一种针对pitpnm3的单克隆抗体及其用图
一种针对pitpnm3的单克隆抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于单克隆抗体领域，涉及针对CCL18(趋化因子配体18)功能受体 PITPNM3的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的用途。
【背景技术】
[0002] 巨噬细胞是肿瘤微环境中最为重要的免疫细胞，巨噬细胞在不同的环境条件下会 表现出不同的表型从而对肿瘤表现出截然不同的作用。而肿瘤相关巨噬细胞是由巨噬细胞 在肿瘤微环境中诱导产生的。肿瘤相关巨噬细胞能促进肿瘤的迀移、转移和进展。而在针 对肿瘤的治疗方案中，抗体靶向性治疗已逐渐发展成为恶性肿瘤治疗的重要组成部分。单 克隆抗体作为特异强、靶向性好的药物在临床上具有非常高的应用价值和意义。然而单克 隆抗体在临床治疗应用中的研宄和进展却是相对滞后，因此有必要开发针对肿瘤微环境作 用的单克隆抗体。
[0003] 在前期研宄中，发明人从人乳腺癌标本分离出肿瘤相关巨噬细胞，通过分析其细 胞因子表达谱，发现CCL18 (趋化因子配体18)是乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞分泌最多的细胞 因子。体内外实验证实，CCL18除了直接促进肿瘤细胞与细胞外基质的粘附，诱导肿瘤细胞 发生上皮间质转化，从而促进肿瘤细胞转移，还诱导血管形成、募集幼稚T淋巴细胞将其诱 导为免疫抑制Treg、诱导正常成纤维细胞分化为促肿瘤表型（Chen J*，Yao Y*，Gong Ο, Yu F*, Sun S, Chen J, Liu B, Deng H, Wang F, Lin L, Yao H, Sun F, Karen S. Anderson, Liu Q, Mark E. Ewen, Yao X#, Song E#. CCL18from Tumor-Associated Macrophages Promotes Breast Cancer Metastasis via PITPNM3. Cancer Cell. 2011，19(4) :541 - 555.) 〇
[0004] 发明人通过与CCL18免疫共沉淀和质谱分析锁定肿瘤细胞膜蛋白PITPNM3。CCL18 和PITP匪3特异性结合在乳腺癌细胞的细胞膜表面。接着，发明人发现在乳腺癌细胞和幼 稚淋巴细胞中敲低PITP匪3能抑制CCL18介导的信号通路激活和趋化运动。最后，发明人 在稳定转染PITPW3的HEK293细胞中通过多种公认鉴定细胞因子受体的方法证明PITPW3 是CCL18的功能受体。因此，有必要开发针对PITPNM3的单克隆抗体，可能为肿瘤细胞和间 质细胞的靶向治疗提供新思路。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种针对PITP匪3的单克隆抗体，它能在体内外模型中明显抑制肿瘤 相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞的转移。
[0006] 本发明所述的一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体 PITP匪3,是由保藏号为CCTCC N0:C2014190的PITP匪3mAb杂交瘤细胞株所分泌的。该杂 交瘤细胞株保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉 大学，保藏日期为2014年10月22日。
[0007] 本发明还提供了所述的针对PITP匪3的单克隆抗体的用途。
[0008] 本发明所述的用途是将所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导 乳腺癌细胞转移的药物的用途。
[0009] 发明人通过专业软件分析挑选出16个抗原表位，然后针对这16个抗原表位研制 出16个针对不同抗原表位的PITP匪3单克隆抗体。经过反复筛选验证，发明人发现其中 一个针对PITPW3胞外段的单克隆抗体，在共培养体系中加入PITPW3单克隆抗体能明显 抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导肿瘤细胞的EMT、迀移和侵袭。在进一步的体内试验中，发明 人验证了 PITP匪3单克隆抗体的药效，通过建立人源化小鼠技术（I. Shicheng Su, Qiang Liuj Jingqi Chen，Jianing Chen，Fei Chen, Chonghua He, Di Huang, Wei Wuj Ling Linj Wei Huang, Jin Zhang, Xiuying Cuij Fang Zheng, Haiyan Li, Herui Yaoj Fengxi Suj Erwei Song. A positive feedback loop between mesenchymal-Iike cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis. Cancer Cell. 2014, 25, I -16.)的巨噬细胞促进肿瘤细胞的肝肺转移模型，即注射PITP匪3单克隆抗体后，发现其能 明显抑制巨噬细胞促进肿瘤细胞的肝肺转移及延长荷瘤小鼠的生存期。
【附图说明】
[0010] 图1显示体外插入孔实验检测PITP匪3单克隆抗体抑制乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231 迀移的结果。
[0011] 图2显示细胞迀移计数结果，发现有三个抗体有较为明显中和功能，其中一个抗 体中和效果达到约70% (箭头所指）。
[0012] 图3显示PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引 起的乳腺肿瘤细胞的上皮间质转化。上排为相差显微镜。图中，下排为DAPI (蓝色）， E-cadherin (红色），vimentin (绿色）的免疫焚光。
[0013] 图4显示PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引起的乳 腺肿瘤细胞的侵袭与迀移。
[0014] 图5显示PITP匪3单克隆抗体对肿瘤细胞的迀移能力和侵袭能力的影响。
[0015] 图6显示PITP匪3单克隆抗体抑制小鼠肝肺转移情况。
[0016] 图7显示PITP匪3单克隆抗体能延长荷瘤小鼠生存期情况。
【具体实施方式】
[0017] 实施例一：针对PITPNM3的单克隆抗体的制备
[0018] 发明人所在的研宄团队利用上海Abmart公司独有的SEAL抗原设计技术对 PITP匪3氨基酸全序列进行分析，并进行综合评分，挑选16个10肽作为抗原（表一）。
[0019] 表一：从PITP匪3氨基酸序列得到的16个抗原序列及其起止氨基酸残基位置
[0020]
[0022] 通过化学合成的方法合成上述16条10肽抗原的核苷酸序列并连上T载体 (TAKARA)，并在抗性琼脂平板上进行蓝白斑筛选挑选阳性克隆，经菌落PCR鉴定并测序验 证后将该阳性克隆小转入小规模培养后抽提质粒进行双酶切，将目标片段进行切胶回收并 连上真核表达载体pcDNA3.1(购买自Invitrogen)，转化大肠杆菌（E.coli)后扩增表达质 粒，中量抽提表达质粒，经纯化后转染HEK293细胞（购买自美国ATCC)。大规模培养并收集 HEK293细胞，经静脉注射注入小鼠外周血中，经过初次基础免疫及加强免疫后，杀死小鼠并 获取小鼠脾脏，碾碎制成单细胞悬液，过滤并离心祛除杂质后收集较纯的脾细胞，加入完全 培养基进行培养。
[0023] 培养骨髓瘤细胞株SP2/0(购自美国典型生物保藏中心ATCC，http://www. atcc. org/products/all/CRL-8287. aspx)，并维持其最佳生长状态，使其在细胞融合时处于对数 生长期。将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，根据常规方法制成杂交瘤细胞株。
[0024] 大规模培养杂交瘤细胞株，通过有限稀释法对杂交瘤细胞株进行克隆化，从而获 取稳定分泌抗体的纯系杂交瘤细胞株。将常规培养的杂交瘤细胞用胰酶消化并计数，将杂 交瘤细胞稀释后的悬液种入96孔板中进行培养，稀释倍数按照每孔中仅有1个细胞为标 准，经过连续多天培养后，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出 只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。将上清中检测出抗体效价较高的孔做好标记， 将该孔中细胞进行规模培养，重复进行上述有限稀释法进行克隆化筛选，重 复筛选2-3轮 次，从而保证产生单克隆抗体的细胞是从同一种系细胞而来，从而保证后面所制备的抗体 是针对同一抗原的纯系单克隆抗体。大规模培养经过克隆化筛选后得到的纯系杂交瘤细胞 系，将杂交瘤细胞株接种至SPF级小鼠腹腔内，经5-7天后即可用注射器从小鼠腹腔中吸取 5mL左右腹水，经过高速离心去除杂质沉淀后即可获取PITP匪3单克隆抗体，测定该抗体效 价。将抽取的腹水用过滤联合二氧化硅吸附的方法除去腹水中的脂肪滴、细胞残渣及小颗 粒物质，即可获取澄清的腹水。腹水中即含有高浓度PITPNM3单克隆抗体。
[0025] 实施例二：针对PITPNM3的单克隆抗体的筛选和保藏
[0026] 单克隆抗体的筛选是针对杂交瘤细胞株在生长过程中分泌到培养基上清中的抗 体效价而进行的。具体方法是通过ELISA对各单克隆细胞株培养基上清效价进行评估，低 于1〇_ 8认为其具有较高的潜在抗体应用价值（数字越低表明该抗体效价越高）。
[0027] 通过对针对16个不同的抗原所产生的所有单克隆抗体培养基上清分别进行 ELISA验证，挑选16个在ELISA检测中效价最高的16个抗体进一步进行后续功能验证。
[0028] 鉴于在前期研宄中发现PITP匪3介导CCL18在乳腺癌中的转移，本发明通过体 外迀移实验对这16个抗体进行功能验证。先用PITP匪3单克隆抗体处理乳腺肿瘤细胞 MDA-MB-231，然后在transwell小室的下室放置CCL18,并提前将纤连蛋白（Fibronectin) 敷在插入孔下沿，将单克隆抗体处理过的乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231种入插入孔上室，37度 培养箱中放置，一段时间后将插入孔拿出，洗掉没有迀移过去的细胞，并用结晶紫染色，拍 照，结果见图1。
[0029] 利用迀移实验对16个抗体抑制乳腺肿瘤细胞迀移功能进行检测，在对迀移过去 的乳腺肿瘤细胞数目进行计数统计时发现，有三个抗体具备体外中和阻断功能，尤其是其 中一个抗体能中和阻断约70%左右CCL18诱导产生的乳腺癌细胞MDA-MB-231的迀移（参 见图2)。
[0030] 该抗体是单抗2,对应表1中的抗原4肽段。
[0031] 基于软件预测的膜蛋白结构（Lev, S.，Hernandez, J.，Martinez, R.，Chen, A.，Plo wman, G. , and Schlessinger, J. (1999). Identification of a novel family of targets of PYK2related to Drosophila retinal degeneration B(rdgB)protein. Mol.Cell. Biol. 19, 2278 - 2288.)，我们确定单抗2所针对的PITPNM3抗原表位位于细胞膜的胞外段。
[0032] 发明人将筛选得到的单抗2送往中国典型培养物保藏中心（CCTCC)进行保藏， 地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年10月22日，保藏编号为CCTCC NO:C2014190,培养物名称为"PITPNM3mAb杂交瘤细胞株"。
[0033] 以下将采用该单抗2进行下面的实施例中的实验。下面实验中的"PITPNM3单克 隆抗体"均是指送交保藏的单抗2。
[0034] 实施例三：针对PITP匪3的单克隆抗体的效果验证
[0035] 本实施例对该抗体其在动物体内的治疗效果进行了评估。从以下几个方面进一步 验证PITP匪3单克隆抗体的体内效果。
[0036] (一）体外验证PITP匪3的治疗效果。
[0037] 实验1 :乳腺肿瘤细胞MCF-7单独培养（对照组），肿瘤相关巨噬细胞（TAMs)与乳 腺肿瘤细胞MCF-7共培养（实验组），加入PITPNM3单克隆抗体处理，通过免疫荧光实验检 测EMT (上皮间质转化）情况。
[0038] 结果如图3所示，与对照组相比，实验组中间质标记物表达受到抑制，而上皮标记 物表达回复，表明PITP匪3单克隆抗体能抑制CCL18所诱导的乳腺肿瘤细胞的上皮间质转 化现象，也就是能抑制肿瘤相关巨噬细胞所分泌的CCL18所诱导的乳腺肿瘤细胞的上皮间 质转化。
[0039] 实验2 :乳腺肿瘤细胞MCF-7单独培养（对照组），肿瘤相关巨噬细胞（TAMs)与乳 腺肿瘤细胞MCF-7共培养（实验组），加入PITPNM3单克隆抗体处理，通过插入孔实验（插 入孔购买自美国Corning公司）检查肿瘤细胞的迀移能力和侵袭能力。
[0040] 结果如图4所示，肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引起的乳腺肿瘤细胞的侵袭 与迀移均被抑制，表明PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引起 的乳腺肿瘤细胞的侵袭与迀移。
[0041] (二）体内验证PITP匪3的治疗效果。
[0042] 实验3 :在免疫缺陷小鼠（购买自北京维通利华公司）体内脂肪垫上种植乳腺肿 瘤细胞MCF-7,待小鼠体内成瘤后，再经尾静脉注入PITPW3单克隆抗体，通过体内小动物 成像系统检测其治疗效果。
[0043] 结果如图5所示，相比较于对照组，PITPNM3单克隆抗体处理组能明显抑制免疫缺 陷小鼠的肝肺转移。
[0044] 实验4 :在免疫缺陷小鼠（购买自北京维通利华公司）体内脂肪垫上种植乳腺肿 瘤细胞MCF-7,然后注入PITP匪3单克隆抗体进行治疗，取小鼠的肝肺组织进行HE染色和免 疫组织化学染色，检查PITPNM3单克隆抗体抑制小鼠肝肺转移情况。
[0045] 结果如图6所示，发现无论是HE染色还是免疫组织化学染色均发现，PITP匪3单 克隆抗体能明显抑制荷瘤小鼠的肝肺转移。
[0046] 实验5 :在免疫缺陷小鼠（购买自美国Jackson实验室）体内脂肪垫上种植乳腺 肿瘤细胞MCF-7,然后注入PITP匪3单克隆抗体进行治疗，观测小鼠存活天数，以检测对照 组及处理组小鼠的生存期。
[0047] 结果如图7所示，对荷瘤小鼠在经过PITP匪3单克隆抗体治疗后生存期进行比 较分析发现，经PITP匪3单克隆抗体治疗后的免疫缺陷小鼠生存期明显得到延长，表明 PITP匪3单克隆抗体能延长荷瘤小鼠的生存期。
[0048] 综合PITP匪3在体内及体外的中和阻断效果表明，PITP匪3mAb杂交瘤细胞株能抑 制乳腺肿瘤细胞的上皮间质转化，抑制乳腺肿瘤细胞的侵袭和迀移，抑制荷瘤小鼠体内肝 肺转移，并能延长荷瘤小鼠带瘤生存时间。由此证明本发明所述针对PITP匪3的单克隆抗 体具有体内外中和阻断效果，也初步具备体内治疗效果。
【主权项】
1. 一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体PITP匪3,是由保藏号 为CCTCCN0:C2014190的PITPMOmAb杂交瘤细胞株所分泌的。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细 胞转移的药物的用途。
【专利摘要】本发明属于单克隆抗体领域，涉及针对CCL18(趋化因子配体18)功能受体PITPNM3的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的用途。本发明所述的一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体PITPNM3，是由保藏号为CCTCC NO:C2014190的PITPNM3mAb杂交瘤细胞株所分泌的。本发明还提供了将所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞转移的药物的用途。本发明所述的针对PITPNM3的单克隆抗体能在体内外模型中明显抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞的转移。CCTCC NO: C201419020141022
【IPC分类】C07K16/28, A61P35/04, A61K39/395
【公开号】CN104892761
【申请号】CN201410573045
【发明人】宋尔卫, 何重华, 苏士成, 刘强, 刘玉洁, 曾韵洁
【申请人】中山大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年10月23日
【技术领域】
[0001] 本发明属于单克隆抗体领域，涉及针对CCL18(趋化因子配体18)功能受体 PITPNM3的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的用途。
【背景技术】
[0002] 巨噬细胞是肿瘤微环境中最为重要的免疫细胞，巨噬细胞在不同的环境条件下会 表现出不同的表型从而对肿瘤表现出截然不同的作用。而肿瘤相关巨噬细胞是由巨噬细胞 在肿瘤微环境中诱导产生的。肿瘤相关巨噬细胞能促进肿瘤的迀移、转移和进展。而在针 对肿瘤的治疗方案中，抗体靶向性治疗已逐渐发展成为恶性肿瘤治疗的重要组成部分。单 克隆抗体作为特异强、靶向性好的药物在临床上具有非常高的应用价值和意义。然而单克 隆抗体在临床治疗应用中的研宄和进展却是相对滞后，因此有必要开发针对肿瘤微环境作 用的单克隆抗体。
[0003] 在前期研宄中，发明人从人乳腺癌标本分离出肿瘤相关巨噬细胞，通过分析其细 胞因子表达谱，发现CCL18 (趋化因子配体18)是乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞分泌最多的细胞 因子。体内外实验证实，CCL18除了直接促进肿瘤细胞与细胞外基质的粘附，诱导肿瘤细胞 发生上皮间质转化，从而促进肿瘤细胞转移，还诱导血管形成、募集幼稚T淋巴细胞将其诱 导为免疫抑制Treg、诱导正常成纤维细胞分化为促肿瘤表型（Chen J*，Yao Y*，Gong Ο, Yu F*, Sun S, Chen J, Liu B, Deng H, Wang F, Lin L, Yao H, Sun F, Karen S. Anderson, Liu Q, Mark E. Ewen, Yao X#, Song E#. CCL18from Tumor-Associated Macrophages Promotes Breast Cancer Metastasis via PITPNM3. Cancer Cell. 2011，19(4) :541 - 555.) 〇
[0004] 发明人通过与CCL18免疫共沉淀和质谱分析锁定肿瘤细胞膜蛋白PITPNM3。CCL18 和PITP匪3特异性结合在乳腺癌细胞的细胞膜表面。接着，发明人发现在乳腺癌细胞和幼 稚淋巴细胞中敲低PITP匪3能抑制CCL18介导的信号通路激活和趋化运动。最后，发明人 在稳定转染PITPW3的HEK293细胞中通过多种公认鉴定细胞因子受体的方法证明PITPW3 是CCL18的功能受体。因此，有必要开发针对PITPNM3的单克隆抗体，可能为肿瘤细胞和间 质细胞的靶向治疗提供新思路。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种针对PITP匪3的单克隆抗体，它能在体内外模型中明显抑制肿瘤 相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞的转移。
[0006] 本发明所述的一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体 PITP匪3,是由保藏号为CCTCC N0:C2014190的PITP匪3mAb杂交瘤细胞株所分泌的。该杂 交瘤细胞株保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉 大学，保藏日期为2014年10月22日。
[0007] 本发明还提供了所述的针对PITP匪3的单克隆抗体的用途。
[0008] 本发明所述的用途是将所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导 乳腺癌细胞转移的药物的用途。
[0009] 发明人通过专业软件分析挑选出16个抗原表位，然后针对这16个抗原表位研制 出16个针对不同抗原表位的PITP匪3单克隆抗体。经过反复筛选验证，发明人发现其中 一个针对PITPW3胞外段的单克隆抗体，在共培养体系中加入PITPW3单克隆抗体能明显 抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导肿瘤细胞的EMT、迀移和侵袭。在进一步的体内试验中，发明 人验证了 PITP匪3单克隆抗体的药效，通过建立人源化小鼠技术（I. Shicheng Su, Qiang Liuj Jingqi Chen，Jianing Chen，Fei Chen, Chonghua He, Di Huang, Wei Wuj Ling Linj Wei Huang, Jin Zhang, Xiuying Cuij Fang Zheng, Haiyan Li, Herui Yaoj Fengxi Suj Erwei Song. A positive feedback loop between mesenchymal-Iike cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis. Cancer Cell. 2014, 25, I -16.)的巨噬细胞促进肿瘤细胞的肝肺转移模型，即注射PITP匪3单克隆抗体后，发现其能 明显抑制巨噬细胞促进肿瘤细胞的肝肺转移及延长荷瘤小鼠的生存期。
【附图说明】
[0010] 图1显示体外插入孔实验检测PITP匪3单克隆抗体抑制乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231 迀移的结果。
[0011] 图2显示细胞迀移计数结果，发现有三个抗体有较为明显中和功能，其中一个抗 体中和效果达到约70% (箭头所指）。
[0012] 图3显示PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引 起的乳腺肿瘤细胞的上皮间质转化。上排为相差显微镜。图中，下排为DAPI (蓝色）， E-cadherin (红色），vimentin (绿色）的免疫焚光。
[0013] 图4显示PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引起的乳 腺肿瘤细胞的侵袭与迀移。
[0014] 图5显示PITP匪3单克隆抗体对肿瘤细胞的迀移能力和侵袭能力的影响。
[0015] 图6显示PITP匪3单克隆抗体抑制小鼠肝肺转移情况。
[0016] 图7显示PITP匪3单克隆抗体能延长荷瘤小鼠生存期情况。
【具体实施方式】
[0017] 实施例一：针对PITPNM3的单克隆抗体的制备
[0018] 发明人所在的研宄团队利用上海Abmart公司独有的SEAL抗原设计技术对 PITP匪3氨基酸全序列进行分析，并进行综合评分，挑选16个10肽作为抗原（表一）。
[0019] 表一：从PITP匪3氨基酸序列得到的16个抗原序列及其起止氨基酸残基位置
[0020]
[0022] 通过化学合成的方法合成上述16条10肽抗原的核苷酸序列并连上T载体 (TAKARA)，并在抗性琼脂平板上进行蓝白斑筛选挑选阳性克隆，经菌落PCR鉴定并测序验 证后将该阳性克隆小转入小规模培养后抽提质粒进行双酶切，将目标片段进行切胶回收并 连上真核表达载体pcDNA3.1(购买自Invitrogen)，转化大肠杆菌（E.coli)后扩增表达质 粒，中量抽提表达质粒，经纯化后转染HEK293细胞（购买自美国ATCC)。大规模培养并收集 HEK293细胞，经静脉注射注入小鼠外周血中，经过初次基础免疫及加强免疫后，杀死小鼠并 获取小鼠脾脏，碾碎制成单细胞悬液，过滤并离心祛除杂质后收集较纯的脾细胞，加入完全 培养基进行培养。
[0023] 培养骨髓瘤细胞株SP2/0(购自美国典型生物保藏中心ATCC，http://www. atcc. org/products/all/CRL-8287. aspx)，并维持其最佳生长状态，使其在细胞融合时处于对数 生长期。将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，根据常规方法制成杂交瘤细胞株。
[0024] 大规模培养杂交瘤细胞株，通过有限稀释法对杂交瘤细胞株进行克隆化，从而获 取稳定分泌抗体的纯系杂交瘤细胞株。将常规培养的杂交瘤细胞用胰酶消化并计数，将杂 交瘤细胞稀释后的悬液种入96孔板中进行培养，稀释倍数按照每孔中仅有1个细胞为标 准，经过连续多天培养后，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出 只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。将上清中检测出抗体效价较高的孔做好标记， 将该孔中细胞进行规模培养，重复进行上述有限稀释法进行克隆化筛选，重 复筛选2-3轮 次，从而保证产生单克隆抗体的细胞是从同一种系细胞而来，从而保证后面所制备的抗体 是针对同一抗原的纯系单克隆抗体。大规模培养经过克隆化筛选后得到的纯系杂交瘤细胞 系，将杂交瘤细胞株接种至SPF级小鼠腹腔内，经5-7天后即可用注射器从小鼠腹腔中吸取 5mL左右腹水，经过高速离心去除杂质沉淀后即可获取PITP匪3单克隆抗体，测定该抗体效 价。将抽取的腹水用过滤联合二氧化硅吸附的方法除去腹水中的脂肪滴、细胞残渣及小颗 粒物质，即可获取澄清的腹水。腹水中即含有高浓度PITPNM3单克隆抗体。
[0025] 实施例二：针对PITPNM3的单克隆抗体的筛选和保藏
[0026] 单克隆抗体的筛选是针对杂交瘤细胞株在生长过程中分泌到培养基上清中的抗 体效价而进行的。具体方法是通过ELISA对各单克隆细胞株培养基上清效价进行评估，低 于1〇_ 8认为其具有较高的潜在抗体应用价值（数字越低表明该抗体效价越高）。
[0027] 通过对针对16个不同的抗原所产生的所有单克隆抗体培养基上清分别进行 ELISA验证，挑选16个在ELISA检测中效价最高的16个抗体进一步进行后续功能验证。
[0028] 鉴于在前期研宄中发现PITP匪3介导CCL18在乳腺癌中的转移，本发明通过体 外迀移实验对这16个抗体进行功能验证。先用PITP匪3单克隆抗体处理乳腺肿瘤细胞 MDA-MB-231，然后在transwell小室的下室放置CCL18,并提前将纤连蛋白（Fibronectin) 敷在插入孔下沿，将单克隆抗体处理过的乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231种入插入孔上室，37度 培养箱中放置，一段时间后将插入孔拿出，洗掉没有迀移过去的细胞，并用结晶紫染色，拍 照，结果见图1。
[0029] 利用迀移实验对16个抗体抑制乳腺肿瘤细胞迀移功能进行检测，在对迀移过去 的乳腺肿瘤细胞数目进行计数统计时发现，有三个抗体具备体外中和阻断功能，尤其是其 中一个抗体能中和阻断约70%左右CCL18诱导产生的乳腺癌细胞MDA-MB-231的迀移（参 见图2)。
[0030] 该抗体是单抗2,对应表1中的抗原4肽段。
[0031] 基于软件预测的膜蛋白结构（Lev, S.，Hernandez, J.，Martinez, R.，Chen, A.，Plo wman, G. , and Schlessinger, J. (1999). Identification of a novel family of targets of PYK2related to Drosophila retinal degeneration B(rdgB)protein. Mol.Cell. Biol. 19, 2278 - 2288.)，我们确定单抗2所针对的PITPNM3抗原表位位于细胞膜的胞外段。
[0032] 发明人将筛选得到的单抗2送往中国典型培养物保藏中心（CCTCC)进行保藏， 地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年10月22日，保藏编号为CCTCC NO:C2014190,培养物名称为"PITPNM3mAb杂交瘤细胞株"。
[0033] 以下将采用该单抗2进行下面的实施例中的实验。下面实验中的"PITPNM3单克 隆抗体"均是指送交保藏的单抗2。
[0034] 实施例三：针对PITP匪3的单克隆抗体的效果验证
[0035] 本实施例对该抗体其在动物体内的治疗效果进行了评估。从以下几个方面进一步 验证PITP匪3单克隆抗体的体内效果。
[0036] (一）体外验证PITP匪3的治疗效果。
[0037] 实验1 :乳腺肿瘤细胞MCF-7单独培养（对照组），肿瘤相关巨噬细胞（TAMs)与乳 腺肿瘤细胞MCF-7共培养（实验组），加入PITPNM3单克隆抗体处理，通过免疫荧光实验检 测EMT (上皮间质转化）情况。
[0038] 结果如图3所示，与对照组相比，实验组中间质标记物表达受到抑制，而上皮标记 物表达回复，表明PITP匪3单克隆抗体能抑制CCL18所诱导的乳腺肿瘤细胞的上皮间质转 化现象，也就是能抑制肿瘤相关巨噬细胞所分泌的CCL18所诱导的乳腺肿瘤细胞的上皮间 质转化。
[0039] 实验2 :乳腺肿瘤细胞MCF-7单独培养（对照组），肿瘤相关巨噬细胞（TAMs)与乳 腺肿瘤细胞MCF-7共培养（实验组），加入PITPNM3单克隆抗体处理，通过插入孔实验（插 入孔购买自美国Corning公司）检查肿瘤细胞的迀移能力和侵袭能力。
[0040] 结果如图4所示，肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引起的乳腺肿瘤细胞的侵袭 与迀移均被抑制，表明PITP匪3单克隆抗体能抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的CCL18所引起 的乳腺肿瘤细胞的侵袭与迀移。
[0041] (二）体内验证PITP匪3的治疗效果。
[0042] 实验3 :在免疫缺陷小鼠（购买自北京维通利华公司）体内脂肪垫上种植乳腺肿 瘤细胞MCF-7,待小鼠体内成瘤后，再经尾静脉注入PITPW3单克隆抗体，通过体内小动物 成像系统检测其治疗效果。
[0043] 结果如图5所示，相比较于对照组，PITPNM3单克隆抗体处理组能明显抑制免疫缺 陷小鼠的肝肺转移。
[0044] 实验4 :在免疫缺陷小鼠（购买自北京维通利华公司）体内脂肪垫上种植乳腺肿 瘤细胞MCF-7,然后注入PITP匪3单克隆抗体进行治疗，取小鼠的肝肺组织进行HE染色和免 疫组织化学染色，检查PITPNM3单克隆抗体抑制小鼠肝肺转移情况。
[0045] 结果如图6所示，发现无论是HE染色还是免疫组织化学染色均发现，PITP匪3单 克隆抗体能明显抑制荷瘤小鼠的肝肺转移。
[0046] 实验5 :在免疫缺陷小鼠（购买自美国Jackson实验室）体内脂肪垫上种植乳腺 肿瘤细胞MCF-7,然后注入PITP匪3单克隆抗体进行治疗，观测小鼠存活天数，以检测对照 组及处理组小鼠的生存期。
[0047] 结果如图7所示，对荷瘤小鼠在经过PITP匪3单克隆抗体治疗后生存期进行比 较分析发现，经PITP匪3单克隆抗体治疗后的免疫缺陷小鼠生存期明显得到延长，表明 PITP匪3单克隆抗体能延长荷瘤小鼠的生存期。
[0048] 综合PITP匪3在体内及体外的中和阻断效果表明，PITP匪3mAb杂交瘤细胞株能抑 制乳腺肿瘤细胞的上皮间质转化，抑制乳腺肿瘤细胞的侵袭和迀移，抑制荷瘤小鼠体内肝 肺转移，并能延长荷瘤小鼠带瘤生存时间。由此证明本发明所述针对PITP匪3的单克隆抗 体具有体内外中和阻断效果，也初步具备体内治疗效果。
【主权项】
1. 一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体PITP匪3,是由保藏号 为CCTCCN0:C2014190的PITPMOmAb杂交瘤细胞株所分泌的。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细 胞转移的药物的用途。
【专利摘要】本发明属于单克隆抗体领域，涉及针对CCL18(趋化因子配体18)功能受体PITPNM3的单克隆抗体，以及该单克隆抗体的用途。本发明所述的一种单克隆抗体，能特异性地识别趋化因子配体18功能受体PITPNM3，是由保藏号为CCTCC NO:C2014190的PITPNM3mAb杂交瘤细胞株所分泌的。本发明还提供了将所述的单克隆抗体用于制备抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞转移的药物的用途。本发明所述的针对PITPNM3的单克隆抗体能在体内外模型中明显抑制肿瘤相关巨噬细胞诱导乳腺癌细胞的转移。CCTCC NO: C201419020141022
【IPC分类】C07K16/28, A61P35/04, A61K39/395
【公开号】CN104892761
【申请号】CN201410573045
【发明人】宋尔卫, 何重华, 苏士成, 刘强, 刘玉洁, 曾韵洁
【申请人】中山大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年10月23日
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