一种抗CD3抗原和Her-2抗原的双特异性抗体的制作方法
一种抗CD3抗原和Her-2抗原的双特异性抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种双特异性抗体，属于多肽，更具体地，属于免疫球蛋白技术领 域。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌在欧美国家及我国部分大城市已占女性恶性肿瘤的首位，目前常用的治疗 方式包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗以及分子靶向治疗等。乳腺癌是乳腺上皮发生恶性 肿瘤，其发病率占女性恶性肿瘤的第一位，在我国近年来发病率明显上升。随着诊疗水平 的不断提尚，5年生存率大为提尚，但仍有20%~30%的患者在手术治疗后复发、转移或死 亡。伴随着免疫科学的发展，免疫治疗成为乳腺癌治疗研宄的新领域。
[0003] 免疫治疗分为被动免疫和主动免疫两种。被动免疫是指将对疾病有免疫力的供者 的免疫应答产物或其人工制成物（抗体、免疫效应细胞、小分子免疫肽等）应用于肿瘤患 者，以发挥治疗疾病的作用，其典型例子是单克隆抗体赫赛汀（Here印tin)治疗Her-2受体 过表达乳腺癌的成功应用。赫赛汀是Her-2抗原的抗体，是最早应用于乳腺癌的单克隆抗 体。抗体主要通过抗体依赖的细胞毒作用（Antibody Dependent Cellular Cytotoxcity， ADCC)起到杀伤肿瘤细胞的作用。赫赛汀与Her-2细胞外域亚结构IV结合，阻止Her-2受 体同源和异源二聚化，一方面抑制Her-2的信号转导系统，另一方面可以激活ADCC效应杀 伤肿瘤细胞。曲妥珠单抗，对于Her-2阳性的乳腺癌患者，曲妥珠单抗联合其他化疗药物作 为辅助或者新辅助治疗已成标准方案。但是，它的治疗效果非常有限，因为66%至88%的 患者在接受治疗的第一年就会产生抗药性。此外，赫赛汀还会损害其它健康器官。另外，赫 赛汀需要和其它化疗药物，如紫杉醇联合用药才能提高患者的生存率。除此之外，另一种针 对Her-2的帕妥珠单抗和联合了曲妥珠单抗与美坦辛（Maytansine)的新型革El向药物T-DMl 经FDA批准也已经用于临床，但是这种药物需要通过共价连接的方式把抗体和药物连接起 来，生产工艺复杂，成本高。
[0004] 肿瘤免疫监视（Immune Surveillance)理论认为，癌前细胞或者癌细胞可以诱发 机体产生免疫反应，从而杀伤异型细胞或者癌细胞。激活的效应T细胞可以直接杀伤肿瘤 细胞，也可以通过分泌细胞因子诱导肿瘤细胞及其他基质细胞凋亡或者趋化巨噬细胞等实 现非特异性免疫杀伤。另一方面，癌细胞也存在免疫逃避机制，逃避免疫系统的杀伤，从而 有利于癌细胞的生长与转移，其中免疫抑制性细胞和分子如调节性T细胞（T regulatory cell，Treg)、髓源抑制细胞（Myeloid Derived Suppressor Cell，MDSC)、肿瘤相关巨细 胞和白细胞介素-6(11^61"16111^11-6，11^-6)等在这个过程中起到重要作用。因此，促进抗 原呈递细胞（Antigen Presenting Cells，APCs)的抗原呈递功能、T细胞的抗肿瘤效应以 及抑制肿瘤相关的免疫抑制因素是免疫治疗的主要策略。如过继性T细胞治疗（Adoptive T Cells Therapy)是将具有抗肿瘤效应的T细胞在体外培养扩增，再回输给相应的肿瘤患 者，发挥抗肿瘤免疫反应的作用。目前在转移性黑素瘤患者中，过继性T细胞治疗已取得了 明显疗效，但是在乳腺癌的治疗中还没有应用。
[0005] 双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗 原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体，在识别肿瘤 细胞抗原，诱导ADCC效应的同时，识别效应T细胞，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强 效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，如乳腺癌细胞的Her-2抗原和T细胞的CD3抗原。
[0006] 抗体分子是通过其重链和轻链可变区共同组成一个特定的空间结构，识别抗原分 子，普通的抗体有四条多肽链组成，2条相同的轻链，2条相同的重链，只能识别同一个抗原 分子。双特异性抗体可以利用不同的技术获得，如将2种不同抗体的可变区序列串联在同 一个恒定区序列基因上，这样表达出来的抗体分子有2种不同的抗原结合区；或者利用化 学的方法，将2个不同轻链、2个不同的重链分子连接成一个抗体样结构的分子。抗体分子 的重链和轻链可变区可以形成一定的空间结构，识别特定的抗原分子。有研宄发现，不同的 抗体分子间，存在轻链序列或者重链序列相同的现象，证明轻链和重链通过空间结构的相 互契合，可以识别不同的抗原分子，这也是抗体分子交叉反应的理论基础。
[0007] 基于现有技术中的单一识别在肿瘤治疗领域存在的问题，本发明意欲提供一种同 时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体，在识别乳腺癌细胞的Her-2抗原，诱导ADCC效 应的同时，识别效应T细胞的CD3抗原，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强效应T细胞 对肿瘤细胞的杀伤作用。
【发明内容】
[0008] 基于上述目的，本发明首先提供了一种双特异性抗体，所述抗体含有两条序列相 同的轻链，两条序列不同的重链。
[0009] 所述轻链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO : 1第1-108位氨 基酸残基所示。其中，⑶Rl、⑶R2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1的第24-34 位、57-63位和89-96位氨基酸残基所示。
[0010] 在一个优选的技术方案中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第 109-214位氨基酸残基所示。
[0011] 所述第1条重链的可变区识别Her-2抗原，简称Her-2重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位氨基酸残基所示。其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO : 2的第26-33位、50-72位和97-109位氨基酸残基所示。
[0012] 在一个优选的技术方案中，所述第1条重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2 第116-450位氨基酸残基所示。
[0013] 所述第2条重链的可变区识别T细胞表面的⑶3抗原，简称⑶3重链，其⑶R1、 CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :3的第25-33位、38-61位和97-110位氨 基酸残基所示。
[0014] 在一个优选的技术方案中，所述第2条重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3 第1-116位氨基酸残基所示。
[0015] 在一个更为优选的技术方案中，所述第2条重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3第117-451位氨基酸残基所示。
[0016] 在免疫球蛋白可变区内，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比V区内其他区 域更易变化，这些区域称为高变区（Hypervariable Region HVR)，其余部分被称为框架区 (Frame Region)。高变区实际上是特异性抗原与免疫球蛋白结合的位置。由于这些高变 区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区（Complementarity-Determining Region， CDR)，即CDR区。一条重链或轻链上的3个CDR区构成了抗体与抗原特异性结合的部位。本 领域技术人员可以根据上述CDR区序列，再配以保守性的框架区序列和恒定区序列，同样 可以达到本发明的发明效果，因此这些技术方案也同样在本发明的保护范围之内。
[0017] 其次，本发明还提供了一种能够表达和分泌上述抗体的宿主细胞，所述细胞含有 能够表达抗人Her-2抗原的抗体轻链的真核表达载体，能够表达抗人Her-2抗原的抗体重 链的真核表达载体，和能够表达抗CD3抗原抗体重链的真核表达载体，其特征在于，所述抗 人Her-2抗原的抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :1第1-108位所示，所述抗人 Her-2抗原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位所示，所述抗⑶3抗 原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :3第1-116位所示。
[0018] 在一个优选的技术方案中，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链可变区的核苷酸编码 序列如SEQ ID NO :4第1-324位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链可变区的核苷 酸编码序列如SEQ ID NO :5第1-345位碱基所示，所述抗CD3抗原的抗体重链可变区的核 苷酸编码序列如SEQ ID NO :6第1-348位碱基所示。
[0019] 在一个更为优选的技术方案中，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链恒定区的核苷酸 编码序列如SEQ ID NO :4第325-642位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链恒定区 的核苷酸编码序列如SEQ ID NO :5第346-1350位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体重链恒 定区的核苷酸编码序列如SEQ ID NO :6第349-1353位碱基所示。
[0020] 优选地，所述真核表达载体为p⑶NA3. 0。
[0021] 更为优选地，所述宿主细胞为HEK293细胞。
[0022] 发明人分别对抗Herceptin抗原的抗体重链序列和抗⑶3抗原的抗体的重链序 列进行了突变，对于Here印tin抗体的重链 间形成第一对二硫键的半胱氨酸残基（SEQ ID NO: 2第229位），突变为赖氨酸残基，而对于抗CD3抗体的重链间第一对二硫键的半胱氨酸 残基（SEQ ID NO:3第230位），则突变为谷氨酸残基。
[0023] 当两个抗体重链基因在同一个细胞中转录后，相同的重链序列由于在第一个二硫 键位置的氨基酸残基所带电荷相同，互相排斥，因此不能形成二聚体，而不同的重链序列由 于分别带有正电荷和负电荷的氨基酸残基，可以形成离子键而构成二聚体，由于两种抗体 使用相同的轻链序列，因此获得的抗体分子带有2条相同的轻链序列和2条不同的重链序 列，可以分别识别乳腺癌细胞表面的Her-2抗原和T细胞表面的CD3抗原，成为双特异性抗 体分子。在针对人乳腺癌细胞MCF-7的ADCC细胞毒性实验中，本发明提供的双特异性抗体 显示出了优异的细胞毒性，显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性，其杀伤率 达到70 %，高于Her-2抗体和⑶3抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用，这显 示出本发明的双特异性抗体在临床治疗Her-2抗原阳性的肿瘤的应用价值。
【附图说明】
[0024] 图I. ScFv构建示意图；
[0025] 图2.重链基因 PCR电泳图谱；
[0026] 图3.双特异性抗体结构示意图；
[0027] 图4.抗体重链表达载体；
[0028] 图5.抗体轻链表达载体；
[0029] 图6.表达产物SDS-PAGE蛋白电泳图谱；
[0030] 图7.蛋白A亲和层析洗脱峰图；
[0031] 图8.双特异性抗体的FACS分析图；
[0032] 图9. ADCC细胞毒性试验结果对照图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0034] 实施例1 :双特异性抗体的制备
[0035] 1.人单链抗体ScFv库的制备
[0036] (1)人外周血B细胞的获得和总RNA的提取
[0037] 静脉取血2ml，加入含肝素溶液（10~50u/ml血样本）的试管中，混匀，使血液抗 凝。用pH7. 2Hanks液将抗凝血稀释1倍。
[0038] (2)吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45°角，用 毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。在18°C~ 20°C下，用水平离心机以2000r/min离心20min。
[0039] (3)用毛细吸管轻轻插到混浊带，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管 中。既要吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成 分。
[0040] (4)用 Hanks 液洗绦细胞 3 次。第一次 2000r/min，IOmin ;第 2 ~3 次 1500r/min， lOmin，可去掉大部分混杂的血小板。将沉淀细胞再于液氮中彻底碾磨成粉末。根据RNA抽 提试剂盒说明提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳（1% )鉴定RNA的完整性。
[0041] 2.采用Herceptin抗体轻链序列固定的人抗体ScFv表达载体的构建
[0042] (1)按照大肠杆菌的密码子偏性人工合成Herceptin抗体轻链可变区的DNA序列， 序列如SEQ ID N0:4的1-324位碱基所示，在其5 端增加了 SacI酶切位点，3'-端增加 了 XbaI酶切位点。将上述人工合成的轻链序列采用Sacl/Xbal双酶切处理，回收630bp的 DNA片段，连接到pComb3载体（见图1)上。
[0043] (2)以Oligod T为引物通过RNA逆转录合成第1条cDNA链。逆转录PCR条件： 42°C 20min，99°C 5min，5°C 5min，1个循环。再以此单链为模板，用确定好的引物对扩增VH 基因片段。
[0044] 人抗体重链5 端引物（加入XhoI酶切位点）
[0045] VH5 5' _(C/G)AGGTGCAGCTCGAGTCTGGG_
[0046] VH6 5' - (C/G)AGGTGCAGCTCGAG(C/G)AGTCTGGG-
[0047] 人抗体重链3 端引物（加入SpeI酶切位点）
[0048] VHl 5' -GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG-
[0049] VH2 5' -CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTT-
[0050] VH3 5'-TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT-
[0051] VH4 5' -GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGA-
[0052] 人抗体重链基因可变区的扩增：采用上述引物的组合进行人B细胞抗体重链可变 区序列的扩增，共8组PCR，PCR的反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火 30S，72°C延伸lmin，30个循环（图2为重链基因扩增的电泳图谱：抗体重链的PCR片段长 度为550-600bp，从8组PCR产物中回收500-600bp长度的DNA片段用于文库的构建）。
[0053] (3)然后将重链PCR产物经SpeI和XhoI双酶切处理后，克隆到上述的pComb3载 体上，构建好双特异性人抗体重链筛选文库。
[0054] (4)噬菌体抗体库的筛选与鉴定
[0055] 将重组人⑶3抗原bFGF用50mmol/L碳酸氢钠 （pH 10. 0)稀释至lmg/L，包被 ELISA板；10g/L BSA. PBS封闭后加入约1X1011初级噬菌体抗体库，孵育2h，PBST液洗1 次（第2轮洗5次，第3轮洗10次，每次5min)，以200ul冼脱液回收噬菌体，中和缓冲液 调节pH至中性，感染对数生长期的大肠杆菌XLL Blue进行富集。转入三角瓶后补加 IOmL SB培养基（含20mg/L氨苄青霉素和10mg/L四环素），取10和IuL涂LB (氨苄）平皿，滴 定洗脱下来的噬菌体，其余的于37°C振荡培养lh。加入IOOmL SB培养基（含20mg/L氨苄 青霉素和10mg/L四环素），37°C振荡培养至OD = 0. 6,加入约1X1012VCSM13进行噬菌体 抗体库活化，测定克隆形成单位（CFU)后进行下一轮筛选。按相同方法进行3轮淘选。
[0056] 挑取16株经3轮筛选获得的阳性克隆，接种于含50mg/L Am p的LB培养液中， 37°C培养至0D600 = 0. 3-0. 4,加入辅助噬菌体进行活化富集噬菌体。富集的各个噬菌体 克隆采用ELISA方法进行特异性鉴定，每孔包被人重组⑶3抗原100ng，加70ul噬菌体抗 体，HRP标记的鼠抗M13抗体显色。
[0057] 经ELISA检测，16株噬菌体克隆均可以和⑶3抗原结合。经序列分析，获得4个抗 体的重链可变区序列。
[0058] (3)双特异性抗体重链恒定区基因的突变
[0059] 为了使获得的抗体分子含有2个不同的抗体重链序列，我们分别对Hec印tin抗体 的重链序列和获得的CD3抗体的重链序列进行了突变，对于Herceptin抗体的重链间形成 第一对二硫键的半胱氨酸残基（SEQ ID NO: 2第229位），突变为赖氨酸残基，而对于抗⑶3 抗体的重链间第一对二硫键的半胱氨酸残基（SEQ ID NO:3第230位），则突变为谷氨酸残 基。
[0060] 当两个抗体重链基因在同一个细胞中转录后，相同的重链序列由于在第一个二硫 键位置的氨基酸残基所带电荷相同，互相排斥，因此不能形成二聚体，而不同的重链序列由 于分别带有正电荷和负电荷的氨基酸残基，可以形成离子键而构成二聚体，由于两种抗体 使用相同的轻链序列，因此获得的抗体分子带有2条相同的轻链序列和2条不同的重链序 列，可以分别识别乳腺癌细胞表面的Her-2抗原和T细胞表面的CD3抗原，成为双特异性抗 体分子。图3为双特异性抗体分子结构示意图。
[0061] (4)共转染与表达
[0062] 分别合成抗CD3的抗体重链全长cDNA序列（230位半胱氨酸残基突变为谷氨 酸残基）和Herceptin的重链cDNA全长序列（229位半胱氨酸残基突变为赖氨酸残基， 然后分别克隆到P⑶NA3. 0质粒中（见图4)，与表达Herceptin抗体的轻链序列的质粒 p⑶NA-HerL (见图5)共转染人HEK293细胞，3天后从培养上清中采用蛋白A亲和层析的方 法纯化表达的IgG。图6为表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图谱，A为非还原性SDS-PAGE电 泳图，表明所表达的双特异性抗体分子量大约为150kDa，B为还原性SDS-PAGE结果图，显示 抗体重链和轻链的分子量。图7A为蛋白A亲和层析洗脱峰图，图7B为双特异抗体洗脱峰 放大图。通过对表达产物的ELISA鉴定，获得的4种IgG中只有1种可以结合重组人⑶3 抗原，选择该抗体为模板构建双特异性抗体。相应的抗体全序列分别为：
[0063] DHerc印tin抗体 轻链全序列为SEQ ID NO :1，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第1-108位氨基酸残基所示，其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1的第24-34位、57-63位和89-96位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第109-214位氨基酸残基所示。
[0064] 2)Hec印tin抗体的重链全序列为SEQ ID NO :2,可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位氨基酸残基所示，其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :2的第26-33位、50-72位和97-109位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2第116-450位氨基酸残基所示。
[0065] 3)⑶3抗体的重链的全序列为SEQ ID NO :3,可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3 第1-116位氨基酸残基所示，其中⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :3 的第25-33位、38-61位和97-110位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3第117-451位氨基酸残基所示。
[0066] 实施例2 :流式细胞仪技术（FACS)检测双特异性抗体的功能
[0067] 将培养的人乳腺癌BT474细胞首先用细胞刮刀从培养皿中刮下，将细胞置于有 5ml PBS缓冲液的50ml离心管中，用注射器的活塞挤压细胞制成单细胞悬液。离心收集细 胞。用50ml染色液重悬样本，进行细胞计数和活力分析；再次离心细胞，弃掉上清，重悬细 胞使其细胞数达到2 X IO7个/ml ;
[0068] 1)抗体的准备和孵育：
[0069] 用50ul染色液稀释纯化获得的双功能抗体至lug/ml，加入50ul细胞悬液（相当 于IO 6个细胞）于每个试管或孔中，轻轻混匀；避光冰浴30分钟。4°C离心沉淀细胞5分钟 (300-400g)，吸掉上清；用染色液重复洗涤细胞2次；加入IOOul用染色液稀释的FITC标记 的鼠抗人二抗（I :1000)，避光冰浴30分钟，然后用染色液洗涤细胞3次，弃上清，用IOOul 含有PI的染色液重悬细胞，进行FACS分析。
[0070] 取IOOul抗凝的人全血，加50ul染色液稀释的纯化获得的双功能抗体（lug/ml)， 然后加等体积2XRBC红细胞裂解液，室温避光放置10分钟，离心弃上清，用染色液洗涤细胞 3次，细胞用IOOul染色液稀释的FITC标记的鼠抗人二抗（I :1000)，避光冰浴30分钟，然 后用染色液洗涤细胞3次，弃上清，用IOOul含有PI的染色液重悬细胞，进行FACS分析。
[0071] 图8为本发明双特异性抗体的FACS分析结果图。图8A为BT474细胞FACS分析 结果，图8B为Jurka细胞FACS分析结果，如图所示，双特异性抗体可同时结合表达Her2抗 原的BT474细胞和表达CD3抗原的Jurkat细胞，而赫赛汀抗体只能结合BT474细胞。
[0072] 实施例3 :ADCC细胞毒性试验
[0073] 1.白细胞分离
[0074] 1)取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀。
[0075] 2)将试管直立静置于室温或37°C温箱中30~60min，待红细胞自然沉降。此时可 见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白 色的白细胞层（正常人外周血白细胞）。
[0076] 3)用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中；
[0077] 4)加入无 Ca2、Mg2Hank's液至离试管口 3cm处，混勾，以水平离心机2000r/min离 心lOmin，弃上清，同法再洗绦两次。
[0078] 5)沉淀细胞用适量10%~20%灭活小牛血清的Hank' s液重悬，计数，配成所需 的细胞浓度的悬液，一般常用2 X IO6/毫升。
[0079] 2.肿瘤细胞的培养
[0080] 人乳腺癌细胞MCF-7在含10%胎牛血清中的RPMI-1640培养基中培养至75 - 80%的密度，弃培养基，用预热至37度的PBS洗涤细胞2次，加2ml胰蛋白酶一 EDTA溶液， 室温放置5分钟，加2ml含10%胎牛血清的培养基终止反应，采用一次性的无菌吸管反复吹 打细胞至单细胞悬液，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，PBS再洗绦两次，计数 后，用培养基重悬细胞至2X10 6/毫升备用。
[0081] 3.细胞毒性试验
[0082] 取重悬肿瘤细胞10微升（2X104)，加入含0. 1 % BSA的RPMI-1640培养基30微升， 然后分别加入不同的抗体10微升（lmg/ml)，37度孵育30分钟，然后加入5X10 5(效应细 胞/靶细胞=25)?1^(：，体积为250微升，37度孵育4小时，以水平离心机20001'/1^11离心 lOmin，取上清采用Roche细胞毒性检测试剂盒检测上清中LDH的活性以换算成肿瘤细胞的 死亡程度，试剂盒的货号为：11644793001。结果如图9所示。
[0083] 如图9所示，纵坐标为T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤率，本发明提供的双特异性抗体 为柱1，其显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性，显示出了优异的细胞毒性， 杀伤率高达70 % (横坐标6种样本的杀伤率依次为70 %，64%，50 %，13 %，2 %，2 % )，高于 Her-2抗体和CD3抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用，这显示出本发明的双 特异性抗体在临床治疗Her-2抗原阳性的肿瘤的应用价值。
【主权项】
1. 一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有两条序列相同的轻链，两条序列不同 的重链，所述轻链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-108位氨基 酸残基所示，所述第1条重链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO:2第 1-115位氨基酸残基所示，所述第2条重链的可变区识别T细胞表面的⑶3抗原，其⑶R1、 CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:3的第25-33位、38-61位和97-110位氨 基酸残基所示。2. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO:1第109-214位氨基酸残基所示。3. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第1条重链恒定区的氨基酸序列如 SEQIDNO:2第116-450位氨基酸残基所示。4. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第2条重链可变区的氨基酸序列如 SEQIDNO:3第1-116位氨基酸残基所示。5. 根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述第2条重链恒定区的氨基酸序列如 SEQIDNO:3第117-451位氨基酸残基所示。6. -种能够表达和分泌权利要求1-5中任一所述抗体的宿主细胞，所述细胞含有能 够表达抗人Her-2抗原的抗体轻链的真核表达载体，能够表达抗人Her-2抗原的抗体重链 的真核表达载体，和能够表达抗CD3抗原抗体重链的真核表达载体，其特征在于，所述抗人 Her-2抗原的抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-108位所示，所述抗人Her-2 抗原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:2第1-115位所示，所述抗CD3抗原的抗 体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:3第1-116位所示。7. 根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述抗人Her-2抗原的抗体的轻链可变区 的核苷酸编码序列如SEQIDNO:4第1-324位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链 可变区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:5第1-345位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体重 链可变区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:6第1-348位碱基所示。8. 根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链恒定区的 核苷酸编码序列如SEQIDNO:4第325-642位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链 恒定区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:5第346-1350位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体 重链恒定区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:6第349-1353位碱基所示。9. 根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述真核表达载体为pCDNA3. 0。10. 根据权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种双特异性抗体，所述抗体带有2条相同的轻链序列和2条不同的重链序列，可以分别识别乳腺癌细胞表面的Her-2抗原和T细胞表面的CD3抗原。所述双特异性抗体能够显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性。
【IPC分类】A61P35/00, C07K16/30, C07K16/46, C12N5/10
【公开号】CN104892765
【申请号】CN201510368641
【发明人】宋海鹏, 李敏, 王庆东
【申请人】长春力太生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种双特异性抗体，属于多肽，更具体地，属于免疫球蛋白技术领 域。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌在欧美国家及我国部分大城市已占女性恶性肿瘤的首位，目前常用的治疗 方式包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗以及分子靶向治疗等。乳腺癌是乳腺上皮发生恶性 肿瘤，其发病率占女性恶性肿瘤的第一位，在我国近年来发病率明显上升。随着诊疗水平 的不断提尚，5年生存率大为提尚，但仍有20%~30%的患者在手术治疗后复发、转移或死 亡。伴随着免疫科学的发展，免疫治疗成为乳腺癌治疗研宄的新领域。
[0003] 免疫治疗分为被动免疫和主动免疫两种。被动免疫是指将对疾病有免疫力的供者 的免疫应答产物或其人工制成物（抗体、免疫效应细胞、小分子免疫肽等）应用于肿瘤患 者，以发挥治疗疾病的作用，其典型例子是单克隆抗体赫赛汀（Here印tin)治疗Her-2受体 过表达乳腺癌的成功应用。赫赛汀是Her-2抗原的抗体，是最早应用于乳腺癌的单克隆抗 体。抗体主要通过抗体依赖的细胞毒作用（Antibody Dependent Cellular Cytotoxcity， ADCC)起到杀伤肿瘤细胞的作用。赫赛汀与Her-2细胞外域亚结构IV结合，阻止Her-2受 体同源和异源二聚化，一方面抑制Her-2的信号转导系统，另一方面可以激活ADCC效应杀 伤肿瘤细胞。曲妥珠单抗，对于Her-2阳性的乳腺癌患者，曲妥珠单抗联合其他化疗药物作 为辅助或者新辅助治疗已成标准方案。但是，它的治疗效果非常有限，因为66%至88%的 患者在接受治疗的第一年就会产生抗药性。此外，赫赛汀还会损害其它健康器官。另外，赫 赛汀需要和其它化疗药物，如紫杉醇联合用药才能提高患者的生存率。除此之外，另一种针 对Her-2的帕妥珠单抗和联合了曲妥珠单抗与美坦辛（Maytansine)的新型革El向药物T-DMl 经FDA批准也已经用于临床，但是这种药物需要通过共价连接的方式把抗体和药物连接起 来，生产工艺复杂，成本高。
[0004] 肿瘤免疫监视（Immune Surveillance)理论认为，癌前细胞或者癌细胞可以诱发 机体产生免疫反应，从而杀伤异型细胞或者癌细胞。激活的效应T细胞可以直接杀伤肿瘤 细胞，也可以通过分泌细胞因子诱导肿瘤细胞及其他基质细胞凋亡或者趋化巨噬细胞等实 现非特异性免疫杀伤。另一方面，癌细胞也存在免疫逃避机制，逃避免疫系统的杀伤，从而 有利于癌细胞的生长与转移，其中免疫抑制性细胞和分子如调节性T细胞（T regulatory cell，Treg)、髓源抑制细胞（Myeloid Derived Suppressor Cell，MDSC)、肿瘤相关巨细 胞和白细胞介素-6(11^61"16111^11-6，11^-6)等在这个过程中起到重要作用。因此，促进抗 原呈递细胞（Antigen Presenting Cells，APCs)的抗原呈递功能、T细胞的抗肿瘤效应以 及抑制肿瘤相关的免疫抑制因素是免疫治疗的主要策略。如过继性T细胞治疗（Adoptive T Cells Therapy)是将具有抗肿瘤效应的T细胞在体外培养扩增，再回输给相应的肿瘤患 者，发挥抗肿瘤免疫反应的作用。目前在转移性黑素瘤患者中，过继性T细胞治疗已取得了 明显疗效，但是在乳腺癌的治疗中还没有应用。
[0005] 双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗 原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体，在识别肿瘤 细胞抗原，诱导ADCC效应的同时，识别效应T细胞，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强 效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，如乳腺癌细胞的Her-2抗原和T细胞的CD3抗原。
[0006] 抗体分子是通过其重链和轻链可变区共同组成一个特定的空间结构，识别抗原分 子，普通的抗体有四条多肽链组成，2条相同的轻链，2条相同的重链，只能识别同一个抗原 分子。双特异性抗体可以利用不同的技术获得，如将2种不同抗体的可变区序列串联在同 一个恒定区序列基因上，这样表达出来的抗体分子有2种不同的抗原结合区；或者利用化 学的方法，将2个不同轻链、2个不同的重链分子连接成一个抗体样结构的分子。抗体分子 的重链和轻链可变区可以形成一定的空间结构，识别特定的抗原分子。有研宄发现，不同的 抗体分子间，存在轻链序列或者重链序列相同的现象，证明轻链和重链通过空间结构的相 互契合，可以识别不同的抗原分子，这也是抗体分子交叉反应的理论基础。
[0007] 基于现有技术中的单一识别在肿瘤治疗领域存在的问题，本发明意欲提供一种同 时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体，在识别乳腺癌细胞的Her-2抗原，诱导ADCC效 应的同时，识别效应T细胞的CD3抗原，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强效应T细胞 对肿瘤细胞的杀伤作用。
【发明内容】
[0008] 基于上述目的，本发明首先提供了一种双特异性抗体，所述抗体含有两条序列相 同的轻链，两条序列不同的重链。
[0009] 所述轻链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO : 1第1-108位氨 基酸残基所示。其中，⑶Rl、⑶R2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1的第24-34 位、57-63位和89-96位氨基酸残基所示。
[0010] 在一个优选的技术方案中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第 109-214位氨基酸残基所示。
[0011] 所述第1条重链的可变区识别Her-2抗原，简称Her-2重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位氨基酸残基所示。其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO : 2的第26-33位、50-72位和97-109位氨基酸残基所示。
[0012] 在一个优选的技术方案中，所述第1条重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2 第116-450位氨基酸残基所示。
[0013] 所述第2条重链的可变区识别T细胞表面的⑶3抗原，简称⑶3重链，其⑶R1、 CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :3的第25-33位、38-61位和97-110位氨 基酸残基所示。
[0014] 在一个优选的技术方案中，所述第2条重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3 第1-116位氨基酸残基所示。
[0015] 在一个更为优选的技术方案中，所述第2条重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3第117-451位氨基酸残基所示。
[0016] 在免疫球蛋白可变区内，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比V区内其他区 域更易变化，这些区域称为高变区（Hypervariable Region HVR)，其余部分被称为框架区 (Frame Region)。高变区实际上是特异性抗原与免疫球蛋白结合的位置。由于这些高变 区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区（Complementarity-Determining Region， CDR)，即CDR区。一条重链或轻链上的3个CDR区构成了抗体与抗原特异性结合的部位。本 领域技术人员可以根据上述CDR区序列，再配以保守性的框架区序列和恒定区序列，同样 可以达到本发明的发明效果，因此这些技术方案也同样在本发明的保护范围之内。
[0017] 其次，本发明还提供了一种能够表达和分泌上述抗体的宿主细胞，所述细胞含有 能够表达抗人Her-2抗原的抗体轻链的真核表达载体，能够表达抗人Her-2抗原的抗体重 链的真核表达载体，和能够表达抗CD3抗原抗体重链的真核表达载体，其特征在于，所述抗 人Her-2抗原的抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :1第1-108位所示，所述抗人 Her-2抗原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位所示，所述抗⑶3抗 原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :3第1-116位所示。
[0018] 在一个优选的技术方案中，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链可变区的核苷酸编码 序列如SEQ ID NO :4第1-324位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链可变区的核苷 酸编码序列如SEQ ID NO :5第1-345位碱基所示，所述抗CD3抗原的抗体重链可变区的核 苷酸编码序列如SEQ ID NO :6第1-348位碱基所示。
[0019] 在一个更为优选的技术方案中，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链恒定区的核苷酸 编码序列如SEQ ID NO :4第325-642位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链恒定区 的核苷酸编码序列如SEQ ID NO :5第346-1350位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体重链恒 定区的核苷酸编码序列如SEQ ID NO :6第349-1353位碱基所示。
[0020] 优选地，所述真核表达载体为p⑶NA3. 0。
[0021] 更为优选地，所述宿主细胞为HEK293细胞。
[0022] 发明人分别对抗Herceptin抗原的抗体重链序列和抗⑶3抗原的抗体的重链序 列进行了突变，对于Here印tin抗体的重链 间形成第一对二硫键的半胱氨酸残基（SEQ ID NO: 2第229位），突变为赖氨酸残基，而对于抗CD3抗体的重链间第一对二硫键的半胱氨酸 残基（SEQ ID NO:3第230位），则突变为谷氨酸残基。
[0023] 当两个抗体重链基因在同一个细胞中转录后，相同的重链序列由于在第一个二硫 键位置的氨基酸残基所带电荷相同，互相排斥，因此不能形成二聚体，而不同的重链序列由 于分别带有正电荷和负电荷的氨基酸残基，可以形成离子键而构成二聚体，由于两种抗体 使用相同的轻链序列，因此获得的抗体分子带有2条相同的轻链序列和2条不同的重链序 列，可以分别识别乳腺癌细胞表面的Her-2抗原和T细胞表面的CD3抗原，成为双特异性抗 体分子。在针对人乳腺癌细胞MCF-7的ADCC细胞毒性实验中，本发明提供的双特异性抗体 显示出了优异的细胞毒性，显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性，其杀伤率 达到70 %，高于Her-2抗体和⑶3抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用，这显 示出本发明的双特异性抗体在临床治疗Her-2抗原阳性的肿瘤的应用价值。
【附图说明】
[0024] 图I. ScFv构建示意图；
[0025] 图2.重链基因 PCR电泳图谱；
[0026] 图3.双特异性抗体结构示意图；
[0027] 图4.抗体重链表达载体；
[0028] 图5.抗体轻链表达载体；
[0029] 图6.表达产物SDS-PAGE蛋白电泳图谱；
[0030] 图7.蛋白A亲和层析洗脱峰图；
[0031] 图8.双特异性抗体的FACS分析图；
[0032] 图9. ADCC细胞毒性试验结果对照图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0034] 实施例1 :双特异性抗体的制备
[0035] 1.人单链抗体ScFv库的制备
[0036] (1)人外周血B细胞的获得和总RNA的提取
[0037] 静脉取血2ml，加入含肝素溶液（10~50u/ml血样本）的试管中，混匀，使血液抗 凝。用pH7. 2Hanks液将抗凝血稀释1倍。
[0038] (2)吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45°角，用 毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。在18°C~ 20°C下，用水平离心机以2000r/min离心20min。
[0039] (3)用毛细吸管轻轻插到混浊带，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管 中。既要吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成 分。
[0040] (4)用 Hanks 液洗绦细胞 3 次。第一次 2000r/min，IOmin ;第 2 ~3 次 1500r/min， lOmin，可去掉大部分混杂的血小板。将沉淀细胞再于液氮中彻底碾磨成粉末。根据RNA抽 提试剂盒说明提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳（1% )鉴定RNA的完整性。
[0041] 2.采用Herceptin抗体轻链序列固定的人抗体ScFv表达载体的构建
[0042] (1)按照大肠杆菌的密码子偏性人工合成Herceptin抗体轻链可变区的DNA序列， 序列如SEQ ID N0:4的1-324位碱基所示，在其5 端增加了 SacI酶切位点，3'-端增加 了 XbaI酶切位点。将上述人工合成的轻链序列采用Sacl/Xbal双酶切处理，回收630bp的 DNA片段，连接到pComb3载体（见图1)上。
[0043] (2)以Oligod T为引物通过RNA逆转录合成第1条cDNA链。逆转录PCR条件： 42°C 20min，99°C 5min，5°C 5min，1个循环。再以此单链为模板，用确定好的引物对扩增VH 基因片段。
[0044] 人抗体重链5 端引物（加入XhoI酶切位点）
[0045] VH5 5' _(C/G)AGGTGCAGCTCGAGTCTGGG_
[0046] VH6 5' - (C/G)AGGTGCAGCTCGAG(C/G)AGTCTGGG-
[0047] 人抗体重链3 端引物（加入SpeI酶切位点）
[0048] VHl 5' -GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG-
[0049] VH2 5' -CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTT-
[0050] VH3 5'-TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT-
[0051] VH4 5' -GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGA-
[0052] 人抗体重链基因可变区的扩增：采用上述引物的组合进行人B细胞抗体重链可变 区序列的扩增，共8组PCR，PCR的反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火 30S，72°C延伸lmin，30个循环（图2为重链基因扩增的电泳图谱：抗体重链的PCR片段长 度为550-600bp，从8组PCR产物中回收500-600bp长度的DNA片段用于文库的构建）。
[0053] (3)然后将重链PCR产物经SpeI和XhoI双酶切处理后，克隆到上述的pComb3载 体上，构建好双特异性人抗体重链筛选文库。
[0054] (4)噬菌体抗体库的筛选与鉴定
[0055] 将重组人⑶3抗原bFGF用50mmol/L碳酸氢钠 （pH 10. 0)稀释至lmg/L，包被 ELISA板；10g/L BSA. PBS封闭后加入约1X1011初级噬菌体抗体库，孵育2h，PBST液洗1 次（第2轮洗5次，第3轮洗10次，每次5min)，以200ul冼脱液回收噬菌体，中和缓冲液 调节pH至中性，感染对数生长期的大肠杆菌XLL Blue进行富集。转入三角瓶后补加 IOmL SB培养基（含20mg/L氨苄青霉素和10mg/L四环素），取10和IuL涂LB (氨苄）平皿，滴 定洗脱下来的噬菌体，其余的于37°C振荡培养lh。加入IOOmL SB培养基（含20mg/L氨苄 青霉素和10mg/L四环素），37°C振荡培养至OD = 0. 6,加入约1X1012VCSM13进行噬菌体 抗体库活化，测定克隆形成单位（CFU)后进行下一轮筛选。按相同方法进行3轮淘选。
[0056] 挑取16株经3轮筛选获得的阳性克隆，接种于含50mg/L Am p的LB培养液中， 37°C培养至0D600 = 0. 3-0. 4,加入辅助噬菌体进行活化富集噬菌体。富集的各个噬菌体 克隆采用ELISA方法进行特异性鉴定，每孔包被人重组⑶3抗原100ng，加70ul噬菌体抗 体，HRP标记的鼠抗M13抗体显色。
[0057] 经ELISA检测，16株噬菌体克隆均可以和⑶3抗原结合。经序列分析，获得4个抗 体的重链可变区序列。
[0058] (3)双特异性抗体重链恒定区基因的突变
[0059] 为了使获得的抗体分子含有2个不同的抗体重链序列，我们分别对Hec印tin抗体 的重链序列和获得的CD3抗体的重链序列进行了突变，对于Herceptin抗体的重链间形成 第一对二硫键的半胱氨酸残基（SEQ ID NO: 2第229位），突变为赖氨酸残基，而对于抗⑶3 抗体的重链间第一对二硫键的半胱氨酸残基（SEQ ID NO:3第230位），则突变为谷氨酸残 基。
[0060] 当两个抗体重链基因在同一个细胞中转录后，相同的重链序列由于在第一个二硫 键位置的氨基酸残基所带电荷相同，互相排斥，因此不能形成二聚体，而不同的重链序列由 于分别带有正电荷和负电荷的氨基酸残基，可以形成离子键而构成二聚体，由于两种抗体 使用相同的轻链序列，因此获得的抗体分子带有2条相同的轻链序列和2条不同的重链序 列，可以分别识别乳腺癌细胞表面的Her-2抗原和T细胞表面的CD3抗原，成为双特异性抗 体分子。图3为双特异性抗体分子结构示意图。
[0061] (4)共转染与表达
[0062] 分别合成抗CD3的抗体重链全长cDNA序列（230位半胱氨酸残基突变为谷氨 酸残基）和Herceptin的重链cDNA全长序列（229位半胱氨酸残基突变为赖氨酸残基， 然后分别克隆到P⑶NA3. 0质粒中（见图4)，与表达Herceptin抗体的轻链序列的质粒 p⑶NA-HerL (见图5)共转染人HEK293细胞，3天后从培养上清中采用蛋白A亲和层析的方 法纯化表达的IgG。图6为表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图谱，A为非还原性SDS-PAGE电 泳图，表明所表达的双特异性抗体分子量大约为150kDa，B为还原性SDS-PAGE结果图，显示 抗体重链和轻链的分子量。图7A为蛋白A亲和层析洗脱峰图，图7B为双特异抗体洗脱峰 放大图。通过对表达产物的ELISA鉴定，获得的4种IgG中只有1种可以结合重组人⑶3 抗原，选择该抗体为模板构建双特异性抗体。相应的抗体全序列分别为：
[0063] DHerc印tin抗体 轻链全序列为SEQ ID NO :1，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第1-108位氨基酸残基所示，其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1的第24-34位、57-63位和89-96位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第109-214位氨基酸残基所示。
[0064] 2)Hec印tin抗体的重链全序列为SEQ ID NO :2,可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位氨基酸残基所示，其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :2的第26-33位、50-72位和97-109位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2第116-450位氨基酸残基所示。
[0065] 3)⑶3抗体的重链的全序列为SEQ ID NO :3,可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3 第1-116位氨基酸残基所示，其中⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :3 的第25-33位、38-61位和97-110位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3第117-451位氨基酸残基所示。
[0066] 实施例2 :流式细胞仪技术（FACS)检测双特异性抗体的功能
[0067] 将培养的人乳腺癌BT474细胞首先用细胞刮刀从培养皿中刮下，将细胞置于有 5ml PBS缓冲液的50ml离心管中，用注射器的活塞挤压细胞制成单细胞悬液。离心收集细 胞。用50ml染色液重悬样本，进行细胞计数和活力分析；再次离心细胞，弃掉上清，重悬细 胞使其细胞数达到2 X IO7个/ml ;
[0068] 1)抗体的准备和孵育：
[0069] 用50ul染色液稀释纯化获得的双功能抗体至lug/ml，加入50ul细胞悬液（相当 于IO 6个细胞）于每个试管或孔中，轻轻混匀；避光冰浴30分钟。4°C离心沉淀细胞5分钟 (300-400g)，吸掉上清；用染色液重复洗涤细胞2次；加入IOOul用染色液稀释的FITC标记 的鼠抗人二抗（I :1000)，避光冰浴30分钟，然后用染色液洗涤细胞3次，弃上清，用IOOul 含有PI的染色液重悬细胞，进行FACS分析。
[0070] 取IOOul抗凝的人全血，加50ul染色液稀释的纯化获得的双功能抗体（lug/ml)， 然后加等体积2XRBC红细胞裂解液，室温避光放置10分钟，离心弃上清，用染色液洗涤细胞 3次，细胞用IOOul染色液稀释的FITC标记的鼠抗人二抗（I :1000)，避光冰浴30分钟，然 后用染色液洗涤细胞3次，弃上清，用IOOul含有PI的染色液重悬细胞，进行FACS分析。
[0071] 图8为本发明双特异性抗体的FACS分析结果图。图8A为BT474细胞FACS分析 结果，图8B为Jurka细胞FACS分析结果，如图所示，双特异性抗体可同时结合表达Her2抗 原的BT474细胞和表达CD3抗原的Jurkat细胞，而赫赛汀抗体只能结合BT474细胞。
[0072] 实施例3 :ADCC细胞毒性试验
[0073] 1.白细胞分离
[0074] 1)取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀。
[0075] 2)将试管直立静置于室温或37°C温箱中30~60min，待红细胞自然沉降。此时可 见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白 色的白细胞层（正常人外周血白细胞）。
[0076] 3)用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中；
[0077] 4)加入无 Ca2、Mg2Hank's液至离试管口 3cm处，混勾，以水平离心机2000r/min离 心lOmin，弃上清，同法再洗绦两次。
[0078] 5)沉淀细胞用适量10%~20%灭活小牛血清的Hank' s液重悬，计数，配成所需 的细胞浓度的悬液，一般常用2 X IO6/毫升。
[0079] 2.肿瘤细胞的培养
[0080] 人乳腺癌细胞MCF-7在含10%胎牛血清中的RPMI-1640培养基中培养至75 - 80%的密度，弃培养基，用预热至37度的PBS洗涤细胞2次，加2ml胰蛋白酶一 EDTA溶液， 室温放置5分钟，加2ml含10%胎牛血清的培养基终止反应，采用一次性的无菌吸管反复吹 打细胞至单细胞悬液，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，PBS再洗绦两次，计数 后，用培养基重悬细胞至2X10 6/毫升备用。
[0081] 3.细胞毒性试验
[0082] 取重悬肿瘤细胞10微升（2X104)，加入含0. 1 % BSA的RPMI-1640培养基30微升， 然后分别加入不同的抗体10微升（lmg/ml)，37度孵育30分钟，然后加入5X10 5(效应细 胞/靶细胞=25)?1^(：，体积为250微升，37度孵育4小时，以水平离心机20001'/1^11离心 lOmin，取上清采用Roche细胞毒性检测试剂盒检测上清中LDH的活性以换算成肿瘤细胞的 死亡程度，试剂盒的货号为：11644793001。结果如图9所示。
[0083] 如图9所示，纵坐标为T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤率，本发明提供的双特异性抗体 为柱1，其显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性，显示出了优异的细胞毒性， 杀伤率高达70 % (横坐标6种样本的杀伤率依次为70 %，64%，50 %，13 %，2 %，2 % )，高于 Her-2抗体和CD3抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用，这显示出本发明的双 特异性抗体在临床治疗Her-2抗原阳性的肿瘤的应用价值。
【主权项】
1. 一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有两条序列相同的轻链，两条序列不同 的重链，所述轻链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-108位氨基 酸残基所示，所述第1条重链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO:2第 1-115位氨基酸残基所示，所述第2条重链的可变区识别T细胞表面的⑶3抗原，其⑶R1、 CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:3的第25-33位、38-61位和97-110位氨 基酸残基所示。2. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO:1第109-214位氨基酸残基所示。3. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第1条重链恒定区的氨基酸序列如 SEQIDNO:2第116-450位氨基酸残基所示。4. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第2条重链可变区的氨基酸序列如 SEQIDNO:3第1-116位氨基酸残基所示。5. 根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述第2条重链恒定区的氨基酸序列如 SEQIDNO:3第117-451位氨基酸残基所示。6. -种能够表达和分泌权利要求1-5中任一所述抗体的宿主细胞，所述细胞含有能 够表达抗人Her-2抗原的抗体轻链的真核表达载体，能够表达抗人Her-2抗原的抗体重链 的真核表达载体，和能够表达抗CD3抗原抗体重链的真核表达载体，其特征在于，所述抗人 Her-2抗原的抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-108位所示，所述抗人Her-2 抗原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:2第1-115位所示，所述抗CD3抗原的抗 体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:3第1-116位所示。7. 根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述抗人Her-2抗原的抗体的轻链可变区 的核苷酸编码序列如SEQIDNO:4第1-324位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链 可变区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:5第1-345位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体重 链可变区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:6第1-348位碱基所示。8. 根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链恒定区的 核苷酸编码序列如SEQIDNO:4第325-642位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链 恒定区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:5第346-1350位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体 重链恒定区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:6第349-1353位碱基所示。9. 根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述真核表达载体为pCDNA3. 0。10. 根据权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种双特异性抗体，所述抗体带有2条相同的轻链序列和2条不同的重链序列，可以分别识别乳腺癌细胞表面的Her-2抗原和T细胞表面的CD3抗原。所述双特异性抗体能够显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性。
【IPC分类】A61P35/00, C07K16/30, C07K16/46, C12N5/10
【公开号】CN104892765
【申请号】CN201510368641
【发明人】宋海鹏, 李敏, 王庆东
【申请人】长春力太生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
最新回复(0)