利用gst表达体系制备aqp7胞外段抗体及应用
利用gst表达体系制备aqp7胞外段抗体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制 备GST-AQP7融合蛋白的多克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] AQP7蛋白（定义为人类9号染色体上)有选择性的表达于睾丸精子细胞、肾近端小 管直部、树突状细胞及骨骼肌细胞中。功能性研究证明AQP7能够通透水、甘油和尿素。
[0003] 随着研究的深入我们对于AQP7蛋白功能及作用机制产生了更多的思考，如它在 睾丸生精过程中的作用机制，它在是否精子成熟过程有促进作用等等。而研究一种新的蛋 白质的功能，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组 织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因 此我们制备的AQP7蛋白高效价抗体对于系统研究AQP7蛋白作用机制意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立一种能够用于AQP7蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入 研究AQP7蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。
[0005] 利用基因工程技术，将AQP7蛋白胞外段218-255位氨基酸对应DNA片段克隆到原 核表达载体PGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导产生GST-AQP7融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫 新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异 性米用ELISA和Westernblot检测。
[0006] 本发明的GST-AQP7融合蛋白是将利用特殊序列（AQP7蛋白胞外段218-255位氨 基酸对应DNA片段）构建GST-AQP7融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特 异性的GST-AQP7融合蛋白，这段218-255位氨基酸序列为：
[0007]
[0008] 这种GST-AQP7融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：
[0009] 第一步，克隆载体的构建
[0010] 从人AQP7基因全长上应用PCR技术以基因组为模板，扩增得到的目的片段与 PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。
[0011] 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建
[0012] 将克隆质粒和质粒PGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片 段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进 一步确定。
[0013] 第三步，GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化
[0014] 重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-AQP7融合蛋 白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细 菌，所获蛋白用Glutathione_Sepharose4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。
[0015] 第四步，兔抗AQP7抗血清的制备及纯化
[0016] 以纯化的AQP7融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500 μ g融合蛋白， 与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血 清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的GST-AQP7融合蛋 白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于 末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1 : 100000时， 颈动脉放血，收集血清。用ProteinA/G纯化抗AQP7血清，准备蛋白AsepharoseCL-4B亲 和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE 鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果 显示该抗体可特异性的与AQP7蛋白结合。
[0017] 利用AQP7蛋白胞外段218-255位氨基酸基因序列成功地构建GST-AQP7融合蛋白 原核表达载体，转化BL21后可高效表达特异性的GST-AQP7融合蛋白。以该融合蛋白免疫 兔子获得抗GST-AQP7融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性， 结果表明抗体效价高达1:1000000且特异性良好。抗体可应用于精子中AQP7蛋白的检测， 对于系统研究AQP7蛋白在精子发生、精子成熟等过程中的作用机制意义重大。另外，AQP7 蛋白为精子表面特异性蛋白，我们制备的AQP7抗体为精子分离研究提供了条件。
【附图说明】：
[0018] 图I :PCR扩增出的AQP7基因218-255位氨基酸片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；
[0019] 图2 :双酶切质粒pGEX-4T-l ;
[0020] 图3 :pGEX-4T-l/AQP7重组体酶切鉴定结果；
[0021] 图4 :纯化后的GST及GST-AQP7融合蛋白SDS-PAGE图；
[0022] 图5 :ProteinA/G纯化后AQP7抗体和纯化前抗AQP7血清SDS-PAGE图；
[0023] 图6 :间接ELISA法测定抗体的效价；
[0024] 图7 :抗血清特异性的Westernblot分析；
[0025] 图8 :AQP7蛋白在LNCaP细胞中定位分析；
【具体实施方式】：
[0026] 实施例1:抗GST-AQP7血清的在制备
[0027] I. PCR-PMD18-T/AQP7 重组质粒的构建
[0028] AQP7基因全长从Genebank得到，基因序列号为GenBank :BAC05693。以基因 组为模板，上游引物为5 ' -GAATTCGGCATGAACACAGGATAT (含EcoRI酶切位点）；下游： 5'-CTCGAGCCACCACCAGTTCTCCCC (含XhoI酶切位点）。应用PCR成功扩增出了 AQP7基因胞 外段218-255位氨基酸对应DNA序列长度114bp【图1】。扩增得到的片段与PMD18-T载体 连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5a中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂 解法小提重组质粒后，以EcoRI和Sail单酶切鉴定。
[0029] 2.原核表达载体pGEX-4T-l的构建
[0030] 将含有AQP7基因胞外段218-255位氨基酸片段的pMD18-T质粒经EcoRI和XholI 双酶切后(片段约〇. Ikbp)，利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片段，同时用相同的酶处理 质粒PGEX-4T-1 (约5kbp)【图2】。然后将回收的AQP7基因胞外段218-255位氨基酸片段 和经酶切的载体PGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜。酶切鉴定重组体，结 果显示该AQP7基因胞外段218-255位氨基酸片段正确【图3】。
[0031] 3. GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化
[0032] 重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基 中，37°C振摇培养过夜。次日，将培养物按1 : 50的比例转接于含Amp+的LB培养基中， 继续在37°C摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0. 5~0. 6时，加入IPTG至终 浓度为〇. 〇8mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25°C继续培养4~5h。离心收集菌体， 以SDS-PAGE进行鉴定GST-AQP7融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。 以5000r/min于4°C离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮IL菌液的沉淀。用 超声裂解细菌，再以9600rpm,于4°C离心15min,取上清，过Glutathione_Sepharose4B 柱，先以等体积洗脱缓冲液1 (含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl，pH=8. 0)洗脱，收集洗脱液， 再以等体积洗脱缓冲液2 (含IOOmM谷胱甘肽）洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化 产物【图4】。
[0033] 4.兔抗AQP7抗血清的制备
[0034] 以纯化的GST-AQP7融合蛋白免疫 雄性新西兰大白兔，初次免疫用500 μ g融合蛋 白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离 血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的GST-AQP7融合 蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。 于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1 : 100000时， 颈动脉放血，收集血清。
[0035] 5. ProteinA/G 纯化抗 AQP7 血清
[0036] 将ProteinA/GsepharoseCL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血 清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后， 加 pH2. 7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体 的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色 结果显示纯化效果明显，纯化后的样品有清晰的轻、重链带【图5】。
[0037] 实施例2: GST-AQP7抗体的分析及应用
[0038] 1.GST-AQP7抗体效价的测定
[0039] 用GST-AQP7融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的 GST-AQP7抗体先稀释10倍再倍比稀释后，用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示，免 疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-AQP7的抗体，GST-AQP7抗体的滴度高达1 : 100000 以上【图6】。
[0040] 2. GST-AQP7抗体应用于细胞中AQP7蛋白的检测
[0041] 收集小鼠睾丸组织蛋白样，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定 量，之后将样品按5ul、IOul浓度梯度进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上。以5%脱 脂奶粉封闭lh，依次滴加兔抗AQP7抗体（室温2h、PBS洗3次）及山羊抗兔IgG2HRP (室 温反应IKPBS洗涤3次），最后加底物DAB显色，并拍照。结果显示【图7】，在小鼠睾丸 组织样中检测出37KD的AQP7和糖基化修饰的AQP7的特意带，并且表达强弱存在浓度梯度 依赖，说明AQP7抗体具有较好的特异性。
[0042] 3. AQP7蛋白在LNcap细胞系中定位分析
[0043] 将LNcap细胞培养于十二孔板，待细胞密度约50%去除培养基（PBS洗1次)，4%多 聚甲醛固定（室温2h、PBS洗3次)，此次兔抗抗AQP7抗体（室温2h、PBS洗3次），及避光 处理异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG(室温反应lh、PBS洗涤3次）和DIPA (室温lmin、 PBS洗3次)，荧光显微镜观察，并拍照。结果显示【图8】，AQP7特异表达在细胞膜上。
【主权项】
1. 利用GST表达体系制备的AQP7蛋白胞外段高效价抗体，其特征在于利用GST表 达体系以（AQP7蛋白218-255位氨基酸对应对应DNA片段作为特异序列制备的GST-AQP7 融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-AQP7抗体的滴度高达 1 : 1000000,并经过Westernblot鉴定该AQP7抗体具有较好的特异性，其中，218-255位氨 基酸序列为：其对应核苷酸序列为：2. 如权利要求1所述的原核表达GST-AQP7融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征 在于利用GST表达系统获得GST-AQP7融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-AQP7抗血清，具体 包括五步： 第一步，PCR-PMD18-T/AQP7重组质粒的构建，AQP7基因全长从Genebank得到，基因序 列号为BAC05693,以基因组为模板，上游引物为5'-GAATTCGGCATGAACACAGGATAT (含EcoRI 酶切位点）；下游：5' -CTCGAGCCACCACCAGTTCTCCCC(含XhoI酶切位点），扩增得到的片段 与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α中，在含Amp+琼脂平板上挑 选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI和Sail分别单酶切鉴定； 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建，将含有AQP7基因 218-255位氨基酸片段的 PMD18-T质粒经EcoRI和XholI双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片段，同时用 相同的酶处理质粒PGEX-4T-1，然后将回收的AQP7基因胞外段218-255氨基酸片段和经酶 切的载体PGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进 一步确定； 第三步，GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化，重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆 菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr\培养基中，37°C振摇培养过夜，次日，将培养物按1 : 50 的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37°C摇床培养至对数生长中期，在培养液的 A600为0. 5~0. 6时，加入IPTG至终浓度0. 08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25°C 继续培养4~5h，离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-AQP7融合蛋白的表达，并优 化表达条件，进行大量扩增诱导，以5000r/min于4°C离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷 的NETN悬浮IL菌液的沉淀，用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4°C离心15min，取上清，过 Glutathione-Sepharose4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1，含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl， pH=8. 0,洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2,含IOOmM谷胱甘肽，洗两遍，收集洗脱 液，SDS-PAGE鉴定纯化产物； 第四步，兔抗AQP7抗血清的制备及纯化 以纯化的AQP7融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μ g融合蛋白，与等 体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作 为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的AQP7融合蛋白与不完全 弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后 lwk\取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1 : 1000000时，颈动脉放血， 收集血清，将ProteinA/GsepharoseCL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血 清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后， 加 pH2. 7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体 的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定； 第五步，AQP7抗体的免疫学检测 用GST-AQP7融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的GST-AQP7抗 体先稀释10倍再倍比稀释后，采用间接ELISA方法测定抗体的效价，并采用Westernblot 方法分析AQP7抗体特异性，将纯化的融合蛋白GST-AQP7样品，经SDS-PAGE分离后再电转 移至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉封闭lh，依次滴加兔抗AQP7抗体，室温2h、PBS洗3 次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应lh、PBS洗涤3次，最后加底物DAB显色，并拍照。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的AQP7胞外段高效价抗体及应用。利用基因工程技术，将AQP7基因胞外段克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后,用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-AQP7融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。该抗AQP7多克隆抗体效价与特异性良好,可以应用于细胞中AQP7蛋白的检测并能有效检出AQP7蛋白在不同细胞中的差异表达，对于系统研究AQP7蛋白功能意义重大。
【IPC分类】C12N15/70, C07K16/18, C07K16/06, C07K19/00
【公开号】CN104892758
【申请号】CN201410079643
【发明人】李晓萌, 赵兵, 杨百全, 徐洪香, 李江
【申请人】东北师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制 备GST-AQP7融合蛋白的多克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] AQP7蛋白（定义为人类9号染色体上)有选择性的表达于睾丸精子细胞、肾近端小 管直部、树突状细胞及骨骼肌细胞中。功能性研究证明AQP7能够通透水、甘油和尿素。
[0003] 随着研究的深入我们对于AQP7蛋白功能及作用机制产生了更多的思考，如它在 睾丸生精过程中的作用机制，它在是否精子成熟过程有促进作用等等。而研究一种新的蛋 白质的功能，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组 织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因 此我们制备的AQP7蛋白高效价抗体对于系统研究AQP7蛋白作用机制意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立一种能够用于AQP7蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入 研究AQP7蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。
[0005] 利用基因工程技术，将AQP7蛋白胞外段218-255位氨基酸对应DNA片段克隆到原 核表达载体PGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导产生GST-AQP7融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫 新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异 性米用ELISA和Westernblot检测。
[0006] 本发明的GST-AQP7融合蛋白是将利用特殊序列（AQP7蛋白胞外段218-255位氨 基酸对应DNA片段）构建GST-AQP7融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特 异性的GST-AQP7融合蛋白，这段218-255位氨基酸序列为：
[0007]
[0008] 这种GST-AQP7融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：
[0009] 第一步，克隆载体的构建
[0010] 从人AQP7基因全长上应用PCR技术以基因组为模板，扩增得到的目的片段与 PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。
[0011] 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建
[0012] 将克隆质粒和质粒PGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片 段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进 一步确定。
[0013] 第三步，GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化
[0014] 重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-AQP7融合蛋 白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细 菌，所获蛋白用Glutathione_Sepharose4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。
[0015] 第四步，兔抗AQP7抗血清的制备及纯化
[0016] 以纯化的AQP7融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500 μ g融合蛋白， 与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血 清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的GST-AQP7融合蛋 白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于 末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1 : 100000时， 颈动脉放血，收集血清。用ProteinA/G纯化抗AQP7血清，准备蛋白AsepharoseCL-4B亲 和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE 鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果 显示该抗体可特异性的与AQP7蛋白结合。
[0017] 利用AQP7蛋白胞外段218-255位氨基酸基因序列成功地构建GST-AQP7融合蛋白 原核表达载体，转化BL21后可高效表达特异性的GST-AQP7融合蛋白。以该融合蛋白免疫 兔子获得抗GST-AQP7融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性， 结果表明抗体效价高达1:1000000且特异性良好。抗体可应用于精子中AQP7蛋白的检测， 对于系统研究AQP7蛋白在精子发生、精子成熟等过程中的作用机制意义重大。另外，AQP7 蛋白为精子表面特异性蛋白，我们制备的AQP7抗体为精子分离研究提供了条件。
【附图说明】：
[0018] 图I :PCR扩增出的AQP7基因218-255位氨基酸片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；
[0019] 图2 :双酶切质粒pGEX-4T-l ;
[0020] 图3 :pGEX-4T-l/AQP7重组体酶切鉴定结果；
[0021] 图4 :纯化后的GST及GST-AQP7融合蛋白SDS-PAGE图；
[0022] 图5 :ProteinA/G纯化后AQP7抗体和纯化前抗AQP7血清SDS-PAGE图；
[0023] 图6 :间接ELISA法测定抗体的效价；
[0024] 图7 :抗血清特异性的Westernblot分析；
[0025] 图8 :AQP7蛋白在LNCaP细胞中定位分析；
【具体实施方式】：
[0026] 实施例1:抗GST-AQP7血清的在制备
[0027] I. PCR-PMD18-T/AQP7 重组质粒的构建
[0028] AQP7基因全长从Genebank得到，基因序列号为GenBank :BAC05693。以基因 组为模板，上游引物为5 ' -GAATTCGGCATGAACACAGGATAT (含EcoRI酶切位点）；下游： 5'-CTCGAGCCACCACCAGTTCTCCCC (含XhoI酶切位点）。应用PCR成功扩增出了 AQP7基因胞 外段218-255位氨基酸对应DNA序列长度114bp【图1】。扩增得到的片段与PMD18-T载体 连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5a中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂 解法小提重组质粒后，以EcoRI和Sail单酶切鉴定。
[0029] 2.原核表达载体pGEX-4T-l的构建
[0030] 将含有AQP7基因胞外段218-255位氨基酸片段的pMD18-T质粒经EcoRI和XholI 双酶切后(片段约〇. Ikbp)，利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片段，同时用相同的酶处理 质粒PGEX-4T-1 (约5kbp)【图2】。然后将回收的AQP7基因胞外段218-255位氨基酸片段 和经酶切的载体PGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜。酶切鉴定重组体，结 果显示该AQP7基因胞外段218-255位氨基酸片段正确【图3】。
[0031] 3. GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化
[0032] 重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基 中，37°C振摇培养过夜。次日，将培养物按1 : 50的比例转接于含Amp+的LB培养基中， 继续在37°C摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0. 5~0. 6时，加入IPTG至终 浓度为〇. 〇8mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25°C继续培养4~5h。离心收集菌体， 以SDS-PAGE进行鉴定GST-AQP7融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。 以5000r/min于4°C离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮IL菌液的沉淀。用 超声裂解细菌，再以9600rpm,于4°C离心15min,取上清，过Glutathione_Sepharose4B 柱，先以等体积洗脱缓冲液1 (含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl，pH=8. 0)洗脱，收集洗脱液， 再以等体积洗脱缓冲液2 (含IOOmM谷胱甘肽）洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化 产物【图4】。
[0033] 4.兔抗AQP7抗血清的制备
[0034] 以纯化的GST-AQP7融合蛋白免疫 雄性新西兰大白兔，初次免疫用500 μ g融合蛋 白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离 血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的GST-AQP7融合 蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。 于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1 : 100000时， 颈动脉放血，收集血清。
[0035] 5. ProteinA/G 纯化抗 AQP7 血清
[0036] 将ProteinA/GsepharoseCL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血 清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后， 加 pH2. 7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体 的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色 结果显示纯化效果明显，纯化后的样品有清晰的轻、重链带【图5】。
[0037] 实施例2: GST-AQP7抗体的分析及应用
[0038] 1.GST-AQP7抗体效价的测定
[0039] 用GST-AQP7融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的 GST-AQP7抗体先稀释10倍再倍比稀释后，用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示，免 疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-AQP7的抗体，GST-AQP7抗体的滴度高达1 : 100000 以上【图6】。
[0040] 2. GST-AQP7抗体应用于细胞中AQP7蛋白的检测
[0041] 收集小鼠睾丸组织蛋白样，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定 量，之后将样品按5ul、IOul浓度梯度进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上。以5%脱 脂奶粉封闭lh，依次滴加兔抗AQP7抗体（室温2h、PBS洗3次）及山羊抗兔IgG2HRP (室 温反应IKPBS洗涤3次），最后加底物DAB显色，并拍照。结果显示【图7】，在小鼠睾丸 组织样中检测出37KD的AQP7和糖基化修饰的AQP7的特意带，并且表达强弱存在浓度梯度 依赖，说明AQP7抗体具有较好的特异性。
[0042] 3. AQP7蛋白在LNcap细胞系中定位分析
[0043] 将LNcap细胞培养于十二孔板，待细胞密度约50%去除培养基（PBS洗1次)，4%多 聚甲醛固定（室温2h、PBS洗3次)，此次兔抗抗AQP7抗体（室温2h、PBS洗3次），及避光 处理异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG(室温反应lh、PBS洗涤3次）和DIPA (室温lmin、 PBS洗3次)，荧光显微镜观察，并拍照。结果显示【图8】，AQP7特异表达在细胞膜上。
【主权项】
1. 利用GST表达体系制备的AQP7蛋白胞外段高效价抗体，其特征在于利用GST表 达体系以（AQP7蛋白218-255位氨基酸对应对应DNA片段作为特异序列制备的GST-AQP7 融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-AQP7抗体的滴度高达 1 : 1000000,并经过Westernblot鉴定该AQP7抗体具有较好的特异性，其中，218-255位氨 基酸序列为：其对应核苷酸序列为：2. 如权利要求1所述的原核表达GST-AQP7融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征 在于利用GST表达系统获得GST-AQP7融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-AQP7抗血清，具体 包括五步： 第一步，PCR-PMD18-T/AQP7重组质粒的构建，AQP7基因全长从Genebank得到，基因序 列号为BAC05693,以基因组为模板，上游引物为5'-GAATTCGGCATGAACACAGGATAT (含EcoRI 酶切位点）；下游：5' -CTCGAGCCACCACCAGTTCTCCCC(含XhoI酶切位点），扩增得到的片段 与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α中，在含Amp+琼脂平板上挑 选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI和Sail分别单酶切鉴定； 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建，将含有AQP7基因 218-255位氨基酸片段的 PMD18-T质粒经EcoRI和XholI双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片段，同时用 相同的酶处理质粒PGEX-4T-1，然后将回收的AQP7基因胞外段218-255氨基酸片段和经酶 切的载体PGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进 一步确定； 第三步，GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化，重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆 菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr\培养基中，37°C振摇培养过夜，次日，将培养物按1 : 50 的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37°C摇床培养至对数生长中期，在培养液的 A600为0. 5~0. 6时，加入IPTG至终浓度0. 08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25°C 继续培养4~5h，离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-AQP7融合蛋白的表达，并优 化表达条件，进行大量扩增诱导，以5000r/min于4°C离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷 的NETN悬浮IL菌液的沉淀，用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4°C离心15min，取上清，过 Glutathione-Sepharose4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1，含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl， pH=8. 0,洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2,含IOOmM谷胱甘肽，洗两遍，收集洗脱 液，SDS-PAGE鉴定纯化产物； 第四步，兔抗AQP7抗血清的制备及纯化 以纯化的AQP7融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μ g融合蛋白，与等 体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作 为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的AQP7融合蛋白与不完全 弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后 lwk\取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1 : 1000000时，颈动脉放血， 收集血清，将ProteinA/GsepharoseCL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血 清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后， 加 pH2. 7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体 的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定； 第五步，AQP7抗体的免疫学检测 用GST-AQP7融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的GST-AQP7抗 体先稀释10倍再倍比稀释后，采用间接ELISA方法测定抗体的效价，并采用Westernblot 方法分析AQP7抗体特异性，将纯化的融合蛋白GST-AQP7样品，经SDS-PAGE分离后再电转 移至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉封闭lh，依次滴加兔抗AQP7抗体，室温2h、PBS洗3 次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应lh、PBS洗涤3次，最后加底物DAB显色，并拍照。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的AQP7胞外段高效价抗体及应用。利用基因工程技术，将AQP7基因胞外段克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后,用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-AQP7融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。该抗AQP7多克隆抗体效价与特异性良好,可以应用于细胞中AQP7蛋白的检测并能有效检出AQP7蛋白在不同细胞中的差异表达，对于系统研究AQP7蛋白功能意义重大。
【IPC分类】C12N15/70, C07K16/18, C07K16/06, C07K19/00
【公开号】CN104892758
【申请号】CN201410079643
【发明人】李晓萌, 赵兵, 杨百全, 徐洪香, 李江
【申请人】东北师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
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