含量检测结果
[0118]
【主权项】
1. 抗大黄酸的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo. 10582的杂交瘤细胞株产生的。2. -株分泌抗大黄酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株RH1F8,其保藏号为CGMCC No.10582。3. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测 或辅助检测待测样品中大黄酸含量的试剂或试剂盒中的应用。4. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株RH1F8在检测或辅 助检测待测样品中大黄酸含量中的应用。5. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株RH1F8在制备检测 或辅助检测待测样品中大黄酸含量的胶体金试纸条中的应用。6. -种检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量的酶联免疫试剂盒，包括独立包装的权 利要求1所述的单克隆抗体。7. 根据权利要求6所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述样品为大黄；所述大黄具 体为掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、土大黄或华北大黄。8. 权利要求6或7所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中大黄酸含量中 的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述样品为大黄；所述大黄具体为掌叶大 黄、唐古特大黄、药用大黄、土大黄或华北大黄。
【专利摘要】本发明公开了一种检测大黄酸的酶联免疫试剂盒及其应用。本发明的试剂盒所使用的抗大黄酸的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株RH1F8分泌产生的。通过实验证明：本发明所提供抗大黄酸的单克隆抗体特异性强，与芦荟大黄素的交叉反应率为27.039％；与大黄素的交叉反应率为0.887％；与大黄酚的交叉反应率为0.114％；与大黄素甲醚的交叉反应率为0.310％；与番泻苷A的交叉反应率为0.005％；与番泻苷B和土大黄苷无交叉反应。利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测样品中大黄酸，线性检测范围在0.02～0.11ng/mL，具有快速、灵敏的优点。CGMCC No.1058220150415
【IPC分类】C12N5/20, G01N33/577, C07K16/16
【公开号】CN104892757
【申请号】CN201510246118
【发明人】黄璐琦, 张波, 南铁贵, 袁媛, 詹志来, 康利平
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
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