抗TNFα的全人源单克隆抗体及其应用
抗TNFα的全人源单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体药物的技术领域。具体地说，涉及一组新的全人源单克隆抗体分 子，其可用于治疗TNFa引起的疾病治疗。
【背景技术】
[0002] 众所周知，肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF)家族参与各种免疫和炎症 反应的调控，是自身免疫性疾病（autoimmune disease)的关键性细胞因子。自身免疫性疾 病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。常见的系统性自 身免疫病有：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、硬皮病、 结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病。TNF参与类风湿关节炎（RA)复杂的细胞网络反应，调 节炎症反应，因而针对TNF治疗RA及其他自身免疫疾病在理论上是有效的。事实上，大样 本多中心临床试验证明 [1]，抗TNF治疗能明显改善RA的症状，减轻疾病活动。
[0003] (一）TNF蛋白结构
[0004] 人TNF- α基因定位在染色体6q21. 3区域，与主要组织相容性抗原复合体III类 基因（MHC-III)紧密连锁。基因组全长3kb (含4个外显子和3个内含子），成熟产物由157 个氨基酸组成，80%的氨基酸序列由第4个外显子编码。TNF-α是一个非螺旋、富含β折 叠的蛋白多肽，每个单体由反向平行的β折叠组成，通常以二聚体、三聚体或五聚体的形 式存在于体内，具有生物学活性的TNF-α分子是紧密连接的三聚体。
[0005] 1984年从HL-60、U937等细胞中克隆成功rHu TNF- a cDNA，并在大肠杆菌中获得 高表达。人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号 肽后成熟型TNF-α为157氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子 内二硫键。rHu TNF-α分子量为17kDa。小鼠 TNF-α前体为235氨基酸残基，信号肽79 氨基酸残基，成熟的小鼠 TNF-a (rMuTNF-α )分子量为17kDa，由156个氨基酸残基组成， 第69位和100位两个半胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生 物学功能。rHu TNF-α与rMu TNF-α有79 %氨基酸组成同源性，TNF-α的生物学作用似 无明显的种属特异性。
[0006] TNF- α基因是RA发病遗传因素的一个重要候选基因，TNF增强子238为GG基因 型于RA进展性关节破坏程度相关且不依赖于DR4的存在。此外有研究发现 [2]，TNF区域多 态性可能于DR等位基因存在交互作用从而影响疾病易感性。
[0007] (二）TNF分子的功能
[0008] 炎症疾病中，TNF-a主要来源于单核巨噬细胞，同时淋巴细胞、自然杀伤细胞、中 性粒细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、肥大细胞、内皮细胞、表皮细胞和成骨细胞等也能产生 和释放TNF- α [3]。
[0009] TNF-a与2种不同的受体TNFRl (p60、p55和CD120a，表达于所有有核细胞表面） 和TNFR2 (p80、p75和⑶120b，表达于造血干细胞系的细胞表面）结合，通过多种信号转导 途径（见图6)在不同类型细胞中、甚至同一类型细胞不同分化阶段中发挥多种不同的生物 学效应[4]。
[0010] TNF-α是维持机体免疫平衡的重要生物介质，它参与淋巴细胞的迁移、活化、增殖 与分化以及淋巴组织的再生[3'5]，在抗肿瘤、免疫防御和炎症反应中发挥重要作用。但值得 注意的是，TNF-α具有双重生物学效应 [6]，一方面TNF和受体系统能够诱导细胞程序化死 亡（即细胞凋亡），另一方面它又能促进细胞增殖、分化和成熟使细胞得以存活并产生相应 的多种生物学效应。正常情况下，TNF和受体系统维持着这两方面功能的平衡，当这种平衡 在某些病理条件下被打破时，便可导致机体免疫环境和功能紊乱，发生疾病。
[0011] Shenm等研究表明，抗TNF-α抗体（例如Humira)能够同时结合游离TNF-α和 细胞膜表面的TNF-α，从而阻止了 TNF-α与受体系统的结合，平衡TNF-α和受体系统的关 系，起到治疗疾病的目的。图7示出了此类抗体药与细胞膜表面TNF-α结合后产生的一系 列生物学反应。
[0012] (三）治疗性抗TNF抗体药
[0013] TNF是机体免疫系统的一个关键性的细胞因子，多种自身免疫性疾病中发现TNF 过表达。目前，使用抗TNF抗体药可以治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强制性关节 炎、银屑病、克罗恩病和炎性肠炎等。有5种TNF-α拮抗剂可用于临床，包括Etanerc印t、 Infliximab、Adalimumab、Golimumab 和 Certolizumab pegoL·
[0014] 因为肿瘤坏死因子在免疫调节上起关键作用，TNF抗体药的可能临床适应症多 达20余种。目前欧美尚有几十个临床实验扩展TNF抗体药的适应症。这些适应症包括： 寻常性银屑病（Psoriasis Vulgaris)、急性移植物抗宿主病（Acute Graft Versus Host Disease)、白血病、皮肤粘膜淋巴结综合征（Mucocutaneous Lymph Node Syndrome)、川崎 病（Kawasaki Disease)、盘状红斑狼疮（DLE)、移植物抗宿主病、HIV感染、Moderate to Severe Active Axial脊椎关节炎、扁平苔藓（Lichen Planus)、肺炎、特发性肺炎综合征 (Idiopathic Pneumonia Syndrome)、肺癌、前列腺癌、肿瘤转移、Bone Cancer Stomatitis、 包涵体肌炎（Inclusion Body Myositis)、风湿性多肌痛（Polymyalgia Rheumatica)、 急性非感染性肺功能障碍（Acute Non-Infectious Pulmonary Dysfunction)、I 型糖尿 病、皮肌炎（Dermatomyositis)、代谢综合征、肥胖症、高血压、高血脂、狼疮性肾炎（Lupus Nephritis)、腰骶神经根病（Lumbosacral Radiculopathy)、慢性梗阻性肺疾病恶化（C0PD Exacerbation)、支气管炎、克罗恩氏病、结肠炎。
[0015] 1) ·抗 TNF α 抗体：Humira
[0016] I"3 年英国 Cambridge Antibody Technology 与美国 BASF Bioresearch Corporation的联合研究中心通过噬菌体展示技术发现了全人源抗TNF单克隆抗体的潜在 临床价值。1999年全人源抗TNF单克隆抗体药（Humira)早期临床试验取得了较好的初步 结果，为全面深入的开展临床试验奠定了基础。2001年271例类风湿关节炎的临床试验结 果证明，50%的病人联合使用Humira和甲氨蝶呤取得了至少50%以上的病情改善。2002 年Abbott公司建设了一个先进的生物制品车间生产Humira。2002年12月31号，美国FDA 正式批准Humira用于治疗类风湿性关节炎。2003年Humira上市销售，用于治疗类风湿性 关节炎，同时开展其他适应症的临床试验。2005年美国FDA批准Humira用于治疗银屑病关 节炎，当年首次取得了 10亿美元的销售额。2005年12月10日，在日本申请了类风湿性关 节炎的新药证书。2006年申请了克罗恩氏病的新药证书，并且FDA批准用于治疗强直性关 节炎。当年的销售突破20亿美元。2007年FDA批准Humira在美国用于治疗克罗恩病，同 时，Abbott申请了全球范围内的银屑病治疗，这也是Humira的第5个适应症。当年12月 10日，Abbott在Puerto Rico建设一个全新的生物制品车间，用于生产Humira。销售额突 破30亿美元。2009年6月10日，Abbott公司连续5年的临床数据揭示，同时使用Humira 和甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎病人，可以阻止病人的骨髓破坏。销售额突破56亿美元。 2011年，美国的消化疾病周上，Abbott公布了 Humira治疗溃疡性结肠炎的III期临床试验 积极成果，并且近期已经向美国和欧盟监管部门提交Humira用于溃疡性结肠炎的申请，预 计将于2011年获批 [8]。
[0017] Humira的临床应用
[0018] 风湿性关节炎--HUMIRA适用于中度至重度活动性风湿性关节炎成人患者，可减 轻体征和症状，产生显著临床疗效，抑制结构性损伤的恶化，改善身体机能。HUMIRA既可单 独使用，又可与甲氨蝶呤或其他非生物性改变病情抗风湿药（DMRD)联合使用 [9]。
[0019] 幼年特发性关节炎一一HUMIRA适用于4岁及4岁以上的中度至重度活动性多关 节型幼年特发性关节炎儿科患者，可减轻体征和症状。HUMIRA既可单独使用，又可与甲氨蝶 呤联合使用。
[0020] 银屑病关节炎一HUMIRA适用于活动性风湿性关节炎成人患者，可减轻体征和症 状，抑制结构性损伤的恶化，改善身体机能。HUMIRA既可单独使用，又可与非生物性DMARD 联合使用。
[0021] 强直性脊柱炎--Humira适用于活动性强直性脊柱炎成人患者，可减轻体征和症 状。
[0022] 克罗恩氏病（Crohn病）--Humira适用于常规疗法疗效不足的中度至重度活 动性Crohn克罗恩病病成人患者，可减轻体征和症状，引起并保持临床缓解。对于那些 infliximab已对其失去疗效或者不耐受infliximab的患者，Humira可减轻他们的体征和 症状，并引起临床缓解。
[0023] 斑块状银屑病--Humira可用于治疗适合全身性治疗或光线疗法、以及从医学角 度来说其他全身性疗法不甚适合的成年中度至重度慢性银屑病患者 [1°]。
[0024] 2).其他TNFa拮抗剂
[0025] 目前有5种TNF- a拮抗剂可在国外上市，包括Etanercept、Infliximab、 Adalimumab (即 Humira)、Golimumab 和 Certolizumab pegol，其中前 3 种药物在我国已 上市并广泛应用。和Etanercept依那西普比，Humira疗效更好，剂量低/生产成本低 (Etanercept 依那西普每周 50mg，Humira 每两周 40mg);和 Infliximab 比，Humira 疗效 更好，剂量低/生产成本低（Infliximab每月600mg，Humira每两周40mg)，副作用小， Infliximab是人鼠嵌合抗体，易引起HAMA免疫反应和休克，而Humira是全人源抗体。
[0026] Etanerc印t是一种完全人源化的重组可溶性TNF p75受体二聚体融合蛋白，是注 射用重组人II型TNF受体-抗体融合蛋白。它与循环血液中可溶性TNF受体结合，减少与 组织细胞表面TNF受体结合的TNF，从而阻断炎症信号转导，减少组织损伤。多项临床试验 表明，使用多种DMRD药物治疗失败的长期RA患者，Etanerc印t单一治疗或与甲氨蝶呤联 用均有较好的耐受性，并能持续改善患者的疾病活动性。不良反应包括局部反应、条件致病 性感染、血液系统毒性、肉芽肿等。以局部反应最常见，皮肤注射部位可发生皮疹、盘状狼 疮、皮肤血管炎等，也有皮肤感染和皮肤肿瘤的报道[11]。
[0027] Infliximab是一种人鼠嵌合的抗TNF-a-IgGl κ同型链单克隆抗体，进入人体 后，与具有TNF-α表达的关节组织细胞起作用，破坏该细胞和使该细胞活性下降。Gao等 [12]研究表明，短期内用Inf Iiximab治疗中重度患者效果好，有助于缓解RA影像学的进展， 用于中重度患者此作用尤为明显。Infliximab治疗风湿病相对安全，可能会出现皮肤不良 反应、输液反应，或导致感染风险增加和结核易感性等。
[0028] Adalimumab (阿达木单抗）是完全人源化的重组单克隆TNF抗体。2002年12月 FDA批准Adalimumab (商品名Humira)可用于治疗对一种或多种抗风湿药物疗效欠佳的中 重度活动性RA。应用Adalimumab治疗后以感染（如上呼吸道、鼻窦炎等）、注射部位反应、 头痛和局部皮疹等不良反应最为常见，发生率>10%。
[0029] 上述3种TNF α拮抗剂有望用于妊娠患者。传统的DMARD多属FDA分类法中的C、 D和X类药物，对胎儿毒性较大，应避免使用，病情需要使用时应谨慎使用。而Etanerc印t， Infliximab和Adalimumab均归为FDA分类法中的B类[13]。有资料显示，至今尚无证据表 明TNF-α拈抗剂具有胚胎毒性、致畸性或导致流产率升高。要得出此结论尚需大量的病例 资料[14]。
[0030] Golimumab 和 Certolizumab pegol 是 2 种新型 TNF-α 拮抗剂。2009 年 4 月 FDA 批准Golimumab(商品名Simponi)用于治疗成年人的中度至重度类RA。Golimumab是一种 完全人源化的TNF-α单克隆抗体。主要优点包括注射间隔时间长（每月注射1次），对使 用过TNF- α拮抗剂治疗的RA患者同样有效。使用Golimumab最常见的不良反应包括注射 部位红斑、头疼和恶心，但发生严重感染或恶性肿瘤者数量少。由于缺乏与其他TNF-α拮 抗剂在疗效和安全性评价方面对比的长期实验数据，Golimumab应在其它药物治疗无效后 使用 [15]。
[0031] Certolizumab pegol是由人源抗体的Fab片段和40kDPEG融合组成的一种TNF- α 单克隆抗体，其中PEG分子能增加药物的血浆半衰期。与其他TNF-α拮抗剂相比，由于不 含IgG Fc区，Certolizumab pegol不引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC)和补体 依赖的细胞毒作用（⑶C)[16]。2009年5月FDA批准UCB公司生产的聚乙二醇抗肿瘤坏死因 子Certolizumab pegol (商品名Cimzia)用于中到重度RA患者的治疗。III期临床实验表 明，Certolizumab pegol单用或与MTX联用患者均耐受良好，不良反应轻微或适中。最常 见的不良反应有上呼吸道感染、发疹、尿道感染。注射部位疼痛发生率低。
[0032](四）全人源抗体制备技术
[0033] 人源抗体的制备20世纪70年代中期杂交瘤技术问世，由此制备出的单克隆抗体 (Mb)是抗单一抗原决定簇的抗体，具有高度的特异性和均一性，且能大量制备，这成为抗 体研究领域的一次重大革命。1986年，应用此技术制备的第一个单克隆抗体药物0KT3被美 国FDA批准上市，被用于治疗器官移植后的免疫排斥。但由于抗体是鼠源的，在病人中引发 了严重的免疫反应，这就大大阻碍了抗体药物的发展和利用。
[0034] 随着抗体被用来开发成药物，它的一些特征也将被严格考量，像免疫原性、亲和 力、稳定性、效应功能、半衰期、组织渗透性及其分布等[17]。在鼠源Mb生产变得成熟时，研 究者便预想通过常规的杂交瘤技术生产人源MAb，但由于人杂交瘤细胞系不能稳定的生产 高产量的抗体，并且对于很多抗原来说，人的体内免疫是不可行的。这样，基因工程抗体由 然而生，1994年，第一个嵌合抗体ReoPro获准上市，临床应用表明其免疫原性远优于鼠源 抗体，这就掀起了继杂交瘤单克隆抗体之后抗体工程研究领域的又一次革命。特别是90年 代中期以来，为进一步降低免疫反应的发生，多种人源化改造技术被成功开发并得以应用， 各种各样的基因工程抗体及抗体库不断出现 [18][19]，使得大规模生产医用人源化抗体成为 可能。从1997年开始，大批的单抗药物被FDA批准上市。
[0035] 单抗人源化改造技术的应用打破了抗体药物产业化的瓶颈。迄今，按照人源化 程度的高低大体可分为三种技术：嵌合、人源化和全人源，其基因中人源序列占比分别为 75%、95%和100% [2°]。其中嵌合抗体是将鼠杂交瘤单克隆抗体基因的可变区和人的恒定 区连接在一起，然后在哺乳动物细胞中进行表达产生；而人源化抗体则是除了将抗体的恒 定区换成人源的之外，更进一步的将可变区的FR区转换成人源的 [2°]，从而降低免疫原性； 而全人源抗体制备则是有四种途径，一种从采集的病人血样中构建Fab或者ScFv文库，并 通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAb [21][22]。2002年，第一个全人源MAb，Humira，就 是通过噬菌体展示开发出来的。第二种生产人源抗体的策略是用含有人免疫球蛋白基因位 点的转基因小鼠，进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以 来生产人源MAb [23]，从转基因小鼠衍生而来的人源MAb正在临床试验中。第三种途径是通 过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应 答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进 行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力 [24]，再克隆 进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生 成的 [25]。第四类途径是通过分离和低密度（约500B细胞每96孔）培养人外周血淋巴细 胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获 得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体 [26]。
[0036] 目前国外已批准上市的5种TNFa拮抗剂中，三种为抗体：英夫利昔单抗 (Infliximab,人鼠嵌合单抗）、阿达木单抗（Adal imumab/Humira，全人源单抗）和 Golimumab全人源单抗），二种为类抗体融合蛋白：益赛普（Etanercept，肿瘤坏死因子II 型受体-人抗体Fc融合蛋白）和Certolizumab pegol (人FAb-PEG融合蛋白）。其中英夫 利昔单抗、阿达木单抗和益赛普已在中国批准上市。中信国建制备了益赛普的仿制药也已 在中国批准上市。总体上来说完整单抗疗效为好，单抗中以阿达木单抗疗效好和销售大。这 得益于其较高的亲和力与其结合的TNFa表位。为了得到功效更高的全人源TNFa单抗， 本发明人进行了大量研发，并得到了本发明。
【发明内容】
[0037] 本发明正是以现有TNFa单抗中疗效最好阿达木单抗为基准进行的新分子创制， 本发明的全人源单抗具有更高的亲和力和生物学功效。
[0038] 本发明的全人源单克隆抗体是基于上述第三种途径（即人杂交瘤技术）并加以随 机突变筛选得来的。利用人杂交瘤产生的单克隆抗体被认为是在氨基酸序列和糖基化谱上 都要优于嵌合抗体和人源化抗体的全人源抗体。但是由于难以找到使人杂交瘤稳定传代的 融合伴侣细胞，且由于融合效率低、细胞培养困难及生产能力低等问题，制备稳定传代且能 持续产生单克隆抗体的人杂交瘤细胞系一直存在较大难度，且成功的实例甚少。本发明对 表达人抗体的人杂交瘤快速进行包括特异性和功能学在内的筛选，并将筛选出的杂交瘤细 胞进行分子克隆化以保存抗体基因，从而克服了上述困难。
[0039] 随着人源化和全人源抗体技术的成熟，如何提高抗体的亲和力成了目前所有基因 工程抗体药物需要解决的关键问题。这是因为增加一个抗体的亲和力将降低抗体药物的剂 量并起到更好的生物活性，还可能使其治疗更多的疾病及降低剂量相关的毒性 [18][22]。此 外，费用也将大大降低。多项独立的研究表明，抗体亲和力和生物学活性在达到极限值之前 是成线性关系的。围绕这一问题人们已经从不同的方向展开了研究，提高抗体亲和力的途 径基本有两条途径，其中一个途径是通过随机突变互补决定区（CDR)或是整个的可变区， 然后从这个大量的突变体库里筛选更高亲和力的抗体 [19];另一个途径是通过集中突变或 是建模模拟体内亲和力成熟的热点区域，建立一个小的突变体库[18][19]。综合起来说，当进 行体外抗体亲和力成熟时，应考虑4个主要方面：①在抗体基因的何处导人突变；②如何导 入突变；③如何从较低亲和力的抗体中选择稀有的更高亲和力抗体。④如何鉴别更高亲和 力抗体。
[0040] 本发明提供抗TNFa的一组新抗体，这些抗体为全人源抗体，并且作为一种新药 物，这些抗体部分功效指标与阿达木单抗相同或比之更好。本发明的抗体可用于治疗和诊 断类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、克罗恩氏病、强直性关节炎、银屑病 和/或溃疡性结肠炎，但不限于此。
[0041] 本发明提供了一种抗TNF a的全人源抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区 的CDRl的氨基酸序列为GFTFSSYDMH，CDR2的氨基酸序列为VIWSDGSIKYYADSVKG，CDR3的氨 基酸序列为EVESAMGGFYYNGMDV ;并且所述抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3选自以下 1)、2)和 / 或 3):
[0042] I) CDRl 为 RASQDIGFDLG，CDR2 为 AASSLQS，且 CDR3 为 LQHKSYPLT ;
[0043] 2) CDRl 为 RASQSIGFDLG，CDR2 为 AASSSQS，且 CDR3 为 LQHRSYPLT ;
[0044] 3) CDRl 为 RASQDIGFDLG，CDR2 为 AASTLPR，且 CDR3 为 LQHKSYPLT。
[0045] 在本发明的抗体中，重链可变区的氨基酸序列优选为Seq ID NO :1。在本发明的 抗体中，轻链可变区的氨基酸序列优选选白Seq ID NO :2、Seq ID NO :3和/或Seq IDNO : 4。
[0046] 除了上述互补决定区序列外，本发明的抗体的重链的其他部分的氨基酸序列优选 对应于人IgG2重链，所述抗体的轻链的其他部分的氨基酸序列优选对应于人κ链。
[0047] 本发明的抗体的两条重链可以相同也可以不同。本发明的抗体的两条轻链也可以 相同或不同。
[0048] 本发明还涉及一种抗TNFa的抗体片段，所述抗体片段包含本发明的抗体的至少 一种重链可变区和至少一种轻链可变区且能够有效地识别并结合TNFa。所述抗体片段可 以是 Fab 或 F (ab'）2。
[0049] 本发明还涉及一种抗TNFa的scFv分子，所述scFv包含本发明的抗体的至少一 种重链可变区和至少一种轻链可变区，并且能够有效地识别并结合TNFa。所述scFv分子 还包括多价scFv,例如二价scFv和三价scFv。
[0050] 本发明还涉及一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的抗体的重链和/或轻 链、抗体片段或scFv分子。
[0051] 本发明还涉及一种载体，所述载体中包含本发明的多核苷酸。
[0052] 本发明还涉及一种抗TNF α结合物，所述结合物包含与同位素、免疫毒素和/或化 学药物共价连接的本发明的抗体、抗体片段或scFv分子。所述结合物可以用作例如靶向药 物。
[0053] 本发明还涉及一种偶联物，所述偶联物由本发明的抗体、抗体片段、scFv分子或抗 TNFa结合物与固体介质或半固体介质偶联而形成。
[0054] 根据抗TNFa抗体的性质，本发明的抗体、抗体片段、scFv分子、抗TNFa结合物 或偶联物可用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、 克罗恩氏病、强直性关节炎、银屑病和/或溃疡性结肠炎。
[0055] 因此，本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体、抗体片 段、scFv分子、抗TNF a结合物和/或偶联物。
[0056] 本领域技术人员将知晓的是，上述抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影 响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。本领域技术人员还知晓， 根据上述抗体的氨基酸序列可以设计出编码其的核苷酸序列，并且针对不同的表达宿主对 该核苷酸序列进行优化。为了治疗、检测、实验或其他目的，本发明的抗体可以与同位素、免 疫毒素和/或化学药物共价连接，还可以与固体介质、半固体介质偶联，还可以使用本发明 的抗体的功能性片段，这在本领域中是已知的。
[0057] 本发明提供了一种方法，使用该方法制造全人源抗体并且作为一种新药物。目前 尚未有抗体药物系使用本发明的技术方法成功创制的报道。该方法所克服的最重要的技术 难点是（1)人淋巴细胞体外有效免疫技术；（2)人杂交瘤基因不稳定，必须快速进行包括特 异性和功能学在内的筛选，并将筛选出的杂交瘤细胞进行分子克隆化以保存抗体基因；（3) 对已筛选出具有一定药理学功效的人源抗体通过分子生物学抗体工程技术进行进一步优 化改造。
[0058] 所述抗体的制造及相关检测方法如下：通过提取不同人的外周血淋巴细胞或者是 人扁桃体淋巴细胞，体外混合后，用抗原和具有佐剂功用的分子共培养，使其产生针对抗原 的抗体，通过与骨髓瘤细胞融合，产生临时稳定的人杂交瘤，培养上清中含有其分泌的人源 抗体。通过细胞ELISA筛选出肿瘤坏死因子a阳性杂交瘤细胞生长孔，再以相对抗原亲和 力排序和细胞学生物活性检测试验综合评估筛选最好的10个细胞生长孔，并立即进行亚 克隆，筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株。立即进行测序和分子克隆抗体基因到适当 的表达载体中，并将质粒DNA扩增纯化于-80 °C永久保存。根据抗体抗原亲和力排序和细胞 学生物活性检测试验综合评估筛选最好的1到3个单克隆细胞株的抗体基因，以此作为模 板对其进行体外抗体亲和力成熟工程。我们以对CDRl、CDR2、CDR3区进行随机突变和定点 突变相结合的方式建立抗体亲和力成熟突变文库。以抗原特异性和相对亲和力排序对文库 进行筛选。将每轮最好的5~10抗体的重链可变区（VH)和轻链可变区（VJ进行全排列组 合形成全长抗体。使用瞬转、培养和微量亲和纯化（ProteinA)制备少量纯化抗体，以阿达 木单抗为参照基点，根据抗体抗原亲和力排序和受体配体竞争结合试验进行筛选鉴定。在 经此筛选出来的一组有良好细胞毒功效的抗体分子，再对这些抗体可变区特别是CDR区序 列检索，确定此组具备TNFa特异性的抗体为首次发现的新分子。在此组新分子里有一个 或一个以上的新抗体分子其（1)亲和力比阿达木单抗高（2)受体配体竞争结合试验功效比 阿达木单抗好（3)细胞学中和保护试验（4)在TNF α介导致死C 57BL/6小鼠动物模型中， 全人抗TNF α抗体的保护作用和阿达木单抗相同和更好。
[0059] 在确定本发明的抗体的氨基酸序列后，可以通过人工合成编码该抗体的多核苷酸 并选取适合的宿主进行有效地表达来制备该抗体，这在本领域中是公知的。
[0060] 除非特别说明，在本文中"Humira"、"Adalimumab"和"阿达木单抗"可以互换使用。
【附图说明】
[0061] 图1 :经亲和力成熟库淘选后，3000个单克隆ScFv抗体对rhNFa结合的ELISA检测 结果。从每轮次不同淘选浓度的重组噬菌体抗体文库中，选择单克隆密度适宜的平板，挑取 1000到3000个单克隆到96深孔细菌培养板中进行培养和诱导表达，收集上清进行ELISA 检测（纵轴为〇D450nm吸光度；横轴为检测上清的样本数）；
[0062] 图2 :H3L4全人源单抗针对单体rhTNF α的亲和力测定结果（SPR技术）；
[0063] 图3 :H3L5全人源单抗针对单体rhTNF α的亲和力测定结果（SPR技术）；
[0064] 图4 :全人源H3L4单抗和阿达木单抗抑制TNF α诱导的MCF-7细胞毒试验；H3L4 单抗的IC50为0. 45ng/ml，阿达木单抗的IC50为8ng/ml ;
[0065] 图5 :全人源H3L4单抗和阿达木单抗的动物体内药理药效试验方案。
[0066] 图6 :TNF和受体的系统信号转导途径[4]。
[0067] 图7 :TNF_a抗体与细胞膜表面TNF-α结合后产生的一系列生物学反应。
【具体实施方式】
[0068] 下文将通过具体的实施例来阐明本发明，但应理解的是，以下实施例并不限制本 发明的范围。
[0069] 实施例
[0070] 实施例1 :杂交瘤和载体的制备
[0071] 1.抗原和淋巴细朐的准各及免疫
[0072] I. 1抗原TNFa蛋白准备
[0073] 人的TNF α蛋白（药靶）和猴的TNF α (药靶）蛋白购白义翘神州，用PBS稀释后， 用0. 22 μ m针式无菌滤器过滤后分装于I. 5ml细胞冻存管中于-80°c保存。
[0074] 1.2人淋巴细胞准备
[0075] 无菌摘取慢性扁桃体炎新鲜组织样本（与徐州医学院附院耳鼻喉科合作，扁桃体 取自扁桃体摘除手术的病人，10例病人，年龄5~10岁），用淋巴细胞分离液（GE)分离出 其中的淋巴细胞，取30 X IO6个；无菌抽取人新鲜外周血细胞，用淋巴细胞分离液（GE)分离 出其中的淋巴细胞，取30X IO6个。
[0076] L 3体外淋巴细胞免疫
[0077] 淋巴细胞培养基配方如下。1升的DMEM中含：20%胎牛血清、1%的200毫摩尔左 旋谷氨酸（3丨81^，〇 &七#62150)、1%的100\的非必须氨基酸（5丨8111&，〇&七#17145)、1%的 100 X青霉素链霉素混合液（Sigma，cat. #P7539,10, OOOU/ml青霉素+10mg/ml链霉素）、10 单位/每毫升白介素6 (Boehringer Mannheim，cat. #1299972)、20单位/每毫升人重组白介 素2 (R&D system，cat. #202-IL-050)、20微克/每毫升美洲商陆有丝分裂原（PWM) (Sigma， cat.#L8777)、l纳克/毫升无内毒素 CpG(定制合成）、1支OPI细胞培养添加剂（Sigma， cat. #05003)。
[0078] 两种来源的16位个体淋巴细胞混合后在含20% FBS的RPMI-1640培养基中进行 混合培养，淋巴细胞终浓度为5X105个/ml，同时加入下述步骤2. 1中获得的小鼠腹腔饲养 细胞（终浓度为I X IO5个/ml)，非必需氨基酸（终浓度为1 μ g/ml)，TNF α抗原（蛋白免 疫：终浓度为1 μ g/ml)，并放于二氧化碳培养箱中共培养6-12天（第5-6天换一次新鲜培 养液）。
[0079] 2.杂夺瘤细朐的制各
[0080] 2. 1饲养细胞的准备
[0081] 在融合前一天，断颈处死BALB/c小鼠（从北京维通利华实验动物技术有限公司购 买），浸泡于75%酒精中5分钟，在超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，露出腹膜， 用注射器注入腹腔内IOml HAT培养基（20%?85，撤11\，其余为01^1)，反复吹吸，吸出培 养基放入50ml离心管内，台盼蓝细胞计数，调整细胞浓度为2X105个/ml，加入96孔板， 100 μ 1/孔，放入二氧化碳培养箱中过夜。此操作适用于所有需要用到小鼠腹腔饲养细胞的 实验中。
[0082] 2. 2骨髓瘤细胞准备（骨髓瘤细胞P3X63Ag8. 653购白中科院上海生命科学研究院 细胞资源中心）
[0083] 培养至对数生长期，lOOOrpm，离心5分钟，用不含FBS的DMEM悬浮，1000 rpm离心 5分钟，轻弹底部，用不含FBS的DMEM培养基悬浮，台盼蓝计数，细胞活性为95%。
[0084] 2. 3细胞电融合及HAT筛选
[0085] 收集与TNFa抗原共培养6天后的淋巴细胞，台盼蓝计数活细胞，1300rpm离心5 分钟，弃上清，轻弹底部，用少量不含FBS的DMEM培养基悬浮；与同样数量的骨髓瘤细胞充 分混匀，补DMEM培养基至40ml，2000rpm离心5分钟，弃上清；
[0086] 加入2ml无菌pronase溶液（CalBiochem，53702)，轻微悬浮细胞团后，作用2分 钟，加入3-5ml FBS终止，再加入电融合溶液至40ml，2000rpm离心5分钟，弃上清；加入少 量电融合溶液轻轻悬浮细胞团后，补加至40ml，2000rpm离心5分钟，弃上清；轻弹底部，加 入电融合溶液，细胞计数，调节细胞至2X IO6个/ml，分成2ml/管；按照2ml体积的秒数进 行设定，启动电融合装置（BTX);融合后，1000 rpm离心5分钟，弃上清；加入少量HAT培养基 悬浮细胞后，加入适量体积的HAT培养基，按照融合时候的淋巴细胞加入量，I X IO6个/板， 加入之前铺好饲养细胞的96孔板中，放入二氧化碳培养箱中进行培养。
[0087] 融合后7天，用HAT培养基进行1/2换液，融合后10天，用HAT培养基全换液。
[0088] 2. 4细胞上清抗原特异性ELISA检测
[0089] 包被：融合后12天，用双套ELISA法检测特异性抗体，一套为人TNF α蛋白包被， 一套为猴TNF α蛋白包被。4°C过夜包板，浓度为50万个细胞膜/50 μ 1/孔，包被液为ΡΗ8. 3 的 1% BSAPBS。
[0090] 封闭：用PBST洗板3次后以10%脱脂牛奶粉PBS封闭，室温孵育1小时。然后用 PBST洗板3次。
[0091] 加样：吸出50ul细胞上清至孔中，阴性对照为1 : 1000人血清（健康成人捐献）， 阳性对照为0. lug/ml阿达木注射液。室温孵育2小时后，用PBST洗板3次。
[0092] 二抗：然后加入次辣酸根过氧化酶标记的山羊抗人IgGHRP(Goat Anti-Human IgG H&L-HRP，货号：ab81202)，50 μ //孔，室温孵育1小时后，用PBST洗板3次。
[0093] 显色：TMB显色，50 μ 1/ml TMB，10~15分钟后以2M盐酸终止显色反应。A45tl读 数。
[0094] 选取阳性杂交瘤生长孔标准：人和猴TNFa蛋白包被ELISA同时呈阳性，并且人血 清蛋白包被ELISA相应孔阴性，为抗原特异性。
[0095] 2. 5扩大培养
[0096] 第一次检测后，选择阳性孔扩大至4个96孔平板培养，过2天，对所扩孔进行检 测，确定阳性孔，扩大至24孔。待24孔细胞长至孔底约1/3,则进行ELISA检测。此方法同 样适用于后期抗体的检测。
[0097] 2. 6细胞上清人抗体定量检测
[0098] 对步骤2. 5产生的经再次ELISA鉴定后仍为阳性的细胞孔培养上清，使用 BethylLaboratories的人Ig定量检测ELISA试剂盒（货号E88-104)，具体步骤按试剂盒 说明书进行。
[0099] 2. 7相对亲和力排序
[0100] 样品准备：待比较的抗体：已知浓度的纯化抗体，或由步骤2. 6定量检测后已知所 含抗体浓度的细胞培养上清，稀释到4~8个相同浓度（120nM，40nM，13. 1ηΜ，4. 4nM)。然后 按2. 4中描述的步骤进行ELISA检测。由于所有样品事先调整到相同抗体浓度，OD值的差 异将由抗体的亲和力引起。OD值越高相对亲和力就越高。使用Prism软件作图和计算出相 对每一抗体的亲和力。综合实施例3~5和此检验结果，选出抗原亲和力和功能学效能最 高的 10 个细胞生长孔，BP L 1、1· 5、1· 6、1· 6、1· 24、2· 2、2· 39、3· 85、3· 12、3· 37。
[0101] 2. 8有限稀释法亚克隆、细胞扩大培养
[0102] 于亚克隆前一天或者是当天采集小鼠腹腔饲养细胞（用HT培养基），细胞浓度为 IX IO5个/ml，加入96孔板，IOOul/孔。对经步骤2. 7检测后筛选的I. 1、1. 5、1. 6、1. 6、 I. 24、2. 2、2. 39、3. 85、3. 12、3. 37阳性杂交瘤细胞株分别进行台盼蓝染色计数后，将细胞分 别按以下浓度铺到板子中，密度为5个/孔,铺1块；1个/孔,铺1块；0. 5个/孔,铺2块。 放入二氧化碳培养箱中进行培养5-7天后，经倒置显微镜从孔底观察细胞，用记号笔圈下 确认为单克隆的孔。只转移这些单克隆孔的细胞培养上清，50微升每孔，进行ELISA检测 (见2. 4方法）。在经ELISA确定抗原阳性的孔里，根据细胞状态和OD值，从被亚克隆的每 杂交瘤细胞株（1. 1、1· 5、L 6、L 6、L 24、2· 2、2· 39、3· 85、3· 12、3· 37)中选取最好的 3-5 个 单克隆细胞孔的上清进行下步骤（2.9)的鉴定。
[0103] 2. 9亚类的鉴定
[0104] 用Zμg/ml羊抗人IgG(Fc)包被平板，4°C过夜，再用BSA封闭，加入待测细胞上 清，37°C下温育2小时，而后加入酶标亚类二抗IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，κ，λ (Southern Biotechnology),显色，A45c!读数，判断所测细胞株的亚类为IgG2，κ。在加液前每步都用 PBST洗涤3次。从被亚克隆的每杂交瘤细胞株中由步骤2. 8筛选出的3-5个单克隆细胞孔 里，选定一个确定为IgG2-κ的单克隆细胞株，其分别为：1. 1. 71、1. 5. 58、1. 6. 17、1. 24. 2、 2· 2· 108、2· 39. 45、3· 85. 3、3· 4. 32、3· 12. 78、3· 76. 109。将此 10 个单克隆细胞株扩大至 24 孔（用含20% FBS的DMEM培养基），待细胞长好，检测后，扩大至方瓶。
[0105] 2.10细胞冻存
[0106] 冻存液配制：10% DMS0,60% FBS，30% DMEM，放于冰上预冷，细胞吹悬后，放入离 心管中，台盼蓝计数，离心，弃上清，加入预冷冻存液，按2~5X IO6个/管，进行冻存。细 胞放入程序降温盒（Nalgene)后置于-70°C冰箱过夜，第二天转入液氮中。
[0107] 2. 11测序、克隆单克隆人杂交瘤基因
[0108] 杂交瘤进行亚克隆后，筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株I. 1. 71、1.5. 58、 L 6· 17、1· 24. 2、2· 2· 108、2· 39. 45、3· 85. 3、3· 4. 32、3· 12. 78、3· 76. 109。立即进行测序和分 子克隆，抗体基因进入适当的表达载体，并将质粒DNA扩增、纯化、于-80°C永久保存。
[0109] 实施例2 :单克隆抗体制备及鉴定
[0110] 1.采用体外培养法制各抗体
[0111] 将含有15%胎牛血清的DMEM培养基中生长的I. I. 71、1. 5. 58、1. 6. 17、1. 24. 2、 2· 2· 108、2· 39. 45、3· 85. 3、3· 4. 32、3· 12. 78、3· 76. 109 细胞，逐渐降低血清至无血清或者 是只含有少量血清的无血清培养基中（Invitrogen，12338-026)，放入225cm 2方瓶，按接种 IX IO5个/ml的细胞量，接种100ml，每株细胞各接种4瓶。
[0112] 2.抗体钝化
[0113] 取出在225cm2方瓶培养了 10天左右的细胞上清，离心，去掉细胞碎片，经 rProteinA亲和层析进行抗体纯化。pH7. 4的细胞培养上清经0. 22 μ m虑膜过滤后直接上 样，而后用pH7. 4PBS流洗10倍的柱床体积，再用pH3. 0甘氨酸溶液洗脱， 每段0. 5ml收集 洗脱液。读每段OD28tl，将含有抗体的各段混合。再检测OD28tl，按1.580D=lmg计算抗体浓 度。将收集的抗体溶液过滤〇. 22 μ m的滤器后无菌保存。用SDS-PAGE胶核实纯化抗体纯 度。进行LAL测试确定无内毒素污染（Genscript，Cat :L00350)，将此纯化抗体用于亲和力 试验（实施例4)、细胞学功能试验（实施例5)、动物体内药理药效试验（实施例6)。基于 对TNFa亲和力和对TNFa细胞毒抑制活性试验，3. 12. 78被选定为模板单抗进行亲和力成 熟（对其⑶Rl/⑶R2/⑶R3改进及优化）。
[0114] 3.实施例3:亲和力成熟
[0115] 为了提高该抗体的亲和力，采用已构建的单链抗体scFv为模板，进行随机突变， 并将突变的单链抗体进行噬菌体展示，然后通过ELISA筛选得到更高亲和力的抗体。
[0116] 3. 1测序Anti-TNF a的重链和轻链
[0117] 经免疫、融合以及单克隆化后，基于亲和力和细胞功能学实验结果选取抗TNFa 单克隆抗体细胞株为模板做抗体亲和力成熟实验。
[0118] 抗体基因重链和轻链的序列分析。抗TNFa单克隆抗体细胞的总RNA采用 Invitrogen公司的ΤΗ/.〇Η.ν reagent试剂盒（15596-026)进行提取；接着米用Takara公司 的5' RACE FULL试剂盒（D315)中的随机引物，以总RNA为模板，反转录为第一链eDNA，并按 照试剂盒的说明书操作步骤，在5'端加上接头；然后用试剂盒白带的接头引物，分别和人 重链基因 IgG2恒定区特异引物以及轻链基因 κ链恒定区特异性引物（见下）一起进行扩 增，得到抗TNFa单克隆抗体基因的重链可变区和轻链可变区。用于PCR扩增的重链和轻 链特异引物是：
[0119] IgG2 反向引物：GCGCCTGAGTTCCACGACAC
[0120] κ 链反向引物：CACAACAGAGGCAGTTCCAG
[0121] 将PCR扩增产物克隆到T载体（Takara，D101A)，并进行测序，测序得到一致的重 链可变区VH和轻链可变区VL (在本文中称之为"源生型" VH和VL)。
[0122] 3. 2源生型scFv抗体的构建及并以源生型scFv抗体为样品建立ELISA检测方法 学
[0123] 根据3. 1中的测序结果，设计重链可变区和轻链可变区特异性引物，并分别在重 链可变区5'端和3'端加上SfiI位点和XhoI位点，轻链可变区5'端和3'端加上NheI位 点和NotI位点，重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)特异性扩增引物如下 ：
[0124] VH 正向引物：ACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
[0125] VH 反向引物：CCACCACTCGAGGC GCTCGAGACGGTGACCAGGGT
[0126] VL 正向引物：TGGCGGGTCGACG GATATTGTGATGACCCAGACT
[0127] VL 反向引物：TGTTCTGCGGCCGC TTTGATCTCCACCTTGGTC
[0128] 分别以完全正确的源生型VH和VL克隆为模板，PCR扩增重链可变区和轻链可变 区后，酶切，分步克隆到噬菌体展示载体PFL249 (基因合成构建），进行测序验证。
[0129] 选择测序正确的克隆转化到TGl感受态细胞（Stratagene，200123)中，挑取单克 隆进行培养、诱导、收集上清，以TNF α蛋白为抗原进行ELISA检测。
[0130] 3. 3随机突变scFv抗体库的构建、筛选及测序分析
[0131] 米用 Stratagene 公司的GeneMorph II Random Mutagenesis 试剂盒（200550)，以 VH正向引物和VL反向引物进行易错PCR扩增，将扩增好的PCR产物进行纯化、酶切、连接到 PFL249载体上，然后电转化到TGI感受态细胞中，通过加入辅助噬菌体M13K07恢复噬菌体 完整功能生产随机突变重组噬菌体抗体文库。分别以1000纳克/毫升、100纳克/毫升、10 纳克/毫升、1纳克/毫升的人肿瘤坏死因子α蛋白包被进行多轮逐步递次淘选。并对每 个不同淘选浓度淘选后的逐步提高亲和力的富集文库铺板留存和克隆。从每轮次不同淘选 浓度重组噬菌体抗体文库中，单克隆密度适宜的平板上挑取1000到3000个单克隆到96深 孔细菌培养板进行培养和诱导表达，收集上清进行ELISA检测（例举ELISA检测结果见图 1)，在OD值比源生型阳性对照高的单克隆中，根据OD值从高到低选择200个单克隆进行测 序。分析测序结果，去除FR区突变的非人源克隆后，根据OD值，从高到低，分别选择20个 突变的VH和VL用于构建全长抗体。
[0132] 3. 4构建全长抗体及亲和力排序
[0133] 3. 4. 1根据之前的结果，设计重链可变区和轻链可变区特异性引物，并分别在重链 可变区5'端和3'端加上SfiI位点和Sail位点，轻链可变区5'端和3'端加上SfiI位点 和BsiwI位点，重链可变区和轻链可变区扩增引物如下：
[0134] VH 正向引物 I : TGGCAGCGGCCACAGGGGCCCACTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
[0135] VH 反向引物 I :GCCCTTGGTCGACGC GCTCGAGACGGTGACCAGGGT
[0136] VL 正向引物 I : TGGCAGCGGCCACAGGGGCCCACTCC GATATTGTGATGACCCAGACT
[0137] VL 反向引物 I :AGCCACCGTACG TTTGATCTCCACCTTGGTC
[0138] 分别以源生型的VH和VL克隆，以及突变后的20个VH和20个VL克隆为模板， PCR扩增重链可变区和轻链可变区后，酶切，分别克隆到含有人的IgG2恒定区和人的κ恒 定区pCI载体（Promega，E1731)上，并进行测序验证。
[0139] 3. 4. 2分别将突变后的20个全长重链与源生型的全长轻链组合，将突变后的20个 全长轻链与源生型的重链组合，将共40种组合采用FreeStyle MAX转染系统（Invitrogen， 16447-100)共转染到CHO-S细胞中，37°C，8% CO2培养6天后，离心收集上清。
[0140] 按前述实施例1中2. 6步骤方法进行40个抗体上清中抗体浓度定量，然后按前述 实施例1中2. 7步骤方法进行相对亲和力排序。依据相对亲和力排序结果分别选定5个亲 和力最高的重链命名为HI、H2、H3、H4、H5和5个亲和力最高的轻链LI、L2、L3、L4、L5。
[0141] 3. 4. 3将上一步筛选到的5个重链突变体和5条轻链突变体相互组合，配成25个 全长突变抗体：HIL1，H1L2, H1L3, H1L4, H1L5, H2L1，H2L2, H2L3, H2L4, H2L5, H3L1，H3L1， H3L2, H3L3, H3L4, H3L5, H4L1，H4L2, H4L3, H4L4H4L5, H5L1，H5L2, H5L3, H5L4, H5L5。将它 们重轻链共转染，培养、收集上清，ProteinA纯化，再使用SPR技术通过ProteOn进行亲和 力测定。
[0142] 实施例4亲和力试验
[0143] 按ProtOn标准试验操作指导进行亲和力测试。选用固化待测抗体与芯片上，流过 单体人肿瘤坏死因子α蛋白模式。抗体可以为上清或纯化蛋白。具体而言，将4mMl-(3_二 甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和ImM羟基硫代琥珀酰亚胺（Bio-Rad)混合后立 即注射以活化芯片持续60秒，然后立即注射溶于IOmMlOmM醋酸纳（pH5. 0)溶液中浓度为 20 μ g/ml的单抗（例如H3L4或H3L5)，按30微升/分钟速度持续240秒。以IM盐酸乙酸 异丁酯灭活。将芯片旋转90度，用运行缓冲液冲洗至基线稳定后，平行注射五个不同浓度 单体rhTNFa (44、22、11、5. 5和2. 75nM)和运行缓冲液，分别进入芯片的6个相应轨道。结 合相为100微升/分钟持续200秒，离解相600秒；
[0144] 结果见图2、图3和下表1。图2和图3中的曲线为不同浓度单体rhTNFa与固化 在芯片上的抗体H3L4和H3L5结合-离解曲线，按I : 1结合模式计算，H3L4全人源单抗针 对单体rhTNFa的亲和力为3. 6pM，H3L5全人源单抗针对单体rhTNFa的亲和力为20. 6pM。 结果显示，在25个新创抗体中，有20个H/L组合（即1-2、5、9-25号）比阿达木的亲和力 高。4个（即3、4、6、8)和阿达木相似。1个（7)比阿达木低。其中，H3L4单抗的抗体亲和 力比阿达木约强50倍。
[0145] 表125个新创全人源单抗和阿达木单抗针对单体人TNF a亲和力
[0146]
[0147] 实施例5 :细胞学功能试验
[0148] 5. 1抗体中和活性检测
[0149] TNF-α与受体结合会刺激信号通路，通过一系列的级联反应引起炎症、细胞坏死 等作用。当内分泌出现紊乱，TNF-α在正常组织中也会大量聚集，对正常组织造成伤害， 从而引起类风湿性关节炎等疾病。单克隆抗体药物能够特异性与TNF-α结合并阻断其与 受体的相互作用，从而抑制TNF- α对正常组织的杀伤作用，达到控制并缓解症状体征的目 的。针对WBP112单克隆抗体药物的体外生物学活性检测方法是基于该作用机理（MOA)进 行设计并开发的。
[0150] 在放线菌素 D (ActD)存在的情况下，rhTNF- α与小鼠成纤维细胞L929表面 TNF-α受体相互作用会导致细胞的迅速解离、死亡。抗TNFa单克隆抗体药物能特异性的 与rhTNF-a结合，阻断其与受体的相互作用，中和rhTNF-a对L929细胞的细胞毒性作用。 通过考察药物对rhTNF- α细胞毒性的中和抑制作用来检测其生物学活性。
[0151] 前述25个抗体和阿达木单抗的中和活性检测结果见表20H3L5的生物学活性约为 阿达木的3. 5倍，H3L4、H3L2的生物学活性约为阿达木的2. 4倍。重链H3的可变区（VH3) 的氨基酸序列为Seq ID No. 1 ;轻链L5、L4、L2的可变区（VL5、VL4、VL2)的氨基酸序列分 别为Seq ID No. 2、3、4(详见氨基酸序列表）。在所附的序列表中，带下划线的氨基酸序列 表示相应序列的各CDR。
[0152] 表225个新创全人源单抗和阿达木单抗的中和活性检测结果
[0153]
[0154] 5. 2H3L4抑制TNFa弓丨起的癌细胞（MCF-7)凋亡
[0155] 在一定条件下，将人TNF a和癌细胞（MCF-7)共孵育，TNF a可诱导大约40 %的癌 细胞（MCF-7)凋亡。
[0156] 图4显示，H3L4与阿达木单抗，均可抑制TNFa弓丨起的癌细胞（MCF-7)凋亡，随着 剂量的增加，抑制作用逐渐增强，直至完全抑制TNFa引起的细胞凋亡。将TNFa引起的 凋亡效应降低至一半所需要的药量（术称IC50,半数抑制浓度）是药理上比较不同药物药 效的常用指标，本实验结果表明H3L4单抗的IC50为0. 45ng/ml ;阿达木单抗IC50为8ng/ ml，，H3L4单抗的IC50比阿达木单抗强约18倍。
[0157] 实施例6全人源H3L4单抗和阿达木单抗对TNFa介导的小鼠致死性的保护试验
[0158] 已知肿瘤坏死因子α和半乳糖葡胺（D-GaIN)共注射，可以导致小鼠死亡。抗 TNF α单抗可以抑制这一病理过程，挽救实验动物的死亡。
[0159] 本实验使用C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，试验设计见表3和 图5。试验结果见表4。结果显示在相同给药量15纳克/公斤情况下，H3L4保护试验小鼠 免于死亡的功效比阿达木强4倍。
[0160] 表3.全人源H3L4单抗和阿达木单抗对TNFa介导的小鼠致死性的保护试验设计
[0161] 动物：C57BL/6小鼠，雌性，18-20克
[0162] 试验材料：人肿瘤坏死因子（Invitrogen，PHC3013)、D-半乳糖葡胺 (SIGMA-G1639)、阿达木单抗注射液（雅培）、H3L4单抗（本发明）。
[0163] 分组、给药途径和剂量：
[0165] 表4.全人源H3L4单抗和阿达木单抗对TNFa介导的小鼠致死性的保护试验设计
[0167] 本发明带来的有益效果
[0168] 本发明正是针对TNFa药靶创制的新抗体分子：1)它具有比现在市场上的同类药 物Humira有更好的功效；2)中国国内原创新分子新药，3)可以以更低的价格和更好疗效治 疗和造福风湿性关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮，脊柱硬化症、阶段性结肠炎、溃 疡性结肠炎和过敏性 疾病；4)潜在可能治疗I型糖尿病、肥胖症/高血压/高血脂和某些 癌症。
[0169] 参考文献：
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【主权项】
1. 一种全人源抗体，其特征在于： 所述抗体的重链可变区的⑶Rl的氨基酸序列为GFTFSSYDMH，⑶R2的氨基酸序列为VIWSDGSIKYYADSVKG，CDR3 的氨基酸序列为EVESAMGGFYYNGMDV;并且 所述抗体的轻链可变区的互补决定区选自以下1)、2)和/或3): 1. CDRl为RASQDIGFDLG，CDR2 为AASSLQS，且CDR3 为LQHKSYPLT; 2. CDRl为RASQSIGFDLG，CDR2 为AASSSQS，且CDR3 为LQHRSYPLT; 3)CDR1 为RASQDIGFDLG，CDR2 为AASTLPR，且CDR3 为LQHKSYPLT。2. 如权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SeqIDNO: 1〇3. 如权利要求1或2所述的抗体，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列选白SeqIDNO: 2、SeqIDNO:3 和 / 或SeqIDNO:4。4. 一种抗TNFa的抗体片段，所述抗体片段包含权利要求1~3中任一项所述的抗体 的至少一种重链可变区和至少一种轻链可变区。5. 如权利要求4所述的抗体片段，所述抗体片段为Fab或F(ab'）2。6. -种抗TNFa的scFv分子，所述scFv包含权利要求1~3中任一项所述的抗体的 至少一种重链可变区和至少一种轻链可变区。7. -种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1~3中任一项所述的抗体的重链和/ 或轻链、权利要求4或5所述的抗体片段或权利要求6所述的scFv分子。8. -种载体，所述载体中包含权利要求7所述的多核苷酸。9. 一种抗TNFa的结合物，所述结合物包含与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价 连接的权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求4或5所述的抗体片段或权利要求 6所述的scFv分子。10. -种偶联物，所述偶联物由权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求4或5 所述的抗体片段、权利要求6所述的scFv分子或权利要求9所述的结合物与固体介质或半 固体介质偶联而形成。11. 权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求4或5所述的抗体片段、权利要求 6所述的scFv分子、权利要求9所述的结合物或权利要求10所述的偶联物在制备用于治疗 下述疾病的药物中的应用：风湿性关节炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关 节炎、克罗恩氏病、强直性关节炎、银屑病和/或溃疡性结肠炎。12. -种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利 要求4或5所述的抗体片段、权利要求6所述的scFv分子、权利要求9所述的结合物和/ 或权利要求10所述的偶联物。
【专利摘要】本发明属于抗体药物的技术领域，提供抗TNFα的全人单克隆抗体及其应用，这些抗体是来源于人杂交瘤并经过细胞毒功能测试筛选和通过噬菌体展示技术进行亲和力筛选获得的，具有对TNFα的优异的亲和力和特异性。在细胞模型的药效学试验中，这些抗体能够有效中和TNFα及其所产生的细胞学效应。在动物实验中，这些抗体同样能有效中和TNFα，并抑制动物模型中TNFα所带来的表型。其效果显示不低于或比Humira更好。
【IPC分类】C07K16/24, C12N15/13, A61P17/06, A61P1/00, C12N15/63, A61P29/00, A61P19/02, A61K39/395
【公开号】CN104892760
【申请号】CN201410076339
【发明人】冯晓, 张洁涵, 李福军, 王涛, 李新灵
【申请人】北京安保康生物医药科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体药物的技术领域。具体地说，涉及一组新的全人源单克隆抗体分 子，其可用于治疗TNFa引起的疾病治疗。
【背景技术】
[0002] 众所周知，肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF)家族参与各种免疫和炎症 反应的调控，是自身免疫性疾病（autoimmune disease)的关键性细胞因子。自身免疫性疾 病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。常见的系统性自 身免疫病有：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、硬皮病、 结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病。TNF参与类风湿关节炎（RA)复杂的细胞网络反应，调 节炎症反应，因而针对TNF治疗RA及其他自身免疫疾病在理论上是有效的。事实上，大样 本多中心临床试验证明 [1]，抗TNF治疗能明显改善RA的症状，减轻疾病活动。
[0003] (一）TNF蛋白结构
[0004] 人TNF- α基因定位在染色体6q21. 3区域，与主要组织相容性抗原复合体III类 基因（MHC-III)紧密连锁。基因组全长3kb (含4个外显子和3个内含子），成熟产物由157 个氨基酸组成，80%的氨基酸序列由第4个外显子编码。TNF-α是一个非螺旋、富含β折 叠的蛋白多肽，每个单体由反向平行的β折叠组成，通常以二聚体、三聚体或五聚体的形 式存在于体内，具有生物学活性的TNF-α分子是紧密连接的三聚体。
[0005] 1984年从HL-60、U937等细胞中克隆成功rHu TNF- a cDNA，并在大肠杆菌中获得 高表达。人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号 肽后成熟型TNF-α为157氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子 内二硫键。rHu TNF-α分子量为17kDa。小鼠 TNF-α前体为235氨基酸残基，信号肽79 氨基酸残基，成熟的小鼠 TNF-a (rMuTNF-α )分子量为17kDa，由156个氨基酸残基组成， 第69位和100位两个半胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生 物学功能。rHu TNF-α与rMu TNF-α有79 %氨基酸组成同源性，TNF-α的生物学作用似 无明显的种属特异性。
[0006] TNF- α基因是RA发病遗传因素的一个重要候选基因，TNF增强子238为GG基因 型于RA进展性关节破坏程度相关且不依赖于DR4的存在。此外有研究发现 [2]，TNF区域多 态性可能于DR等位基因存在交互作用从而影响疾病易感性。
[0007] (二）TNF分子的功能
[0008] 炎症疾病中，TNF-a主要来源于单核巨噬细胞，同时淋巴细胞、自然杀伤细胞、中 性粒细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、肥大细胞、内皮细胞、表皮细胞和成骨细胞等也能产生 和释放TNF- α [3]。
[0009] TNF-a与2种不同的受体TNFRl (p60、p55和CD120a，表达于所有有核细胞表面） 和TNFR2 (p80、p75和⑶120b，表达于造血干细胞系的细胞表面）结合，通过多种信号转导 途径（见图6)在不同类型细胞中、甚至同一类型细胞不同分化阶段中发挥多种不同的生物 学效应[4]。
[0010] TNF-α是维持机体免疫平衡的重要生物介质，它参与淋巴细胞的迁移、活化、增殖 与分化以及淋巴组织的再生[3'5]，在抗肿瘤、免疫防御和炎症反应中发挥重要作用。但值得 注意的是，TNF-α具有双重生物学效应 [6]，一方面TNF和受体系统能够诱导细胞程序化死 亡（即细胞凋亡），另一方面它又能促进细胞增殖、分化和成熟使细胞得以存活并产生相应 的多种生物学效应。正常情况下，TNF和受体系统维持着这两方面功能的平衡，当这种平衡 在某些病理条件下被打破时，便可导致机体免疫环境和功能紊乱，发生疾病。
[0011] Shenm等研究表明，抗TNF-α抗体（例如Humira)能够同时结合游离TNF-α和 细胞膜表面的TNF-α，从而阻止了 TNF-α与受体系统的结合，平衡TNF-α和受体系统的关 系，起到治疗疾病的目的。图7示出了此类抗体药与细胞膜表面TNF-α结合后产生的一系 列生物学反应。
[0012] (三）治疗性抗TNF抗体药
[0013] TNF是机体免疫系统的一个关键性的细胞因子，多种自身免疫性疾病中发现TNF 过表达。目前，使用抗TNF抗体药可以治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强制性关节 炎、银屑病、克罗恩病和炎性肠炎等。有5种TNF-α拮抗剂可用于临床，包括Etanerc印t、 Infliximab、Adalimumab、Golimumab 和 Certolizumab pegoL·
[0014] 因为肿瘤坏死因子在免疫调节上起关键作用，TNF抗体药的可能临床适应症多 达20余种。目前欧美尚有几十个临床实验扩展TNF抗体药的适应症。这些适应症包括： 寻常性银屑病（Psoriasis Vulgaris)、急性移植物抗宿主病（Acute Graft Versus Host Disease)、白血病、皮肤粘膜淋巴结综合征（Mucocutaneous Lymph Node Syndrome)、川崎 病（Kawasaki Disease)、盘状红斑狼疮（DLE)、移植物抗宿主病、HIV感染、Moderate to Severe Active Axial脊椎关节炎、扁平苔藓（Lichen Planus)、肺炎、特发性肺炎综合征 (Idiopathic Pneumonia Syndrome)、肺癌、前列腺癌、肿瘤转移、Bone Cancer Stomatitis、 包涵体肌炎（Inclusion Body Myositis)、风湿性多肌痛（Polymyalgia Rheumatica)、 急性非感染性肺功能障碍（Acute Non-Infectious Pulmonary Dysfunction)、I 型糖尿 病、皮肌炎（Dermatomyositis)、代谢综合征、肥胖症、高血压、高血脂、狼疮性肾炎（Lupus Nephritis)、腰骶神经根病（Lumbosacral Radiculopathy)、慢性梗阻性肺疾病恶化（C0PD Exacerbation)、支气管炎、克罗恩氏病、结肠炎。
[0015] 1) ·抗 TNF α 抗体：Humira
[0016] I"3 年英国 Cambridge Antibody Technology 与美国 BASF Bioresearch Corporation的联合研究中心通过噬菌体展示技术发现了全人源抗TNF单克隆抗体的潜在 临床价值。1999年全人源抗TNF单克隆抗体药（Humira)早期临床试验取得了较好的初步 结果，为全面深入的开展临床试验奠定了基础。2001年271例类风湿关节炎的临床试验结 果证明，50%的病人联合使用Humira和甲氨蝶呤取得了至少50%以上的病情改善。2002 年Abbott公司建设了一个先进的生物制品车间生产Humira。2002年12月31号，美国FDA 正式批准Humira用于治疗类风湿性关节炎。2003年Humira上市销售，用于治疗类风湿性 关节炎，同时开展其他适应症的临床试验。2005年美国FDA批准Humira用于治疗银屑病关 节炎，当年首次取得了 10亿美元的销售额。2005年12月10日，在日本申请了类风湿性关 节炎的新药证书。2006年申请了克罗恩氏病的新药证书，并且FDA批准用于治疗强直性关 节炎。当年的销售突破20亿美元。2007年FDA批准Humira在美国用于治疗克罗恩病，同 时，Abbott申请了全球范围内的银屑病治疗，这也是Humira的第5个适应症。当年12月 10日，Abbott在Puerto Rico建设一个全新的生物制品车间，用于生产Humira。销售额突 破30亿美元。2009年6月10日，Abbott公司连续5年的临床数据揭示，同时使用Humira 和甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎病人，可以阻止病人的骨髓破坏。销售额突破56亿美元。 2011年，美国的消化疾病周上，Abbott公布了 Humira治疗溃疡性结肠炎的III期临床试验 积极成果，并且近期已经向美国和欧盟监管部门提交Humira用于溃疡性结肠炎的申请，预 计将于2011年获批 [8]。
[0017] Humira的临床应用
[0018] 风湿性关节炎--HUMIRA适用于中度至重度活动性风湿性关节炎成人患者，可减 轻体征和症状，产生显著临床疗效，抑制结构性损伤的恶化，改善身体机能。HUMIRA既可单 独使用，又可与甲氨蝶呤或其他非生物性改变病情抗风湿药（DMRD)联合使用 [9]。
[0019] 幼年特发性关节炎一一HUMIRA适用于4岁及4岁以上的中度至重度活动性多关 节型幼年特发性关节炎儿科患者，可减轻体征和症状。HUMIRA既可单独使用，又可与甲氨蝶 呤联合使用。
[0020] 银屑病关节炎一HUMIRA适用于活动性风湿性关节炎成人患者，可减轻体征和症 状，抑制结构性损伤的恶化，改善身体机能。HUMIRA既可单独使用，又可与非生物性DMARD 联合使用。
[0021] 强直性脊柱炎--Humira适用于活动性强直性脊柱炎成人患者，可减轻体征和症 状。
[0022] 克罗恩氏病（Crohn病）--Humira适用于常规疗法疗效不足的中度至重度活 动性Crohn克罗恩病病成人患者，可减轻体征和症状，引起并保持临床缓解。对于那些 infliximab已对其失去疗效或者不耐受infliximab的患者，Humira可减轻他们的体征和 症状，并引起临床缓解。
[0023] 斑块状银屑病--Humira可用于治疗适合全身性治疗或光线疗法、以及从医学角 度来说其他全身性疗法不甚适合的成年中度至重度慢性银屑病患者 [1°]。
[0024] 2).其他TNFa拮抗剂
[0025] 目前有5种TNF- a拮抗剂可在国外上市，包括Etanercept、Infliximab、 Adalimumab (即 Humira)、Golimumab 和 Certolizumab pegol，其中前 3 种药物在我国已 上市并广泛应用。和Etanercept依那西普比，Humira疗效更好，剂量低/生产成本低 (Etanercept 依那西普每周 50mg，Humira 每两周 40mg);和 Infliximab 比，Humira 疗效 更好，剂量低/生产成本低（Infliximab每月600mg，Humira每两周40mg)，副作用小， Infliximab是人鼠嵌合抗体，易引起HAMA免疫反应和休克，而Humira是全人源抗体。
[0026] Etanerc印t是一种完全人源化的重组可溶性TNF p75受体二聚体融合蛋白，是注 射用重组人II型TNF受体-抗体融合蛋白。它与循环血液中可溶性TNF受体结合，减少与 组织细胞表面TNF受体结合的TNF，从而阻断炎症信号转导，减少组织损伤。多项临床试验 表明，使用多种DMRD药物治疗失败的长期RA患者，Etanerc印t单一治疗或与甲氨蝶呤联 用均有较好的耐受性，并能持续改善患者的疾病活动性。不良反应包括局部反应、条件致病 性感染、血液系统毒性、肉芽肿等。以局部反应最常见，皮肤注射部位可发生皮疹、盘状狼 疮、皮肤血管炎等，也有皮肤感染和皮肤肿瘤的报道[11]。
[0027] Infliximab是一种人鼠嵌合的抗TNF-a-IgGl κ同型链单克隆抗体，进入人体 后，与具有TNF-α表达的关节组织细胞起作用，破坏该细胞和使该细胞活性下降。Gao等 [12]研究表明，短期内用Inf Iiximab治疗中重度患者效果好，有助于缓解RA影像学的进展， 用于中重度患者此作用尤为明显。Infliximab治疗风湿病相对安全，可能会出现皮肤不良 反应、输液反应，或导致感染风险增加和结核易感性等。
[0028] Adalimumab (阿达木单抗）是完全人源化的重组单克隆TNF抗体。2002年12月 FDA批准Adalimumab (商品名Humira)可用于治疗对一种或多种抗风湿药物疗效欠佳的中 重度活动性RA。应用Adalimumab治疗后以感染（如上呼吸道、鼻窦炎等）、注射部位反应、 头痛和局部皮疹等不良反应最为常见，发生率>10%。
[0029] 上述3种TNF α拮抗剂有望用于妊娠患者。传统的DMARD多属FDA分类法中的C、 D和X类药物，对胎儿毒性较大，应避免使用，病情需要使用时应谨慎使用。而Etanerc印t， Infliximab和Adalimumab均归为FDA分类法中的B类[13]。有资料显示，至今尚无证据表 明TNF-α拈抗剂具有胚胎毒性、致畸性或导致流产率升高。要得出此结论尚需大量的病例 资料[14]。
[0030] Golimumab 和 Certolizumab pegol 是 2 种新型 TNF-α 拮抗剂。2009 年 4 月 FDA 批准Golimumab(商品名Simponi)用于治疗成年人的中度至重度类RA。Golimumab是一种 完全人源化的TNF-α单克隆抗体。主要优点包括注射间隔时间长（每月注射1次），对使 用过TNF- α拮抗剂治疗的RA患者同样有效。使用Golimumab最常见的不良反应包括注射 部位红斑、头疼和恶心，但发生严重感染或恶性肿瘤者数量少。由于缺乏与其他TNF-α拮 抗剂在疗效和安全性评价方面对比的长期实验数据，Golimumab应在其它药物治疗无效后 使用 [15]。
[0031] Certolizumab pegol是由人源抗体的Fab片段和40kDPEG融合组成的一种TNF- α 单克隆抗体，其中PEG分子能增加药物的血浆半衰期。与其他TNF-α拮抗剂相比，由于不 含IgG Fc区，Certolizumab pegol不引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC)和补体 依赖的细胞毒作用（⑶C)[16]。2009年5月FDA批准UCB公司生产的聚乙二醇抗肿瘤坏死因 子Certolizumab pegol (商品名Cimzia)用于中到重度RA患者的治疗。III期临床实验表 明，Certolizumab pegol单用或与MTX联用患者均耐受良好，不良反应轻微或适中。最常 见的不良反应有上呼吸道感染、发疹、尿道感染。注射部位疼痛发生率低。
[0032](四）全人源抗体制备技术
[0033] 人源抗体的制备20世纪70年代中期杂交瘤技术问世，由此制备出的单克隆抗体 (Mb)是抗单一抗原决定簇的抗体，具有高度的特异性和均一性，且能大量制备，这成为抗 体研究领域的一次重大革命。1986年，应用此技术制备的第一个单克隆抗体药物0KT3被美 国FDA批准上市，被用于治疗器官移植后的免疫排斥。但由于抗体是鼠源的，在病人中引发 了严重的免疫反应，这就大大阻碍了抗体药物的发展和利用。
[0034] 随着抗体被用来开发成药物，它的一些特征也将被严格考量，像免疫原性、亲和 力、稳定性、效应功能、半衰期、组织渗透性及其分布等[17]。在鼠源Mb生产变得成熟时，研 究者便预想通过常规的杂交瘤技术生产人源MAb，但由于人杂交瘤细胞系不能稳定的生产 高产量的抗体，并且对于很多抗原来说，人的体内免疫是不可行的。这样，基因工程抗体由 然而生，1994年，第一个嵌合抗体ReoPro获准上市，临床应用表明其免疫原性远优于鼠源 抗体，这就掀起了继杂交瘤单克隆抗体之后抗体工程研究领域的又一次革命。特别是90年 代中期以来，为进一步降低免疫反应的发生，多种人源化改造技术被成功开发并得以应用， 各种各样的基因工程抗体及抗体库不断出现 [18][19]，使得大规模生产医用人源化抗体成为 可能。从1997年开始，大批的单抗药物被FDA批准上市。
[0035] 单抗人源化改造技术的应用打破了抗体药物产业化的瓶颈。迄今，按照人源化 程度的高低大体可分为三种技术：嵌合、人源化和全人源，其基因中人源序列占比分别为 75%、95%和100% [2°]。其中嵌合抗体是将鼠杂交瘤单克隆抗体基因的可变区和人的恒定 区连接在一起，然后在哺乳动物细胞中进行表达产生；而人源化抗体则是除了将抗体的恒 定区换成人源的之外，更进一步的将可变区的FR区转换成人源的 [2°]，从而降低免疫原性； 而全人源抗体制备则是有四种途径，一种从采集的病人血样中构建Fab或者ScFv文库，并 通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAb [21][22]。2002年，第一个全人源MAb，Humira，就 是通过噬菌体展示开发出来的。第二种生产人源抗体的策略是用含有人免疫球蛋白基因位 点的转基因小鼠，进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以 来生产人源MAb [23]，从转基因小鼠衍生而来的人源MAb正在临床试验中。第三种途径是通 过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应 答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进 行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力 [24]，再克隆 进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生 成的 [25]。第四类途径是通过分离和低密度（约500B细胞每96孔）培养人外周血淋巴细 胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获 得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体 [26]。
[0036] 目前国外已批准上市的5种TNFa拮抗剂中，三种为抗体：英夫利昔单抗 (Infliximab,人鼠嵌合单抗）、阿达木单抗（Adal imumab/Humira，全人源单抗）和 Golimumab全人源单抗），二种为类抗体融合蛋白：益赛普（Etanercept，肿瘤坏死因子II 型受体-人抗体Fc融合蛋白）和Certolizumab pegol (人FAb-PEG融合蛋白）。其中英夫 利昔单抗、阿达木单抗和益赛普已在中国批准上市。中信国建制备了益赛普的仿制药也已 在中国批准上市。总体上来说完整单抗疗效为好，单抗中以阿达木单抗疗效好和销售大。这 得益于其较高的亲和力与其结合的TNFa表位。为了得到功效更高的全人源TNFa单抗， 本发明人进行了大量研发，并得到了本发明。
【发明内容】
[0037] 本发明正是以现有TNFa单抗中疗效最好阿达木单抗为基准进行的新分子创制， 本发明的全人源单抗具有更高的亲和力和生物学功效。
[0038] 本发明的全人源单克隆抗体是基于上述第三种途径（即人杂交瘤技术）并加以随 机突变筛选得来的。利用人杂交瘤产生的单克隆抗体被认为是在氨基酸序列和糖基化谱上 都要优于嵌合抗体和人源化抗体的全人源抗体。但是由于难以找到使人杂交瘤稳定传代的 融合伴侣细胞，且由于融合效率低、细胞培养困难及生产能力低等问题，制备稳定传代且能 持续产生单克隆抗体的人杂交瘤细胞系一直存在较大难度，且成功的实例甚少。本发明对 表达人抗体的人杂交瘤快速进行包括特异性和功能学在内的筛选，并将筛选出的杂交瘤细 胞进行分子克隆化以保存抗体基因，从而克服了上述困难。
[0039] 随着人源化和全人源抗体技术的成熟，如何提高抗体的亲和力成了目前所有基因 工程抗体药物需要解决的关键问题。这是因为增加一个抗体的亲和力将降低抗体药物的剂 量并起到更好的生物活性，还可能使其治疗更多的疾病及降低剂量相关的毒性 [18][22]。此 外，费用也将大大降低。多项独立的研究表明，抗体亲和力和生物学活性在达到极限值之前 是成线性关系的。围绕这一问题人们已经从不同的方向展开了研究，提高抗体亲和力的途 径基本有两条途径，其中一个途径是通过随机突变互补决定区（CDR)或是整个的可变区， 然后从这个大量的突变体库里筛选更高亲和力的抗体 [19];另一个途径是通过集中突变或 是建模模拟体内亲和力成熟的热点区域，建立一个小的突变体库[18][19]。综合起来说，当进 行体外抗体亲和力成熟时，应考虑4个主要方面：①在抗体基因的何处导人突变；②如何导 入突变；③如何从较低亲和力的抗体中选择稀有的更高亲和力抗体。④如何鉴别更高亲和 力抗体。
[0040] 本发明提供抗TNFa的一组新抗体，这些抗体为全人源抗体，并且作为一种新药 物，这些抗体部分功效指标与阿达木单抗相同或比之更好。本发明的抗体可用于治疗和诊 断类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、克罗恩氏病、强直性关节炎、银屑病 和/或溃疡性结肠炎，但不限于此。
[0041] 本发明提供了一种抗TNF a的全人源抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区 的CDRl的氨基酸序列为GFTFSSYDMH，CDR2的氨基酸序列为VIWSDGSIKYYADSVKG，CDR3的氨 基酸序列为EVESAMGGFYYNGMDV ;并且所述抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3选自以下 1)、2)和 / 或 3):
[0042] I) CDRl 为 RASQDIGFDLG，CDR2 为 AASSLQS，且 CDR3 为 LQHKSYPLT ;
[0043] 2) CDRl 为 RASQSIGFDLG，CDR2 为 AASSSQS，且 CDR3 为 LQHRSYPLT ;
[0044] 3) CDRl 为 RASQDIGFDLG，CDR2 为 AASTLPR，且 CDR3 为 LQHKSYPLT。
[0045] 在本发明的抗体中，重链可变区的氨基酸序列优选为Seq ID NO :1。在本发明的 抗体中，轻链可变区的氨基酸序列优选选白Seq ID NO :2、Seq ID NO :3和/或Seq IDNO : 4。
[0046] 除了上述互补决定区序列外，本发明的抗体的重链的其他部分的氨基酸序列优选 对应于人IgG2重链，所述抗体的轻链的其他部分的氨基酸序列优选对应于人κ链。
[0047] 本发明的抗体的两条重链可以相同也可以不同。本发明的抗体的两条轻链也可以 相同或不同。
[0048] 本发明还涉及一种抗TNFa的抗体片段，所述抗体片段包含本发明的抗体的至少 一种重链可变区和至少一种轻链可变区且能够有效地识别并结合TNFa。所述抗体片段可 以是 Fab 或 F (ab'）2。
[0049] 本发明还涉及一种抗TNFa的scFv分子，所述scFv包含本发明的抗体的至少一 种重链可变区和至少一种轻链可变区，并且能够有效地识别并结合TNFa。所述scFv分子 还包括多价scFv,例如二价scFv和三价scFv。
[0050] 本发明还涉及一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的抗体的重链和/或轻 链、抗体片段或scFv分子。
[0051] 本发明还涉及一种载体，所述载体中包含本发明的多核苷酸。
[0052] 本发明还涉及一种抗TNF α结合物，所述结合物包含与同位素、免疫毒素和/或化 学药物共价连接的本发明的抗体、抗体片段或scFv分子。所述结合物可以用作例如靶向药 物。
[0053] 本发明还涉及一种偶联物，所述偶联物由本发明的抗体、抗体片段、scFv分子或抗 TNFa结合物与固体介质或半固体介质偶联而形成。
[0054] 根据抗TNFa抗体的性质，本发明的抗体、抗体片段、scFv分子、抗TNFa结合物 或偶联物可用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、 克罗恩氏病、强直性关节炎、银屑病和/或溃疡性结肠炎。
[0055] 因此，本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体、抗体片 段、scFv分子、抗TNF a结合物和/或偶联物。
[0056] 本领域技术人员将知晓的是，上述抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影 响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。本领域技术人员还知晓， 根据上述抗体的氨基酸序列可以设计出编码其的核苷酸序列，并且针对不同的表达宿主对 该核苷酸序列进行优化。为了治疗、检测、实验或其他目的，本发明的抗体可以与同位素、免 疫毒素和/或化学药物共价连接，还可以与固体介质、半固体介质偶联，还可以使用本发明 的抗体的功能性片段，这在本领域中是已知的。
[0057] 本发明提供了一种方法，使用该方法制造全人源抗体并且作为一种新药物。目前 尚未有抗体药物系使用本发明的技术方法成功创制的报道。该方法所克服的最重要的技术 难点是（1)人淋巴细胞体外有效免疫技术；（2)人杂交瘤基因不稳定，必须快速进行包括特 异性和功能学在内的筛选，并将筛选出的杂交瘤细胞进行分子克隆化以保存抗体基因；（3) 对已筛选出具有一定药理学功效的人源抗体通过分子生物学抗体工程技术进行进一步优 化改造。
[0058] 所述抗体的制造及相关检测方法如下：通过提取不同人的外周血淋巴细胞或者是 人扁桃体淋巴细胞，体外混合后，用抗原和具有佐剂功用的分子共培养，使其产生针对抗原 的抗体，通过与骨髓瘤细胞融合，产生临时稳定的人杂交瘤，培养上清中含有其分泌的人源 抗体。通过细胞ELISA筛选出肿瘤坏死因子a阳性杂交瘤细胞生长孔，再以相对抗原亲和 力排序和细胞学生物活性检测试验综合评估筛选最好的10个细胞生长孔，并立即进行亚 克隆，筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株。立即进行测序和分子克隆抗体基因到适当 的表达载体中，并将质粒DNA扩增纯化于-80 °C永久保存。根据抗体抗原亲和力排序和细胞 学生物活性检测试验综合评估筛选最好的1到3个单克隆细胞株的抗体基因，以此作为模 板对其进行体外抗体亲和力成熟工程。我们以对CDRl、CDR2、CDR3区进行随机突变和定点 突变相结合的方式建立抗体亲和力成熟突变文库。以抗原特异性和相对亲和力排序对文库 进行筛选。将每轮最好的5~10抗体的重链可变区（VH)和轻链可变区（VJ进行全排列组 合形成全长抗体。使用瞬转、培养和微量亲和纯化（ProteinA)制备少量纯化抗体，以阿达 木单抗为参照基点，根据抗体抗原亲和力排序和受体配体竞争结合试验进行筛选鉴定。在 经此筛选出来的一组有良好细胞毒功效的抗体分子，再对这些抗体可变区特别是CDR区序 列检索，确定此组具备TNFa特异性的抗体为首次发现的新分子。在此组新分子里有一个 或一个以上的新抗体分子其（1)亲和力比阿达木单抗高（2)受体配体竞争结合试验功效比 阿达木单抗好（3)细胞学中和保护试验（4)在TNF α介导致死C 57BL/6小鼠动物模型中， 全人抗TNF α抗体的保护作用和阿达木单抗相同和更好。
[0059] 在确定本发明的抗体的氨基酸序列后，可以通过人工合成编码该抗体的多核苷酸 并选取适合的宿主进行有效地表达来制备该抗体，这在本领域中是公知的。
[0060] 除非特别说明，在本文中"Humira"、"Adalimumab"和"阿达木单抗"可以互换使用。
【附图说明】
[0061] 图1 :经亲和力成熟库淘选后，3000个单克隆ScFv抗体对rhNFa结合的ELISA检测 结果。从每轮次不同淘选浓度的重组噬菌体抗体文库中，选择单克隆密度适宜的平板，挑取 1000到3000个单克隆到96深孔细菌培养板中进行培养和诱导表达，收集上清进行ELISA 检测（纵轴为〇D450nm吸光度；横轴为检测上清的样本数）；
[0062] 图2 :H3L4全人源单抗针对单体rhTNF α的亲和力测定结果（SPR技术）；
[0063] 图3 :H3L5全人源单抗针对单体rhTNF α的亲和力测定结果（SPR技术）；
[0064] 图4 :全人源H3L4单抗和阿达木单抗抑制TNF α诱导的MCF-7细胞毒试验；H3L4 单抗的IC50为0. 45ng/ml，阿达木单抗的IC50为8ng/ml ;
[0065] 图5 :全人源H3L4单抗和阿达木单抗的动物体内药理药效试验方案。
[0066] 图6 :TNF和受体的系统信号转导途径[4]。
[0067] 图7 :TNF_a抗体与细胞膜表面TNF-α结合后产生的一系列生物学反应。
【具体实施方式】
[0068] 下文将通过具体的实施例来阐明本发明，但应理解的是，以下实施例并不限制本 发明的范围。
[0069] 实施例
[0070] 实施例1 :杂交瘤和载体的制备
[0071] 1.抗原和淋巴细朐的准各及免疫
[0072] I. 1抗原TNFa蛋白准备
[0073] 人的TNF α蛋白（药靶）和猴的TNF α (药靶）蛋白购白义翘神州，用PBS稀释后， 用0. 22 μ m针式无菌滤器过滤后分装于I. 5ml细胞冻存管中于-80°c保存。
[0074] 1.2人淋巴细胞准备
[0075] 无菌摘取慢性扁桃体炎新鲜组织样本（与徐州医学院附院耳鼻喉科合作，扁桃体 取自扁桃体摘除手术的病人，10例病人，年龄5~10岁），用淋巴细胞分离液（GE)分离出 其中的淋巴细胞，取30 X IO6个；无菌抽取人新鲜外周血细胞，用淋巴细胞分离液（GE)分离 出其中的淋巴细胞，取30X IO6个。
[0076] L 3体外淋巴细胞免疫
[0077] 淋巴细胞培养基配方如下。1升的DMEM中含：20%胎牛血清、1%的200毫摩尔左 旋谷氨酸（3丨81^，〇 &七#62150)、1%的100\的非必须氨基酸（5丨8111&，〇&七#17145)、1%的 100 X青霉素链霉素混合液（Sigma，cat. #P7539,10, OOOU/ml青霉素+10mg/ml链霉素）、10 单位/每毫升白介素6 (Boehringer Mannheim，cat. #1299972)、20单位/每毫升人重组白介 素2 (R&D system，cat. #202-IL-050)、20微克/每毫升美洲商陆有丝分裂原（PWM) (Sigma， cat.#L8777)、l纳克/毫升无内毒素 CpG(定制合成）、1支OPI细胞培养添加剂（Sigma， cat. #05003)。
[0078] 两种来源的16位个体淋巴细胞混合后在含20% FBS的RPMI-1640培养基中进行 混合培养，淋巴细胞终浓度为5X105个/ml，同时加入下述步骤2. 1中获得的小鼠腹腔饲养 细胞（终浓度为I X IO5个/ml)，非必需氨基酸（终浓度为1 μ g/ml)，TNF α抗原（蛋白免 疫：终浓度为1 μ g/ml)，并放于二氧化碳培养箱中共培养6-12天（第5-6天换一次新鲜培 养液）。
[0079] 2.杂夺瘤细朐的制各
[0080] 2. 1饲养细胞的准备
[0081] 在融合前一天，断颈处死BALB/c小鼠（从北京维通利华实验动物技术有限公司购 买），浸泡于75%酒精中5分钟，在超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，露出腹膜， 用注射器注入腹腔内IOml HAT培养基（20%?85，撤11\，其余为01^1)，反复吹吸，吸出培 养基放入50ml离心管内，台盼蓝细胞计数，调整细胞浓度为2X105个/ml，加入96孔板， 100 μ 1/孔，放入二氧化碳培养箱中过夜。此操作适用于所有需要用到小鼠腹腔饲养细胞的 实验中。
[0082] 2. 2骨髓瘤细胞准备（骨髓瘤细胞P3X63Ag8. 653购白中科院上海生命科学研究院 细胞资源中心）
[0083] 培养至对数生长期，lOOOrpm，离心5分钟，用不含FBS的DMEM悬浮，1000 rpm离心 5分钟，轻弹底部，用不含FBS的DMEM培养基悬浮，台盼蓝计数，细胞活性为95%。
[0084] 2. 3细胞电融合及HAT筛选
[0085] 收集与TNFa抗原共培养6天后的淋巴细胞，台盼蓝计数活细胞，1300rpm离心5 分钟，弃上清，轻弹底部，用少量不含FBS的DMEM培养基悬浮；与同样数量的骨髓瘤细胞充 分混匀，补DMEM培养基至40ml，2000rpm离心5分钟，弃上清；
[0086] 加入2ml无菌pronase溶液（CalBiochem，53702)，轻微悬浮细胞团后，作用2分 钟，加入3-5ml FBS终止，再加入电融合溶液至40ml，2000rpm离心5分钟，弃上清；加入少 量电融合溶液轻轻悬浮细胞团后，补加至40ml，2000rpm离心5分钟，弃上清；轻弹底部，加 入电融合溶液，细胞计数，调节细胞至2X IO6个/ml，分成2ml/管；按照2ml体积的秒数进 行设定，启动电融合装置（BTX);融合后，1000 rpm离心5分钟，弃上清；加入少量HAT培养基 悬浮细胞后，加入适量体积的HAT培养基，按照融合时候的淋巴细胞加入量，I X IO6个/板， 加入之前铺好饲养细胞的96孔板中，放入二氧化碳培养箱中进行培养。
[0087] 融合后7天，用HAT培养基进行1/2换液，融合后10天，用HAT培养基全换液。
[0088] 2. 4细胞上清抗原特异性ELISA检测
[0089] 包被：融合后12天，用双套ELISA法检测特异性抗体，一套为人TNF α蛋白包被， 一套为猴TNF α蛋白包被。4°C过夜包板，浓度为50万个细胞膜/50 μ 1/孔，包被液为ΡΗ8. 3 的 1% BSAPBS。
[0090] 封闭：用PBST洗板3次后以10%脱脂牛奶粉PBS封闭，室温孵育1小时。然后用 PBST洗板3次。
[0091] 加样：吸出50ul细胞上清至孔中，阴性对照为1 : 1000人血清（健康成人捐献）， 阳性对照为0. lug/ml阿达木注射液。室温孵育2小时后，用PBST洗板3次。
[0092] 二抗：然后加入次辣酸根过氧化酶标记的山羊抗人IgGHRP(Goat Anti-Human IgG H&L-HRP，货号：ab81202)，50 μ //孔，室温孵育1小时后，用PBST洗板3次。
[0093] 显色：TMB显色，50 μ 1/ml TMB，10~15分钟后以2M盐酸终止显色反应。A45tl读 数。
[0094] 选取阳性杂交瘤生长孔标准：人和猴TNFa蛋白包被ELISA同时呈阳性，并且人血 清蛋白包被ELISA相应孔阴性，为抗原特异性。
[0095] 2. 5扩大培养
[0096] 第一次检测后，选择阳性孔扩大至4个96孔平板培养，过2天，对所扩孔进行检 测，确定阳性孔，扩大至24孔。待24孔细胞长至孔底约1/3,则进行ELISA检测。此方法同 样适用于后期抗体的检测。
[0097] 2. 6细胞上清人抗体定量检测
[0098] 对步骤2. 5产生的经再次ELISA鉴定后仍为阳性的细胞孔培养上清，使用 BethylLaboratories的人Ig定量检测ELISA试剂盒（货号E88-104)，具体步骤按试剂盒 说明书进行。
[0099] 2. 7相对亲和力排序
[0100] 样品准备：待比较的抗体：已知浓度的纯化抗体，或由步骤2. 6定量检测后已知所 含抗体浓度的细胞培养上清，稀释到4~8个相同浓度（120nM，40nM，13. 1ηΜ，4. 4nM)。然后 按2. 4中描述的步骤进行ELISA检测。由于所有样品事先调整到相同抗体浓度，OD值的差 异将由抗体的亲和力引起。OD值越高相对亲和力就越高。使用Prism软件作图和计算出相 对每一抗体的亲和力。综合实施例3~5和此检验结果，选出抗原亲和力和功能学效能最 高的 10 个细胞生长孔，BP L 1、1· 5、1· 6、1· 6、1· 24、2· 2、2· 39、3· 85、3· 12、3· 37。
[0101] 2. 8有限稀释法亚克隆、细胞扩大培养
[0102] 于亚克隆前一天或者是当天采集小鼠腹腔饲养细胞（用HT培养基），细胞浓度为 IX IO5个/ml，加入96孔板，IOOul/孔。对经步骤2. 7检测后筛选的I. 1、1. 5、1. 6、1. 6、 I. 24、2. 2、2. 39、3. 85、3. 12、3. 37阳性杂交瘤细胞株分别进行台盼蓝染色计数后，将细胞分 别按以下浓度铺到板子中，密度为5个/孔,铺1块；1个/孔,铺1块；0. 5个/孔,铺2块。 放入二氧化碳培养箱中进行培养5-7天后，经倒置显微镜从孔底观察细胞，用记号笔圈下 确认为单克隆的孔。只转移这些单克隆孔的细胞培养上清，50微升每孔，进行ELISA检测 (见2. 4方法）。在经ELISA确定抗原阳性的孔里，根据细胞状态和OD值，从被亚克隆的每 杂交瘤细胞株（1. 1、1· 5、L 6、L 6、L 24、2· 2、2· 39、3· 85、3· 12、3· 37)中选取最好的 3-5 个 单克隆细胞孔的上清进行下步骤（2.9)的鉴定。
[0103] 2. 9亚类的鉴定
[0104] 用Zμg/ml羊抗人IgG(Fc)包被平板，4°C过夜，再用BSA封闭，加入待测细胞上 清，37°C下温育2小时，而后加入酶标亚类二抗IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，κ，λ (Southern Biotechnology),显色，A45c!读数，判断所测细胞株的亚类为IgG2，κ。在加液前每步都用 PBST洗涤3次。从被亚克隆的每杂交瘤细胞株中由步骤2. 8筛选出的3-5个单克隆细胞孔 里，选定一个确定为IgG2-κ的单克隆细胞株，其分别为：1. 1. 71、1. 5. 58、1. 6. 17、1. 24. 2、 2· 2· 108、2· 39. 45、3· 85. 3、3· 4. 32、3· 12. 78、3· 76. 109。将此 10 个单克隆细胞株扩大至 24 孔（用含20% FBS的DMEM培养基），待细胞长好，检测后，扩大至方瓶。
[0105] 2.10细胞冻存
[0106] 冻存液配制：10% DMS0,60% FBS，30% DMEM，放于冰上预冷，细胞吹悬后，放入离 心管中，台盼蓝计数，离心，弃上清，加入预冷冻存液，按2~5X IO6个/管，进行冻存。细 胞放入程序降温盒（Nalgene)后置于-70°C冰箱过夜，第二天转入液氮中。
[0107] 2. 11测序、克隆单克隆人杂交瘤基因
[0108] 杂交瘤进行亚克隆后，筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株I. 1. 71、1.5. 58、 L 6· 17、1· 24. 2、2· 2· 108、2· 39. 45、3· 85. 3、3· 4. 32、3· 12. 78、3· 76. 109。立即进行测序和分 子克隆，抗体基因进入适当的表达载体，并将质粒DNA扩增、纯化、于-80°C永久保存。
[0109] 实施例2 :单克隆抗体制备及鉴定
[0110] 1.采用体外培养法制各抗体
[0111] 将含有15%胎牛血清的DMEM培养基中生长的I. I. 71、1. 5. 58、1. 6. 17、1. 24. 2、 2· 2· 108、2· 39. 45、3· 85. 3、3· 4. 32、3· 12. 78、3· 76. 109 细胞，逐渐降低血清至无血清或者 是只含有少量血清的无血清培养基中（Invitrogen，12338-026)，放入225cm 2方瓶，按接种 IX IO5个/ml的细胞量，接种100ml，每株细胞各接种4瓶。
[0112] 2.抗体钝化
[0113] 取出在225cm2方瓶培养了 10天左右的细胞上清，离心，去掉细胞碎片，经 rProteinA亲和层析进行抗体纯化。pH7. 4的细胞培养上清经0. 22 μ m虑膜过滤后直接上 样，而后用pH7. 4PBS流洗10倍的柱床体积，再用pH3. 0甘氨酸溶液洗脱， 每段0. 5ml收集 洗脱液。读每段OD28tl，将含有抗体的各段混合。再检测OD28tl，按1.580D=lmg计算抗体浓 度。将收集的抗体溶液过滤〇. 22 μ m的滤器后无菌保存。用SDS-PAGE胶核实纯化抗体纯 度。进行LAL测试确定无内毒素污染（Genscript，Cat :L00350)，将此纯化抗体用于亲和力 试验（实施例4)、细胞学功能试验（实施例5)、动物体内药理药效试验（实施例6)。基于 对TNFa亲和力和对TNFa细胞毒抑制活性试验，3. 12. 78被选定为模板单抗进行亲和力成 熟（对其⑶Rl/⑶R2/⑶R3改进及优化）。
[0114] 3.实施例3:亲和力成熟
[0115] 为了提高该抗体的亲和力，采用已构建的单链抗体scFv为模板，进行随机突变， 并将突变的单链抗体进行噬菌体展示，然后通过ELISA筛选得到更高亲和力的抗体。
[0116] 3. 1测序Anti-TNF a的重链和轻链
[0117] 经免疫、融合以及单克隆化后，基于亲和力和细胞功能学实验结果选取抗TNFa 单克隆抗体细胞株为模板做抗体亲和力成熟实验。
[0118] 抗体基因重链和轻链的序列分析。抗TNFa单克隆抗体细胞的总RNA采用 Invitrogen公司的ΤΗ/.〇Η.ν reagent试剂盒（15596-026)进行提取；接着米用Takara公司 的5' RACE FULL试剂盒（D315)中的随机引物，以总RNA为模板，反转录为第一链eDNA，并按 照试剂盒的说明书操作步骤，在5'端加上接头；然后用试剂盒白带的接头引物，分别和人 重链基因 IgG2恒定区特异引物以及轻链基因 κ链恒定区特异性引物（见下）一起进行扩 增，得到抗TNFa单克隆抗体基因的重链可变区和轻链可变区。用于PCR扩增的重链和轻 链特异引物是：
[0119] IgG2 反向引物：GCGCCTGAGTTCCACGACAC
[0120] κ 链反向引物：CACAACAGAGGCAGTTCCAG
[0121] 将PCR扩增产物克隆到T载体（Takara，D101A)，并进行测序，测序得到一致的重 链可变区VH和轻链可变区VL (在本文中称之为"源生型" VH和VL)。
[0122] 3. 2源生型scFv抗体的构建及并以源生型scFv抗体为样品建立ELISA检测方法 学
[0123] 根据3. 1中的测序结果，设计重链可变区和轻链可变区特异性引物，并分别在重 链可变区5'端和3'端加上SfiI位点和XhoI位点，轻链可变区5'端和3'端加上NheI位 点和NotI位点，重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)特异性扩增引物如下 ：
[0124] VH 正向引物：ACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
[0125] VH 反向引物：CCACCACTCGAGGC GCTCGAGACGGTGACCAGGGT
[0126] VL 正向引物：TGGCGGGTCGACG GATATTGTGATGACCCAGACT
[0127] VL 反向引物：TGTTCTGCGGCCGC TTTGATCTCCACCTTGGTC
[0128] 分别以完全正确的源生型VH和VL克隆为模板，PCR扩增重链可变区和轻链可变 区后，酶切，分步克隆到噬菌体展示载体PFL249 (基因合成构建），进行测序验证。
[0129] 选择测序正确的克隆转化到TGl感受态细胞（Stratagene，200123)中，挑取单克 隆进行培养、诱导、收集上清，以TNF α蛋白为抗原进行ELISA检测。
[0130] 3. 3随机突变scFv抗体库的构建、筛选及测序分析
[0131] 米用 Stratagene 公司的GeneMorph II Random Mutagenesis 试剂盒（200550)，以 VH正向引物和VL反向引物进行易错PCR扩增，将扩增好的PCR产物进行纯化、酶切、连接到 PFL249载体上，然后电转化到TGI感受态细胞中，通过加入辅助噬菌体M13K07恢复噬菌体 完整功能生产随机突变重组噬菌体抗体文库。分别以1000纳克/毫升、100纳克/毫升、10 纳克/毫升、1纳克/毫升的人肿瘤坏死因子α蛋白包被进行多轮逐步递次淘选。并对每 个不同淘选浓度淘选后的逐步提高亲和力的富集文库铺板留存和克隆。从每轮次不同淘选 浓度重组噬菌体抗体文库中，单克隆密度适宜的平板上挑取1000到3000个单克隆到96深 孔细菌培养板进行培养和诱导表达，收集上清进行ELISA检测（例举ELISA检测结果见图 1)，在OD值比源生型阳性对照高的单克隆中，根据OD值从高到低选择200个单克隆进行测 序。分析测序结果，去除FR区突变的非人源克隆后，根据OD值，从高到低，分别选择20个 突变的VH和VL用于构建全长抗体。
[0132] 3. 4构建全长抗体及亲和力排序
[0133] 3. 4. 1根据之前的结果，设计重链可变区和轻链可变区特异性引物，并分别在重链 可变区5'端和3'端加上SfiI位点和Sail位点，轻链可变区5'端和3'端加上SfiI位点 和BsiwI位点，重链可变区和轻链可变区扩增引物如下：
[0134] VH 正向引物 I : TGGCAGCGGCCACAGGGGCCCACTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
[0135] VH 反向引物 I :GCCCTTGGTCGACGC GCTCGAGACGGTGACCAGGGT
[0136] VL 正向引物 I : TGGCAGCGGCCACAGGGGCCCACTCC GATATTGTGATGACCCAGACT
[0137] VL 反向引物 I :AGCCACCGTACG TTTGATCTCCACCTTGGTC
[0138] 分别以源生型的VH和VL克隆，以及突变后的20个VH和20个VL克隆为模板， PCR扩增重链可变区和轻链可变区后，酶切，分别克隆到含有人的IgG2恒定区和人的κ恒 定区pCI载体（Promega，E1731)上，并进行测序验证。
[0139] 3. 4. 2分别将突变后的20个全长重链与源生型的全长轻链组合，将突变后的20个 全长轻链与源生型的重链组合，将共40种组合采用FreeStyle MAX转染系统（Invitrogen， 16447-100)共转染到CHO-S细胞中，37°C，8% CO2培养6天后，离心收集上清。
[0140] 按前述实施例1中2. 6步骤方法进行40个抗体上清中抗体浓度定量，然后按前述 实施例1中2. 7步骤方法进行相对亲和力排序。依据相对亲和力排序结果分别选定5个亲 和力最高的重链命名为HI、H2、H3、H4、H5和5个亲和力最高的轻链LI、L2、L3、L4、L5。
[0141] 3. 4. 3将上一步筛选到的5个重链突变体和5条轻链突变体相互组合，配成25个 全长突变抗体：HIL1，H1L2, H1L3, H1L4, H1L5, H2L1，H2L2, H2L3, H2L4, H2L5, H3L1，H3L1， H3L2, H3L3, H3L4, H3L5, H4L1，H4L2, H4L3, H4L4H4L5, H5L1，H5L2, H5L3, H5L4, H5L5。将它 们重轻链共转染，培养、收集上清，ProteinA纯化，再使用SPR技术通过ProteOn进行亲和 力测定。
[0142] 实施例4亲和力试验
[0143] 按ProtOn标准试验操作指导进行亲和力测试。选用固化待测抗体与芯片上，流过 单体人肿瘤坏死因子α蛋白模式。抗体可以为上清或纯化蛋白。具体而言，将4mMl-(3_二 甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和ImM羟基硫代琥珀酰亚胺（Bio-Rad)混合后立 即注射以活化芯片持续60秒，然后立即注射溶于IOmMlOmM醋酸纳（pH5. 0)溶液中浓度为 20 μ g/ml的单抗（例如H3L4或H3L5)，按30微升/分钟速度持续240秒。以IM盐酸乙酸 异丁酯灭活。将芯片旋转90度，用运行缓冲液冲洗至基线稳定后，平行注射五个不同浓度 单体rhTNFa (44、22、11、5. 5和2. 75nM)和运行缓冲液，分别进入芯片的6个相应轨道。结 合相为100微升/分钟持续200秒，离解相600秒；
[0144] 结果见图2、图3和下表1。图2和图3中的曲线为不同浓度单体rhTNFa与固化 在芯片上的抗体H3L4和H3L5结合-离解曲线，按I : 1结合模式计算，H3L4全人源单抗针 对单体rhTNFa的亲和力为3. 6pM，H3L5全人源单抗针对单体rhTNFa的亲和力为20. 6pM。 结果显示，在25个新创抗体中，有20个H/L组合（即1-2、5、9-25号）比阿达木的亲和力 高。4个（即3、4、6、8)和阿达木相似。1个（7)比阿达木低。其中，H3L4单抗的抗体亲和 力比阿达木约强50倍。
[0145] 表125个新创全人源单抗和阿达木单抗针对单体人TNF a亲和力
[0146]
[0147] 实施例5 :细胞学功能试验
[0148] 5. 1抗体中和活性检测
[0149] TNF-α与受体结合会刺激信号通路，通过一系列的级联反应引起炎症、细胞坏死 等作用。当内分泌出现紊乱，TNF-α在正常组织中也会大量聚集，对正常组织造成伤害， 从而引起类风湿性关节炎等疾病。单克隆抗体药物能够特异性与TNF-α结合并阻断其与 受体的相互作用，从而抑制TNF- α对正常组织的杀伤作用，达到控制并缓解症状体征的目 的。针对WBP112单克隆抗体药物的体外生物学活性检测方法是基于该作用机理（MOA)进 行设计并开发的。
[0150] 在放线菌素 D (ActD)存在的情况下，rhTNF- α与小鼠成纤维细胞L929表面 TNF-α受体相互作用会导致细胞的迅速解离、死亡。抗TNFa单克隆抗体药物能特异性的 与rhTNF-a结合，阻断其与受体的相互作用，中和rhTNF-a对L929细胞的细胞毒性作用。 通过考察药物对rhTNF- α细胞毒性的中和抑制作用来检测其生物学活性。
[0151] 前述25个抗体和阿达木单抗的中和活性检测结果见表20H3L5的生物学活性约为 阿达木的3. 5倍，H3L4、H3L2的生物学活性约为阿达木的2. 4倍。重链H3的可变区（VH3) 的氨基酸序列为Seq ID No. 1 ;轻链L5、L4、L2的可变区（VL5、VL4、VL2)的氨基酸序列分 别为Seq ID No. 2、3、4(详见氨基酸序列表）。在所附的序列表中，带下划线的氨基酸序列 表示相应序列的各CDR。
[0152] 表225个新创全人源单抗和阿达木单抗的中和活性检测结果
[0153]
[0154] 5. 2H3L4抑制TNFa弓丨起的癌细胞（MCF-7)凋亡
[0155] 在一定条件下，将人TNF a和癌细胞（MCF-7)共孵育，TNF a可诱导大约40 %的癌 细胞（MCF-7)凋亡。
[0156] 图4显示，H3L4与阿达木单抗，均可抑制TNFa弓丨起的癌细胞（MCF-7)凋亡，随着 剂量的增加，抑制作用逐渐增强，直至完全抑制TNFa引起的细胞凋亡。将TNFa引起的 凋亡效应降低至一半所需要的药量（术称IC50,半数抑制浓度）是药理上比较不同药物药 效的常用指标，本实验结果表明H3L4单抗的IC50为0. 45ng/ml ;阿达木单抗IC50为8ng/ ml，，H3L4单抗的IC50比阿达木单抗强约18倍。
[0157] 实施例6全人源H3L4单抗和阿达木单抗对TNFa介导的小鼠致死性的保护试验
[0158] 已知肿瘤坏死因子α和半乳糖葡胺（D-GaIN)共注射，可以导致小鼠死亡。抗 TNF α单抗可以抑制这一病理过程，挽救实验动物的死亡。
[0159] 本实验使用C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，试验设计见表3和 图5。试验结果见表4。结果显示在相同给药量15纳克/公斤情况下，H3L4保护试验小鼠 免于死亡的功效比阿达木强4倍。
[0160] 表3.全人源H3L4单抗和阿达木单抗对TNFa介导的小鼠致死性的保护试验设计
[0161] 动物：C57BL/6小鼠，雌性，18-20克
[0162] 试验材料：人肿瘤坏死因子（Invitrogen，PHC3013)、D-半乳糖葡胺 (SIGMA-G1639)、阿达木单抗注射液（雅培）、H3L4单抗（本发明）。
[0163] 分组、给药途径和剂量：
[0165] 表4.全人源H3L4单抗和阿达木单抗对TNFa介导的小鼠致死性的保护试验设计
[0167] 本发明带来的有益效果
[0168] 本发明正是针对TNFa药靶创制的新抗体分子：1)它具有比现在市场上的同类药 物Humira有更好的功效；2)中国国内原创新分子新药，3)可以以更低的价格和更好疗效治 疗和造福风湿性关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮，脊柱硬化症、阶段性结肠炎、溃 疡性结肠炎和过敏性 疾病；4)潜在可能治疗I型糖尿病、肥胖症/高血压/高血脂和某些 癌症。
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【主权项】
1. 一种全人源抗体，其特征在于： 所述抗体的重链可变区的⑶Rl的氨基酸序列为GFTFSSYDMH，⑶R2的氨基酸序列为VIWSDGSIKYYADSVKG，CDR3 的氨基酸序列为EVESAMGGFYYNGMDV;并且 所述抗体的轻链可变区的互补决定区选自以下1)、2)和/或3): 1. CDRl为RASQDIGFDLG，CDR2 为AASSLQS，且CDR3 为LQHKSYPLT; 2. CDRl为RASQSIGFDLG，CDR2 为AASSSQS，且CDR3 为LQHRSYPLT; 3)CDR1 为RASQDIGFDLG，CDR2 为AASTLPR，且CDR3 为LQHKSYPLT。2. 如权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SeqIDNO: 1〇3. 如权利要求1或2所述的抗体，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列选白SeqIDNO: 2、SeqIDNO:3 和 / 或SeqIDNO:4。4. 一种抗TNFa的抗体片段，所述抗体片段包含权利要求1~3中任一项所述的抗体 的至少一种重链可变区和至少一种轻链可变区。5. 如权利要求4所述的抗体片段，所述抗体片段为Fab或F(ab'）2。6. -种抗TNFa的scFv分子，所述scFv包含权利要求1~3中任一项所述的抗体的 至少一种重链可变区和至少一种轻链可变区。7. -种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1~3中任一项所述的抗体的重链和/ 或轻链、权利要求4或5所述的抗体片段或权利要求6所述的scFv分子。8. -种载体，所述载体中包含权利要求7所述的多核苷酸。9. 一种抗TNFa的结合物，所述结合物包含与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价 连接的权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求4或5所述的抗体片段或权利要求 6所述的scFv分子。10. -种偶联物，所述偶联物由权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求4或5 所述的抗体片段、权利要求6所述的scFv分子或权利要求9所述的结合物与固体介质或半 固体介质偶联而形成。11. 权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求4或5所述的抗体片段、权利要求 6所述的scFv分子、权利要求9所述的结合物或权利要求10所述的偶联物在制备用于治疗 下述疾病的药物中的应用：风湿性关节炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关 节炎、克罗恩氏病、强直性关节炎、银屑病和/或溃疡性结肠炎。12. -种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利 要求4或5所述的抗体片段、权利要求6所述的scFv分子、权利要求9所述的结合物和/ 或权利要求10所述的偶联物。
【专利摘要】本发明属于抗体药物的技术领域，提供抗TNFα的全人单克隆抗体及其应用，这些抗体是来源于人杂交瘤并经过细胞毒功能测试筛选和通过噬菌体展示技术进行亲和力筛选获得的，具有对TNFα的优异的亲和力和特异性。在细胞模型的药效学试验中，这些抗体能够有效中和TNFα及其所产生的细胞学效应。在动物实验中，这些抗体同样能有效中和TNFα，并抑制动物模型中TNFα所带来的表型。其效果显示不低于或比Humira更好。
【IPC分类】C07K16/24, C12N15/13, A61P17/06, A61P1/00, C12N15/63, A61P29/00, A61P19/02, A61K39/395
【公开号】CN104892760
【申请号】CN201410076339
【发明人】冯晓, 张洁涵, 李福军, 王涛, 李新灵
【申请人】北京安保康生物医药科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
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