高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用
高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物与新医药技术领域，特别涉及高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及 其在抗肿瘤中的应用。
【背景技术】
[0002] 在本发明作出之前，肿瘤的靶向治疗研究是迄今提高肿瘤治疗效果、减少药物毒 副反应的最有效、最有实际应用潜力的措施之一。融合蛋白（重组蛋白）的构建和表达为 肿瘤靶向药物的研发提供了方法。然而这类药物只对一小部分（通常< 20% )肿瘤发挥作 用，通过个体化地检查药物疗效相关生物标志，才能确定少数适宜用药的患者，并且药物发 挥理想抗肿瘤效应的前提不仅仅是设法让药物积聚于肿瘤局部，更重要的是要使药物在肿 瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就在于克服上述缺陷，研究高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在 抗肿瘤中的应用。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] 高穿透性纳米抗体融合蛋白，其主要技术特征在于：该蛋白由革巴向人EGFR纳米抗 体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。
[0006] 本发明的另一技术方案是：
[0007] 高穿透性纳米抗体融合蛋白的制备方法，其主要技术特征在于它包括以下步骤： 通过设计三条引物在已保存有ant i-EGFR基因片段的载体PSJF2上进行聚合酶链式反应扩 增得到HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表达载体pET-28a上，构建表达载 体pET-28a-ant i-EGFR-iRGD，并经过测序验证，将其转化入大肠杆菌BL21DE3表达菌，经过 异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达，通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，可 得到聚丙烯酰氨凝胶电泳纯95%，15mg/L细菌培养物的融合蛋白；
[0008] 上游引物Pl:
[0009] 5, -CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3'
[0010] 45bp
[0011] 下游引物P2:
[0012] 5 ' -CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGAT
[0013] 67bp
[0014] 下游引物P3:
[0015] 5 ' -CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCC GCCTGAACCGCCTCCACC-3 '
[0016] 84bp
[0017] (1)重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：
[0018] 选用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2 载体重组质粒为模板，聚合酶链式反应（PCR)扩增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker， 将此作为模板，再用上游引物Pl和下游引物P3进行PCR反应，得到Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III ；
[0019] (? ant i-EGFR-iRGD 表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶的构建：
[0020] 将步骤⑴中获得的ant i-EGFR-iR⑶目的基因 PCR产物纯化回收，并将其与载体 pET28a连接，构建ant i-EGFR-iRGD表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD，通过转化入大肠杆 菌DH5 α，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并用菌液PCR手段对表达载体进行鉴定，挑 选得到阳性克隆按照质粒小提试剂盒使用说明提取质粒并送测序验证；
[0021] (3)将表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iRGD 转化至表达菌株 BL21DE3 :
[0022] 取已经确认的 100 μ g/ μ L表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGDO. 1 μ L-5 μ L 转化入 氯化钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克 隆低温冰箱内甘油保存该菌种；
[0023] (4)重组ant i-EGFR-iR⑶的诱导表达及纯化：
[0024] 3)重组ant i-EGFR-iRGD异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达：
[0025] 对重组ant i-EGFR-iRGD用ImM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4 小时后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳；
[0026] 4)重组ant i-EGFR-iR⑶经AKTA Purifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：
[0027] 收集1000 mL经过异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后的BL21DE3菌体，用 PBS、5mM咪唑重悬菌体，350W功率进行超声破碎，12000r ·π?η-1离心后收集上清液于AKTA PurifieWOOFPLC系统纯化，最后通过对纯化的蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，检测蛋白，测 定纯度；
[0028] (5) AXIMA MALDI-LNR-T0F验证纯化蛋白的分子量为18KD。
[0029] 本发明又一技术方案是：
[0030] 高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其主要技术特征在于高穿透 性纳米抗体融合蛋白为活性成分用于治疗肿瘤。
[0031] 所述肿瘤特别是指胃癌和胃转移癌。
[0032] 所述适于经直肠、鼻内、肺部、阴道内、外部、口服或肠胃外，包括皮下、植入、静脉 内和肌内给药。
[0033] 本发明的有益效果是：融合蛋白的双特异性靶向（EGFR和整合素 α νβ 3/β 5)可以 提高该融合蛋白的适应范围，使药物积聚于肿瘤局部，同时融合蛋白通过NRP-I途径，使药 物在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【附图说明】
[0034] 图1-Pl Ρ2 PCR得到的Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker基因片段琼脂糖电泳图：
[0035] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 结果（489bp)。
[0036] 图 2-P1P3PCR 得到的 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III 基因片段 琼脂糖凝胶电泳图：
[0037] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 结果（528bp)。
[0038] 图3-目的基因表达载体pET28a_ant i-EGFR-iRGD DH5 α菌体PCR电泳图：
[0039] 泳道I :DL2000marker ;泳道2 :阳性对照（同图2泳道2);泳道3 :1号菌PCR结 果；泳道4 :2号菌PCR结果；泳道5 :3号菌PCR结果；泳道6 :4号菌PCR结果；泳道7 :5号 菌PCR结果；泳道8 :6号菌PCR结果。
[0040] 图4-表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD中Nco I和Hind III之间的测序结果 示意图。
[0041] 图 5-BL21 DE3-pET28a-ant i-EGFR-iRGD 蛋白可溶性表达与纯化：
[0042] 泳道1 :未诱导；泳道2 :诱导；泳道3 :沉淀；泳道4 :上清；泳道5 :纯化蛋白（星 标出）；泳道6 :Marker。
[0043] 图6--镍柱亲和层析纯化目的蛋白图谱（流速：5MI/min ;A液：1*PBS PH7. 4 ;B 液：1*PBSPH7.4，1M咪唑，箭头指示目的蛋白）。
[0044] 图 7-AXIMA MALDI-LNR-T0F 检测结果示意图。
[0045] 图8--胃癌细胞株EGFR表达情况示意图。
[0046] 图9--免疫荧光分析示意图。
[0047] A ant i-EGFR 组 FITC 荧光；B ant i-EGFR-iRGD 组 FITC 荧光；C EGFR 单克隆抗体 组 FITC 荧光；D ant i-EGFR 组 Hochest 染色；E ant i-EGFR-iR⑶组 Hochest 染色；F EGFR 单克隆抗体组 Hochest 染色；G ant i-EGFR 组 FITC 与 Hochest 融合；H ant i-EGFR-iR⑶组 FITC与Hochest融合；I EGFR单克隆抗体组FITC与Hochest融合。
[0048] 图10--ant i-EGFR-iR⑶融合蛋白对BGC823胃癌细胞的体外抑制作用：
[0049] 对于西妥昔单抗横坐标0.5以]?、14]\1、2 4]\1、4 4]\1、8 4]\1、16 4]\1分别指7.5 4 8/1^、 15 μ g/mL、30 μ g/mL、60 μ g/mL、120 μ g/mL、240 μ g/mL。
[0050] 图11--ant i-EGFR-iRGD融合蛋白的小鼠体内抗肿瘤作用。
【具体实施方式】
[0051] 本发明技术思路是：将编码抗人EGFR抗原的单域抗体和肿瘤穿透肽iRGD的核苷 酸序列连接起来，得到编码ant i-EGFR-iRGD的融合基因片段，并将其插入原核表达质粒载 体。发明还涉及了能够表达融合蛋白的宿主细胞，该融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达，及 在抗肿瘤中的应用。
[0052] 以下结合【具体实施方式】详细说明，但不限制本发明。
[0053] 具有抗肿瘤作用的融合蛋白的表达和纯化过程如下：
[0054] 1、重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：
[005 5] 选用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2载体 重组质粒为模板，PCR反应扩增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker ;将此作为模板，再用上游 引物 Pl 和下游引物 P3 进行 PCR 反应，得到 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III ; 反应条件如下：
[0056] 95 °C 5min
[0057] (95〇C 30s ；55〇C 30s ；72〇C lmin)*30 ；
[0058] 72 °C 7min ；
[0059] 4°C hold
[0060] 50 μ L反应体系如下：
[0061] ddH2037. 5 μ L
[0062] 模版 1 μ L
[0063] 上游引物1μ L
[0064] 下游引物1μ L
[0065] Taq 酶 0· 5 μ L
[0066] 镁离子3yL
[0067] dNTPl μ L
[0068] KCI MgC12-Buffer5y L
[0069] 第一次PCR产物Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker基因片段大小为489bp，如图1所 示：经过1 %琼脂糖凝胶电泳，可见片段大小与预期一致；用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂 盒（AxyPrep)进行该片段回收作为第二次PCR的模版，以P1P3为引物，反应条件、体系同第 一次 PCR ;重组 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III 基因片段大小为 528bp，如图 2所示：经过1 %琼脂糖凝胶电泳，可见片段大小与预期一致。
[0070] 2、ant i-EGFR-iRGD 表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶的构建：
[0071] 1)将步骤1中获得的ant i-EGFR-iRGD目的基因 PGR产物用琼脂糖凝胶DNA片段 回收试剂盒（AxyPr印）进行该片段回收。根据上游引物P1、下游引物P3设计的酶切位点对 纯化的PCR产物和pET28a分别进行双酶切。
[0072] 酶切反应体系如下（两种酶购于NEB公司）：
[0073] 16 μ L PCR 产物 / 载体质粒 pET28a
[0074] 1 μ L Nco I
[0075] 1 μ L Hind III
[0076] 2 μ L buffer
[0077] 反应 37°C3_4h
[0078] 对酶切得到的DNA片段及线性的质粒进行凝胶纯化回收。
[0079] 2)连接反应体系：
[0080] 17 μ L mix (载体：目的基因=1 : 3-4)
[0081] 2 μ L ligation buffer
[0082] 1 μ L T4连接酶（T4连接酶购自TAKARA公司）
[0083] 反应 16°C 12h
[0084] 再采用连接反应对目的基因 ant i-EGFR-iRGD和酶切后的线性pET28a连接，构建 ant i-EGFR-iRGD 表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶。
[0085] 3)感受态大肠杆菌制备：
[0086] 自甘油菌（DH5 α中接种至含50ug/ml的3ml LB培养基中，220rpm37 °C过夜培 养。次日按1 : 100放大接种于含50μg/mlLB培养基中，37°C 220rpm振摇至0D600为 0. 6-0. 8 (约3小时）。此LB管冰上放置30min，取ImL菌液4°C 12000g离心3min，弃上清， 加700 μ L预冷的氯化钙（高温灭菌），重悬后置冰上30min，4°C 12000g离心3min后弃上 清，再加200 μ L预冷的氯化钙（高温灭菌），感受细胞制备好。接下来直接转化。
[0087] 4)转化方法：
[0088] 向感受态细菌中加入20 μ L连接产物，混匀；冰上30min ;42°C，90s热击；冰上放 置3-5min ;加700 μ L37°C预热的LB ;37°C 220rpm摇菌lh，涂板37°C培养过夜。
[0089] 将连接后的产物转化入感受态大肠杆菌DH5 α。
[0090] 5)用卡那抗性筛选连接成功的菌株，并用菌液PCR手段对表达载体进行鉴定。
[0091] 从LB板上用枪头随机挑选6个克隆于LB管，分别加入卡那抗生素，37°C 220rpm 摇菌过夜。
[0092] 建立PCR反应体系：
[0093] 95 〇C 5min
[0094] (95〇C 30s ；55〇C 30s ；72〇C lmin)*30 ；
[0095] 72 °C 7min ；
[0096] 4°C hold
[0097] 50 μ L反应体系如下：
[0098] ddH2037. 5 μ L
[0099] 模版（菌液）I μ L
[0100] 上游引物Pl 1μ L
[0101] 下游引物Ρ3 IyL
[0102] Taq 酶 0.5yL
[0103] 镁离子3yL
[0104] dNTPl μ L
[0105] KCI MgC12-Buffer5y L
[0106] PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳，阳性对照为1中第二次PCR的产物Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III，如图3所示：2号菌液、5号菌液为阳性。将2号与5号阳 性菌液按照质粒小提试剂盒（axygen)使用说明提取质粒并送测序验证（金斯瑞公司）。测 序基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与设计的结果进行对比分析。经对比表明表达 2号载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD构建成功，测序结果如图4所示。
[0107] 3、将表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iRGD 转化至表达菌株 BL21DE3 :
[0108] 取已经确认的 100 μ g/ μ L表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGDO. 1 μ L-5 μ L转化入 氯化钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定卡那抗性的LB平板上。挑选阳 性克隆低温冰箱内甘油保存该菌种。
[0109] 4、重组ant i-EGFR-iR⑶的诱导表达及纯化：
[0110] 1)重组 ant i-EGFR-iRGD IPTG 诱导表达：
[0111] 对重组ant i-EGFR-iRGD用ImMIPTG诱导表达，诱导4小时后，SDS-PAGE全蛋白电 泳，在20KD左右可以看到清晰特异性蛋白条带，在17KD到26KD Marker之间，在无 IPTG诱 导和存在IPTG诱导对比显示，ant i-EGFR-iRGD蛋白已经表达成功。
[0112] 全蛋白I PTG诱导表达，实验步骤如下：
[0113] a)取3μ L菌液（表达菌株甘油保存菌）加入3mLLB(卡那抗性）培养基， 220rpm37°C过夜摇菌；
[0114] b)取3 μ L菌液，加入3mLLB (卡那抗性）培养基，220rpm37°C摇菌；
[0115] c)测 0D600 至 0· 5 时；
[0116] d)加入浓度为ImM的IPTG ;
[0117] e)220rpm37°C摇菌 4 小时；
[0118] f)取出菌液，12000glmin离心去上清；
[0119] g)加入 100 μ LddH2O 重悬菌液,加入 100 μ L2*lcading buffer ;
[0120] h)100°C煮沸 10 分钟
[0121] i)配置15%聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳；
[0122] j)考马斯亮蓝染色，Gel Doc XR凝胶成像系统成像（Bio-Rad，US);
[0123] 2)重组ant i-EGFR-iR⑶经AKTA Purifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：
[0124] 收集1000 mL经过IPTG诱导表达后的BL21DE3菌液，经4200r ·π?η-1离心10min， 收集菌体。沉淀重悬于PBS (PH7. 4)、5mM咪唑80mL中进行超声裂解，超声条件为350W、工作 3s、间歇3s、总时间为45min。超声裂解物于4°C、12000r · min-1离心20min。收集上清液 与AKTA Purifier900FPLC系统纯化。镍柱用5倍柱体积PBS(PH7. 4)、5mmol I · L-I咪唑平 衡后上样，经PBS(pH7.4)、40mmol，L-1咪唑洗杂后，目的蛋白用PBS(pH7.4)、500mmol，L-1 咪唑洗脱。洗脱后的纯化蛋白在PBS(pH7.4)中透析。得到anti-EGFR-iRGD蛋白有15mg/ L菌液。
[0125] 5、用SDS-PAGE方法检测目的蛋白：
[0126] 选取未诱导表达的表达菌株BL21DE3-pET28a-ant i-EGFR-iRGD菌液ImU加 入IPTG诱导表达4小时后的菌液ImL进行12000r · min-1离心lmin，弃上清，沉淀用 100 μ LddH2O重悬作为"未诱导"与"诱导";超声后的菌液100 μ L进行12000r · min-1离心 lmin，上清移至新的EP管，沉淀用100 μ LddH2O重悬分别作为"上清"与"沉淀"；经过AKTA 纯化得到的蛋白100 μ L作为"纯化蛋白";进行SDS-PAGE电泳，电泳后考马斯亮蓝染色并脱 色，拍照。经过BAND SCAN软件分析，结果显示纯化得到的ant i-EGFR-iRGD蛋白达95 %纯 度。
[01 27] 6、Biacore (Biomo lecular Interaction Analysis)生物分子间相互作用分析法 利用表面等离子共振技术检测蛋白与人EGFR的解离、亲和常数：
[0128] 融合蛋白通过表面等离子共振技术（Biacore)检测蛋白与人EGFR的解离、亲和常 数，得到KD值为7. 09nM。
[0129] 7、AXIMA MALDI-LNR-T0F验证纯化蛋白的分子量为18KD左右。
[0130] 8、免疫荧光验证蛋白与高表达EGFR的胃癌细胞株结合能力：
[0131] 首先WESTERN BLOT方法验证胃癌细胞株中BGC823EGFR高表达。将胃癌细胞株 BGC823种在十二孔板中，贴壁后，用PBS清洗两遍；将标记FITC的融合蛋白及EGFR单克隆 抗体（EGFR mab)加入细胞，37度孵育1小时，PBS清洗两遍；Hochest染核15min，荧光显微 镜拍照；对照选择EGFR单克隆抗体。结果显示蛋白ant i-EGFR-iRGD靶向胃癌BGC823能 力好于EGFR单克隆抗体。
[0132] 9、在胃癌细胞株BGC823上对比ant i-EGFR、ant i-EGFR-iRGD及西妥昔单抗的抗 肿瘤细胞增殖能力。
[0133] 培养胃癌细胞株BGC823细胞至90 %融合，传至96孔板中，5000/每孔C02培养 箱培养12h。用无血清1640培养基按设定梯度浓度稀释ant i-EGFR(0. 5μΜ、1μΜ、2μΜ、 4μΜ,8μΜ,16μΜ), ant i-EGFR-iRGD (0. 5 μ MU μ Μ,2 μ Μ,4 μ Μ,8 μ MU6 μ Μ) (7· 5 μ g/mL、15 μ g/mL、30 μ g/mL、60 μ g/mL、120 μ g/mL、240 μ g/mL)。待细胞贴壁后，洗净 96孔板中培养基，按照浓度梯度每孔加入100 μ L稀释后的蛋白，每组浓度设置3个平行 孔。继续培养48h。每孔加入10 μ L0. 5mg/ml MTT工作液，继续培养4h。吸弃培养基，每孔 加入10(^1^1^0室温震荡1511^11，溶解结晶体。于57〇11111处测定吸光值，参比波长63〇11111， 以OD 57tl-OD63tl作为最终结果。以样品测定值除以测定的空白对照作为肿瘤细胞生长存活比 例数值。在多个浓度点（〇. 5μΜ、2μΜ、4μΜ、8μΜ、16μΜ)融合蛋白anti-EGFR-iR⑶比纳 米抗体ant i-EGFR对BGC823细胞的增殖有更强的抑制效果（* < 0· 05,林< 0· 01)，另外 与西妥昔单抗（〇6七1^!1^)相比，在浓度4以]\1、8以]\1、16以]\1时，&拉丨46?1^1?0有更强的 抑制肿瘤细胞增殖的能力（# < 〇· 05, ## < 0· 01)。
[0134] 10、ant i-EGFR-iRGD有效地抑制小鼠肿瘤的生长的比较研究。
[0135] 选用24只生长良好的裸鼠，每只右腋下注射人BGC823细胞5*10~5,0. lmL。待 荷瘤裸鼠瘤体积增至l〇〇mm3(约一周），将其随机分成4组。分别腹腔注射PBS(c 〇ntr〇l 组）10(^1^、纯化的蛋白&拉146卩1?0.4以]\1/1^*10(^1^&1^146卩1?-11?00.4 4]\1/ kg*100 μ L、西妥昔单抗6mg/kg*100 μ L，每三天给药一次（即d0、d3、d6、d9、dl2)并对 裸鼠测量肿瘤体积（V= 1/2长径*短径*短径）、小鼠体重。第十五天处死小鼠。使用 spss软件分析数据。第12天时对照组肿瘤体积是1603±572mm3, ant i-EGFR组肿瘤体积 是1269±480mm3,抑制率为21%，ant i-EGFR-iR⑶组肿瘤体积是581±229mm3,抑制率为 64%，西妥昔单抗组肿瘤体积是1098±301mm 3,抑制率为31. 5%;高穿透性纳米抗体融合蛋 白ant i-EGFR-iR⑶组与对照组PBS相比能显著抑制肿瘤的生长；并且高穿透性纳米抗体 融合蛋白ant i-EGFR-iRGD组与纳米抗体ant i-EGFR相比也能显著地抑制肿瘤的生长（* < 0. 05，** < 0. 01)。实验期间，各组小鼠生命体征基本正常，小鼠本身体重并无明显减轻， 主要器官组织形态良好。
【主权项】
1. 高穿透性纳米抗体融合蛋白，其特征在于：该蛋白由革巴向人EGFR纳米抗体和肿瘤穿 透肽iR⑶经由连接肽linker，S卩GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。2. 高穿透性纳米抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：通过设计 三条引物在已保存有anti-EGFR基因片段的载体pSJF2上进行聚合酶链式反应扩增得 到HIS-anti-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表达载体pET-28a上，构建表达载体 pET-28a-anti-EGFR-iRGD，并经过测序验证，将其转化入大肠杆菌BL21DE3表达菌，经过异 丙基-0 -D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达，通过镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，可得 到聚丙烯酰氨凝胶电泳纯95%，15mg/L细菌培养物的融合蛋白； 上游引物Pl: 5，-CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3 ' 45bp 下游引物P2: 5 ' -CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGATC-3 ' 67bp 下游引物P3: 5'-CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCT GAACCGCCTCCACC-3, 84bp (1) 重组人anti-EGFR-iRGD基因片段扩增： 选用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有anti-EGFR基因片段的pSJF2载 体重组质粒为模板，聚合酶链式反应扩增出NcoI-HIS-anti-EGFR-1inker，将此作 为模板，再用上游引物Pl和下游引物P3进行聚合酶链式反应，得到NcoI-HIS-ant i-EGFR-1inker-iRGD-HindIII； (2) anti-EGFR-iRGD表达载体pET28a-anti-EGFR-iR⑶的构建： 将步骤⑴中获得的anti-EGFR-iRGD目的基因聚合酶链式反应产物纯化回收，并将其 与载体pET28a连接，构建anti-EGFR-iRGD表达载体pET28a-anti-EGFR-iRGD，通过转化入 大肠杆菌DH5a，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并用菌液聚合酶链式反应手段对表达 载体进行鉴定，挑选得到阳性克隆按照质粒小提试剂盒使用说明提取质粒并送测序验证； (3) 将表达载体pET28a-anti-EGFR-iRGD转化至表达菌株BL21DE3 : 取已经确认的100Ug/UL表达载体pET28a-anti-EGFR-iRGDO.IiiL-5iiL转化入氯化 钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克隆低 温冰箱内甘油保存该菌种； (4) 重组anti-EGFR-iRGD的诱导表达及纯化： 1) 重组anti-EGFR-iRGD异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导表达： 对重组anti-EGFR-iRGD用ImM异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4小时 后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳； 2) 重组anti-EGFR-iR⑶经AKTAPurifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化： 收集1000 mL经过异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导表达后的BL21DE3菌体，用PBS、 5mM咪唑重悬菌体，350W功率进行超声破碎，12000r?min-1离心后收集上清液于AKTA PurifieWOOFPLC系统纯化，最后通过对纯化的蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，检测蛋白，测 定纯度； (5)AXIMAMALDI-LNR-TOF验证纯化蛋白的分子量为18KD。3. 高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特征在于高穿透性纳米抗体 融合蛋白为活性成分用于治疗肿瘤。4. 根据权利要求3所述的高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特征 在于所述肿瘤特别是指胃癌和胃转移癌。5. 根据权利要求3所述的高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特 征在于含有作为活性成分的高穿透性纳米抗体融合蛋白的液体制剂，适于经直肠、鼻内、肺 部、阴道内、外部、口服或肠胃外，包括皮下、植入、静脉内和肌内给药。
【专利摘要】本发明涉及高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用。本发明高穿透性纳米抗体融合蛋白由靶向人EGFR纳米抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。本发明克服了过去存在的融合蛋白只对一小部分肿瘤有作用以及在肿瘤局部无法获得良好的穿透性的缺陷。本发明将编码抗人EGFR抗原的单域抗体和肿瘤穿透肽iRGD的核苷酸序列连接起来，得到编码ant i-EGFR-iRGD的融合基因片段，并将其插入原核表达质粒载体，涉及了能够表达融合蛋白的宿主细胞，该融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达，及在抗肿瘤中的应用，使药物积聚于肿瘤局部，同时融合蛋白通过NRP-1途径，使药物在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【IPC分类】C12N15/62, A61P35/04, A61K39/395, C12N15/70, A61P35/00, A61K47/48, C07K19/00
【公开号】CN104892766
【申请号】CN201410083161
【发明人】刘宝瑞, 曹鹏, 沙慧子
【申请人】南京大学医学院附属鼓楼医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物与新医药技术领域，特别涉及高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及 其在抗肿瘤中的应用。
【背景技术】
[0002] 在本发明作出之前，肿瘤的靶向治疗研究是迄今提高肿瘤治疗效果、减少药物毒 副反应的最有效、最有实际应用潜力的措施之一。融合蛋白（重组蛋白）的构建和表达为 肿瘤靶向药物的研发提供了方法。然而这类药物只对一小部分（通常< 20% )肿瘤发挥作 用，通过个体化地检查药物疗效相关生物标志，才能确定少数适宜用药的患者，并且药物发 挥理想抗肿瘤效应的前提不仅仅是设法让药物积聚于肿瘤局部，更重要的是要使药物在肿 瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就在于克服上述缺陷，研究高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在 抗肿瘤中的应用。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] 高穿透性纳米抗体融合蛋白，其主要技术特征在于：该蛋白由革巴向人EGFR纳米抗 体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。
[0006] 本发明的另一技术方案是：
[0007] 高穿透性纳米抗体融合蛋白的制备方法，其主要技术特征在于它包括以下步骤： 通过设计三条引物在已保存有ant i-EGFR基因片段的载体PSJF2上进行聚合酶链式反应扩 增得到HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表达载体pET-28a上，构建表达载 体pET-28a-ant i-EGFR-iRGD，并经过测序验证，将其转化入大肠杆菌BL21DE3表达菌，经过 异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达，通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，可 得到聚丙烯酰氨凝胶电泳纯95%，15mg/L细菌培养物的融合蛋白；
[0008] 上游引物Pl:
[0009] 5, -CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3'
[0010] 45bp
[0011] 下游引物P2:
[0012] 5 ' -CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGAT
[0013] 67bp
[0014] 下游引物P3:
[0015] 5 ' -CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCC GCCTGAACCGCCTCCACC-3 '
[0016] 84bp
[0017] (1)重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：
[0018] 选用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2 载体重组质粒为模板，聚合酶链式反应（PCR)扩增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker， 将此作为模板，再用上游引物Pl和下游引物P3进行PCR反应，得到Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III ；
[0019] (? ant i-EGFR-iRGD 表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶的构建：
[0020] 将步骤⑴中获得的ant i-EGFR-iR⑶目的基因 PCR产物纯化回收，并将其与载体 pET28a连接，构建ant i-EGFR-iRGD表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD，通过转化入大肠杆 菌DH5 α，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并用菌液PCR手段对表达载体进行鉴定，挑 选得到阳性克隆按照质粒小提试剂盒使用说明提取质粒并送测序验证；
[0021] (3)将表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iRGD 转化至表达菌株 BL21DE3 :
[0022] 取已经确认的 100 μ g/ μ L表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGDO. 1 μ L-5 μ L 转化入 氯化钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克 隆低温冰箱内甘油保存该菌种；
[0023] (4)重组ant i-EGFR-iR⑶的诱导表达及纯化：
[0024] 3)重组ant i-EGFR-iRGD异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达：
[0025] 对重组ant i-EGFR-iRGD用ImM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4 小时后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳；
[0026] 4)重组ant i-EGFR-iR⑶经AKTA Purifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：
[0027] 收集1000 mL经过异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后的BL21DE3菌体，用 PBS、5mM咪唑重悬菌体，350W功率进行超声破碎，12000r ·π?η-1离心后收集上清液于AKTA PurifieWOOFPLC系统纯化，最后通过对纯化的蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，检测蛋白，测 定纯度；
[0028] (5) AXIMA MALDI-LNR-T0F验证纯化蛋白的分子量为18KD。
[0029] 本发明又一技术方案是：
[0030] 高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其主要技术特征在于高穿透 性纳米抗体融合蛋白为活性成分用于治疗肿瘤。
[0031] 所述肿瘤特别是指胃癌和胃转移癌。
[0032] 所述适于经直肠、鼻内、肺部、阴道内、外部、口服或肠胃外，包括皮下、植入、静脉 内和肌内给药。
[0033] 本发明的有益效果是：融合蛋白的双特异性靶向（EGFR和整合素 α νβ 3/β 5)可以 提高该融合蛋白的适应范围，使药物积聚于肿瘤局部，同时融合蛋白通过NRP-I途径，使药 物在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【附图说明】
[0034] 图1-Pl Ρ2 PCR得到的Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker基因片段琼脂糖电泳图：
[0035] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 结果（489bp)。
[0036] 图 2-P1P3PCR 得到的 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III 基因片段 琼脂糖凝胶电泳图：
[0037] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 结果（528bp)。
[0038] 图3-目的基因表达载体pET28a_ant i-EGFR-iRGD DH5 α菌体PCR电泳图：
[0039] 泳道I :DL2000marker ;泳道2 :阳性对照（同图2泳道2);泳道3 :1号菌PCR结 果；泳道4 :2号菌PCR结果；泳道5 :3号菌PCR结果；泳道6 :4号菌PCR结果；泳道7 :5号 菌PCR结果；泳道8 :6号菌PCR结果。
[0040] 图4-表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD中Nco I和Hind III之间的测序结果 示意图。
[0041] 图 5-BL21 DE3-pET28a-ant i-EGFR-iRGD 蛋白可溶性表达与纯化：
[0042] 泳道1 :未诱导；泳道2 :诱导；泳道3 :沉淀；泳道4 :上清；泳道5 :纯化蛋白（星 标出）；泳道6 :Marker。
[0043] 图6--镍柱亲和层析纯化目的蛋白图谱（流速：5MI/min ;A液：1*PBS PH7. 4 ;B 液：1*PBSPH7.4，1M咪唑，箭头指示目的蛋白）。
[0044] 图 7-AXIMA MALDI-LNR-T0F 检测结果示意图。
[0045] 图8--胃癌细胞株EGFR表达情况示意图。
[0046] 图9--免疫荧光分析示意图。
[0047] A ant i-EGFR 组 FITC 荧光；B ant i-EGFR-iRGD 组 FITC 荧光；C EGFR 单克隆抗体 组 FITC 荧光；D ant i-EGFR 组 Hochest 染色；E ant i-EGFR-iR⑶组 Hochest 染色；F EGFR 单克隆抗体组 Hochest 染色；G ant i-EGFR 组 FITC 与 Hochest 融合；H ant i-EGFR-iR⑶组 FITC与Hochest融合；I EGFR单克隆抗体组FITC与Hochest融合。
[0048] 图10--ant i-EGFR-iR⑶融合蛋白对BGC823胃癌细胞的体外抑制作用：
[0049] 对于西妥昔单抗横坐标0.5以]?、14]\1、2 4]\1、4 4]\1、8 4]\1、16 4]\1分别指7.5 4 8/1^、 15 μ g/mL、30 μ g/mL、60 μ g/mL、120 μ g/mL、240 μ g/mL。
[0050] 图11--ant i-EGFR-iRGD融合蛋白的小鼠体内抗肿瘤作用。
【具体实施方式】
[0051] 本发明技术思路是：将编码抗人EGFR抗原的单域抗体和肿瘤穿透肽iRGD的核苷 酸序列连接起来，得到编码ant i-EGFR-iRGD的融合基因片段，并将其插入原核表达质粒载 体。发明还涉及了能够表达融合蛋白的宿主细胞，该融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达，及 在抗肿瘤中的应用。
[0052] 以下结合【具体实施方式】详细说明，但不限制本发明。
[0053] 具有抗肿瘤作用的融合蛋白的表达和纯化过程如下：
[0054] 1、重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：
[005 5] 选用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2载体 重组质粒为模板，PCR反应扩增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker ;将此作为模板，再用上游 引物 Pl 和下游引物 P3 进行 PCR 反应，得到 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III ; 反应条件如下：
[0056] 95 °C 5min
[0057] (95〇C 30s ；55〇C 30s ；72〇C lmin)*30 ；
[0058] 72 °C 7min ；
[0059] 4°C hold
[0060] 50 μ L反应体系如下：
[0061] ddH2037. 5 μ L
[0062] 模版 1 μ L
[0063] 上游引物1μ L
[0064] 下游引物1μ L
[0065] Taq 酶 0· 5 μ L
[0066] 镁离子3yL
[0067] dNTPl μ L
[0068] KCI MgC12-Buffer5y L
[0069] 第一次PCR产物Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker基因片段大小为489bp，如图1所 示：经过1 %琼脂糖凝胶电泳，可见片段大小与预期一致；用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂 盒（AxyPrep)进行该片段回收作为第二次PCR的模版，以P1P3为引物，反应条件、体系同第 一次 PCR ;重组 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III 基因片段大小为 528bp，如图 2所示：经过1 %琼脂糖凝胶电泳，可见片段大小与预期一致。
[0070] 2、ant i-EGFR-iRGD 表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶的构建：
[0071] 1)将步骤1中获得的ant i-EGFR-iRGD目的基因 PGR产物用琼脂糖凝胶DNA片段 回收试剂盒（AxyPr印）进行该片段回收。根据上游引物P1、下游引物P3设计的酶切位点对 纯化的PCR产物和pET28a分别进行双酶切。
[0072] 酶切反应体系如下（两种酶购于NEB公司）：
[0073] 16 μ L PCR 产物 / 载体质粒 pET28a
[0074] 1 μ L Nco I
[0075] 1 μ L Hind III
[0076] 2 μ L buffer
[0077] 反应 37°C3_4h
[0078] 对酶切得到的DNA片段及线性的质粒进行凝胶纯化回收。
[0079] 2)连接反应体系：
[0080] 17 μ L mix (载体：目的基因=1 : 3-4)
[0081] 2 μ L ligation buffer
[0082] 1 μ L T4连接酶（T4连接酶购自TAKARA公司）
[0083] 反应 16°C 12h
[0084] 再采用连接反应对目的基因 ant i-EGFR-iRGD和酶切后的线性pET28a连接，构建 ant i-EGFR-iRGD 表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶。
[0085] 3)感受态大肠杆菌制备：
[0086] 自甘油菌（DH5 α中接种至含50ug/ml的3ml LB培养基中，220rpm37 °C过夜培 养。次日按1 : 100放大接种于含50μg/mlLB培养基中，37°C 220rpm振摇至0D600为 0. 6-0. 8 (约3小时）。此LB管冰上放置30min，取ImL菌液4°C 12000g离心3min，弃上清， 加700 μ L预冷的氯化钙（高温灭菌），重悬后置冰上30min，4°C 12000g离心3min后弃上 清，再加200 μ L预冷的氯化钙（高温灭菌），感受细胞制备好。接下来直接转化。
[0087] 4)转化方法：
[0088] 向感受态细菌中加入20 μ L连接产物，混匀；冰上30min ;42°C，90s热击；冰上放 置3-5min ;加700 μ L37°C预热的LB ;37°C 220rpm摇菌lh，涂板37°C培养过夜。
[0089] 将连接后的产物转化入感受态大肠杆菌DH5 α。
[0090] 5)用卡那抗性筛选连接成功的菌株，并用菌液PCR手段对表达载体进行鉴定。
[0091] 从LB板上用枪头随机挑选6个克隆于LB管，分别加入卡那抗生素，37°C 220rpm 摇菌过夜。
[0092] 建立PCR反应体系：
[0093] 95 〇C 5min
[0094] (95〇C 30s ；55〇C 30s ；72〇C lmin)*30 ；
[0095] 72 °C 7min ；
[0096] 4°C hold
[0097] 50 μ L反应体系如下：
[0098] ddH2037. 5 μ L
[0099] 模版（菌液）I μ L
[0100] 上游引物Pl 1μ L
[0101] 下游引物Ρ3 IyL
[0102] Taq 酶 0.5yL
[0103] 镁离子3yL
[0104] dNTPl μ L
[0105] KCI MgC12-Buffer5y L
[0106] PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳，阳性对照为1中第二次PCR的产物Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III，如图3所示：2号菌液、5号菌液为阳性。将2号与5号阳 性菌液按照质粒小提试剂盒（axygen)使用说明提取质粒并送测序验证（金斯瑞公司）。测 序基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与设计的结果进行对比分析。经对比表明表达 2号载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD构建成功，测序结果如图4所示。
[0107] 3、将表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iRGD 转化至表达菌株 BL21DE3 :
[0108] 取已经确认的 100 μ g/ μ L表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGDO. 1 μ L-5 μ L转化入 氯化钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定卡那抗性的LB平板上。挑选阳 性克隆低温冰箱内甘油保存该菌种。
[0109] 4、重组ant i-EGFR-iR⑶的诱导表达及纯化：
[0110] 1)重组 ant i-EGFR-iRGD IPTG 诱导表达：
[0111] 对重组ant i-EGFR-iRGD用ImMIPTG诱导表达，诱导4小时后，SDS-PAGE全蛋白电 泳，在20KD左右可以看到清晰特异性蛋白条带，在17KD到26KD Marker之间，在无 IPTG诱 导和存在IPTG诱导对比显示，ant i-EGFR-iRGD蛋白已经表达成功。
[0112] 全蛋白I PTG诱导表达，实验步骤如下：
[0113] a)取3μ L菌液（表达菌株甘油保存菌）加入3mLLB(卡那抗性）培养基， 220rpm37°C过夜摇菌；
[0114] b)取3 μ L菌液，加入3mLLB (卡那抗性）培养基，220rpm37°C摇菌；
[0115] c)测 0D600 至 0· 5 时；
[0116] d)加入浓度为ImM的IPTG ;
[0117] e)220rpm37°C摇菌 4 小时；
[0118] f)取出菌液，12000glmin离心去上清；
[0119] g)加入 100 μ LddH2O 重悬菌液,加入 100 μ L2*lcading buffer ;
[0120] h)100°C煮沸 10 分钟
[0121] i)配置15%聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳；
[0122] j)考马斯亮蓝染色，Gel Doc XR凝胶成像系统成像（Bio-Rad，US);
[0123] 2)重组ant i-EGFR-iR⑶经AKTA Purifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：
[0124] 收集1000 mL经过IPTG诱导表达后的BL21DE3菌液，经4200r ·π?η-1离心10min， 收集菌体。沉淀重悬于PBS (PH7. 4)、5mM咪唑80mL中进行超声裂解，超声条件为350W、工作 3s、间歇3s、总时间为45min。超声裂解物于4°C、12000r · min-1离心20min。收集上清液 与AKTA Purifier900FPLC系统纯化。镍柱用5倍柱体积PBS(PH7. 4)、5mmol I · L-I咪唑平 衡后上样，经PBS(pH7.4)、40mmol，L-1咪唑洗杂后，目的蛋白用PBS(pH7.4)、500mmol，L-1 咪唑洗脱。洗脱后的纯化蛋白在PBS(pH7.4)中透析。得到anti-EGFR-iRGD蛋白有15mg/ L菌液。
[0125] 5、用SDS-PAGE方法检测目的蛋白：
[0126] 选取未诱导表达的表达菌株BL21DE3-pET28a-ant i-EGFR-iRGD菌液ImU加 入IPTG诱导表达4小时后的菌液ImL进行12000r · min-1离心lmin，弃上清，沉淀用 100 μ LddH2O重悬作为"未诱导"与"诱导";超声后的菌液100 μ L进行12000r · min-1离心 lmin，上清移至新的EP管，沉淀用100 μ LddH2O重悬分别作为"上清"与"沉淀"；经过AKTA 纯化得到的蛋白100 μ L作为"纯化蛋白";进行SDS-PAGE电泳，电泳后考马斯亮蓝染色并脱 色，拍照。经过BAND SCAN软件分析，结果显示纯化得到的ant i-EGFR-iRGD蛋白达95 %纯 度。
[01 27] 6、Biacore (Biomo lecular Interaction Analysis)生物分子间相互作用分析法 利用表面等离子共振技术检测蛋白与人EGFR的解离、亲和常数：
[0128] 融合蛋白通过表面等离子共振技术（Biacore)检测蛋白与人EGFR的解离、亲和常 数，得到KD值为7. 09nM。
[0129] 7、AXIMA MALDI-LNR-T0F验证纯化蛋白的分子量为18KD左右。
[0130] 8、免疫荧光验证蛋白与高表达EGFR的胃癌细胞株结合能力：
[0131] 首先WESTERN BLOT方法验证胃癌细胞株中BGC823EGFR高表达。将胃癌细胞株 BGC823种在十二孔板中，贴壁后，用PBS清洗两遍；将标记FITC的融合蛋白及EGFR单克隆 抗体（EGFR mab)加入细胞，37度孵育1小时，PBS清洗两遍；Hochest染核15min，荧光显微 镜拍照；对照选择EGFR单克隆抗体。结果显示蛋白ant i-EGFR-iRGD靶向胃癌BGC823能 力好于EGFR单克隆抗体。
[0132] 9、在胃癌细胞株BGC823上对比ant i-EGFR、ant i-EGFR-iRGD及西妥昔单抗的抗 肿瘤细胞增殖能力。
[0133] 培养胃癌细胞株BGC823细胞至90 %融合，传至96孔板中，5000/每孔C02培养 箱培养12h。用无血清1640培养基按设定梯度浓度稀释ant i-EGFR(0. 5μΜ、1μΜ、2μΜ、 4μΜ,8μΜ,16μΜ), ant i-EGFR-iRGD (0. 5 μ MU μ Μ,2 μ Μ,4 μ Μ,8 μ MU6 μ Μ) (7· 5 μ g/mL、15 μ g/mL、30 μ g/mL、60 μ g/mL、120 μ g/mL、240 μ g/mL)。待细胞贴壁后，洗净 96孔板中培养基，按照浓度梯度每孔加入100 μ L稀释后的蛋白，每组浓度设置3个平行 孔。继续培养48h。每孔加入10 μ L0. 5mg/ml MTT工作液，继续培养4h。吸弃培养基，每孔 加入10(^1^1^0室温震荡1511^11，溶解结晶体。于57〇11111处测定吸光值，参比波长63〇11111， 以OD 57tl-OD63tl作为最终结果。以样品测定值除以测定的空白对照作为肿瘤细胞生长存活比 例数值。在多个浓度点（〇. 5μΜ、2μΜ、4μΜ、8μΜ、16μΜ)融合蛋白anti-EGFR-iR⑶比纳 米抗体ant i-EGFR对BGC823细胞的增殖有更强的抑制效果（* < 0· 05,林< 0· 01)，另外 与西妥昔单抗（〇6七1^!1^)相比，在浓度4以]\1、8以]\1、16以]\1时，&拉丨46?1^1?0有更强的 抑制肿瘤细胞增殖的能力（# < 〇· 05, ## < 0· 01)。
[0134] 10、ant i-EGFR-iRGD有效地抑制小鼠肿瘤的生长的比较研究。
[0135] 选用24只生长良好的裸鼠，每只右腋下注射人BGC823细胞5*10~5,0. lmL。待 荷瘤裸鼠瘤体积增至l〇〇mm3(约一周），将其随机分成4组。分别腹腔注射PBS(c 〇ntr〇l 组）10(^1^、纯化的蛋白&拉146卩1?0.4以]\1/1^*10(^1^&1^146卩1?-11?00.4 4]\1/ kg*100 μ L、西妥昔单抗6mg/kg*100 μ L，每三天给药一次（即d0、d3、d6、d9、dl2)并对 裸鼠测量肿瘤体积（V= 1/2长径*短径*短径）、小鼠体重。第十五天处死小鼠。使用 spss软件分析数据。第12天时对照组肿瘤体积是1603±572mm3, ant i-EGFR组肿瘤体积 是1269±480mm3,抑制率为21%，ant i-EGFR-iR⑶组肿瘤体积是581±229mm3,抑制率为 64%，西妥昔单抗组肿瘤体积是1098±301mm 3,抑制率为31. 5%;高穿透性纳米抗体融合蛋 白ant i-EGFR-iR⑶组与对照组PBS相比能显著抑制肿瘤的生长；并且高穿透性纳米抗体 融合蛋白ant i-EGFR-iRGD组与纳米抗体ant i-EGFR相比也能显著地抑制肿瘤的生长（* < 0. 05，** < 0. 01)。实验期间，各组小鼠生命体征基本正常，小鼠本身体重并无明显减轻， 主要器官组织形态良好。
【主权项】
1. 高穿透性纳米抗体融合蛋白，其特征在于：该蛋白由革巴向人EGFR纳米抗体和肿瘤穿 透肽iR⑶经由连接肽linker，S卩GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。2. 高穿透性纳米抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：通过设计 三条引物在已保存有anti-EGFR基因片段的载体pSJF2上进行聚合酶链式反应扩增得 到HIS-anti-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表达载体pET-28a上，构建表达载体 pET-28a-anti-EGFR-iRGD，并经过测序验证，将其转化入大肠杆菌BL21DE3表达菌，经过异 丙基-0 -D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达，通过镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，可得 到聚丙烯酰氨凝胶电泳纯95%，15mg/L细菌培养物的融合蛋白； 上游引物Pl: 5，-CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3 ' 45bp 下游引物P2: 5 ' -CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGATC-3 ' 67bp 下游引物P3: 5'-CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCT GAACCGCCTCCACC-3, 84bp (1) 重组人anti-EGFR-iRGD基因片段扩增： 选用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有anti-EGFR基因片段的pSJF2载 体重组质粒为模板，聚合酶链式反应扩增出NcoI-HIS-anti-EGFR-1inker，将此作 为模板，再用上游引物Pl和下游引物P3进行聚合酶链式反应，得到NcoI-HIS-ant i-EGFR-1inker-iRGD-HindIII； (2) anti-EGFR-iRGD表达载体pET28a-anti-EGFR-iR⑶的构建： 将步骤⑴中获得的anti-EGFR-iRGD目的基因聚合酶链式反应产物纯化回收，并将其 与载体pET28a连接，构建anti-EGFR-iRGD表达载体pET28a-anti-EGFR-iRGD，通过转化入 大肠杆菌DH5a，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并用菌液聚合酶链式反应手段对表达 载体进行鉴定，挑选得到阳性克隆按照质粒小提试剂盒使用说明提取质粒并送测序验证； (3) 将表达载体pET28a-anti-EGFR-iRGD转化至表达菌株BL21DE3 : 取已经确认的100Ug/UL表达载体pET28a-anti-EGFR-iRGDO.IiiL-5iiL转化入氯化 钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克隆低 温冰箱内甘油保存该菌种； (4) 重组anti-EGFR-iRGD的诱导表达及纯化： 1) 重组anti-EGFR-iRGD异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导表达： 对重组anti-EGFR-iRGD用ImM异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4小时 后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳； 2) 重组anti-EGFR-iR⑶经AKTAPurifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化： 收集1000 mL经过异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导表达后的BL21DE3菌体，用PBS、 5mM咪唑重悬菌体，350W功率进行超声破碎，12000r?min-1离心后收集上清液于AKTA PurifieWOOFPLC系统纯化，最后通过对纯化的蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，检测蛋白，测 定纯度； (5)AXIMAMALDI-LNR-TOF验证纯化蛋白的分子量为18KD。3. 高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特征在于高穿透性纳米抗体 融合蛋白为活性成分用于治疗肿瘤。4. 根据权利要求3所述的高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特征 在于所述肿瘤特别是指胃癌和胃转移癌。5. 根据权利要求3所述的高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特 征在于含有作为活性成分的高穿透性纳米抗体融合蛋白的液体制剂，适于经直肠、鼻内、肺 部、阴道内、外部、口服或肠胃外，包括皮下、植入、静脉内和肌内给药。
【专利摘要】本发明涉及高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用。本发明高穿透性纳米抗体融合蛋白由靶向人EGFR纳米抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。本发明克服了过去存在的融合蛋白只对一小部分肿瘤有作用以及在肿瘤局部无法获得良好的穿透性的缺陷。本发明将编码抗人EGFR抗原的单域抗体和肿瘤穿透肽iRGD的核苷酸序列连接起来，得到编码ant i-EGFR-iRGD的融合基因片段，并将其插入原核表达质粒载体，涉及了能够表达融合蛋白的宿主细胞，该融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达，及在抗肿瘤中的应用，使药物积聚于肿瘤局部，同时融合蛋白通过NRP-1途径，使药物在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【IPC分类】C12N15/62, A61P35/04, A61K39/395, C12N15/70, A61P35/00, A61K47/48, C07K19/00
【公开号】CN104892766
【申请号】CN201410083161
【发明人】刘宝瑞, 曹鹏, 沙慧子
【申请人】南京大学医学院附属鼓楼医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
最新回复(0)