抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DM1、其与Trastuzumab的组合物及其应用
抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DM1、其与Trastuzumab的组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体-药物偶联物以及用其治疗高增殖性病症的方法，具体涉及一种 抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)及其与治疗有效量的HER2二聚化抑制剂 抗体Trastuzumab的组合物，以及使用所述抗体-药物偶联物或组合物治疗高增殖性病症 的方法。
【背景技术】
[0002] HER2(ErbB2)是结合在细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，由原癌基因 HER2/neu编 码。属于表皮生长因子受体家族，该家族包括HERl (erbBl，EGFR)、HER2 (erbB2，NEU)、 HER3 (erbB3)及HER4 (erbB4)。HER2参与导致细胞生长和分化的信号传导途径。在大约 25%-30%的人乳腺癌中观察到有HER2的过表达。研究显示当HER2蛋白质过表达时乳癌浸 润性强，更具有侵袭性。而且HER2阳性肿瘤比不呈HER2阳性的肿瘤生长和蔓延得更快。据 报道HER2阳性乳癌是非HER2阳性乳癌复发率的2. 5倍。
[0003] 曲妥珠单抗（Trastuzumab)是一种针对Her-2/neu原癌基因产物的人源化单克隆 抗体，其选择性地结合在HER2 (或HER2/neu)受体的区域IV。曲妥珠单抗通过与HER2蛋 白质结合抑制肿瘤细胞生长。1998年，曲妥珠单抗(商品名：赫赛汀，Herceptin)获得美国 食品及药物管理局（Food and Drug Administration, FDA)批准上市，用于Her-2表达阳性 的乳腺癌治疗。虽然Herceptin的开发给具有HER2阳性肿瘤的患者提供了比单独的化疗 显著要好的结果，但另有将近50%的Her-2阳性患者对曲妥珠单抗治疗不敏感（Singer CF， Predicting the efficacy of Trastuzumab-based therapy in breast cancer: current standards and future strategies,Biochim Biophys Acta,2008,1786 (2):105-113),并 且大部分Her2阳性患者在经过I年的曲妥珠单抗治疗后，即会对其产生耐药性。因此，临 床上仍需要为对Herceptin治疗不响应或响应不足，具有过表达HER2的肿瘤或其它与HER2 表达有关的疾病的患者开发新的针对HER2的癌症疗法。
[0004] 抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate,ADC)利用单克隆抗体特异性识别 肿瘤细胞上特定抗原的特点，偶联小分子化疗药物，可实现精准地将抗肿瘤物质递送到肿 瘤革G细胞释放。2013年3月，Roche公司的ADC药物T-DMl (曲妥珠单抗Trastuzumab与 美登素 DMl偶联)获得FDA的认可用于HER2阳性转移性乳腺癌治疗。T-DMl在过表达HER2 的Trastuzumab敏感性和Trastuzumab抗性肿瘤细胞系，和人乳腺癌的异种移植物模型中 均显示出有力的抗肿瘤活性。T-DMl的作用机理研究显示除了小分子DMl的作用外，还包括 Trastuzumab 本身的作用和 ADCC 作用（Trastuzumab Emtansine:A Unique Antibody-Drug Conjugate in Development for Human Epidermal Growth Factor Receptor2 - Positive Cancer，Clin Cancer Res，2011，17 (20)，6437-6447)。帕妥珠单抗 Pertuzumab 亦是一个 作用于HER二聚化的单克隆抗体。通过结合HER2,阻滞了 HER2与其它HER受体的杂二聚， 导致有丝分裂活化蛋白激酶和PI3K通路受阻，进而出现肿瘤细胞生长停滞和凋亡，从而 减缓了肿瘤的生长。Pertuzumab与TTrastuzumab的区别在于轻链和重链的表位结合区， Pertuzumab结合在HER2的亚结构域2内的表位，而TTrastuzumab的表位则位于亚结构 域4。Pertuzumab通过阻断HER2与其它HER家族成员，包括HERl (表皮生长因子受体； EGFR)，HER3,和HER4的结合来起作用的。这种结合是在存在配体下及经MAP激酶和PI3 激酶发信号所需要的。因此，Pertuzumab可抑制配体启动的细胞内信号传导。抑制这些 信号传导途径分别能导致生长阻滞和调亡。将T-DMl与Pertuzumab联用在细胞及动物模 型上显示出较单个试剂更强的抗肿瘤活性（Dual targeting of HER2_positive cancer with Trastuzumab-emtansine(T-DMl) and pertuzumab: critical role for neuregulin blockade in anti-tumor response to combination therapy, Clin Cancer Res, Published Online First on 0ctober4, 2013)。但目前尚无关于将 Pertuzumab 与小分子 化疗药物小分子化疗药物偶联，来治疗HER2介导的疾病的相关报道。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗体-药物偶联物 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)及其与治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体Trastuzumab的 组合物。
[0006] 为了达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供一种具有如下结构的抗体-药物偶联物 Pertuzumab-MCC-DMl(P-DMl)：
[0008]
[0009] 其中，mAb指帕妥珠单抗Pertuzumab, Pertuzumab经双功能连接体试剂SMCC与美 登素生物碱DMl连接，上式中η表示药物-抗体比，且其范围优选为1至8之间的整数值， 其中，1、2、3、4、5、6、7或8个药物部分共价结合在抗体Pertuzumab上。
[0010] 本发明还提供一种用于治疗高增殖性疾病或病症的治疗剂组合物，其中，所述治 疗剂组合物包含治疗有效量的P-DMl和治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体。
[0011] 进一步地，所述HER2二聚化抑制剂抗体优选为曲妥珠单抗（Trastuzumab);
[0012] 进一步地，所述治疗有效量的P-DMl和所述治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体 可以组合成配制剂的形式施用或交替地施用。
[0013] 本发明还提供使用所述治疗剂组合物体外和/或原位治疗哺乳动物细胞、生物体 高增殖性疾病或病症的方法。本发明的另一方面还提供一种使用本发明的治疗剂组合物来 治疗哺乳动物或人高增殖性疾病或病症(诸如癌症，包括受HER2或KDR9 (VEGF受体1)调控 的疾病）的方法。
[0014] 本发明还提供一种治疗高增殖性疾病或病症的方法，包括对需要此类治疗的哺乳 动物或人施用治疗有效量的P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂。
[0015] 进一步地，所述P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂是以组合配制剂形式施用的；
[0016] 进一步地，所述P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂作为治疗剂组合交替地(交替， 序贯给药）分开施用；更进一步地，所述P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂是以约3周间 隔或每周1次间隔对具有1?增殖性病症的病人施用的；
[0017] 进一步地，所述哺乳动物是HER2阳性患者；更进一步地，所述HER2阳性患者已经 接受Trastuzumab和其它化疗试剂疗法。
[0018] 本发明的另一个方面还提供本发明所述的抗体-药物偶联物P-DMl和治疗剂组合 物在制备用于治疗哺乳动物或人高增殖性疾病或病症(诸如癌症，包括受HER2调控）的药 物中的用途。
[0019] 其中，本发明所述高增殖性病症是癌症；进一步地，所述高增殖性病症是表达 HER2的癌症；更进一步地，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生 殖泌尿道癌、非小细胞肺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、结肠 _直肠癌、肝癌和胆管癌、皮肤癌、 食管癌、喉癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、腺癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、表皮样癌、大细 胞癌、小细胞癌、肾癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、黑素瘤、 唇癌、毛细胞癌、滤 泡性癌、脑和中枢神经系统癌、霍奇金淋巴癌或白血病，优选为乳腺癌。
[0020] 本发明的另一个方面还提供通过定性和定量分析来自体外细胞增殖和体内肿 瘤异种移植物实验的功效数据为体内功效预测有效药物组合的方法，其中所述组合包括 P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体。
[0021] 本发明提供一种用于为癌症治疗确定要组合使用的化合物的方法，包括：a)用 Pertuzumab-MCC-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体的治疗剂组合处理体外肿瘤细胞系，并b) 测量协同或非协同效应，由此为癌症治疗确定协同治疗剂组合。
[0022] 进一步地，本发明还提供一种用于为癌症治疗确定要组合使用的化合物的方法， 包括：（a)对HER2扩增的乳腺癌细胞或胃癌细胞施用Pertuzumab-MCC-DMl和HER2二聚化 抑制剂抗体的治疗剂组合，和（b)测量对细胞增殖的抑制，由此为癌症治疗确定协同治疗剂 组合。其中，以固定浓度比例的P -DMl和Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)，或以固定浓 度的P-DMl联合各种浓度的Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)。CI值小于0. 9指示协 同性；CI值介于0. 9-1. 1之间指示加和性；而CI值大于I. 1指示拮抗性。
[0023] 其中，所述HER2扩增的乳腺癌细胞是BT-474、SK-BR-3 ;所述HER2扩增的胃癌细 胞是 NCI-N87。
[0024] 本发明的抗体-药物偶联物（P-DM1可以通过如下方法来制备：
[0025] 1)抗体的缓冲液交换
[0026] 利用脱盐层析（SephadexTM G25脱盐柱）方式置换帕妥珠单抗原液至反应缓冲液 (磷酸钾盐/NaCl/EDTA)中，并浓缩抗体，制备帕妥珠单抗抗体；
[0027] 2) MCC-DMl母液的制备
[0028] 称取MCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA)充分溶解制备母液；
[0029] 3)偶联反应
[0030] 在步骤（1)所制备的帕妥珠单抗中加入步骤（2)所配制的MCC-DMl母液进行缀合 反应。最初用若干过量的MCC-DMl滴定抗体以测定希望的DMl : mAb比例。然后加入8-10 倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液进行反应；
[0031] 4)纯化
[0032] 采用凝胶过滤柱（SuperdeX200)将偶联反应混合物用琥珀酸钠 /NaCl缓冲液凝胶 过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，或超滤数遍。
[0033] 在本发明中，作出如下定义：
[0034] 术语"治疗"或"处理"指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预 防或减缓(减轻）不想要的生理学变化或病症，诸如高增殖性状况诸如癌症的生长，形成或 传播。为了本发明，有利或期望的临床结果包括但不限于：缓解症状，削弱疾病的程度，疾病 状态稳定（即不恶化)，延迟或减缓疾病发展，改善或减轻疾病状态，及康复(无论是部分的 还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。"治疗"或"处理"还可以指与不接受治疗 的预期存活相比延长存活。需要治疗的受试者包括早就患有疾病或病症的受试者以及倾向 于患上疾病或病症的受试者或者要预防状况或病症的受试者。
[0035] 术语"治疗有效量"指本发明化合物的量，其（i )治疗本文所述特定疾病，状况，或 病症，（ii)减轻，改善，或消除特定疾病，状况，或病症的一种或多种症状，或（iii)预防或延 迟特定疾病，状况，或病症的一种或多种症状的发作。在癌症的情况中，药物的治疗有效量 可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制（即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器 官中；抑制（即一定程度的减缓，优选停止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一 定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物可抑制癌细胞生长和/或杀死现有癌 细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。对于癌症疗法，可以例如通过评 价距疾病发展的时间（TTP)和/或测定响应率（RR)来测量功效。
[0036] "高增殖性病症"指肿瘤，癌症，和新生物组织，包括恶变前和非新生物阶段，而且 还包括银屑病，子宫内膜异位症，息肉和纤维腺瘤。
[0037] 术语"癌症"和"癌性"指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生 理状况。"肿瘤"包括一个或多个癌性细胞。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞 瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞 状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞 癌，胃癌(包括胃肠癌)，膜腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀肮癌，肝瘤，乳腺 癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌， 甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，以及头颈癌。
[0038] 术语"药学可接受的"指明该物质或组合物必须是在化学和/或毒理学方面与构 成配制剂的其它成分和/或用它治疗的哺乳动物相容的。
[0039] 本文中所使用的术语"协同的"指比两种或更多种单一药剂的加和效果更有效的 治疗剂组合。P-DMl和HER2二聚化抑制剂的抗体之间的协同相互作用的确定可以基于自本 文所述测定法获得的结果。
[0040] 组合疗法可提供"协同性"和证明是"协同的"，即一起使用活性成分时所实现的效 果大于分开使用所致效果之和。当活性成分如下所述时可获得协同效应：（1)以组合的单 位剂量配制剂共配制和同时施用或递送；（2)作为分开的配制剂交替递送；或（3)提供一些 其它方案。当在交替疗法中递送时，当化合物序贯施用或边送时(例如通过分开的注射器中 的不同注射）可获得协同效应。一般而言，在交替疗法期间，序贯地（即时间上连续地）施用 有效剂量的每种活性成分。
[0041] 有益效果：
[0042] 在本发明的中，将Pertuzumab与小分子化疗药物偶联，P-DMl和HER2二聚化抑制 剂抗体的组合物在体外和在体内在抑制癌细胞生长中显示协同效应，可以达到对HER2介 导的病症如癌症的较好治疗效果。本发明所述的抗体-药物偶联物P-DMl及其与抗体曲妥 珠单抗的组合显著地提高了治疗效果，提供了治疗基于HER2介导的病症如癌症更有效的 方法。
[0043] 本发明的另外的优点和新颖的特征部分在下面的说明中列出，部分在检查下面的 说明书后对于本领域技术人员是显而易见的或可以通过本发明的实践而学会。凭借所附权 利要求中特别指出的手段/工具、组合、组合物和方法可以认识和获得本发明的优点。
【附图说明】
[0044] 图 1 显不单独各种浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1 )、Trastuzumab 以及固定 浓度比例（I: 1)的P-DMl和Trastuzumab组合处理5天后对BT-474细胞体外细胞增殖抑 制作用。
[0045] 图 2 显不各种固定浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1)联合 Trastuzumab,和单 独的各种浓度的Trastuzumab处理5天后对BT-474细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0046] 图 3 显不单独各种浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1 )、Trastuzumab 以及固定 浓度比例（1:10)的P-DMl和Trastuzumab组合处理5天后对NCI-N87细胞体外细胞增殖 抑制作用。
[0047] 图 4 显不各种固定浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1)联合 Trastuzumab,和单 独的各种浓度的Trastuzumab处理5天后对NCI-N87细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0048] 图 5 显不单独各种浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1 )、Trastuzumab 以及各种 固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab组合处理5天后对SK-BR-3细胞体外细胞增殖抑制作 用。
[0049] 图6 (A)显不单独各种浓度的Pertuzumab-MCC_DM1(P-DM1)处理5天后对Calcu_3 细胞体外细胞增殖抑制作用，（B)显示各种固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab,和单独的 各种浓度的Trastuzumab (+溶媒）处理5天后对Calu-3细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0050] 图7 (A)显示单独各种浓度的Pertuzumab-MCC- DMl (P-DMl)处理3天后对DU-145 细胞体外细胞增殖抑制作用，（B)显示各种固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab,和单独的 各种浓度的Trastuzumab (+溶媒）处理3天后对DU-145细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0051] 图8 (A)显示单独各种浓度的Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)处理3天后对SK0V-3 细胞体外细胞增殖抑制作用，（B)显示各种固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab,和单独的 各种浓度的Trastuzumab (+溶媒）处理3天后对SK0V-3细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0052] 图9显示如下给药后对Here印tin-抗药性人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠移植瘤 的肿瘤体积均值随时间变化的图：（1)溶剂对照；（2) P-DMl 3mg/kg ; (3) P-DMl 10mg/kg ; (4) P-DMl 3mg/kg+Trastuzumab 10mg/kg〇
【具体实施方式】
[0053] 在此详细地述及本发明的某些实施方案，所附结构和公式中例示了它们的例子。 虽然将会连同所列举的实施方案来描述本发明，应当理解它们并非意图将本发明限于那些 实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有备选方案、修改和等同方案，其可以包括在权利要求 所限定的本发明范围内。本领域技术人员会领会与本文中所描述的方法和材料相似的或等 同的许多方法和材料可用于实施本发明。本发明绝非限于所描述的方法和材料。倘若所 收入的文献、专利和相似的材料与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语，术语的 用法，所描述的技术，诸如此类，以本申请为准。
[0054] 实施例
[0055] 为了例示本发明，包括下列实施例。然而，应当理解，这些实施例不限制本发明，而 只是意图提示实施本发明的方法。
[0056] 实施例 I:Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)的制备
[0057] 制备步骤如下：
[0058] 1)抗体的缓冲液交换
[0059] 利用脱盐层析（SephadexTM G25脱盐柱）方式置换帕妥珠单抗原液至反应缓冲液 (50mM磷酸钾盐/50mM NaCl/2mM EDTA，pH7. 5)中，并浓缩抗体浓度至5mg/ml，制备帕妥珠 单抗抗体；
[0060] 2) MCC-DMl母液的制备
[0061] 称取MCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA)充分溶解制备10mg/ml的MCC-DMl母液；
[0062] 3)偶联反应
[0063] 在步骤（1)所制备的帕妥珠单抗中加入步骤（2)所配置的MCC-DMl母液进行缀合 反应。最初用若干过量的MCC-DMl滴定抗体以测定希望的DMl : mAb比例，对于人抗体通 常这个范围是6-10倍摩尔过量。反应中DM在5% v/v以内。反应温度为25°C，反应时间 为1. 5至约20小时。反应分为三组进行：
[0064] a)反应中加入8倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液；
[0065] b)反应中加入9倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液；
[0066] c)反应中加入10倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液；
[0067] 4)纯化
[0068] 采用凝胶过滤柱（Superdex200)将偶联反应混合物用pH5. O的琥拍酸钠/150mM NaCl缓冲液凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，或超滤数遍。通过测定 缀合物在252和280nm的吸光度并使用DMl和抗体在这两个波长的已知消光系数来测量最 终缀合物中的每个Ab抗体分子的DMl分子的数目（计算公式如式1)。同时使用质谱分析 法计算产品的偶联率，并进行对比。数据见表1。
[0069] 式 1
[0071] 表1投料比对偶联率的影响
[0072]
[0073] 本实验中偶联率的测定方法：测定偶联率是指测定每个单抗分子上连接有小分子 药物的数量，即偶联物中药物与抗体的摩尔比。可采用紫外分光光度法和质谱分析法两种 方法测定。紫外分光光度法：通过测定偶联物在252nM和280nM处的紫外吸收值，并通过 朗伯比尔定律进行计算得出偶联率（DAR);质谱分析法：对抗体-美登素生物碱偶联物进行 ESI-MS分析，可以获得连接不用个数药物的峰型图，根据各个峰的面积进行计算得出偶联 率。通过两种方法获得的偶联率具有很好的一致性。
[0074] 本实验中偶联物浓度测定：采用紫外分光光度法，测定在252nM和280nM处的紫外 吸收值，通过朗伯比尔定律计算抗体和药物的浓度；本发明中所述的偶联物浓度是单抗浓 度与连接到单抗上的美登素生物碱（DMl)药物的总和。
[0075] 实施例2 :体外细胞增殖测定生物活性实验
[0076] 以下实验中所用的实验材料来源于：DMEM培养基、F12K培养基、RPMI1640培养基、 0. 25 %胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、100 X丙酮酸钠、100 X青链霉素购自Gibco公司。磺酰罗 丹明B (Sulforhodamine B，SRB)购自Sigma公司。BT-474乳腺癌细胞和NCI-N87胃癌细胞 来自中国科学院昆明细胞库，SK-BR-3乳腺癌细胞来自上海博谷生物科技有限公司，Calu-3 肺癌细胞来自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，SK0V-3卵巢癌细胞和DU-145前列 腺癌细胞来自美国典型培养物保藏中心（ATCC)。其他试剂均是分析纯。96孔平底聚苯乙 烯（Corning,产品目录号 3599)。Synergy2 酶标仪（Bio-Tek)。
[0077] 在本实施例中，研究了将 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)单独或与 Trastuzumab 组 合对肿瘤细胞系增殖的作用。
[0078] 本实施例使用磺酰罗丹明B (SRB)比色法来评价药物组合的抗增殖作用。SRB是一 种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨 基酸结合；在510nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的 定量检测。
[0079] 本实施例选择的细胞系有：BT-474、SK-BR-3乳腺癌细胞、NCI-N87胃癌细胞、 Calu-3肺癌细胞、SK0V-3卵巢癌细胞和DU-145前列腺癌细胞。
[0080] BT-474、SK-BR-3、NCI-N87 细胞在含 10%胎牛血清的 1640 培养基中，Calu-3、 SK0V-3、DU-145细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37°C，5% C02培养箱中培养 至对数生长期，将处于对数生长期的上述细胞分别以2 X 103~9 X 103个细胞每孔的密度 接种至96孔培养板，每孔100 μ L，培养24小时后，加入不同浓度的药物分别作用3天或5 天，分别以3、4或5倍稀释制备9个浓度，每个浓度设复孔，以使得所有组合药物处理组在 同一块板，并设相应浓度的溶媒对照及无细胞培养基孔。作用结束后，贴壁细胞倾去培养 液，加入4°C预冷的三氯乙酸溶液（30%，w/v) 100 μ 1，于4°C固定1小时，随后用去离子水冲 洗5遍，室温干燥后，每孔加入0. 4%(w/v)的SRB染液（Sigma, 1%冰乙酸配制)100μ L，室温 下孵育染色30min后，用1%冰乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。每孔加入IOmM Tris溶液100 μ L,室温下孵育染色15min后,用1%冰乙酸冲洗五次洗去未结合的SRB,室温 干燥后，每孔加入IOmM Tris缓冲液（pH=10. 5)溶解与细胞蛋白结合的染料，采用Synergy2 酶标仪（Bio-Tek)波长510nm和690nm处测定光吸收值（OD值)，并得到A=0D510-0D690。
[0081] 抑制率（％)=( A对照-A给药）/ A对照X 100%。
[0082] 用CalcuSyn软件程序使用Chou和Talalay组合法，通过等效图解方程CI=(D) 1/ (Dx) 1+⑶2ADx) 2确定组合指数（Cl )。药物I (D) 1与药物2 (D) 2组合的抑制X%，（Dx) 1和 (Dx) 2是抑制X%时的单独使用药物1和药物2时的浓度。对于各化合物而言，使用通过SRB 测定法测得的各浓度下的生长％值。
[0083] 本实验使用 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1)单独或联合 Trastuzumab 对多种 HER2 过表达的肿瘤细胞系进行了体外细胞 培养增殖作用的研究，同时也对非HER2过表达的肿 瘤细胞系进行了体外细胞培养增殖作用的研究。使用Chou&Talalay方法分析了数据，以固 定浓度比例的P-DMl和Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)，或以固定浓度的P-DMl联合 各种浓度的Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)。CI值小于0. 9指示协同性；CI值介于 0. 9-1. 1之间指示加和性；而CI值大于I. 1指示拮抗性。P-DMl单独处理均能产生抗肿 瘤细胞增殖活性，如图1所示，对于HER2过表达的BT-474细胞使用固定浓度比例（1:1)的 P-DMl与Trastuzumab组合导致协同的抗细胞增殖活性。小鼠异种移植物研究显示了相似 的结果，P-DMl联合Trastuzumab导致与用单独药剂治疗相比大大增强的抗肿瘤功效（图 9)。如图3所示，HER2过表达的NCI-N87细胞使用固定浓度比例的P-DMl与Tastuzumab联合 (P-DMl = Tastuzumab为1:10)也导致协同的抗细胞增殖活性，除了最高（10 μ g/mL P-DMl和 100yg/mL Trastuzumab)或最低（0.0256ng/mL P-DM1 和0.256ng/mL Trastuzumab)浓度的 组合。如图3-5所示，在HER2过表达的NCI-N87、SK-BR-3细胞中，各种浓度的Trastuzumab 与多个固定浓度的P-DMl组合均导致协同的抗细胞增殖活性。如图2所示，在BT-474细胞 中，各种浓度的Trastuzumab与多个固定浓度的P-DMl组合均导致协同的抗细胞增殖活性， 除了与高浓度的Trastuzumab (25或100 μ g/mL)的组合。如图6所示，对HER2过表达的 Calu-3细胞，固定浓度的P-DM1 (0. 5或5 μ g/mL)与一定浓度范围的Trastuzumab (0. 1~ 6. 5 μ g/mL)组合导致协同的抗细胞增殖活性。如图7所示，对非HER2过表达的DU-145细 胞，各种浓度的Trastuzumab与固定浓度的P-DMl (7或10 μ g/mL)组合导致协同的抗细胞 增殖活性。如图8所示，对非HER2过表达的SK0V-3细胞，单独的P-DMl产生抑制肿瘤细胞 增殖作用；固定浓度的P-DMl与Trastuzumab组合不比单独的P-DMl更有效。
[0084] 实施例3 :体内抗肿瘤功效测定实验：
[0085] 可以在体内测量本发明的组合的功效，即在啮齿类动物中植入癌细胞的同种异体 移植物或异种移植物，并用所述组合处理肿瘤。将受试小鼠用药物或对照处理，并监测数周 或更长时间以测量到达肿瘤倍增的时间，对数细胞杀伤，和肿瘤抑制。
[0086] 1)实验动物
[0087] BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。合 格证号：SCXK (沪）2012 - 0002。饲养环境：SPF级。
[0088] 2)实验步骤
[0089] 裸小鼠皮下接种人乳腺癌BT-474/T721细胞，待肿瘤生长至100-200mm3后，将动 物随机分组（D0)。给药剂量和给药方案见表2。每周测2次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿 瘤体积（V)计算公式为：
[0090] V = l/2XaXb2其中a、b分别表示长、宽。
[0091] T/C(%) = (T-Ttl) AC-Cci) X 100,其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；TQ、Cci为实验开 始时的肿瘤体积。
[0092] 表2给药剂量和给药方案
[0093]
[0094] D0:第一次给药时间；IV:静脉给药；
[0095] 实验开始时小鼠数目：对照组n=10,治疗组n=6。
[0096] 3)实验结果
[0097] 图9显示了如下给药后对Here印tin-抗药性人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠移 植瘤的疗效：（1)溶剂对照；（2 ) P-DMl 3mg/kg ; (3 ) P-DMl 10mg/kg ; (4 ) P-DMl 3mg/ 1^+1^&81：112111]^131〇11^/1^。结果显示，？-〇11(3、1〇11^/1^，1￥，每周1次，共3次）明显抑制 BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为72%和97%，其中高剂量组有1/6肿 瘤部分消退；Trasutuzumab (10mg/kg，IV，每周1次，共3次）明显增效P-DMl的抗肿瘤作 用，使抑瘤率从单用P-DMl 3mg/kg时的72%提高到127%，并有5/6肿瘤部分消退，增效时 毒性没有明显增加。因此，P-DMl (3、10mg/kg，IV，每周1次，共3次)剂量依赖性地明显抑 制Here印tin-抗药人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤的生长，引起肿瘤部分消退； Trastuzumab (10mg/kg，IV，每周1次，共3次）明显增效P-DMl的抗肿瘤作用。
[0098] 综上所述，本发明所述的抗体-药物偶联物P-DMl及其与抗体曲妥珠单抗的组合 显著地提高了治疗效果，本发明的方法提供了治疗基于HER2介导的病症如癌症更有效的 方法。
【主权项】
1. 一种具有如下结构的抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DM，即P-DMl :其中，mAb指帕妥珠单抗Pertuzumab，Pertuzumab经双功能连接体试剂SMCC与美登素 生物碱DMl连接，上式中η表示药物-抗体比。2. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物P-DM1，其特征在于，所述药物-抗体比 η的范围为1至8之间的整数值，其中，1、2、3、4、5、6、7或8个药物部分共价结合在抗体 Pertuzumab 上。3. -种用于制备治疗高增殖性疾病或病症的药物的治疗剂组合物，其特征在于，所述 治疗剂组合物包含治疗有效量的根据权利要求1或2所述的抗体-药物偶联物P-DMl和治 疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体。4. 根据权利要求3所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述HER2二聚化抑制剂抗体为 曲妥珠单抗Trastuzumab。5. 根据权利要求3或4所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述治疗有效量的抗体-药 物偶联物P-DMl和所述治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体可以组合成配制剂的形式施 用或交替地施用。6. 根据权利要求3或4所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述高增殖性病症是癌症。7. 根据权利要求3或4所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述高增殖性病症是表达 HER2的癌症。8. 根据权利要求7所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵 巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、非小细胞肺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、结 肠-直肠癌、肝癌和胆管癌、皮肤癌、食管癌、喉癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、腺癌、口 腔癌、甲状腺癌、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、肾癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌、鼻咽 癌、膀胱癌、黑素瘤、唇癌、毛细胞癌、滤泡性癌、脑和中枢神经系统癌、霍奇金淋巴癌或白血 病。9. 根据权利要求8所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述癌症是乳腺癌或胃癌。10. 权利要求1或2所述的P-DMl在制备用于治疗高增殖性疾病或病症的药物中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有如下结构的抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DM1(P-DM1)，以及包含P-DM1和HER2二聚化抑制剂抗体的治疗剂组合物，其中，所述治疗剂组合物包含治疗有效量的P-DM1和治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体。本发明还公开了一种治疗高增殖性疾病或病症的方法，包括对需要此类治疗的哺乳动物或人施用治疗有效量的P-DM1和HER2二聚化抑制剂抗体剂。本发明将Pertuzumab与美登素生物碱DM1偶联，所得偶联物P-DM1和HER2二聚化抑制剂抗体的组合物在体外和在体内在抑制癌细胞生长中显示协同效应，可以达到对HER2介导的病症如癌症的较好治疗效果。。
【IPC分类】C07K16/32, A61K31/537, A61P35/00, A61P35/02, A61K39/395
【公开号】CN104892763
【申请号】CN201410079082
【发明人】沈竞康, 孟韬, 马兰萍, 张永良, 彭红丽, 王昕 , 王英, 陈驎
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日
【公告号】WO2015131822A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体-药物偶联物以及用其治疗高增殖性病症的方法，具体涉及一种 抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)及其与治疗有效量的HER2二聚化抑制剂 抗体Trastuzumab的组合物，以及使用所述抗体-药物偶联物或组合物治疗高增殖性病症 的方法。
【背景技术】
[0002] HER2(ErbB2)是结合在细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，由原癌基因 HER2/neu编 码。属于表皮生长因子受体家族，该家族包括HERl (erbBl，EGFR)、HER2 (erbB2，NEU)、 HER3 (erbB3)及HER4 (erbB4)。HER2参与导致细胞生长和分化的信号传导途径。在大约 25%-30%的人乳腺癌中观察到有HER2的过表达。研究显示当HER2蛋白质过表达时乳癌浸 润性强，更具有侵袭性。而且HER2阳性肿瘤比不呈HER2阳性的肿瘤生长和蔓延得更快。据 报道HER2阳性乳癌是非HER2阳性乳癌复发率的2. 5倍。
[0003] 曲妥珠单抗（Trastuzumab)是一种针对Her-2/neu原癌基因产物的人源化单克隆 抗体，其选择性地结合在HER2 (或HER2/neu)受体的区域IV。曲妥珠单抗通过与HER2蛋 白质结合抑制肿瘤细胞生长。1998年，曲妥珠单抗(商品名：赫赛汀，Herceptin)获得美国 食品及药物管理局（Food and Drug Administration, FDA)批准上市，用于Her-2表达阳性 的乳腺癌治疗。虽然Herceptin的开发给具有HER2阳性肿瘤的患者提供了比单独的化疗 显著要好的结果，但另有将近50%的Her-2阳性患者对曲妥珠单抗治疗不敏感（Singer CF， Predicting the efficacy of Trastuzumab-based therapy in breast cancer: current standards and future strategies,Biochim Biophys Acta,2008,1786 (2):105-113),并 且大部分Her2阳性患者在经过I年的曲妥珠单抗治疗后，即会对其产生耐药性。因此，临 床上仍需要为对Herceptin治疗不响应或响应不足，具有过表达HER2的肿瘤或其它与HER2 表达有关的疾病的患者开发新的针对HER2的癌症疗法。
[0004] 抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate,ADC)利用单克隆抗体特异性识别 肿瘤细胞上特定抗原的特点，偶联小分子化疗药物，可实现精准地将抗肿瘤物质递送到肿 瘤革G细胞释放。2013年3月，Roche公司的ADC药物T-DMl (曲妥珠单抗Trastuzumab与 美登素 DMl偶联)获得FDA的认可用于HER2阳性转移性乳腺癌治疗。T-DMl在过表达HER2 的Trastuzumab敏感性和Trastuzumab抗性肿瘤细胞系，和人乳腺癌的异种移植物模型中 均显示出有力的抗肿瘤活性。T-DMl的作用机理研究显示除了小分子DMl的作用外，还包括 Trastuzumab 本身的作用和 ADCC 作用（Trastuzumab Emtansine:A Unique Antibody-Drug Conjugate in Development for Human Epidermal Growth Factor Receptor2 - Positive Cancer，Clin Cancer Res，2011，17 (20)，6437-6447)。帕妥珠单抗 Pertuzumab 亦是一个 作用于HER二聚化的单克隆抗体。通过结合HER2,阻滞了 HER2与其它HER受体的杂二聚， 导致有丝分裂活化蛋白激酶和PI3K通路受阻，进而出现肿瘤细胞生长停滞和凋亡，从而 减缓了肿瘤的生长。Pertuzumab与TTrastuzumab的区别在于轻链和重链的表位结合区， Pertuzumab结合在HER2的亚结构域2内的表位，而TTrastuzumab的表位则位于亚结构 域4。Pertuzumab通过阻断HER2与其它HER家族成员，包括HERl (表皮生长因子受体； EGFR)，HER3,和HER4的结合来起作用的。这种结合是在存在配体下及经MAP激酶和PI3 激酶发信号所需要的。因此，Pertuzumab可抑制配体启动的细胞内信号传导。抑制这些 信号传导途径分别能导致生长阻滞和调亡。将T-DMl与Pertuzumab联用在细胞及动物模 型上显示出较单个试剂更强的抗肿瘤活性（Dual targeting of HER2_positive cancer with Trastuzumab-emtansine(T-DMl) and pertuzumab: critical role for neuregulin blockade in anti-tumor response to combination therapy, Clin Cancer Res, Published Online First on 0ctober4, 2013)。但目前尚无关于将 Pertuzumab 与小分子 化疗药物小分子化疗药物偶联，来治疗HER2介导的疾病的相关报道。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗体-药物偶联物 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)及其与治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体Trastuzumab的 组合物。
[0006] 为了达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供一种具有如下结构的抗体-药物偶联物 Pertuzumab-MCC-DMl(P-DMl)：
[0008]
[0009] 其中，mAb指帕妥珠单抗Pertuzumab, Pertuzumab经双功能连接体试剂SMCC与美 登素生物碱DMl连接，上式中η表示药物-抗体比，且其范围优选为1至8之间的整数值， 其中，1、2、3、4、5、6、7或8个药物部分共价结合在抗体Pertuzumab上。
[0010] 本发明还提供一种用于治疗高增殖性疾病或病症的治疗剂组合物，其中，所述治 疗剂组合物包含治疗有效量的P-DMl和治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体。
[0011] 进一步地，所述HER2二聚化抑制剂抗体优选为曲妥珠单抗（Trastuzumab);
[0012] 进一步地，所述治疗有效量的P-DMl和所述治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体 可以组合成配制剂的形式施用或交替地施用。
[0013] 本发明还提供使用所述治疗剂组合物体外和/或原位治疗哺乳动物细胞、生物体 高增殖性疾病或病症的方法。本发明的另一方面还提供一种使用本发明的治疗剂组合物来 治疗哺乳动物或人高增殖性疾病或病症(诸如癌症，包括受HER2或KDR9 (VEGF受体1)调控 的疾病）的方法。
[0014] 本发明还提供一种治疗高增殖性疾病或病症的方法，包括对需要此类治疗的哺乳 动物或人施用治疗有效量的P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂。
[0015] 进一步地，所述P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂是以组合配制剂形式施用的；
[0016] 进一步地，所述P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂作为治疗剂组合交替地(交替， 序贯给药）分开施用；更进一步地，所述P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体剂是以约3周间 隔或每周1次间隔对具有1?增殖性病症的病人施用的；
[0017] 进一步地，所述哺乳动物是HER2阳性患者；更进一步地，所述HER2阳性患者已经 接受Trastuzumab和其它化疗试剂疗法。
[0018] 本发明的另一个方面还提供本发明所述的抗体-药物偶联物P-DMl和治疗剂组合 物在制备用于治疗哺乳动物或人高增殖性疾病或病症(诸如癌症，包括受HER2调控）的药 物中的用途。
[0019] 其中，本发明所述高增殖性病症是癌症；进一步地，所述高增殖性病症是表达 HER2的癌症；更进一步地，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生 殖泌尿道癌、非小细胞肺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、结肠 _直肠癌、肝癌和胆管癌、皮肤癌、 食管癌、喉癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、腺癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、表皮样癌、大细 胞癌、小细胞癌、肾癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、黑素瘤、 唇癌、毛细胞癌、滤 泡性癌、脑和中枢神经系统癌、霍奇金淋巴癌或白血病，优选为乳腺癌。
[0020] 本发明的另一个方面还提供通过定性和定量分析来自体外细胞增殖和体内肿 瘤异种移植物实验的功效数据为体内功效预测有效药物组合的方法，其中所述组合包括 P-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体。
[0021] 本发明提供一种用于为癌症治疗确定要组合使用的化合物的方法，包括：a)用 Pertuzumab-MCC-DMl和HER2二聚化抑制剂抗体的治疗剂组合处理体外肿瘤细胞系，并b) 测量协同或非协同效应，由此为癌症治疗确定协同治疗剂组合。
[0022] 进一步地，本发明还提供一种用于为癌症治疗确定要组合使用的化合物的方法， 包括：（a)对HER2扩增的乳腺癌细胞或胃癌细胞施用Pertuzumab-MCC-DMl和HER2二聚化 抑制剂抗体的治疗剂组合，和（b)测量对细胞增殖的抑制，由此为癌症治疗确定协同治疗剂 组合。其中，以固定浓度比例的P -DMl和Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)，或以固定浓 度的P-DMl联合各种浓度的Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)。CI值小于0. 9指示协 同性；CI值介于0. 9-1. 1之间指示加和性；而CI值大于I. 1指示拮抗性。
[0023] 其中，所述HER2扩增的乳腺癌细胞是BT-474、SK-BR-3 ;所述HER2扩增的胃癌细 胞是 NCI-N87。
[0024] 本发明的抗体-药物偶联物（P-DM1可以通过如下方法来制备：
[0025] 1)抗体的缓冲液交换
[0026] 利用脱盐层析（SephadexTM G25脱盐柱）方式置换帕妥珠单抗原液至反应缓冲液 (磷酸钾盐/NaCl/EDTA)中，并浓缩抗体，制备帕妥珠单抗抗体；
[0027] 2) MCC-DMl母液的制备
[0028] 称取MCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA)充分溶解制备母液；
[0029] 3)偶联反应
[0030] 在步骤（1)所制备的帕妥珠单抗中加入步骤（2)所配制的MCC-DMl母液进行缀合 反应。最初用若干过量的MCC-DMl滴定抗体以测定希望的DMl : mAb比例。然后加入8-10 倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液进行反应；
[0031] 4)纯化
[0032] 采用凝胶过滤柱（SuperdeX200)将偶联反应混合物用琥珀酸钠 /NaCl缓冲液凝胶 过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，或超滤数遍。
[0033] 在本发明中，作出如下定义：
[0034] 术语"治疗"或"处理"指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预 防或减缓(减轻）不想要的生理学变化或病症，诸如高增殖性状况诸如癌症的生长，形成或 传播。为了本发明，有利或期望的临床结果包括但不限于：缓解症状，削弱疾病的程度，疾病 状态稳定（即不恶化)，延迟或减缓疾病发展，改善或减轻疾病状态，及康复(无论是部分的 还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。"治疗"或"处理"还可以指与不接受治疗 的预期存活相比延长存活。需要治疗的受试者包括早就患有疾病或病症的受试者以及倾向 于患上疾病或病症的受试者或者要预防状况或病症的受试者。
[0035] 术语"治疗有效量"指本发明化合物的量，其（i )治疗本文所述特定疾病，状况，或 病症，（ii)减轻，改善，或消除特定疾病，状况，或病症的一种或多种症状，或（iii)预防或延 迟特定疾病，状况，或病症的一种或多种症状的发作。在癌症的情况中，药物的治疗有效量 可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制（即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器 官中；抑制（即一定程度的减缓，优选停止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一 定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物可抑制癌细胞生长和/或杀死现有癌 细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。对于癌症疗法，可以例如通过评 价距疾病发展的时间（TTP)和/或测定响应率（RR)来测量功效。
[0036] "高增殖性病症"指肿瘤，癌症，和新生物组织，包括恶变前和非新生物阶段，而且 还包括银屑病，子宫内膜异位症，息肉和纤维腺瘤。
[0037] 术语"癌症"和"癌性"指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生 理状况。"肿瘤"包括一个或多个癌性细胞。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞 瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞 状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞 癌，胃癌(包括胃肠癌)，膜腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀肮癌，肝瘤，乳腺 癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌， 甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，以及头颈癌。
[0038] 术语"药学可接受的"指明该物质或组合物必须是在化学和/或毒理学方面与构 成配制剂的其它成分和/或用它治疗的哺乳动物相容的。
[0039] 本文中所使用的术语"协同的"指比两种或更多种单一药剂的加和效果更有效的 治疗剂组合。P-DMl和HER2二聚化抑制剂的抗体之间的协同相互作用的确定可以基于自本 文所述测定法获得的结果。
[0040] 组合疗法可提供"协同性"和证明是"协同的"，即一起使用活性成分时所实现的效 果大于分开使用所致效果之和。当活性成分如下所述时可获得协同效应：（1)以组合的单 位剂量配制剂共配制和同时施用或递送；（2)作为分开的配制剂交替递送；或（3)提供一些 其它方案。当在交替疗法中递送时，当化合物序贯施用或边送时(例如通过分开的注射器中 的不同注射）可获得协同效应。一般而言，在交替疗法期间，序贯地（即时间上连续地）施用 有效剂量的每种活性成分。
[0041] 有益效果：
[0042] 在本发明的中，将Pertuzumab与小分子化疗药物偶联，P-DMl和HER2二聚化抑制 剂抗体的组合物在体外和在体内在抑制癌细胞生长中显示协同效应，可以达到对HER2介 导的病症如癌症的较好治疗效果。本发明所述的抗体-药物偶联物P-DMl及其与抗体曲妥 珠单抗的组合显著地提高了治疗效果，提供了治疗基于HER2介导的病症如癌症更有效的 方法。
[0043] 本发明的另外的优点和新颖的特征部分在下面的说明中列出，部分在检查下面的 说明书后对于本领域技术人员是显而易见的或可以通过本发明的实践而学会。凭借所附权 利要求中特别指出的手段/工具、组合、组合物和方法可以认识和获得本发明的优点。
【附图说明】
[0044] 图 1 显不单独各种浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1 )、Trastuzumab 以及固定 浓度比例（I: 1)的P-DMl和Trastuzumab组合处理5天后对BT-474细胞体外细胞增殖抑 制作用。
[0045] 图 2 显不各种固定浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1)联合 Trastuzumab,和单 独的各种浓度的Trastuzumab处理5天后对BT-474细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0046] 图 3 显不单独各种浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1 )、Trastuzumab 以及固定 浓度比例（1:10)的P-DMl和Trastuzumab组合处理5天后对NCI-N87细胞体外细胞增殖 抑制作用。
[0047] 图 4 显不各种固定浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1)联合 Trastuzumab,和单 独的各种浓度的Trastuzumab处理5天后对NCI-N87细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0048] 图 5 显不单独各种浓度的 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1 )、Trastuzumab 以及各种 固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab组合处理5天后对SK-BR-3细胞体外细胞增殖抑制作 用。
[0049] 图6 (A)显不单独各种浓度的Pertuzumab-MCC_DM1(P-DM1)处理5天后对Calcu_3 细胞体外细胞增殖抑制作用，（B)显示各种固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab,和单独的 各种浓度的Trastuzumab (+溶媒）处理5天后对Calu-3细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0050] 图7 (A)显示单独各种浓度的Pertuzumab-MCC- DMl (P-DMl)处理3天后对DU-145 细胞体外细胞增殖抑制作用，（B)显示各种固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab,和单独的 各种浓度的Trastuzumab (+溶媒）处理3天后对DU-145细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0051] 图8 (A)显示单独各种浓度的Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)处理3天后对SK0V-3 细胞体外细胞增殖抑制作用，（B)显示各种固定浓度的P-DMl联合Trastuzumab,和单独的 各种浓度的Trastuzumab (+溶媒）处理3天后对SK0V-3细胞体外细胞增殖抑制作用。
[0052] 图9显示如下给药后对Here印tin-抗药性人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠移植瘤 的肿瘤体积均值随时间变化的图：（1)溶剂对照；（2) P-DMl 3mg/kg ; (3) P-DMl 10mg/kg ; (4) P-DMl 3mg/kg+Trastuzumab 10mg/kg〇
【具体实施方式】
[0053] 在此详细地述及本发明的某些实施方案，所附结构和公式中例示了它们的例子。 虽然将会连同所列举的实施方案来描述本发明，应当理解它们并非意图将本发明限于那些 实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有备选方案、修改和等同方案，其可以包括在权利要求 所限定的本发明范围内。本领域技术人员会领会与本文中所描述的方法和材料相似的或等 同的许多方法和材料可用于实施本发明。本发明绝非限于所描述的方法和材料。倘若所 收入的文献、专利和相似的材料与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语，术语的 用法，所描述的技术，诸如此类，以本申请为准。
[0054] 实施例
[0055] 为了例示本发明，包括下列实施例。然而，应当理解，这些实施例不限制本发明，而 只是意图提示实施本发明的方法。
[0056] 实施例 I:Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)的制备
[0057] 制备步骤如下：
[0058] 1)抗体的缓冲液交换
[0059] 利用脱盐层析（SephadexTM G25脱盐柱）方式置换帕妥珠单抗原液至反应缓冲液 (50mM磷酸钾盐/50mM NaCl/2mM EDTA，pH7. 5)中，并浓缩抗体浓度至5mg/ml，制备帕妥珠 单抗抗体；
[0060] 2) MCC-DMl母液的制备
[0061] 称取MCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA)充分溶解制备10mg/ml的MCC-DMl母液；
[0062] 3)偶联反应
[0063] 在步骤（1)所制备的帕妥珠单抗中加入步骤（2)所配置的MCC-DMl母液进行缀合 反应。最初用若干过量的MCC-DMl滴定抗体以测定希望的DMl : mAb比例，对于人抗体通 常这个范围是6-10倍摩尔过量。反应中DM在5% v/v以内。反应温度为25°C，反应时间 为1. 5至约20小时。反应分为三组进行：
[0064] a)反应中加入8倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液；
[0065] b)反应中加入9倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液；
[0066] c)反应中加入10倍过量摩尔比的SMCC-DMl母液；
[0067] 4)纯化
[0068] 采用凝胶过滤柱（Superdex200)将偶联反应混合物用pH5. O的琥拍酸钠/150mM NaCl缓冲液凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，或超滤数遍。通过测定 缀合物在252和280nm的吸光度并使用DMl和抗体在这两个波长的已知消光系数来测量最 终缀合物中的每个Ab抗体分子的DMl分子的数目（计算公式如式1)。同时使用质谱分析 法计算产品的偶联率，并进行对比。数据见表1。
[0069] 式 1
[0071] 表1投料比对偶联率的影响
[0072]
[0073] 本实验中偶联率的测定方法：测定偶联率是指测定每个单抗分子上连接有小分子 药物的数量，即偶联物中药物与抗体的摩尔比。可采用紫外分光光度法和质谱分析法两种 方法测定。紫外分光光度法：通过测定偶联物在252nM和280nM处的紫外吸收值，并通过 朗伯比尔定律进行计算得出偶联率（DAR);质谱分析法：对抗体-美登素生物碱偶联物进行 ESI-MS分析，可以获得连接不用个数药物的峰型图，根据各个峰的面积进行计算得出偶联 率。通过两种方法获得的偶联率具有很好的一致性。
[0074] 本实验中偶联物浓度测定：采用紫外分光光度法，测定在252nM和280nM处的紫外 吸收值，通过朗伯比尔定律计算抗体和药物的浓度；本发明中所述的偶联物浓度是单抗浓 度与连接到单抗上的美登素生物碱（DMl)药物的总和。
[0075] 实施例2 :体外细胞增殖测定生物活性实验
[0076] 以下实验中所用的实验材料来源于：DMEM培养基、F12K培养基、RPMI1640培养基、 0. 25 %胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、100 X丙酮酸钠、100 X青链霉素购自Gibco公司。磺酰罗 丹明B (Sulforhodamine B，SRB)购自Sigma公司。BT-474乳腺癌细胞和NCI-N87胃癌细胞 来自中国科学院昆明细胞库，SK-BR-3乳腺癌细胞来自上海博谷生物科技有限公司，Calu-3 肺癌细胞来自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，SK0V-3卵巢癌细胞和DU-145前列 腺癌细胞来自美国典型培养物保藏中心（ATCC)。其他试剂均是分析纯。96孔平底聚苯乙 烯（Corning,产品目录号 3599)。Synergy2 酶标仪（Bio-Tek)。
[0077] 在本实施例中，研究了将 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DMl)单独或与 Trastuzumab 组 合对肿瘤细胞系增殖的作用。
[0078] 本实施例使用磺酰罗丹明B (SRB)比色法来评价药物组合的抗增殖作用。SRB是一 种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨 基酸结合；在510nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的 定量检测。
[0079] 本实施例选择的细胞系有：BT-474、SK-BR-3乳腺癌细胞、NCI-N87胃癌细胞、 Calu-3肺癌细胞、SK0V-3卵巢癌细胞和DU-145前列腺癌细胞。
[0080] BT-474、SK-BR-3、NCI-N87 细胞在含 10%胎牛血清的 1640 培养基中，Calu-3、 SK0V-3、DU-145细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37°C，5% C02培养箱中培养 至对数生长期，将处于对数生长期的上述细胞分别以2 X 103~9 X 103个细胞每孔的密度 接种至96孔培养板，每孔100 μ L，培养24小时后，加入不同浓度的药物分别作用3天或5 天，分别以3、4或5倍稀释制备9个浓度，每个浓度设复孔，以使得所有组合药物处理组在 同一块板，并设相应浓度的溶媒对照及无细胞培养基孔。作用结束后，贴壁细胞倾去培养 液，加入4°C预冷的三氯乙酸溶液（30%，w/v) 100 μ 1，于4°C固定1小时，随后用去离子水冲 洗5遍，室温干燥后，每孔加入0. 4%(w/v)的SRB染液（Sigma, 1%冰乙酸配制)100μ L，室温 下孵育染色30min后，用1%冰乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。每孔加入IOmM Tris溶液100 μ L,室温下孵育染色15min后,用1%冰乙酸冲洗五次洗去未结合的SRB,室温 干燥后，每孔加入IOmM Tris缓冲液（pH=10. 5)溶解与细胞蛋白结合的染料，采用Synergy2 酶标仪（Bio-Tek)波长510nm和690nm处测定光吸收值（OD值)，并得到A=0D510-0D690。
[0081] 抑制率（％)=( A对照-A给药）/ A对照X 100%。
[0082] 用CalcuSyn软件程序使用Chou和Talalay组合法，通过等效图解方程CI=(D) 1/ (Dx) 1+⑶2ADx) 2确定组合指数（Cl )。药物I (D) 1与药物2 (D) 2组合的抑制X%，（Dx) 1和 (Dx) 2是抑制X%时的单独使用药物1和药物2时的浓度。对于各化合物而言，使用通过SRB 测定法测得的各浓度下的生长％值。
[0083] 本实验使用 Pertuzumab-MCC-DMl (P-DM1)单独或联合 Trastuzumab 对多种 HER2 过表达的肿瘤细胞系进行了体外细胞 培养增殖作用的研究，同时也对非HER2过表达的肿 瘤细胞系进行了体外细胞培养增殖作用的研究。使用Chou&Talalay方法分析了数据，以固 定浓度比例的P-DMl和Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)，或以固定浓度的P-DMl联合 各种浓度的Trastuzumab组合测定组合指数（Cl)。CI值小于0. 9指示协同性；CI值介于 0. 9-1. 1之间指示加和性；而CI值大于I. 1指示拮抗性。P-DMl单独处理均能产生抗肿 瘤细胞增殖活性，如图1所示，对于HER2过表达的BT-474细胞使用固定浓度比例（1:1)的 P-DMl与Trastuzumab组合导致协同的抗细胞增殖活性。小鼠异种移植物研究显示了相似 的结果，P-DMl联合Trastuzumab导致与用单独药剂治疗相比大大增强的抗肿瘤功效（图 9)。如图3所示，HER2过表达的NCI-N87细胞使用固定浓度比例的P-DMl与Tastuzumab联合 (P-DMl = Tastuzumab为1:10)也导致协同的抗细胞增殖活性，除了最高（10 μ g/mL P-DMl和 100yg/mL Trastuzumab)或最低（0.0256ng/mL P-DM1 和0.256ng/mL Trastuzumab)浓度的 组合。如图3-5所示，在HER2过表达的NCI-N87、SK-BR-3细胞中，各种浓度的Trastuzumab 与多个固定浓度的P-DMl组合均导致协同的抗细胞增殖活性。如图2所示，在BT-474细胞 中，各种浓度的Trastuzumab与多个固定浓度的P-DMl组合均导致协同的抗细胞增殖活性， 除了与高浓度的Trastuzumab (25或100 μ g/mL)的组合。如图6所示，对HER2过表达的 Calu-3细胞，固定浓度的P-DM1 (0. 5或5 μ g/mL)与一定浓度范围的Trastuzumab (0. 1~ 6. 5 μ g/mL)组合导致协同的抗细胞增殖活性。如图7所示，对非HER2过表达的DU-145细 胞，各种浓度的Trastuzumab与固定浓度的P-DMl (7或10 μ g/mL)组合导致协同的抗细胞 增殖活性。如图8所示，对非HER2过表达的SK0V-3细胞，单独的P-DMl产生抑制肿瘤细胞 增殖作用；固定浓度的P-DMl与Trastuzumab组合不比单独的P-DMl更有效。
[0084] 实施例3 :体内抗肿瘤功效测定实验：
[0085] 可以在体内测量本发明的组合的功效，即在啮齿类动物中植入癌细胞的同种异体 移植物或异种移植物，并用所述组合处理肿瘤。将受试小鼠用药物或对照处理，并监测数周 或更长时间以测量到达肿瘤倍增的时间，对数细胞杀伤，和肿瘤抑制。
[0086] 1)实验动物
[0087] BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。合 格证号：SCXK (沪）2012 - 0002。饲养环境：SPF级。
[0088] 2)实验步骤
[0089] 裸小鼠皮下接种人乳腺癌BT-474/T721细胞，待肿瘤生长至100-200mm3后，将动 物随机分组（D0)。给药剂量和给药方案见表2。每周测2次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿 瘤体积（V)计算公式为：
[0090] V = l/2XaXb2其中a、b分别表示长、宽。
[0091] T/C(%) = (T-Ttl) AC-Cci) X 100,其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；TQ、Cci为实验开 始时的肿瘤体积。
[0092] 表2给药剂量和给药方案
[0093]
[0094] D0:第一次给药时间；IV:静脉给药；
[0095] 实验开始时小鼠数目：对照组n=10,治疗组n=6。
[0096] 3)实验结果
[0097] 图9显示了如下给药后对Here印tin-抗药性人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠移 植瘤的疗效：（1)溶剂对照；（2 ) P-DMl 3mg/kg ; (3 ) P-DMl 10mg/kg ; (4 ) P-DMl 3mg/ 1^+1^&81：112111]^131〇11^/1^。结果显示，？-〇11(3、1〇11^/1^，1￥，每周1次，共3次）明显抑制 BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为72%和97%，其中高剂量组有1/6肿 瘤部分消退；Trasutuzumab (10mg/kg，IV，每周1次，共3次）明显增效P-DMl的抗肿瘤作 用，使抑瘤率从单用P-DMl 3mg/kg时的72%提高到127%，并有5/6肿瘤部分消退，增效时 毒性没有明显增加。因此，P-DMl (3、10mg/kg，IV，每周1次，共3次)剂量依赖性地明显抑 制Here印tin-抗药人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤的生长，引起肿瘤部分消退； Trastuzumab (10mg/kg，IV，每周1次，共3次）明显增效P-DMl的抗肿瘤作用。
[0098] 综上所述，本发明所述的抗体-药物偶联物P-DMl及其与抗体曲妥珠单抗的组合 显著地提高了治疗效果，本发明的方法提供了治疗基于HER2介导的病症如癌症更有效的 方法。
【主权项】
1. 一种具有如下结构的抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DM，即P-DMl :其中，mAb指帕妥珠单抗Pertuzumab，Pertuzumab经双功能连接体试剂SMCC与美登素 生物碱DMl连接，上式中η表示药物-抗体比。2. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物P-DM1，其特征在于，所述药物-抗体比 η的范围为1至8之间的整数值，其中，1、2、3、4、5、6、7或8个药物部分共价结合在抗体 Pertuzumab 上。3. -种用于制备治疗高增殖性疾病或病症的药物的治疗剂组合物，其特征在于，所述 治疗剂组合物包含治疗有效量的根据权利要求1或2所述的抗体-药物偶联物P-DMl和治 疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体。4. 根据权利要求3所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述HER2二聚化抑制剂抗体为 曲妥珠单抗Trastuzumab。5. 根据权利要求3或4所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述治疗有效量的抗体-药 物偶联物P-DMl和所述治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体可以组合成配制剂的形式施 用或交替地施用。6. 根据权利要求3或4所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述高增殖性病症是癌症。7. 根据权利要求3或4所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述高增殖性病症是表达 HER2的癌症。8. 根据权利要求7所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵 巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、非小细胞肺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、结 肠-直肠癌、肝癌和胆管癌、皮肤癌、食管癌、喉癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、腺癌、口 腔癌、甲状腺癌、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、肾癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌、鼻咽 癌、膀胱癌、黑素瘤、唇癌、毛细胞癌、滤泡性癌、脑和中枢神经系统癌、霍奇金淋巴癌或白血 病。9. 根据权利要求8所述的治疗剂组合物，其特征在于，所述癌症是乳腺癌或胃癌。10. 权利要求1或2所述的P-DMl在制备用于治疗高增殖性疾病或病症的药物中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有如下结构的抗体-药物偶联物Pertuzumab-MCC-DM1(P-DM1)，以及包含P-DM1和HER2二聚化抑制剂抗体的治疗剂组合物，其中，所述治疗剂组合物包含治疗有效量的P-DM1和治疗有效量的HER2二聚化抑制剂抗体。本发明还公开了一种治疗高增殖性疾病或病症的方法，包括对需要此类治疗的哺乳动物或人施用治疗有效量的P-DM1和HER2二聚化抑制剂抗体剂。本发明将Pertuzumab与美登素生物碱DM1偶联，所得偶联物P-DM1和HER2二聚化抑制剂抗体的组合物在体外和在体内在抑制癌细胞生长中显示协同效应，可以达到对HER2介导的病症如癌症的较好治疗效果。。
【IPC分类】C07K16/32, A61K31/537, A61P35/00, A61P35/02, A61K39/395
【公开号】CN104892763
【申请号】CN201410079082
【发明人】沈竞康, 孟韬, 马兰萍, 张永良, 彭红丽, 王昕 , 王英, 陈驎
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日
【公告号】WO2015131822A1
最新回复(0)