由杂交瘤细胞系分泌的抗Ki67单克隆抗体及其应用
由杂交瘤细胞系分泌的抗Ki67单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂 交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞核内Ki67分子的单克隆抗体，对该 抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用 于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC)、酶联免疫吸附（ELISA)或免疫印迹 (Western Blot)方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法 中，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002] Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中 是不可缺少，但其确切机制尚不清楚，Ki67作为标记细胞增殖状态的抗原，阳性说明癌细胞 增殖活跃。
[0003] 作为一种存在于增殖细胞中的核抗原，Ki67的确切功能目前尚不清楚，但通过研 宄它的表达及在核内分布的情况，认为它的功能与染色质相连与细胞有丝分裂有关，因此 是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一。Gerdes等研宄表明Ki67免疫的反应与细胞周期 密切相关，在Gl、S、G2、M期均表达，但GO期无表达，而且还发现Ki67在Gl晚期/S早期微 量表达，S期聚集，尤其在后半期表达率明显增高，有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定 簇，故认为Ki67是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。目前有研宄表明在多种实体 恶性肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发展，转移及预后有关。国外有 报道Ki67在乳腺癌组织中阳性率为78. 0%。有报道Ki67的表达与乳腺癌肿瘤的生长和 浸润以及淋巴结转移之间存在着密切相关性，即Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性 程度大，细胞增殖活跃，因此肿瘤生长速度快，侵袭性大，转移的机会高，预后差。但其机制 目前尚不清楚。关于乳腺癌组织中Ki67表达对于乳腺癌的预后判断以及指导治疗价值有 待进一步研宄，但近来有文献报道Ki67可作为乳腺癌化疗敏感性指标，肿瘤细胞增殖率降 低，比肿瘤的肿块缩小更能反映肿瘤对化疗敏感程度，而且还有研宄表明Ki67的表达比T 分期能更好预测肿瘤的放射敏感性。应用免疫组化技术检测乳腺癌组织中多项生物指标简 单、易行，为乳腺癌患者的临床评估提供参考，并有助于临床个体化治疗。Ki67与PCNA这类 增殖标记及c-erbB-2、p53等一同被列为仅次于激素受体、组织学级别的乳腺癌第二类预 后指标，由于Ki67在GO期以外各增殖周期均有表达，更具可用性。两者具有一定的互补 性。Ki-67在低分化腺癌组织中的表达较在中高分化腺癌组织的表达明显升高，表明Ki67 染色阳性程度与组织学分级的相关性。表明Ki67表达与乳腺癌发生、发展有关，是一个不 良预后因素，对乳腺癌的诊断治疗及预后评价有重要的参考价值。与Ki67不同的是，PCNA 的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记，也成为肿瘤细胞失调状态下的一个标记， 检测PCNA可以评价肿瘤细胞增殖状态，也有研宄显示PCNA与某些肿瘤的预后及诊断有一 定关系。在乳腺癌的预后研宄中，PCNA在肿瘤的良恶性的区分、恶性程度的确定及评估预 后等方面有较广泛的应用。
[0004] Ki67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研宄中的热门生物指标，可以通过对 抗原的检测，了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。公开号为CN 101896819 A的发明专利"对癌 症的诊断测试、预测测试和预后测试"的发明专利描述了一种利用孪蛋白、Aurora A、Plkl、 Ki67和H3S10ph几种蛋白标志物，采用点印迹分析、狭线印迹分析、RIA、肽微阵列和ELISA 方法进行肿瘤预后评估的方法。申请号为CN201110088864的发明专利"蛋白组合物及其在 制备肺癌诊断试剂盒中的应用"则公开了一种利用p53、p63、Ki67、MCM7及EGFR五种蛋白 的组合物配体，如单克隆抗体对肺癌进行诊断的方法。
[0005] 目前在肿瘤诊断中使用最多的Ki67抗体为克隆号MIBl的单克隆抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供由杂交瘤细胞系分泌抗Ki67单克隆抗体及其应用。提供 一种设计和制备Ki67抗原肽的方法，该抗原由Ki67分子中具有特征性序列的多肽经化学 合成后与载体蛋白偶联制备而来。本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的 Ki67单克隆抗体的制备方法，该抗体能特异结合Ki67重组抗原和天然抗原。本发明的第三 个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。
[0007] 所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8,已于2015年2月5日在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路一 号院3号，保藏号为CGMCC No. 10402。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明对在乳腺癌和其他恶性肿瘤中细胞核表达的Ki67分子，按照公布的序列进行 分析，依据其内在重复序列的氨基酸组成、抗原性以及序列的亲疏水性、二级结构以及序列 的特异性等特征选择适宜合成又具有良好免疫原性的第1213-1232位肽段用于化学合成， 为提高其免疫原性，在N端增加一个Cys用于和载体蛋白偶联作为免疫原，免疫Balb/c小 鼠。经细胞融合、重组Ki67筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
[0009] 利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获 得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgGl亚型的单克隆抗体，亲和 常数为7. 68 X 109。免疫印记（Western blotting)实验显示该抗体能特异识别重组的Ki67 蛋白。
[0010] 具体地，本发明涉及以下几个方面： 一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。
[0011] 所述抗体特异识别由SEQ ID No. 1所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0012] 所述的单克隆抗体，其免疫原为按照SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列经化学合成 多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白（（keyhole limpet hemocyanin， KLH)的自由疏基偶联而成的蛋白质。
[0013] 单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8,已于2015 年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.10402。
[0014] 其分泌抗体的重链和轻链可变区序列，重链可变区由SEQ ID No. 4所示的DNA序 列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 5,轻链可变区由SEQ ID No. 6所示的 DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 7。
[0015] 所述的单克隆抗体，其可识别重组蛋白和肿瘤细胞的Ki67分子。
[0016] 单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及 正常组织细胞Ki67蛋白的表达情况。可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、月中 瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法。
[0017] 所述的单克隆抗体，在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。
[0018] 本发明的优点及有益效果 (1)本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8)分泌产生的单克隆抗体，能识别重 组蛋白Ki67和表达Ki67的淋巴细胞，能够检测高表达Ki67蛋白的乳腺癌等多种肿瘤组 织。
[0019] (2)本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8)所分泌的单克隆抗体为一种 IgGl类抗体，与Ki67蛋白的结合有极强特异性和敏感性。
[0020] (3 )本发明获得的杂交瘤细胞系（73043-24E8 )所分泌的的单克隆抗体可应用于免 疫组织化学（IHC)、免疫印记（Western blotting)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛 查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化抗体MIBl的对比实验中，本发明细胞 株制备的抗体在乳腺癌的诊断中特异性同对照抗体相当，敏感度优于已有的抗体。因此，本 发明的Ki67单克隆抗体具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。
【附图说明】
[0021] 图I :73043-24E8抗体的识别特性和实际应用效果 应用纯化的73043-24E8单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出Ki67重组蛋 白，重组GST-Ki67片段融合的重组蛋白上样10微升，HRP酶标羊抗鼠按照1:5000稀释，目 标蛋白为38kDa左右。
[0022] 图2 :Ki67单克隆抗体73043-24E8的免疫组织化学检测结果 应用纯化的Ki67抗体同商品化抗体MIB-I在组织芯片上进行免疫组织化学检测，左为 对照抗体MIB1，右为纯化抗体73043-24E8。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合图表和【具体实施方式】对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以 更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
[0024] 实施例1多肽合成和重组抗原制备 一、抗原多肽选择 依据Uniprot及Genbank中登录号为P46013和GI: 118572663的蛋白质序列进行序列 和二级结构分析，全长为3256个氨基酸长度的Ki67蛋白由N端的FHA结构域（Forkhead associated domain，FHA)以及多个长度为11 0个氨基酸左右的重复序列构成，其分子量约 为 359kDa 左右，依据通过在线服务器 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetSurfP/ 预测 的蛋白的二级结构（secondary structure)和表面可及性（Surface Accessibility)参数， 并通过对其抗原性指数（Jameson BA, Wolf H. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci. 1988,4 (I):181-6.)的 分析结果，选择此重复序列靠近C末端的氨基酸序列TPKEKAQALEDLAGFKELFQ作为抗原进行 化学合成(南京金斯瑞生物科技有限公司），为便于偶联，在该多肽的氨基端添加了一个半 胱氨酸用于提供巯基偶联。
[0025] 二、多肽的偶联及纯化 选择Thermo Scientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按 照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂（Thermo Scientific， 货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100 μ L Ellman试剂储备液，再加 入10 μ L多肽溶液，用Nano Drop分光光度计在λ =412 nm下测其紫外吸收值，如果OD值 >0. 15做下一步；OD值〈0. 15并>0. 05补加多肽，直至达到要求；OD值〈0. 05返回多肽合成 步骤重新质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200 μ L去离子水，配制成10mg/mL 的KLH溶液，在500 μ L的Imject EDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500 μ L多肽溶液 加入到200 yL的载体蛋白溶液中，将ImL去离子水加入到一个包装的EDC (IOmg)中，缓慢 振摇至完全溶解，取50 μ L加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未 偶联的交联剂和盐类。
[0026] 三.重组Ki67蛋白片段的表达和纯化 为便于对获得的抗体进行筛选和评价，选择Ki67蛋白中第1063至1157位氨基酸区 域，长度为95个氨基酸的片段与GST蛋白融合表达，此段氨基酸的编码序列由南京金斯瑞 生物科技有限公司直接合成并克隆进克隆载体质粒PUC57。该DNA片段5'端和3'端分别带 有feoRI和ZAoI酶切位点，取5 μ L(约1微克)带有Ki67片段的质粒pUC57-Ki67和用作载 体的pET30 (Merck)5yL (约1微克)分别进行双酶切，酶切体系为(TakaRa)lyL， ZAoI(TaKaRa)I μ L，5 μ L IOXbuffer Η，38 μ L ddH20,37°C酶切三小时。酶切产物经 1%琼 脂糖电泳，柱离心式DNA回收试剂盒(北京华大蛋白质研发中心有限公司）切胶回收基因和 载体片段。取2yL回收的线性化载体，3yL酶切回收的Ki67基因片段，5yL 2XEZ-lig T4DNA快连试剂(北京华大蛋白质研发中心有限公司），混匀，室温连接三十分钟。取出-80°C 保存的感受态细胞（BL21)，解冻后加入连接产物，冰上放置30 min。42°C热激90秒后冰浴 2 min后，加入800 μ L无抗性的LB培养基。37°C复苏培养20 min，涂板。从转化的平板挑 单克隆到1.5 ml LB液体培养基中，37°C，200 rpm培养，DNA测序(北京华大基因）。将测序 正确的克隆菌液进行活化，取50yL活化的菌液到5 ml LB液体培养基中，37°C，200 rpm，培 养。将培养的菌液转接到500 ml LB液体培养基混合，37°C，200 rpm，培养至0D=0. 6-0. 8， IPTG (0.5 mM)低温过夜诱导。400 ml大离心筒，6000 rpm，离心5 min收集菌体，弃上清。 沉淀用20-30 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和终浓度为0.5 M的NaCl溶液吹散，超声破 碎菌体。12000rpm离心20分钟，取离心上清上样到Ni-NTA镍柱（QIAGEN)进行纯化，之后 分别用含15 mM咪唑、60 mM咪唑、300 mM咪唑的10 mM Tris-HCl (pH 8.0)(含0.5 M氯 化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测，备用。
[0027] 实施例2杂交瘤细胞系的建立 一、免疫 将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌 性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点， 剂量为6(^g/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司，F5506)乳 化，剂量为3(^g/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA (波长450nm)检测小鼠血清中 抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量 为5〇Pg/只。
[0028] 二、细胞融合 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 (ATCC NumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37°C水浴中， 在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(R〇che公司），并搅动细胞。在温水中静置Imin后，加 入IOml无血清的IMDM (Sigma公司），混勾，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入IOml血 清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合IOxHAT (Sigma公司）的胸腺细胞， 混匀。再加入25ml含有2. 1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均 匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37°C 5%C02培养箱中培 养。
[0029] 三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞 融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先 准备好培养基的96孔培养板中，放入37 °C 5% 0)2培养箱中培养。
[0030] 3天后，细胞量大约占底面积2/3,取10〇μL上清用免疫原和合成多肽分别进行 ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入20〇μL含饲养细胞和1%HT (Sigma公司）的完全培养 基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的 24孔板培养。五天后取10〇μ1上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细 胞培养瓶扩大培养并冻存。
[0031] 实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体 一、腹水制备 对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数~5Χ 105, lml。悬浮的细胞腹腔 注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4°C离心4000 rpm， lOmin。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4°C或-20°C保存。
[0032] 二、单克隆抗体的纯化 用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE 胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20°C。
[0033] 实施例4单克隆抗体特性鉴定 一、亚类鉴定 用IOOmM PBS (pH7. 4)稀释包被羊抗鼠 IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 Kg/ml，每孔加10〇μ1，4?，过夜。倾空液体，用含0. 05% Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔 加入20〇μ1封闭液(含2%BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。 每孔加入0.1 ml杂交瘤上清，37°C孵育lh。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液I :1000 稀释HRP标记的羊抗鼠（κ，λ )抗体或I :2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgGl，IgG2a， IgG2b，IgG3, IgA)抗体（Southern Biotech公司）0· Iml每孔分别加入适当的孔中，37°C孵 育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加5〇μL含0· 15% ABTS (Southern Biotech公 司）和0. 03% H2O2的柠檬酸缓冲液（PH4. 0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下 的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgGl型鼠源单克隆抗体。
[0034] 二、亲和常数测定 包被重组Ki67蛋白，包被浓度为2Pg/ml，10〇μL7孔，4°C包被过夜，PBS-T洗3次。每 孔加20〇μ1封闭液37°C封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从I :200 开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠 二抗I :20000稀释，每孔10〇μL，37?孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入10〇μ1含0. 1% TMB (Sigma公司）和0. 03% H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色lOmin，加5〇μL 0. 5Μ硫酸溶液终 止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出 多1/2 "平台OD值"对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为7.68X 109。 r ? 150000 X A
[_雜常数Μ抗傾始浓度 四、单抗反应特异性和应用效果 选择重组的Ki67蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免 疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法 在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含 5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4°C过夜。加入单克隆抗体73043-24E8 (I :1000稀释）4°C 孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入I :5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限 公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限 公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
[0036] 实施例5抗体的可变区序列测定 取培养新鲜的杂交瘤细胞系，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株 的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集IO6以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交 瘤细胞总 RNA，取 9 yL 总 RNA，加入 2.5 yLoligo(dT)12-18primer (10mM)，及 5 yL dNTPs，混合均匀，70°C保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。 随后加入 5 yL RT buffer (5X)，2.5 yL DTT (0.1 M)及 I yL 逆转录酶，42°C 反应 1 小时。70°C孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20°C。将获得的第一链cDNA进 行PCR扩增，在50 yL反应体系中加入引物各25 pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引 物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序 列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV. Bl直至MHV.B12的11条引物 为上游引物，可分别与重链下游引物MHC. F组合用于扩增重链可变区基因。
[0037] MHV. B1:5 ' -GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3， MHV. B2:5 ' -CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3， MHV. B3:5 ' -CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3， MHV. B4:5 ' -AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3 ' MHV. B5:5 ' -GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3 ' MHV. B6:5 ' -GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3， MHV. B7:5 ' -CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3 ' MHV.B8: 5' -GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3， MHV.B9: 5' -GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3， MHV. BIO: 5' -GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3' MHV. B12: 5' -GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3， MHC. F:5' -GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3' 用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV. BI直至MKV. BlO的IO条引物为上游引物， 可分别与轻链下游引物MKC. F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。
[0038] MKV.B1: 5， -GATGTTTTGATGACCCAAACT -3， MKV.B2: 5' -GATATTGTGATGACGCAGGCT-3' MKV.B3: 5' -GATATTGTGATAACCCAG-3' MKV. B4: 5' -GACATTGTGCTGACCCAATCT-3' MKV.B5: 5' -GACATTGTGATGACCCAGTCT-3' MKV. B6: 5' -GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3' MKV. B7: 5' -GATATCCAGATGACACAGACT-3' MKV.B8: 5' -GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3' MKV. B9: 5' -CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3' MKV.B10: 5' -GACATTCTGATGACCCAGTCT-3' MKC. F: 5' -GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3' 其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1 μ L和IU热启动Taq DNA 聚合酶。设置PCR扩增程序为94°C 40秒，52 °C 40秒，72 °C 40秒，进行20至25个循环，最后 72 °C延伸3分钟，产物可置于4°C备用或直接电泳。取20 μ L PCR产物进行电泳分析，在1. 5% 琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之 间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。
[0039] 实施例6.组织芯片染色和鉴定 一.芯片制备过程 对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空 白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在66~68 °C )倒入模具，冷却至 室温后将模具放入-20 °C冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1.5mm 直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3~4 _，用另一直径I. 5mm的打孔针在蜡块的标记 部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1 mm左右。将采集到的组织芯直接插 入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后 用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡 块制作模具，放入70 °C烤箱内IOmin，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤 箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20 °C冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4 °C冰箱内保存备用。修片后进行连续 切片，厚度定为4 μ m，将连续切片漂在凉水中，让其自然展开，再将分开的切片转移到45 °C的温水中展片30秒，用经2 % APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片 放入70 °C烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4°C冰箱保存。
[0040] 二· IHC染色及分析 常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟， 最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3 X 3分钟。滴加3%H202 孵育10分钟，PBS冲洗3X 3分钟。甩去PBS，滴加封闭液(动物非免疫血清）室温孵育10 分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比 例）室温（25°C )孵育1小时，PBS冲洗3 X 3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗 3 X 3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返 蓝30秒。按照85% (3分钟）-95% (3分钟）-100% (3分钟）-100% (3分钟）的酒精梯度依 次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。
[0041] 三.数据统计 根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率(着色样本数/样本总数)，见表 Io
[0042] 表1 Ki67同Ki67 (MIB-I)在肿瘤组织中的表达差异比较
【主权项】
1. 一种单克隆抗体，其特征在于由小鼠杂交瘤细胞系分泌。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体特异识别由SEQIDNo. 1 所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列。3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其免疫原为按照SEQIDNo. 3 所示的氨基酸序列经化学合成多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白 ((keyholelimpethemocyanin，KLH)的自由疏基偶联而成的蛋白质。4. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交 瘤细胞系73043-24E8,已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心登记保藏，保藏号为CGMCCNo. 10402。5. 根据权利要求1所述的的单克隆抗体，其特征在于：其分泌抗体的重链和轻链可变 区序列，重链可变区由SEQIDNo. 4所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为 SEQIDNo. 5,轻链可变区由SEQIDNo. 6所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸 序列为SEQIDNo. 7。6. -种如权利要求1所述的单克隆抗体的应用，其特征在于：独立或与其他抗体组合 应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法上。7. -种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系，本发明选择一段Ki67蛋白质特征性的多肽抗原免疫小鼠后筛选获得了制得了一种保藏编号为10402的杂交瘤细胞系73043-24E8，该细胞可分泌针对Ki67分子的单克隆抗体，并可特异性识别Ki67蛋白及肿瘤组织，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。CGMCC No.1040220150205
【IPC分类】G01N33/68, C07K16/18, C12N5/20, G01N33/577, C12R1/91
【公开号】CN104892759
【申请号】CN201510339210
【发明人】杨清海, 陈惠玲, 周洪辉, 王小亚
【申请人】福州迈新生物技术开发有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂 交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞核内Ki67分子的单克隆抗体，对该 抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用 于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC)、酶联免疫吸附（ELISA)或免疫印迹 (Western Blot)方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法 中，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002] Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中 是不可缺少，但其确切机制尚不清楚，Ki67作为标记细胞增殖状态的抗原，阳性说明癌细胞 增殖活跃。
[0003] 作为一种存在于增殖细胞中的核抗原，Ki67的确切功能目前尚不清楚，但通过研 宄它的表达及在核内分布的情况，认为它的功能与染色质相连与细胞有丝分裂有关，因此 是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一。Gerdes等研宄表明Ki67免疫的反应与细胞周期 密切相关，在Gl、S、G2、M期均表达，但GO期无表达，而且还发现Ki67在Gl晚期/S早期微 量表达，S期聚集，尤其在后半期表达率明显增高，有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定 簇，故认为Ki67是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。目前有研宄表明在多种实体 恶性肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发展，转移及预后有关。国外有 报道Ki67在乳腺癌组织中阳性率为78. 0%。有报道Ki67的表达与乳腺癌肿瘤的生长和 浸润以及淋巴结转移之间存在着密切相关性，即Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性 程度大，细胞增殖活跃，因此肿瘤生长速度快，侵袭性大，转移的机会高，预后差。但其机制 目前尚不清楚。关于乳腺癌组织中Ki67表达对于乳腺癌的预后判断以及指导治疗价值有 待进一步研宄，但近来有文献报道Ki67可作为乳腺癌化疗敏感性指标，肿瘤细胞增殖率降 低，比肿瘤的肿块缩小更能反映肿瘤对化疗敏感程度，而且还有研宄表明Ki67的表达比T 分期能更好预测肿瘤的放射敏感性。应用免疫组化技术检测乳腺癌组织中多项生物指标简 单、易行，为乳腺癌患者的临床评估提供参考，并有助于临床个体化治疗。Ki67与PCNA这类 增殖标记及c-erbB-2、p53等一同被列为仅次于激素受体、组织学级别的乳腺癌第二类预 后指标，由于Ki67在GO期以外各增殖周期均有表达，更具可用性。两者具有一定的互补 性。Ki-67在低分化腺癌组织中的表达较在中高分化腺癌组织的表达明显升高，表明Ki67 染色阳性程度与组织学分级的相关性。表明Ki67表达与乳腺癌发生、发展有关，是一个不 良预后因素，对乳腺癌的诊断治疗及预后评价有重要的参考价值。与Ki67不同的是，PCNA 的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记，也成为肿瘤细胞失调状态下的一个标记， 检测PCNA可以评价肿瘤细胞增殖状态，也有研宄显示PCNA与某些肿瘤的预后及诊断有一 定关系。在乳腺癌的预后研宄中，PCNA在肿瘤的良恶性的区分、恶性程度的确定及评估预 后等方面有较广泛的应用。
[0004] Ki67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研宄中的热门生物指标，可以通过对 抗原的检测，了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。公开号为CN 101896819 A的发明专利"对癌 症的诊断测试、预测测试和预后测试"的发明专利描述了一种利用孪蛋白、Aurora A、Plkl、 Ki67和H3S10ph几种蛋白标志物，采用点印迹分析、狭线印迹分析、RIA、肽微阵列和ELISA 方法进行肿瘤预后评估的方法。申请号为CN201110088864的发明专利"蛋白组合物及其在 制备肺癌诊断试剂盒中的应用"则公开了一种利用p53、p63、Ki67、MCM7及EGFR五种蛋白 的组合物配体，如单克隆抗体对肺癌进行诊断的方法。
[0005] 目前在肿瘤诊断中使用最多的Ki67抗体为克隆号MIBl的单克隆抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供由杂交瘤细胞系分泌抗Ki67单克隆抗体及其应用。提供 一种设计和制备Ki67抗原肽的方法，该抗原由Ki67分子中具有特征性序列的多肽经化学 合成后与载体蛋白偶联制备而来。本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的 Ki67单克隆抗体的制备方法，该抗体能特异结合Ki67重组抗原和天然抗原。本发明的第三 个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。
[0007] 所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8,已于2015年2月5日在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路一 号院3号，保藏号为CGMCC No. 10402。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明对在乳腺癌和其他恶性肿瘤中细胞核表达的Ki67分子，按照公布的序列进行 分析，依据其内在重复序列的氨基酸组成、抗原性以及序列的亲疏水性、二级结构以及序列 的特异性等特征选择适宜合成又具有良好免疫原性的第1213-1232位肽段用于化学合成， 为提高其免疫原性，在N端增加一个Cys用于和载体蛋白偶联作为免疫原，免疫Balb/c小 鼠。经细胞融合、重组Ki67筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
[0009] 利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获 得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgGl亚型的单克隆抗体，亲和 常数为7. 68 X 109。免疫印记（Western blotting)实验显示该抗体能特异识别重组的Ki67 蛋白。
[0010] 具体地，本发明涉及以下几个方面： 一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。
[0011] 所述抗体特异识别由SEQ ID No. 1所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0012] 所述的单克隆抗体，其免疫原为按照SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列经化学合成 多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白（（keyhole limpet hemocyanin， KLH)的自由疏基偶联而成的蛋白质。
[0013] 单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8,已于2015 年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.10402。
[0014] 其分泌抗体的重链和轻链可变区序列，重链可变区由SEQ ID No. 4所示的DNA序 列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 5,轻链可变区由SEQ ID No. 6所示的 DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 7。
[0015] 所述的单克隆抗体，其可识别重组蛋白和肿瘤细胞的Ki67分子。
[0016] 单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及 正常组织细胞Ki67蛋白的表达情况。可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、月中 瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法。
[0017] 所述的单克隆抗体，在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。
[0018] 本发明的优点及有益效果 (1)本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8)分泌产生的单克隆抗体，能识别重 组蛋白Ki67和表达Ki67的淋巴细胞，能够检测高表达Ki67蛋白的乳腺癌等多种肿瘤组 织。
[0019] (2)本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8)所分泌的单克隆抗体为一种 IgGl类抗体，与Ki67蛋白的结合有极强特异性和敏感性。
[0020] (3 )本发明获得的杂交瘤细胞系（73043-24E8 )所分泌的的单克隆抗体可应用于免 疫组织化学（IHC)、免疫印记（Western blotting)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛 查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化抗体MIBl的对比实验中，本发明细胞 株制备的抗体在乳腺癌的诊断中特异性同对照抗体相当，敏感度优于已有的抗体。因此，本 发明的Ki67单克隆抗体具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。
【附图说明】
[0021] 图I :73043-24E8抗体的识别特性和实际应用效果 应用纯化的73043-24E8单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出Ki67重组蛋 白，重组GST-Ki67片段融合的重组蛋白上样10微升，HRP酶标羊抗鼠按照1:5000稀释，目 标蛋白为38kDa左右。
[0022] 图2 :Ki67单克隆抗体73043-24E8的免疫组织化学检测结果 应用纯化的Ki67抗体同商品化抗体MIB-I在组织芯片上进行免疫组织化学检测，左为 对照抗体MIB1，右为纯化抗体73043-24E8。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合图表和【具体实施方式】对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以 更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
[0024] 实施例1多肽合成和重组抗原制备 一、抗原多肽选择 依据Uniprot及Genbank中登录号为P46013和GI: 118572663的蛋白质序列进行序列 和二级结构分析，全长为3256个氨基酸长度的Ki67蛋白由N端的FHA结构域（Forkhead associated domain，FHA)以及多个长度为11 0个氨基酸左右的重复序列构成，其分子量约 为 359kDa 左右，依据通过在线服务器 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetSurfP/ 预测 的蛋白的二级结构（secondary structure)和表面可及性（Surface Accessibility)参数， 并通过对其抗原性指数（Jameson BA, Wolf H. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci. 1988,4 (I):181-6.)的 分析结果，选择此重复序列靠近C末端的氨基酸序列TPKEKAQALEDLAGFKELFQ作为抗原进行 化学合成(南京金斯瑞生物科技有限公司），为便于偶联，在该多肽的氨基端添加了一个半 胱氨酸用于提供巯基偶联。
[0025] 二、多肽的偶联及纯化 选择Thermo Scientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按 照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂（Thermo Scientific， 货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100 μ L Ellman试剂储备液，再加 入10 μ L多肽溶液，用Nano Drop分光光度计在λ =412 nm下测其紫外吸收值，如果OD值 >0. 15做下一步；OD值〈0. 15并>0. 05补加多肽，直至达到要求；OD值〈0. 05返回多肽合成 步骤重新质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200 μ L去离子水，配制成10mg/mL 的KLH溶液，在500 μ L的Imject EDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500 μ L多肽溶液 加入到200 yL的载体蛋白溶液中，将ImL去离子水加入到一个包装的EDC (IOmg)中，缓慢 振摇至完全溶解，取50 μ L加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未 偶联的交联剂和盐类。
[0026] 三.重组Ki67蛋白片段的表达和纯化 为便于对获得的抗体进行筛选和评价，选择Ki67蛋白中第1063至1157位氨基酸区 域，长度为95个氨基酸的片段与GST蛋白融合表达，此段氨基酸的编码序列由南京金斯瑞 生物科技有限公司直接合成并克隆进克隆载体质粒PUC57。该DNA片段5'端和3'端分别带 有feoRI和ZAoI酶切位点，取5 μ L(约1微克)带有Ki67片段的质粒pUC57-Ki67和用作载 体的pET30 (Merck)5yL (约1微克)分别进行双酶切，酶切体系为(TakaRa)lyL， ZAoI(TaKaRa)I μ L，5 μ L IOXbuffer Η，38 μ L ddH20,37°C酶切三小时。酶切产物经 1%琼 脂糖电泳，柱离心式DNA回收试剂盒(北京华大蛋白质研发中心有限公司）切胶回收基因和 载体片段。取2yL回收的线性化载体，3yL酶切回收的Ki67基因片段，5yL 2XEZ-lig T4DNA快连试剂(北京华大蛋白质研发中心有限公司），混匀，室温连接三十分钟。取出-80°C 保存的感受态细胞（BL21)，解冻后加入连接产物，冰上放置30 min。42°C热激90秒后冰浴 2 min后，加入800 μ L无抗性的LB培养基。37°C复苏培养20 min，涂板。从转化的平板挑 单克隆到1.5 ml LB液体培养基中，37°C，200 rpm培养，DNA测序(北京华大基因）。将测序 正确的克隆菌液进行活化，取50yL活化的菌液到5 ml LB液体培养基中，37°C，200 rpm，培 养。将培养的菌液转接到500 ml LB液体培养基混合，37°C，200 rpm，培养至0D=0. 6-0. 8， IPTG (0.5 mM)低温过夜诱导。400 ml大离心筒，6000 rpm，离心5 min收集菌体，弃上清。 沉淀用20-30 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和终浓度为0.5 M的NaCl溶液吹散，超声破 碎菌体。12000rpm离心20分钟，取离心上清上样到Ni-NTA镍柱（QIAGEN)进行纯化，之后 分别用含15 mM咪唑、60 mM咪唑、300 mM咪唑的10 mM Tris-HCl (pH 8.0)(含0.5 M氯 化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测，备用。
[0027] 实施例2杂交瘤细胞系的建立 一、免疫 将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌 性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点， 剂量为6(^g/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司，F5506)乳 化，剂量为3(^g/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA (波长450nm)检测小鼠血清中 抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量 为5〇Pg/只。
[0028] 二、细胞融合 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 (ATCC NumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37°C水浴中， 在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(R〇che公司），并搅动细胞。在温水中静置Imin后，加 入IOml无血清的IMDM (Sigma公司），混勾，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入IOml血 清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合IOxHAT (Sigma公司）的胸腺细胞， 混匀。再加入25ml含有2. 1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均 匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37°C 5%C02培养箱中培 养。
[0029] 三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞 融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先 准备好培养基的96孔培养板中，放入37 °C 5% 0)2培养箱中培养。
[0030] 3天后，细胞量大约占底面积2/3,取10〇μL上清用免疫原和合成多肽分别进行 ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入20〇μL含饲养细胞和1%HT (Sigma公司）的完全培养 基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的 24孔板培养。五天后取10〇μ1上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细 胞培养瓶扩大培养并冻存。
[0031] 实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体 一、腹水制备 对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数~5Χ 105, lml。悬浮的细胞腹腔 注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4°C离心4000 rpm， lOmin。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4°C或-20°C保存。
[0032] 二、单克隆抗体的纯化 用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE 胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20°C。
[0033] 实施例4单克隆抗体特性鉴定 一、亚类鉴定 用IOOmM PBS (pH7. 4)稀释包被羊抗鼠 IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 Kg/ml，每孔加10〇μ1，4?，过夜。倾空液体，用含0. 05% Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔 加入20〇μ1封闭液(含2%BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。 每孔加入0.1 ml杂交瘤上清，37°C孵育lh。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液I :1000 稀释HRP标记的羊抗鼠（κ，λ )抗体或I :2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgGl，IgG2a， IgG2b，IgG3, IgA)抗体（Southern Biotech公司）0· Iml每孔分别加入适当的孔中，37°C孵 育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加5〇μL含0· 15% ABTS (Southern Biotech公 司）和0. 03% H2O2的柠檬酸缓冲液（PH4. 0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下 的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgGl型鼠源单克隆抗体。
[0034] 二、亲和常数测定 包被重组Ki67蛋白，包被浓度为2Pg/ml，10〇μL7孔，4°C包被过夜，PBS-T洗3次。每 孔加20〇μ1封闭液37°C封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从I :200 开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠 二抗I :20000稀释，每孔10〇μL，37?孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入10〇μ1含0. 1% TMB (Sigma公司）和0. 03% H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色lOmin，加5〇μL 0. 5Μ硫酸溶液终 止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出 多1/2 "平台OD值"对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为7.68X 109。 r ? 150000 X A
[_雜常数Μ抗傾始浓度 四、单抗反应特异性和应用效果 选择重组的Ki67蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免 疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法 在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含 5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4°C过夜。加入单克隆抗体73043-24E8 (I :1000稀释）4°C 孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入I :5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限 公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限 公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
[0036] 实施例5抗体的可变区序列测定 取培养新鲜的杂交瘤细胞系，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株 的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集IO6以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交 瘤细胞总 RNA，取 9 yL 总 RNA，加入 2.5 yLoligo(dT)12-18primer (10mM)，及 5 yL dNTPs，混合均匀，70°C保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。 随后加入 5 yL RT buffer (5X)，2.5 yL DTT (0.1 M)及 I yL 逆转录酶，42°C 反应 1 小时。70°C孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20°C。将获得的第一链cDNA进 行PCR扩增，在50 yL反应体系中加入引物各25 pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引 物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序 列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV. Bl直至MHV.B12的11条引物 为上游引物，可分别与重链下游引物MHC. F组合用于扩增重链可变区基因。
[0037] MHV. B1:5 ' -GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3， MHV. B2:5 ' -CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3， MHV. B3:5 ' -CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3， MHV. B4:5 ' -AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3 ' MHV. B5:5 ' -GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3 ' MHV. B6:5 ' -GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3， MHV. B7:5 ' -CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3 ' MHV.B8: 5' -GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3， MHV.B9: 5' -GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3， MHV. BIO: 5' -GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3' MHV. B12: 5' -GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3， MHC. F:5' -GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3' 用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV. BI直至MKV. BlO的IO条引物为上游引物， 可分别与轻链下游引物MKC. F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。
[0038] MKV.B1: 5， -GATGTTTTGATGACCCAAACT -3， MKV.B2: 5' -GATATTGTGATGACGCAGGCT-3' MKV.B3: 5' -GATATTGTGATAACCCAG-3' MKV. B4: 5' -GACATTGTGCTGACCCAATCT-3' MKV.B5: 5' -GACATTGTGATGACCCAGTCT-3' MKV. B6: 5' -GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3' MKV. B7: 5' -GATATCCAGATGACACAGACT-3' MKV.B8: 5' -GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3' MKV. B9: 5' -CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3' MKV.B10: 5' -GACATTCTGATGACCCAGTCT-3' MKC. F: 5' -GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3' 其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1 μ L和IU热启动Taq DNA 聚合酶。设置PCR扩增程序为94°C 40秒，52 °C 40秒，72 °C 40秒，进行20至25个循环，最后 72 °C延伸3分钟，产物可置于4°C备用或直接电泳。取20 μ L PCR产物进行电泳分析，在1. 5% 琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之 间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。
[0039] 实施例6.组织芯片染色和鉴定 一.芯片制备过程 对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空 白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在66~68 °C )倒入模具，冷却至 室温后将模具放入-20 °C冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1.5mm 直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3~4 _，用另一直径I. 5mm的打孔针在蜡块的标记 部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1 mm左右。将采集到的组织芯直接插 入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后 用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡 块制作模具，放入70 °C烤箱内IOmin，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤 箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20 °C冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4 °C冰箱内保存备用。修片后进行连续 切片，厚度定为4 μ m，将连续切片漂在凉水中，让其自然展开，再将分开的切片转移到45 °C的温水中展片30秒，用经2 % APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片 放入70 °C烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4°C冰箱保存。
[0040] 二· IHC染色及分析 常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟， 最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3 X 3分钟。滴加3%H202 孵育10分钟，PBS冲洗3X 3分钟。甩去PBS，滴加封闭液(动物非免疫血清）室温孵育10 分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比 例）室温（25°C )孵育1小时，PBS冲洗3 X 3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗 3 X 3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返 蓝30秒。按照85% (3分钟）-95% (3分钟）-100% (3分钟）-100% (3分钟）的酒精梯度依 次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。
[0041] 三.数据统计 根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率(着色样本数/样本总数)，见表 Io
[0042] 表1 Ki67同Ki67 (MIB-I)在肿瘤组织中的表达差异比较
【主权项】
1. 一种单克隆抗体，其特征在于由小鼠杂交瘤细胞系分泌。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体特异识别由SEQIDNo. 1 所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列。3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其免疫原为按照SEQIDNo. 3 所示的氨基酸序列经化学合成多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白 ((keyholelimpethemocyanin，KLH)的自由疏基偶联而成的蛋白质。4. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交 瘤细胞系73043-24E8,已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心登记保藏，保藏号为CGMCCNo. 10402。5. 根据权利要求1所述的的单克隆抗体，其特征在于：其分泌抗体的重链和轻链可变 区序列，重链可变区由SEQIDNo. 4所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为 SEQIDNo. 5,轻链可变区由SEQIDNo. 6所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸 序列为SEQIDNo. 7。6. -种如权利要求1所述的单克隆抗体的应用，其特征在于：独立或与其他抗体组合 应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法上。7. -种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系，本发明选择一段Ki67蛋白质特征性的多肽抗原免疫小鼠后筛选获得了制得了一种保藏编号为10402的杂交瘤细胞系73043-24E8，该细胞可分泌针对Ki67分子的单克隆抗体，并可特异性识别Ki67蛋白及肿瘤组织，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。CGMCC No.1040220150205
【IPC分类】G01N33/68, C07K16/18, C12N5/20, G01N33/577, C12R1/91
【公开号】CN104892759
【申请号】CN201510339210
【发明人】杨清海, 陈惠玲, 周洪辉, 王小亚
【申请人】福州迈新生物技术开发有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
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