用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品的制作方法
用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品的制作方法
【专利说明】用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年11月15日提交的美国临时申请No. 61/904,951的利益。上 述申请的全部教导通过引用并入本文。
[0003] 通过引用并入ASCII文本文件中的材料
[0004] 本申请通过引用并入在与本申请同时提交的以下ASCII文本文件中包含的序列 表：
[0005] a)文件名：序列表.txt ;建立于2014年10月28日，大小38KB。
[0006] 发明背景
[0007] 原发性肝癌在全世界是男性中第五常见的癌症和在女性中是第七常见的癌症。在 全球范围内，它是男性中癌症死亡的第二位的主要原因和在女性中癌症死亡的第六位的主 要原因。肝细胞癌（HCC)占原发性肝癌的85%。HCC在东南亚和撒哈拉以南非洲中是地方 病。西方国家中的发病率在近年中提高并预期继续提高。HCC在美国对于男性和女性是癌 症死亡的第五位和第九位的主要原因。HCC的五年总生存率仅为15%。
[0008] 鉴于这一疾病的高发病率及其对患者、其支持系统和大多数社团造成的巨大负 担，迫切地需要患有中期和晚期疾病的HCC患者的治疗中的进一步改善一更特别地，存在 着对于可以发生特异性地靶向HCC肿瘤且例如减小肿瘤的体积以治疗HCC和/或消除肿瘤 的药剂以及制备和使用该药剂的方法的需要。
【发明内容】
[0009] 本发明特别地提供特异性地靶向HCC肿瘤的血管内皮细胞和治疗HCC的药剂以及 使用这些药剂的相关方法。在第一方面中，本发明提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物， 其中所述抗体特异性地结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。
[0010] 在一些实施方式中，凝结剂是凝血蛋白。在更特别的实施方式中，凝血蛋白是组织 因子（tissue factor)。在还更特别的实施方式中，组织因子包含与SEQ ID NO: 1具有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；例 如，与SEQ ID N0:1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性；例如，与SEQID NO: 1具有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。
[0011] 在相关的方面中，本发明提供包含通过肽键与抗体偶联的具有与SEQ ID NO: 1至 少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列的 组织因子的偶联物，其中所述抗体特异性地结合人PLVAP蛋白的细胞外结构域中的表位。
[0012] 在前述任何方面和实施方式中，哺乳动物PLVAP蛋白可以包含与SEQ ID N0:2具 有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；更 优选与SEQ ID N0:2具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，还更优选与SEQ ID N0:2具有至95、96、97、98、99%或更高同一性。
[0013] 对于前述任何方面和实施方式，所述抗体可以特异性地结合选自 PPAGIPVAPSSG(SEQ ID N0:25)或 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM(SEQ ID N0:26)的表位。 在更特别的实施方式中，所述抗体特异性地结合表位PPAGIPVAPSSG(SEQ ID N0:25)。
[0014] 对于前述任何方面和实施方式的偶联物，在一些实施方式中，凝血蛋白和抗体化 学交联。在其它实施方式中，凝血蛋白和抗体通过肽键连接。
[0015] 在前述任何一个方面和实施方式的偶联物中，抗体可以是包含轻链可变区和重链 可变区的免疫球蛋白。在更特别的实施方式中，凝血蛋白和抗体通过在包含重链可变区的 蛋白质的羧基末端与凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。在其它实施方式中，凝血蛋白 和抗体通过在包含轻链可变区的蛋白质的羧基末端与凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连 接。
[0016] 在一些实施方式中，在前述任何一个方面或实施方式的偶联物中，凝血蛋白和抗 体经由接头肽通过肽键连接。在更特别的实施方式中，接头肽包含（Gly 4-Ser)n，其中η是 1、2、3、4、5或6 ;更优选其中η是3。
[0017] 在特定实施方式中，前述任何一个方面或实施方式的偶联物中，抗体是包含以下 的免疫球蛋白：
[0018] i)包含含有SEQ ID ΝΟ:3的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含含 有SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列的可变区中的⑶R的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变 区和重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换；或
[0019] ii)包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含 含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列的可变区中的⑶R的轻链可变区，任选地其中所述轻链可 变区和重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换。
[0020] 在更特别的实施方式中，轻链可变区和/或重链可变区是人源化的。在还更特别 的实施方式中，轻链可变区和重链可变区由以下给出：
[0021] i)选自SEQ ID N0:7、8、9、10或11的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区 是SEQ ID NO: 11;和选自SEQ ID NO: 12、13或14的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可 变区是SEQ ID NO: 13 ;或
[0022] ii)选自SEQ ID N0:15、16、17、18或19的重链可变区，更特别地其中所述重链可 变区是SEQ ID NO: 19;和选自SEQ ID N0:20、21或22的轻链可变区，更特别地其中所述轻 链可变区是SEQ ID N0:22。
[0023] 前述任何方面和实施方式的特定实施方式中，偶联物包含与SEQ ID NO: 23具有至 少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列。
[0024] 在相关的方面中，本发明提供编码前述任何一个方面和实施方式的偶联物的核 酸。在特别的实施方式中，本发明提供的核酸包含在载体中。在相关的实施方式中，载体可 以是在宿主细胞中，且在特定的实施方式中，宿主细胞是细菌细胞（例如大肠杆菌）。在其 它实施方式中，宿主细胞是真核细胞（例如，真菌如酵母，包括芽殖酵母；昆虫细胞如SfO、 Sf21或high five细胞；或哺乳动物细胞如CHO、VERO或COS细胞）。
[0025] 在另一个相关的方面中，本发明提供包含前述任何方面和实施方式的偶联物的药 物组合物，其中该组合物进一步包含合适的载体、赋形剂和/或造影剂。在更特别的实施方 式中，该组合物为适合施用于受试者的剂型。
[0026] 在另一个方面，本发明提供通过在支持前述任何一个方面和实施方式的宿主细胞 表达偶联物的条件下培养所述宿主细胞并分离表达的偶联物来制备前述任何一个方面和 实施方式的偶联物的方法。
[0027] 在再另一个实施方式中，本发明提供在需要的哺乳动物受试者中治疗具有PLVAP 阳性脉管系统的肿瘤、治疗肝细胞癌（HCC)、减小具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的体积或 者诱导具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的血栓形成和肿瘤坏死的方法。在这些方法中，向 受试者（例如，人）提供（例如，通过任何合适的方式施用）治疗有效量的前述任何一个方 面和实施方式的偶联物或前述任何一个方面和实施方式的药物组合物。
[0028] 在一些实施方式中，HCC肿瘤体积在所述偶联物诱导的血栓形成和肿瘤坏死后减 小。
[0029] 在特定实施方式中，偶联物血管内施用到受试者的肿瘤，例如HCC。在更特别的实 施方式中，偶联物直接输注到一个或多个给肿瘤供血的动脉中。
[0030] 在一些实施方式中，受试者同时或顺序经受一种或多种化疗剂、放射疗法、肿瘤内 酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治疗。在更特别的实施方 式中，偶联物与一种或多种化疗剂一起施用于受试者。在更特别的实施方式中，一种或多种 化疗剂包括治疗有效量的过索拉非尼（参见，例如PubChem 216239)、贝伐单抗或其它抗血 管生成（antiangeogenic)治疗药。在特定实施方式中，偶联物在进一步包含一种或多种化 疗剂的药物组合物中施用于受试者。
[0031] 在一些实施方式中，偶联物以约5-约200 μ g/cm3肿瘤，更特别地约10-约150 μ g/ cm3肿瘤和更特别地约15-约100 μ g/cm 3肿瘤的剂量施用。
[0032] 在特定实施方式中，偶联物以单一剂量施用。在其它实施方式中，偶联物以2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多个剂量施用。在更特别的实施方式中，所述剂量在1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10天或者1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月或更长时间段内施用。
[0033] 附图简要说明
[0034] 本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的图形。具有彩色图形的本专利或专 利申请公开的拷贝在请求和支付必要费用时由专利局提供。
[0035] 前述内容从如附图中显示的本发明以下示例实施方式的更详细说明来看是清楚 的。
[0036] 图1是电泳凝胶的照片，其显示纯化的带GST标签的人组织因子蛋白的SDS-PAGE 分析。使用10%聚丙烯酰胺凝胶。3微克的带GST标签的重组人组织因子（GST-hTF)加载 到凝胶上。
[0037] 图2是随蛋白质浓度变化的OD 405nm的曲线图，通过酶联免疫分析证明与人 组织因子化学偶联的MECA32(MECA32-hTF)与人PLVAP的结合。分析板的各孔涂覆有小 鼠 PLVAP蛋白的水溶性细胞外结构域。在封闭后，涂覆的孔与提高浓度的MECA32-hTF - 起孵育。一个孔与人组织因子（hTF) -起孵育。MECA32-hTF与PLVAP的结合用来自R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)的生物素化抗-hTF抗体和来自 Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL)的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物检测。结果显示MECA32-hTF结合小鼠 PLVAP并携带可用抗-hTF抗体检测的hTF。没有抗体的对照可溶性hTF(实心圆）不能结 合PLVAP和被检测。
[0038] 图3A和3B是显示MECA32-Fab-TF表达载体的构建的示意图。
[0039] 图4是CSR02-Fab_TF的表达构建体的示意图。
[0040] 图5是重组人PLVAP和小鼠 PLVAP的SDS-PAGE的照片。重组人PLVAP (5 μ g)和 小鼠 PLVAP(2. 5 μ g)用12%聚丙烯酰胺凝胶进行分析。
[0041] 图6A和6B是显示SCID小鼠的H印3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞中PLVAP 表达的免疫组织化学（IHC)染色的显微照片。MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体（10 μ g/ ml)用于IHC染色（图B)。左图是用作为阴性对照的相同浓度正常大鼠 IgG染色的相同块 的切片（图A)。结果显示H印3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞与人HCC -样对于PLVAP 表达阳性染色（图B中通过箭头所指的黑棕色沉淀）。肿瘤血管内皮细胞表达的PLVAP因 此可以被靶定以评估MECA32-TF和MECA32-Fab-TF的治疗效果。相同的血管不能用对照大 鼠 IgG染色（图A中的箭头）。
[0042] 图7显示通过超声检查获得的肿瘤中血流的照片，其表明与重组人组织因子偶联 的抗-PLVAP MECA32单克隆抗体（mAb) (MECA32-TF)对肿瘤血流的影响。肿瘤血流用3D能 量多普勒（Power Doppler)超声检查评估。能量多普勒检查在治疗前48小时和治疗后48 小时进行。结果显示血流在用20 μ g MECA32-TF处理的组中显著变小（白色箭头）但在用 24 μ g MECA32 mAb处理的对照组中没有变小。红色血流信号在处理前存在于肿瘤内部。
[0043] 图8是肿瘤体积随时间的线图，其表明MECA32-TF输注对肿瘤生长的影响。该图中 显示的结果来自图7中描述的相同试验。携带H印3B肿瘤异种移植物的SCID小鼠通过输 注20yg MECA32-TF到给肿瘤供血的动脉中进行处理。对照组用24yg MECA32 mAb处理。 肿瘤体积在第〇天处理之前和之后使用3D超声检查监测。对照组中的小鼠之一在初次处 理后第20天由于快速发展的肿瘤生长而死亡(f)。处理组和对照组的生长率使用线性混合 效应模型进行比较并显著不同（P = 0. 0002)。该研宄的结果（图7和8)证明与组织因子 偶联的抗-PLVAP抗体能够阻断肿瘤血流并有效地抑制肿瘤生长。实心圆（·）：MECA32mAb 对照（η = 3);交叉（X) :MECA32-TF 处理组（η = 3)。
[0044] 图 9 是提供重组抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF 和抗-人 PLVAPCSR02-Fab-TF 偶 联物的结构示意图的图片。两种抗-PLVAP Fab-TF之间的主要差异在于在MECA32-Fab-TF 的κ轻链的C末端具有组氨酸标签（His-标签）。引入组氨酸标签用于纯化目的。 CSR02-Fab-TF不需要组氨酸标签来进行纯化。
[0045] 图10是相对于竞争抗体浓度的OD 405nm的线图，其通过竞争酶联免疫分析表明 MECA32-Fab-TF结合小鼠 PLVAP。ELISA板的孔涂覆重组的水溶性小鼠 PLVAP (2. 5 μ g/ml) 过夜。在用含有牛血清白蛋白的缓冲液封闭孔后，提高浓度的大鼠 IgG(0. 5 μ g/ml-50 μ g/ ml)、MECA32-Fab-TF(0· 5 μ g/ml-50 μ g/ml)或 MECA32 mAb(0· 05 μ g/ml-5 μ g/ml)与 0. 25 μ g/ml的生物素化MECA32 mAb -起孵育。生物素化MECA32 mAb与PLVAP的结合用链 霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物和显色底物测量。结果显示MECA32 mAb和MECA32-Fab-TF 两者可以与生物素化MECA32 mAb竞争结合小鼠 PLVAP，大鼠 IgG对照不结合竞争结合小鼠 PLVAP。如所预期的，MECA32 mAb对于与小鼠 PLVAP的结合具有比MECA32-Fab-TF高一个 数量级的效力，因为MECA32-Fab-TF的结合亲和力比MECA32 mAb低一个数量级。
[0046] 图11是显示通过MECA32-Fab-TF (3、6和12 μ g)和对照MECA32单克隆抗体 (12 μ g)诱导H印3B肿瘤异种移植物肿瘤坏死的一组显微照片。在输注MECA32-Fab-TF或 MECA32 mAb到给肿瘤供血的动脉中后，肿瘤异种移植物在处理后72收获并送交组织学切 片。显示的显微照片对于所有三个不同剂量的MECA32-Fab-TF显示肿瘤的大量坏死（以粉 红色突出显示的区域）。其余区域的有活性肿瘤组织以蓝色突出显示。来自对照组的所有 三个肿瘤是100%有活性的，如右栏所示。处理的肿瘤的坏死区域通过衡量全肿瘤图象和坏 死区域的剪切块来计算，并以百分比表示。肿瘤边界用红线和蓝描画轮廓。各处理组中有 二只小鼠。
[0047] 图12是显示通过MECA32-Fab-TF(2. 5、5和10 μ g)和对照MECA32单克隆抗体 (IOyg)诱导ifep3B肿瘤异种移植物肿瘤坏死的一组显微照片。本研宄与图11中所示的 相似。主要差别是用于处理Hep3B肿瘤异种移植物的剂量。同样，肿瘤在输注到给肿瘤供 血的动脉中后72小时收获并送交组织学切片。各组中有两只小鼠。同样，结果显示处理后 所有三个剂量下的显著肿瘤坏死。以粉红色突出显示的各处理肿瘤中的坏死区域如图11 中所描述的以总肿瘤切片的百分比确定。肿瘤边界用红线和蓝线描画轮廓。方块区域放大 (40x和IOOx)并显示在右侧以显示残留的存活肿瘤细胞（箭头）。各肿瘤中显示的百分比 是相对于肿瘤总截面的相对坏死面积。
[0048] 图13A和13B是显示输注10 μ g MECA32-Fab-TF后2、4、24、48和72小时肿瘤组 织学的变化的显微照片组。切片用苏木精和曙红染色。在图13A中，血管中纤维蛋白血栓 块的出现（箭头）在输注后2小时观察到。含有纤维蛋白血栓块的血管的数目在之后变得 更突出（箭头）。在处理前（〇小时）肿瘤血管中没有观察到纤维蛋白血栓块。在48和72 小时肿瘤组织变得完全坏死。显微照片以IOOx放大率获取。在图13B中，肿瘤细胞显示在 处理后4小时彼此之间具有增大的清晰空间的轻微分离。这一变化在24小时变得更显著。 具有蓝色核染色损失的明确坏死在处理后48小时变得明显，并在72小时变得更显著。显 微照片以200x放大率获取。
[0049] 图14是通过超声检查获得的肿瘤血流的一组照片，其显示输注IOyg MECA32-Fab-TF后不同时间点肿瘤血流的改变。肿瘤血流在处理前和处理后通过3D能量多 普勒评估。各时间点有两只小鼠。小鼠在处理后的3D能量多普勒研宄后立即处死。此处 显示具有来自处理前和处理后的各时间点的两只小鼠之一的能量多普勒信号（红色）的声 谱图。处理前48小时收集的肿瘤的声谱图显示在左侧。处理后声谱图显示在右侧，其中肿 瘤血流信号在处理后2小时消失并持续直到处理后72小时。
[0050] 图15是肿瘤体积随时间的线图，其显示动脉内输注MECA32-Fab-TF对H印3B肿瘤 异种移植物生长的作用。携带H印3B人肝细胞癌异种移植物的SCID小鼠在第0天用单次 输注的10 μ g对照MECA32单克隆抗体（mAb)和5或10 μ g MECA32-Fab-TF处理。肿瘤体 积从第0天的处理开始的_2、9和24天使用3D超声检查测量。在第-2天对于MECA32mAb 对照组和两个MECA32-Fab-TF处理组（10和5 μ g)测量的平均初始肿瘤体积分别是26. 8、 29. 0和23. 1mm3。各组的肿瘤体积表示为以mm3计的平均值土SD。处理组和对照组的不同生 长率使用线性混合效应模型进行比较。P值对于5 μ g处理组和对照组之间的比较及10 μ g 处理组和对照组之间的比较分别是0. 0003和0. 0001。
[0051] 图16A显示在用MECA32 mAb或MECA32-Fab-TF初次处理后25天切除的H印3B肿 瘤的照片和重量（图A)。各处理组和对照组的平均肿瘤重量（平均值土SEM)作为条形图 显示于图16B中。各MECA32-Fab-TF处理组的肿瘤重量通过t检验与对照组的肿瘤重量进 行比较。10 μ g和5 μ g MECA32-Fab-TF处理组的p值分别是0· 01和0· 03。
[0052] 图17是肿瘤体积随时间的线图，其显示系统性施用MECA-32-Fab-TF对H印3B月中 瘤异种移植物生长的作用。对于处理组小鼠通过尾静脉用MECA32-Fab-TF的系统性施用进 行处理或对于对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水的系统性施用进行处理。肿瘤生长在第O天的处 理之前和之后通过用测径器测量三个垂直的维度进行监测。所有三个组的最终肿瘤体积通 过ANOVA进行比较。结果显示所有三个组之间没有显著差异，p值为0. 96。这三个组的平均 肿瘤体积（平均值±SEM)是 1844±840mm3(对照）、1867±602mm3(20μgMECA32-Fab-TF) 和 1617±559mm3(10 μ g MECA32-Fab-TF)。
[0053] 图18是一组显微照片，其显示来自三个病例的人肝细胞癌（HCC)和相邻非肿瘤性 肝组织的切片用生物素化CSR02-Fab-TF的免疫组织化学染色。在左栏显示的三个HCC切 片中所有血管对于PLVAP染色阳性（箭头），在血管内皮细胞中具有棕色沉淀。相反，肝窦 状隙、门静脉和肝静脉内层的内皮细胞（菱形）显示阴性染色而没有可检测的PLVAP表达。
[0054] 图19是SEQ ID N0:2的注释序列，其中完整NP_112600. l(hPLVAP)的细胞外区域 加下划线。
[0055] 图 20 是 SEQ ID NO: 3>KFCC-GY4_VH_domain_4 的注释序列，其中 CDR 加下划线。
[0056] 图 21 是 SEQ ID N0:4>KFCC-GY4_VL_domain_9 的注释序列，其中 CDR 加下划线。
[0057] 图22是SEQ ID NO: 5>KFCC-GY5_VH_14的注释序列，其中CDR加下划线。
[0058] 图23是SEQ ID N0:6>KFCC-GY5_VL_19的注释序列，其中CDR加下划线。
[0059] 图24是SEQ ID N0:23,重组CSR02-Fd-TF插入序列，的注释序列，其中Fd(I-IH) 的VH结构域加下划线，Fd(115-216)的CHl结构域加粗，铰链（217-225)加双下划线，接头 (226-239)通过小写字母表示，且人组织因子的细胞外结构域（240-458)为斜体。
[0060] 本发明的详细描述
[0061] 本发明的示例实施方式的说明如下。特定术语的定义在整个说明书中适用。
[0062] 本发明提供的偶联物和组合物
[0063] 本发明提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中该抗体特异性地结合哺乳动 物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。这样的偶联物称为"本发明提供的偶联物"、"本发明 的偶联物"等，而包含该偶联物的组合物（如药物组合物）称为"本发明提供的组合物"等。 该申请也可以指称"本发明提供的偶联物和组合物"以描述"本发明提供的偶联物"和"本 发明提供的组合物"。
[0064] "凝结剂"促进哺乳动物循环系统中，即在功能性凝血级联和血小板激活途径的存 在下，血栓的体内形成。肽"凝结剂"是"凝血蛋白"。凝血级联的示例性成分包括，例如，组织 因子、哈格曼因子（人GeneID No. 2161)、血浆促凝血酶原激酶（人GeneID No. 2160)、凝血 酶（人GeneID No. 2147)、克里斯马斯因子（人GeneID No. 2158)、稳定因子VII (人GeneID No. 2155)和纤维蛋白稳定因子（人 GeneID No. 2162, 2165);也参见人 GeneID No. 2156、 2157和2159。血小板激活途径的示例性成分包括，例如，ADP、血清素、血小板激活因子 (PAF ;人 GeneID No. 7941)、Von Willebrand 因子（vWF ;人 GeneID No. 7450)、血小板因子 4(人GeneID No. 5196)和血栓烷A2 (TXA2))。凝结剂可以是凝血级联的成分或产物（即，内 源性、外源性或共同途径的成分）或血小板激活途径的成分或产物以及异源蛋白质，包括 凝血毒素，如convulxin(参见例如，分别对于α和β亚基参照蛋白质序列的uniprot ID 093426和093427)和Russellysin(参见例如，uniprot Q7LZ61)，只要该试剂促进血栓形 成，例如在功能性凝血级联和血小板激活途径的存在下。
[0065] 在特别的实施方式中，凝结剂是凝血蛋白。凝血蛋白可以以单体或寡聚体（如 二聚体或三聚体）或者以较高阶结构的聚合物处于偶联物中。在更特别的实施方式中， 凝血蛋白是组织因子。"组织因子"，也称为因子III、促凝血酶原激酶和⑶142,是促进血 栓形成的因子VII的受体。组织因子以人GeneID No. 2152为例，且众多的同源物是已 知的（参见 HomoloGene ID 1511)，包括人：NP_001984. 1、小鼠：NP_034301. 3、黑猩猩： XP_001156450. 1和狗NP_001019811. 1的蛋白质。人蛋白质包括基序（如在同源物间保守 的一对纤连蛋白3型结构域（C100065)以及一对WKS基序（Uniprot P13726. 1))和干扰素 结合区域（保守结构域CDD:204189)。在特别的实施方式中，组织因子是组织因子的可溶性 细胞外部分，以SEQ ID N0:1为例，其是NP_001984. 1的氨基酸33-251，和可通过与来自其 它生物体的同源序列比对确认的对应序列，以及其功能性变体，包括置换和截短（例如1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10个残基或更多个残基的置换和截短）。在一些实施方式中，组织因子 包含与 SEQ ID NO: 1 具有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或 更高同一性的氨基酸；更优选与SEQ ID NO: 1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更 高同一性；还更优选与SEQ ID N0:1具有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。具有改变 的活性水平的变体组织因子也可以作为单体用于本发明中，或者在一些实施方式中，作为 多聚体如二聚体用于本发明中。它们包括"凝血缺陷"组织因子（如美国专利No. 6, 156, 321 中所述的，其通过引用并入），其比原始组织因子活性低100倍或更多，例如关于激活因子 VII0
[0066] "抗体"包括免疫球蛋白（及其抗原结合片段）及可以与免疫球蛋白类似地适 应和使用的非免疫球蛋白骨架一所谓的抗体模拟物。示例性抗体模拟物包括基于纤连蛋 白3结构域（Fn3结构域；也称为单体（monobody);参见，例如Koide和Koide, Methods Mol. Biol. 352:95 - 109) (2007))、蛋白 A 的 Z 结构域（也称为亲和体（aff ibody);参 见，例如 Nygren FEBS 275(11) :2668 - 76(2008))、γ-B 晶体或泛素 （afflins ;参 见，例如 Ebersbach 等 J. Mol. Biol. 372 (1) : 172 - 85 (2007))、脂笼蛋白（Iipocalins) (anticalins ;参见，例如 Skerra, FEBS J.，275(11) :2677 - 83(2008))的那些；膜受 体的A结构域（高亲和性多聚体（avimers);参见，例如Silverman等Nat. Biotechn ol. 23(12) :1556 - 61 (2005));销蛋白（ankryn)重复序列（darpins;参见，例如 Stumpp 等，Drug Discov. Todayl3 (15 - 16) :695 - 701 (2008)) ;Fyn 的 SH3 结构域（fynomers; 参见，例如 Grabulovski 等，J Biol Chem 282 (5) : 3196 - 3204 (2007))和 Kunitz 型结 构域（Kunitz 结构域肽；参见，例如 Nixon 和 Wood CR, Curr Opin Drug Discov Devel 9(2) :261 - 8(2006)) 〇
[0067] 用于本发明提供的偶联物中的抗体特异性结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结 构域表位。哺乳动物PLVAP的示例性细胞外结构域表位包括对应于PLVAP的细胞外结构域 (SEQ ID Ν0:2中约氨基酸49及之后）的区域（例如，如通过序列比对评价的，如BLASTp、 ClustalWXOBALT等等，使用默认参数），或更特别地在PLVAP的C-末端，如SEQ ID NO: 24 中约氨基酸238及之后（NP_115774. 2,小鼠 PLVAP参照序列，例如由SEQ ID N0:24的氨基酸 238-413的氨基酸序列组成的肽），或者在SEQ ID N0:2(人PLVAP参照序列，NP_112600. 1) 的约氨基酸370-约442中包含的序列，如SEQ ID NO: 2的氨基酸378-404或SEQ ID NO: 2 的氨基酸431-442。在特别的实施方式中，用于本发明提供的偶联物中的抗体特异性结 合SEQ ID NO:2的氨基酸378-404或SEQ ID NO:2的氨基酸431-442中的表位；和/或 这些中任一的对应灵长类动物同源物，如来自食蟹猴（Macaca fascicularis)的相应序列 (ΧΡ_005588437· 1)和来自猕猴（Macaca mulatta)的相应序列（AFH29537. 1)。
[0068] 在特别的实施方式中，抗体是免疫球蛋白。"免疫球蛋白"指的是全长免疫球蛋白 以及免疫球蛋白的抗原结合片段，如Fab、F(ab'）2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能 的其它免疫球蛋白片段。免疫球蛋白在其抗原结合结构域中具有至少3个CDR(互补决定 区），且在更特别的实施方式中，4、5或6个⑶R。且还更特别地，抗原结合结构域中具有6 个CDR。用于本发明中的免疫球蛋白包括，例如人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、兔和鸡抗 体。免疫球蛋白可以是多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化 的、骆驼源化的、单域的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的或CDR-移植的。用于本发 明中的特定免疫球蛋白包括具有由鼠杂交瘤KFCC-GY4 (ATCC专利保藏号PTA-9963,于2009 年4月8日保藏于美国典型培养物保藏中心，地址：10801University Boulevard，Manass as, VA, 20110-2209,美国）或鼠杂交瘤 KFCC-GY5(ATCC 专利保藏号 PTA-9964,于 2009 年 4月8日保藏于美国典型培养物保藏中心，地址：10801University Boulevard, Manassas, VA，20110-2209,美国）产生的抗体的⑶R或其保守置换的那些，例如在特别的实施方式中， 在抗体结合结构域中具有最多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个 保守氨基酸置换（更特别地1、2、3、4、5或更多个置换），例如，在各⑶R中最多约1、2、3或 4个保守置换；更特别地在各CDR中最多1或2个保守置换。在特定实施方式中，免疫球蛋 白包含人源化重链和轻链可变结构域。KFCC-GY4和KFCC-GY5抗体，包括其可变结构域和 CDR的氨基酸序列，描述于美国专利申请公开号US 2011/0085973(首次描述在小鼠中产 生的该单克隆抗体）和US 2011/0262349(描述特定的嵌合和人源化变体）中，这两者通过 引用全文并入本文。也参见SEQ ID NO: 3-22,其提供了可变结构域序列，及这些抗体的鉴定 的 CDR0
[0069] "PLVAP"也称为质膜囊泡相关蛋白、PVUFELS和gp68,是在肿瘤脉管系统（如HCC 肿瘤脉管系统）中表达的蛋白质，并描述于人Gene ID No. 83483中。PLVAP已经在七种 生物体中鉴别（参见 HomoloGene ID 10578)，如人（ΝΡ_112600·1，也参见 SEQ ID N0:2)、 黑猩猩（XP_512490. 3)、小鼠（NP_115774. 2)和狗（XP_541953. 3)，并包含 PV-I 结构域 (pfam06637)。在一些实施方式中，特异性结合PLVAP (如哺乳动物PLVAP)的抗体结合PLVAP 的细胞外结构域，其对应于SEQ ID N0:2的大致氨基酸49-442或51-442。在特别的实施方 式中，哺乳动物PLVAP包含与SEQ ID N0:2(或其细胞外结构域）具有至少50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列 ；更优选与SEQIDN0:2(或 其细胞外结构域）具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性 ；更优选与SEQID 勵:2(或其细胞外结构域）具有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。在一些实施方式中， PLVAP蛋白包括相对于SEQ ID N0:2或其细胞外结构域的置换（例如，1、2、3、4、5个或更多 个残基）和/或截短（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个残基）。
[0070] 与本发明协同使用的接头肽可以通过肽键偶联抗体和凝结剂（例如凝血蛋白）一 例如，抗体（例如，免疫球蛋白的一个可变结构域）和凝血蛋白可以表达为单一多肽链。接 头肽的长度可以变化，例如从约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或者更 多个氨基酸到例如约75、100、150、200、250或300个氨基酸。在一些实施方式中，接头包含 铰链区，与在天然发生的免疫球蛋白中发现的富半胱氨酸和富脯氨酸结构域类似，且任选 包括另外的接头肽，如（Gly4-Ser)3，以分隔抗体（例如免疫球蛋白）和凝结剂（例如凝血 蛋白）。
[0071] 本发明提供的偶联物可以任选地包含标记，如可检测标记，如荧光、酶或放射性标 记。在特定实施方式中，发明提供的偶联物是生物素化的。
[0072] 在相关的方面，本发明提供编码本发明提供的偶联物的核酸、包含该核酸的载体 及包含该核酸和载体的宿主细胞。示例性的核酸包括编码与本发明提供的偶联物（在特别 的实施方式中，包括具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的偶联物）至少80、85、90、95、96、97、 98、99 %或更多相同的蛋白质的核酸。在其它实施方式中，核酸可以在高严格性杂交条件下 与编码本发明提供的偶联物的核酸杂交。"高严格性杂交"条件是：65°C下至少约6X SSC和 1% SDS。首次洗涤在约42°C下用0.1 X SSC中的约20% (v/v)甲酰胺进行10分钟，后续 洗涤在65°C下用0. 2X SSC和0. 1% SDS进行。在特别的实施方式中，本发明提供的核酸可 以是密码子修饰的，例如针对用于产生偶联物的特定宿主细胞。编码本发明提供的核酸的 载体可以包含例如表达本发明提供的偶联物所需的附加序列（如调控序列、启动子和增强 子）以及某些合适的辅助序列，如一个或多个复制起点、一个或多个选择标记和整合序列 (例如，用于整合到宿主基因组中，其通过随机整合、可转座元件或位点特异性整合，例如通 过同源重组，如通过靶向核酸酶）。
[0073] 在相关的方面中，本发明提供制备本发明提供的偶联物的方法，例如通过在支持 宿主细胞表达偶联物的条件下（例如，如果启动子是诱导型的，则通过添加诱导剂，等等） 培养包含本发明提供的核酸的宿主细胞，并随后分离表达的偶联物。合适的宿主包括细菌 细胞（例如，大肠杆菌）以及真核细胞，如真菌，如酵母（包括裂殖酵母）；昆虫细胞，如SfO、 Sf21或high five细胞；或哺乳动物细胞，如CH0、VER0或COS细胞，或间充质干细胞（MSC)。
[0074] 本发明提供的偶联物可以有利地配制到组合物如药物组合物中一例如，其中本发 明提供的偶联物与合适的载体或赋形剂复合的情况。任何合适的药用载体可以用于本发明 中。在特别的实施方式中，载体将促进偶联物的稳定性（例如当冻干用于储存或运输时）， 并在溶液（如重构后的水溶液）中时支持本发明提供的偶联物的稳定性，以与最佳的药学 实践一致。药物组合物可以包括以下一种或多种：缓冲剂（如组氨酸、磷酸盐或琥珀酸盐缓 冲剂）、增量剂或粘接剂（如甘氨酸或山梨醇，或者糖，如蔗糖、葡萄糖、乳糖或果糖）、张力 调节剂（如无机盐，如氯化钠、磷酸钾或磷酸钠）、防腐剂、湿润剂、乳化剂等等。
[0075] 在特别的实施方式中，本发明提供的偶联物配制成适合直接施用（例如通过经血 管施用，如经动脉施用）到HCC肿瘤脉管系统的药物组合物。在特别的实施方式中，本发明 提供的偶联物可以配制到脂醇油中。在其它实施方式中，本发明提供的偶联物可以用具有 约45 μ m和约90 μ m之间的平均直径的微粒如1VALON?栓塞颗粒配制。当施用于处理 的肿瘤时，存在这类赋形剂的情况下注射可以提高本发明提供的偶联物的利用度，例如通 过在注射后诱导肿瘤血管内血液的停滞。
[0076] 在一些实施方式中，本发明提供的组合物可以包括相容的水溶性造影剂（用于放 射照相、MRI或超声应用）以例如允许通过荧光检查评估本发明提供的偶联物在处理的肿 瘤中的分布和/或评估暴露于本发明提供的偶联物的肿瘤的完整性。< br>[0077] 本发明提供的药物组合物可以制备成用于分配和施用于需要的受试者的剂型 (与本发明提供的方法协调一致），包括多种剂型的试剂盒，其可以包含一个或多个填充有 本发明药物组合物的一种或多种成分的容器。任选地与这种容器相关的可以是按照管理药 物或生物制品的制造、使用或销售的政府部门规定的形式的通告，该通告表明政府部门对 于制造、使用和销售用于人类施用的批准。包装和试剂盒可以标记关于施用方式、药物施用 的顺序（例如，在多药剂试剂盒的情况中单独地、顺序地或同时地）等等的信息。包装或试 剂盒也可以包括用于提醒患者采取治疗的装置。包装或试剂盒可以是联合治疗的单一单位 剂量或它可以是多个单位剂量。特别地，化合物可以是分离的、以任何组合混合在一起、存 在于单一形式中，例如小瓶或药片。出于本发明的目的，单位剂量意图指取决于各化合物的 单独药效学并以FDA批准的剂量在标准时程中施用的剂量。
[0078] 本发明提供的偶联物、本发明提供的药物组合物和包含该偶联物和药物组合物的 本发明提供的试剂盒因此可用于治疗罹患具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤（如HCC)的受 试者的方法中以及使具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤可视化的方法中。
[0079] 治疗方法
[0080] 本发明提供的偶联物和药物组合物可以用于例如在需要的哺乳动物受试者中治 疗具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤（如HCC或成胶质细胞瘤）、治疗肝细胞癌（HCC)、减小 具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤的肿瘤体积或诱导具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤的血 栓形成和肿瘤坏死的方法。这些方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明提供的偶联物 或本发明提供的组合物。
[0081] "受试者"是指哺乳动物，更特别地人类患者（男性或女性），且在更特别的实施方 式中，患HCC、成胶质细胞瘤或任何具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤的人类患者。而受试者 可以为任何生命阶段或任何年龄，例如新生儿、婴儿、幼儿、儿童、年轻成人、成人或老人；在 特别的实施方式中，受试者是成年的，例如成年人，即约18岁或更大，例如约18-70、20-60、 25-55、25-50、30-50、25-65岁以及大于约30、40、50、60、70、80或90岁。在更特别的实施方 式中，受试者是60岁或更大，如更特别地65岁或更大。在还更特别的实施方式中，受试者 是约70-约79岁。
[0082] 如本文中使用的，术语"治疗"、"处理"或"疗法"意思是对抗医学状况（例如，HCC 或具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤）以使得医学状况按照临床可接受的标准得到改善。例 如，HCC的改善包括减小的肿瘤体积、减小的肿瘤血流、肿瘤坏死和/或细胞凋亡、正常化的 肝功能等等。
[0083] "治疗有效量"是足以在施用的条件下实现所需的治疗或预防效果的量，如 足以治疗HCC的量。疗法的有效性可以通过本领域技术人员使用标准测量和常规方 法确定。在特别的实施方式中，偶联物以约5-约200 μ g/cm3肿瘤的剂量施用，更特 别地约10-约150 μ g/cm3肿瘤，和更特别地约15-约100 μ g/cm 3肿瘤。在一种生物 体（如本文中提供的小鼠实例）中发现有效的剂量可以使用已经方法转换用于另一 生物体（如人类）。参见，例如 Reagan-Shaw 等，FASEB J. 22:659-61 (2008) ;Schein 等，Clin.Pharmacol. Ther. 11:3-40(1970)和 Freireich 等，Cancer Chemother. Reports 50(4) :219-244(1966)。例如，基于动物给药的以mg/kg计的人等效剂量（HED)可以通过以 下等式给出：HED (mg/kg)=动物剂量（mg/kg) X (Kmsfe /ΚπιΛ )，其中Km =重量/表面积（kg/ m2)。基于上述等式的示例性转换因子显示于表A中。
[0084] 表 A
[0085]
[0086] 本发明提供的偶联物和本发明提供的药物组合物可以通过任何合适的方式提供 (例如，施用）于受试者，在特别的实施方式中包括血管内施用于受试者的肿瘤，例如偶联 物直接输注到HCC的一个或多个给肿瘤供血的血管中。
[0087] 通过本发明提供的方法治疗的受试者可以同时或顺序经受一种或多种化疗剂、 放射疗法、肿瘤内酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治疗。 在特定实施方式中，一种或多种化疗剂包括治疗有效量的索拉非尼（参见，例如PubChem 216239)、贝伐单抗或其它抗血管生成治疗药。对于组合方法，本发明提供的偶联物（或本 发明提供的组合物）可以同时（在单一组合物中或在单独的组合物中）或顺序地（在另一 治疗之前或之后）施用。
[0088] 在其中所述方法采用包括造影剂的本发明提供的组合物的情况中，在一些实施方 式中，本发明提供的方法可以包括使用造影剂可视化肿瘤（例如，HCC或成胶质细胞瘤）的 步骤，例如通过X-射线（包括CAT扫描）、MRI或超声。
[0089] 受试者可以以单一剂量或在其它实施方式中以多个剂量（例如，以2、3、4、5、6、7、 8、9、10个或更多个剂量）施用本发明提供的偶联物或组合物。当施用多个剂量时，该剂量 可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月的时 间段内施用。
[0090] 发生HCC的高风险组可以包括以下受试者：HBV-阳性；HCV-阳性；具有受损的肝 功能；具有肝硬化；具有 TP53 (OMIM 191170)、MET (OMIM 164860)、CTNNBl (OMIM 116806)、 CASP8(0MM601763)、PIK3CA (0ΜΙΜ 171834)、AXINl (0ΜΙΜ 603816)、PDGFRL (0ΜΙΜ 604584) 和APC(C)MM 611731)的一个或多个的突变；α-1-抗胰蛋白酶缺陷（ΟΜΜ 613490);血色 素沉着（0ΜΜ 235200);酪氨酸血症（0ΜΜ 276700)及前述的组合。因此，在特定实施方式 中，本发明提供的方法需要提供患有（或疑似具有）HCC的受试者（其具有这些突变中的一 种或多种），例如受试者在施用本发明提供的偶联物之前确认为具有突变之一（或者与HCC 的更高致病性相关的任何突变）。
[0091] 本发明提供的偶联物和本发明提供的组合物可以通过任何合适的途径或通过任 何合适的方式施用于受试者（如人）。例如，偶联物或组合物可以血管内施用于受试者的 HCC，例如通过直接输注到一个或多个给肿瘤供血的血管中，如肝动脉或股动脉或通过肝门 静脉。本发明提供的偶联物和本发明提供的组合物单独地或与一种或多种化疗剂（如索拉 非尼（参见，例如PubChem 216239)、贝伐单抗或其它抗血管生成治疗药中的一种或多种） 一起（在相同组合物中，或者同时或顺序施用）施用于受试者。
[0092] 在任何本发明提供的方法中，偶联物以约5 μ g/cm3肿瘤至约200 μ g/cm3肿瘤的剂 量施用，更特别地约10-约150 μ g/cm3肿瘤，且更特别地约15-约100 μ g/cm 3肿瘤。本发 明提供的偶联物或本发明提供的组合物可以以单一剂量或以多个剂量（例如，以2、3、4、5、 6、 7、8、9、10个或更多个剂量）施用。多个剂量可以是在任何可用的时期如1、2、3、4、5、6、 7、 8、9或10天或者1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月内。
[0093] 示例
[0094] PLVAP基因表达限制于HCC的血管内皮细胞且不存在于非肿瘤性肝组织中。PLVAP 蛋白是血管内皮孔和小窝的结构蛋白。未知它参与信号传导。抗-PLVAP抗体处理最近报 告为在小鼠中影响跨血管内皮细胞的白细胞运输。
[0095] 在本专利申请中，我们描述了通过利用在HCC的血管内皮细胞中而不在非肿瘤性 肝组织中PLVAP的差异表达来开发用于治疗HCC的新型治疗生物制品。对于我们的方式， 我们通过共表达在抗-PLVAP抗体或其Fab片段上的人组织因子蛋白开发这一治疗性生物 制品。人组织因子是血液凝固的强力触发剂。我们将开发的这种治疗剂输注到HCC的血管 中可以导致其与肿瘤血管内皮细胞结合并在HCC的所有血管中触发血凝块形成。HCC肿瘤 血管的血栓形成导致肿瘤血液供应的剥夺和缺血性坏死。使用SCID小鼠中的HCC异种移 植物模型，我们证明所开发的抗-PLVAP单克隆抗体或其Fab片段与人组织因子输注到给肿 瘤供血的动脉中成功地诱导肿瘤异种移植物的大量缺血性坏死并抑制肿瘤生长。通过外周 静脉系统施用这种治疗剂是无效的。因此，这种新的药剂输注到给肿瘤供血的动脉中对于 实现治疗效果是优选的。
[0096] 材料和方法
[0097] 大鼠抗-小鼠 PLVAP MECA32单克隆抗体（mAb)
[0098] MECA 32 杂交瘤获自衣阿华州大学的 Developmental Studies hybridoma Bank (Iowacity, ΙΑ)。杂交瘤细胞在含有 10 % 低-IgG 胎牛血清、I % GLUTA-Max (Life Technologies, Carlsbad, CA)、1 % 抗生素-抗霉菌剂（Life Technologies)和 1 % HEPES(Life Technologies)的 RPMI 培养基中培养。大鼠抗-小鼠 PLVAP MECA32 mAb 使 用来自GE Healthcare Life Sciences的HiTrap Protein G柱按照制造商的说明从MECA 32杂交瘤细胞的稠培养上清液纯化。纯化的抗体透析到磷酸盐缓冲盐水（PBS)，pH 7. 4中。 抗体的浓度对于lmg/ml使用1. 37的消光系统通过280nm波长处的吸光度测定。
[0099] 人组织因子蛋白的水溶性细胞外结构域的产生
[0100] 为产生人组织因子蛋白（hTF)的重组水溶性细胞外结构域，人组织因子蛋白 细胞外结构域cDNA的PCR片段（氨基酸残基33-251)从人组织因子的全长cDNA克隆 (NM001993. 2) (OriGene Corp. ,Rockville, MD)制备。用于PCR的引物分别在正向和反向引 物两者的5'端包含BamHl和Sail的限制性序列。扩增的cDNA片段插入pGEX€-6P-l 质粒（GEHeathcare Life Sciences)中并用谷胱甘肽（GST)标记。上述表达构建体通过 DNA 测序验证并转化到大肠杆菌菌株 SHuffle? T7Express(New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA)中用于产生hTF。大肠杆菌转化体接种在选择性培养基上。之后，随机选择 l-2mm的集落并在30°C下接种到含有100 y g/ml氨苄青霉素的4ml 2xYT培养基中和在 230rpm搅拌孵育器中孵育过夜。下一天，过夜培养物接种到含有100 μ g/ml氨苄青霉素的 400ml 2xYT培养基中并继续在30°C下230rpm搅拌孵育器中生长过夜。当600nm的吸光 度达到约0. 6~0. 8时，异丙基β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG)添加达到0. 4mM的最 终浓度以诱导蛋白质产生。振摇在30°C下持续约20小时。在用IPTG诱导后，细胞通过离 心（10, OOOx g;20min)收获并在室温下在含溶菌酶和Benzonase核酸酶（Novagen)的具 有0. 2% Tween 80的lx PBS中进行裂解2小时。细胞裂解产物在4°C下以10, OOOrpm离 心30分钟。收集上清液并作为可溶性部分过滤。
[0101] 带GST标签的重组人组织因子（GST-hTF)按照制造商的说明从GSTrap FF柱（GE Helathcare Life Sciences, Piscataway, NJ)纯化。含有 GST-hTF 的洗脱级分用 SDS-聚丙 稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)鉴定、合并和在PBS中透析。纯化蛋白质的浓度使用Bradford 蛋白质分析（Bio-Rad laboratories, Hercules, CA)和使用牛血清白蛋白作为标准测定。纯 化的GST-hTF在SDS-PAGE凝胶（10% polyacrylamid)中显示具有预期的50kDa分子量的 蛋白质条带（图1)。纯化蛋白质的组织因子活性使用显色分析针对商用人组织因子进行分 析。纯化的GST-hTF针对商用hTF标准进行分析并具有每微克蛋白3ug的hTF活性。这一 hTF活性分析的过程在后面章节中详细描述。
[0102] 重组GST-hTF与大鼠抗-小鼠 PLVAP MECA32单克隆抗体的偶联
[0103] 首先，纯化的MECA32 mAb在含有0· 5M NaCl的0· IM MES缓冲液pH 6. 0中透析。 MES是2- (N-吗啉代）乙磺酸。抗体使用相同的MES缓冲液调节到lmg/ml。向Iml的MECA32 mAb中，添加 I. 2mg EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）和3. 3mg的 硫代-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺）。在温和涡旋以溶解添加的试剂后，混合物在室温下 孵育一小时。用PBS偶联缓冲液预平衡的Zeba脱盐柱用于回收活化的MECA32 mAb。PBS 偶联缓冲液由140mM NaCl、10mM磷酸钠和3mM KCl组成，pH 7. 4-7. 5。接下来，相等数量的 GST-hTF(0. 66ml中0. 33mg)添加到活化的MECA32-mAb中。混合物在室温下旋转混合器上 孵育3小时。反应然后通过添加羟胺到IOmM的最终浓度淬灭。与人组织因子蛋白偶联的 抗体针对Ix磷酸盐缓冲盐水深度地透析以除去所有小的有机化学物质。抗体的浓度通过 280nm的吸光度测定。对于lmg/ml使用1. 37的消光系数测定抗体浓度。与人组织因子偶 联的抗体使用显色分析测量组织因子活性。购自R&D Systems (Minneapolis, MN)的重组人 组织因子作为标准品用于该分析中。纯化的MECA32单克隆抗体的TF偶联物（MECA32-TF) 针对与小鼠 PLVAP的结合及与小鼠 PLVAP结合的抗体上人组织因子的存在进行分析（图 2) 〇
[0104] 用于表达MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达 hTF(MECA32-Fab-TF)的质粒构建体的开发
[0105] 用于产生MECA32-Fab-TF的质粒构建体的制备在四个步骤中完成。第一步是制 备MECA32 mAb轻链可变结构域（VL)和MECA32 mAb重链可变结构域（VH)的cDNA，并确定 其DNA序列用于制备在第二步中使用的引物。第二步是制备在羧基末端具有His-标签的 MECA32mAbK轻链的全长cDNA，并插入pET26b质粒载体中。第三步是制备3'端具有接头 序列的MECA32 mAb重链的VHl和CHl结构域（Fd)加铰链区的cDNA，及用于hTF和5'端接 头序列的cDNA。然后重叠 PCR用于将两个cDNA连结在一起。MECA32-Fd-铰链-接头-TF 的这一 cDNA插入pET26b质粒载体中。第四步是从第二和第三步制备的质粒构建双顺反子 质粒载体。这四个步骤在下面更详细地描述并总结于图3A和3B中。
[0106] 第一步：克隆MECA32 mAb κ轻链的VL结构域和MECA32 mAb重链的VH结构域的 cDNA用于核酸测序
[0107] 编码MECA32 mAb轻链可变结构域（VL)和重链可变结构域（VH)的CDNA使用 FirstChoice RLM-RACE试剂盒（Ambion, Inc. ,Austin, TX)按照制造商的说明制备。简而 言之，从MECA32杂交瘤分离的总RNA用作模板以通过反转录PCR分别地使用与VL结构域 相接的κ轻链恒定结构域的核苷酸序列互补的引物（5' TGTCCTGATCAGTAACACTGTCC3'） (SEQ ID N0:27)和与VH结构域相接的重链CHl结构域的核苷酸序列互补的引物 (5, TGAGAGTGTAGAGTCCAGACTGCAGG3'）（SEQ ID N0:28)扩增。
[0108] 分析PCR产物并使用 Qiaquick凝胶提取试剂盒（Qiagen, Mississauga, Ontario, C anada)从I. 5%琼脂糖凝胶分离。纯化的PCR片段插入到质粒载体pGEM-T-easy (Promega ，Madison, WI, USA)中并转化到大肠杆菌菌株YE707-J (Yeastern Biotech, Taipei, Taiwan) 中。包含VL和VH结构域的插入序列的质粒从转化的大肠杆菌制备并用于确定VL和VH结 构域的DNA序列。然后序列用于设计引物以用于第二和第三步中。
[0109] 第二步：制备由MECA32 mAbK轻链和His-标签组成的cDNA并插入pET-26b质粒 载体中
[0110] 来自第一步的VL链的序列用于设计适宜的引物以获得MECA32抗体的全长κ轻 链cDNA序列。首先，MECA32 mAb的全长κ链cDNA使用以下所列引物通过RT-PCR从MECA32 杂交瘤细胞的总RNA产生：
[0111] 正向引物：5'GATCCTGACATCCAGATGACCCAGACTCC3'（SEQ ID N0:29)，和
[0112] 反向引物：5' CACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3'（SEQ ID N0:30)。
[0113] 具有BamHI和Sal I限制性位点的纯化PCR片段插入在CK结构域的羧基末端具 有（His)6-标签的质粒载体pET26b中且这一质粒命名为pET26b-M32K (图3A)。
[0114] 第三步：MECA32-Fd-铰链-接头-TF cDNA的制备和插入pET26b质粒载体中
[0115] 我们首先使用来自MECA32杂交瘤细胞的cDNA模板和以下引物对通过PCR制备由 MECA32 mAb FcU铰链区加接头序列组成的cDNA :
[0116] 正向引物：5'GACATCCAGATGACCCAGACTCC3'（SEQ ID N0:31)，和
[0117] 铰链接头反向引物：
[0118] 5' AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGTACATCCACAAGGATTGCATTCC3' （SEQ ID N0:32)。
[0119] 接下来，我们使用克隆的hTF cDNA模板和以下引物对通过PCR制备由（Gly4Ser)3 接头序列和人组织因子细胞外结构域（AA. 33-251) (hTF)组成的cDNA :
[0120] hTF接头正向引物：
[0121] 5' GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG3' （SEQ ID NO:33)，和
[0122] TF 反向引物：5'CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3'（SEQ ID NO:34)。
[0123] 两种PCR产物通过重叠延伸连结。最终的融合PCR产物插入到pET_26b载体中。 这一载体命名为 pET26b-M32-Fd-TF (图 3A)。
[0124] 第四步：含MECA32 Fd-铰链-(Gly4Ser)3接头-TF和具有His-标签的MECA32 κ 轻链两者的双顺反子质粒载体的构建
[0125] 我们使用pET26b-M32-Fd-TF作为模板和以下引物对通过PCR产生DNA片段：
[0126] 26b-RBS-F:
[0127] 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3' （SEQ ID NO:35)，和
[0128] 26b-终止-R:
[0129] 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3' （SEQ ID NO:36)。
[0130] 这一 DNA片段包括核糖体结合序列（rbs)、MECA32 mAb重链的VHl和CH1、铰链区、 接头序列、hTF和终止密码子。这一片段然后插入pET26b-M32K的Xba I限制性位点中。整 个插入片段的序列使用染料-脱氧（dye-deoxy)方法通过DNA测序验证。这一质粒构建体 命名为 pET26b MECA32-Fab-TF (图 3B)并转化到大肠杆菌 SHuffle T7Express 菌株（New England Biolabs Corp.)中用于蛋白质表达。总结用于产生MECA32_Fab_TF的这一双顺序 子质粒表达载体的构建步骤的示意图显示于图3A和3B中。
[0131] MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体的Fab共表达人组织因子（MECA32-Fab-TF)的 产生
[0132] 为产生MECA32-Fab-TF，新鲜大肠杆菌培养物的集落（l-2mm)在30°C，230rpm下接 种到含有30 μ g/ml卡那霉素的4ml 2xYT培养基中过夜。第二天早晨，过夜培养物接种到 含有30μg/ml卡那霉素的400ml 2χΥΤ培养基中并继续在30°C，250rpm下生长。当600nm 的吸光度达到~〇. 6-0. 8时，添加异丙基β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG)到0. 4mM的最 终浓度用于诱导重组蛋白质产生。振摇在30°C下持续约20h。
[0133] 细胞通过在室温下以1000 Ox g离心20min收获并用于分离包涵体。细胞浆悬浮在 4ml 含有 150mM NaCl、ImM MgCl2、0. 17mg/mlPMSF 和 2mg/ml 鸡蛋清溶菌酶（Sigma)的 IOmM Tris/HCl, pH 7. 5中。添加 Benzonase (250单位；EM Science)且悬浮液在室温下温和地混 合1. 5小时，然后以12000x g离心15min。沉淀重悬浮在含有ImMEDTA和3% Nonidet P40 的 IOmM Tris/HCl，pH 7.5(2ml)中，以 50%功率超声处理 Imin 并以 12000g离心 20min。沉 淀重悬浮在水中，以50%功率超声处理20-30秒并以12000g离心20min。重复用水洗涤， 且高度富集包涵体的最终沉淀通过在室温下温和混合过夜而悬浮在含有6M盐酸胍、0. 5M NaCl、20mM磷酸盐和IOmM 2-巯基乙醇的缓冲液，pH 8中。溶液保持在室温下过夜，然后 在6M尿素/50mMTris/HCl，pH 8中稀释到约lmg/ml的蛋白质浓度并在4°C下针对10-20 体积的相同缓冲液透析过夜。然后，透析改变到含2M尿素、50mM Tris/HCl、300mM NaCl、 2.5mM GSH、0.5mM GSSG的缓冲液，pH 8(折叠缓冲液）中。在透析2天后，缓冲液用新鲜的 折叠缓冲液替换且透析再继续2天。接下来，透析缓冲液改变为IM尿素、50mM Tris-HCl、 300mM NaCl的缓冲液，pH8且透析再继续一天。透析然后在具有顺序降低的尿素浓度的相 同缓冲液中进行，〇. 8M尿素6小时，0. 56M尿素过夜和0. 28M尿素6小时。最后，透析在没 有尿素的折叠缓冲液中进行并持续过夜。重折叠的上清液加载到氮川三乙酸镍（Ni-NTA ;GE Healthcare)柱上并用 50mM 磷酸钠和 0· 3M NaCl，pH 7. 0 中的 500mM immidazol 洗脱。重 组 MECA32_Fab_TF 进一步通过 HiLoadl6/60Superdex 75 制备级（GE Healthcare)凝胶过 滤柱色谱纯化。含靶MECA32-Fab-TF的洗脱液通过SDS-PAGE分析并合并。MECA32-Fab-TF 通过ELISA表征以确认与小鼠 PLVAP的结合。MECA32-Fab-TF的组织因子特异性活性使用 显色TF分析测量。
[0134] 用于表达重组CSR02抗-人PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达水溶性人组织因 子（CSR02-Fab-TF)的质粒构建体的开发
[0135] 我们也产生与MECA32-Fab-TF类似的重组抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF蛋白。这 一蛋白质基于抗-人PLVAP mAb CSR02开发。这一重组蛋白质的结构基本上类似于如上所 述的MECA32-Fab-TF，除了不同的Ab结构域和在κ轻链的羧基端不存在His-标签外。除 去His-标签，因为his-标签不是CSR02-Fab-TF的纯化所需的。CSR02-Fab-TF通过使用 抗-人 κ 轻链KappaSelect 亲和柱色谱（GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 纯化。CSR02mAb是抗人PLVAP的人源化单克隆抗体。
[0136] 用于制备产生CSR02-Fab_TF的质粒构建体的过程类似于制备用于 MECA32-Fab-TF的质粒构建体而具有一些改变。先前对于克隆cDNA以获得抗体重链和轻 链5' -端的DNA序列所描述的第一步省略，因为CSR02mAb重链和轻链的cDNA序列是早已 知道的。因此，仅需要三个步骤来制备CSR02-Fab-TF表达构建体。这三个步骤描述如下。
[0137] 第一步：CSR02 mAb轻链cDNA插入pET26b质粒载体中
[0138] 来自产生CSR02 mAb的NSO细胞系的总RNA使用寡-dT作为引物反转录为cDNA。 CSR02的κ轻链cDNA使用寡-dT引发的cDNA作为模板和以下所示的引物对通过PCR产 生：
[0139] CSR02-VK3F-26b F Nde I 正向引物：
[0140] 5'TATGGATGTTGTGATGACCCAATCTCCA 3' （SEQ ID NO:37)
[0141] κ-R-26b_Not I 反向引物：
[0142] 5，GGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTG 3, （SEQ ID NO:38)。
[0143] 纯化的CSR02mAb轻链的PCR DNA片段然后插入质粒载体pET26b的Nde I和Not I位点中以产生pET26b-cVK3。
[0144] 第二步：插入有用于表达由CSR02 mAb的VHUCHl和铰链区加上（Gly4Ser)3接头 区域和人组织因子的细胞外结构域（AA. 33-251) (hTF)构成的融合多肽的cDNA的pET26b 质粒构建体的构建
[0145] 这一质粒使用从NSO细胞系制备的cDNA和克隆的人组织因子cDNA作为模板通过 PCR构建。以下的引物对用于PCR :
[0146] I)用于CSR02mAb重链的VHl-CHl-铰链区和接头区域的引物对：
[0147] VH5-pro26b-NdeI_F 正向引物：
[0148] 5'TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG 3' （SEQ ID N0:39)，和
[0149] 铰链接头R:
[0150] 5'AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGCATGATGGGCATGGGGGACC 3' （SEQ ID NO:40).
[0151] II)用于接头序列-hTF-加用于插入的限制性位点的引物对：
[0152] hTF 接头 F:
[0153] 5'GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG 3' （SEQ ID N0:41)
[0154] hTF R-Not I:
[0155] 5'GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG 3' （SEQ ID N0:42)。
[0156] 从如上所述的这两个PCR反应产生的PCR片段进一步融合并通过重叠延伸进行扩 增。融合的cDNA插入pET26b质粒载体中，其命名为pET26b-VH5-Fd-TF。
[0157] 第三步：含用于CSR02 mAb Fd-铰链-(Gly4Ser)3接头-TF和CSR02 mAb κ轻链两 者的cDNA的双顺反子质粒载体的构建
[0158] 我们使用作为模板的pET-26b-VH5-Fd-TF和以下引物对通过PCR产生DNA片段：
[0159] 26b-RBS-F:
[0160] 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3' （SEQ ID N0:43)，和
[0161] 26b-终止-R:
[0162] 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3' （SEQ ID N0:44)。
[0163] 扩增的DNA片段包括核糖体结合位点（rbs) ;CSR02重链的VHl、CHl和铰链序列； 接头序列；可溶性人组织因子；和终止密码子。这一 DNA插入pET26b-cVK3载体的Xba I位 点中以得到新的双顺反子质粒载体，命名为pET26b CSR02-Fab-TF(图4)。这一质粒用于 在单一启动子的控制下表达κ轻链和融合重链。整个插入片段的序列使用染料-脱氧方 法通过DNA测序验证。
[0164] 重组CSR02抗-人PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达水溶性人组织因子 (CSR〇2_Fab_TF)的产生
[0165] 重组 CSR02_Fab_TF 蛋白质的表达。大肠杆菌 Shuffle T7Express (New England Biolabs)的转化通过将感受态细胞与pET-26b CSR02-Fab-TF质粒DNA -起在冰上孵育 5min，在42°C水浴中精确地加热30秒和随后置于冰上2分钟来进行。在接种到选择性培养 基上之前，转化体在30°C下孵育，同时与SOC培养基（0. 5%酵母提取物、2%胰蛋白酶化蛋 白胨、IOmM NaCl、2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgS04、20mM 葡萄糖）以 250rpm 振摇 60min。 CSR02-Fab-TF的表达在30°C或37°C下用0. 05mM的异丙基-β -D-硫代半乳吡喃糖苷诱导 16小时。在诱导后，细菌细胞在室温下在溶菌酶和Benzonase核酸酶存在下通过具有0. 2% Tween 80的lx PBS进行裂解2小时。细胞裂解产物通过在4°C下以1000 Orpm离心30分 钟收获。收集上清液并过滤以分离可溶性部分。
[0166] CSR02_Fab_TF 通过 KappaSelect 和 Capto AdhereMmultimodal 柱色谱纯化。 KappaSelect柱（Iml)用磷酸盐缓冲盐水（PBS)，pH 7. 4(0.0 lM磷酸盐缓冲液，0.0027M KC1，0. 14M NaCl)平衡。含有CSR02-Fab-TF的大肠杆菌细胞裂解产物以lml/min的流率加 载。在应用样品后，柱用平衡缓冲液洗涤直到0D280降低到基线。结合的蛋白质的其余部 分用含有〇. 25M蔗糖的0.1 M甘氨酸缓冲液，pH 2. 7洗脱。洗脱液立即通过添加每1ml洗 脱液50 μ 1的IM Tris-基础缓冲液，pH 9. 0调节到生理pH。
[0167] 从KappaSelect 柱洗脱的 CSR02-Fab-TF进一步用 20mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 预平 衡的 Capto Adhere 柱（5ml)纯化。从 KappaSelect 柱洗脱的 CSR02-Fab_TF 样品用 20mM Tris缓冲液，pH 7. 5稀释50倍并随后以lml/min的流率加载到Capto Adhere柱上。在应 用样品后，柱用平衡缓冲液洗涤直到0D280降低到基线。结合的CSR02-Fab-TF蛋白然后用 含有200mM NaCl的20mM Tris缓冲液，pH 7. 5洗脱。
[0168] 可溶性重组人和小鼠 PLVAP蛋白（hPLVAP和mPLVAP)的产生
[0169] (hPLVAP)的产生。质粒 pGEM'T Easy - hPLVAP51_442通过插入代表截 短的PLVAP (构成小鼠 PLVAP细胞外结构域的氨基酸残基51-442)的PCR片段到 pGEM?-T Easy载体（Promega)中产生。这一 PCR片段使用以下引物对通过PCR从人 PLVAP(NM_031310)的 cDNA 克隆（OriGene, Rockville, MD)产生：
[0170] 5' - |CATATG| aACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3' (SEQ ID NO:45)，和
[0171] 5? - 0GATCC| TGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3? (SEQ ID NO: 46)。
[0172] 为构建质粒pET-15b-hPLVAP51-442以产生重组PLVAP蛋白，在末端具有Ndel/Bam HI识别序列（加框的序列）的编码PLVAP的氨基酸残基51-442的cDNA片段从pGEM?-T Easy - hPLVAP51_442切割并插入pET-15b (Novagen)中。上述表达构建体通过DNA测序验证 并转化到大肠杆菌（R〇setta_gami2(DE3)pLysS)(EMD Millipore Corp.)中。
[0173] 如以下所述产生和纯化带His-标签的hPLVAP融合蛋白。来自新鲜培养物的转化 的大肠杆菌的集落（l -2mm)在37°C下以230rpm接种到含有100 μ g/ml氨节青霉素、34 μ g/ ml氯霉素、12. 5 μ g/ml四环素的4ml TB培养基中过夜。过夜培养物接种到含有100 μ g/ ml氨苄青霉素、34 μ g/ml氯霉素、12. 5 μ g/ml四环素的400ml TB培养基中并在37°C下以 250rpm继续生长。当600nm的吸光度达到约0. 6~0. 8时，添加异丙基β -D-I-硫代半乳 吡喃糖苷（IPTG)到I. 66mM的最终浓度以诱导蛋白质产生。在30°C下继续振摇约20h。细 胞通过在4°C下以1000 Og离心30分钟收获。细胞沉淀重悬浮在12ml补充有8M尿素的平 衡-洗涤缓冲液（50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7，10mM imidazol)中并储存在-20°C下至 少2小时。解冻的样品超声处理10秒，各次超声处理之间具有30秒中断以降低粘度直到 其变成透明的。细胞悬浮液在4°C下以10, 000 - 12, OOOx g离心20min以使任何不溶性材 料成团。来自前一步骤的上清液应用于用补充有8M尿素的10倍柱体积平衡-洗涤缓冲液 平衡的TALON树脂柱（Clontech)。在用10-20倍柱体积的IX平衡-洗涤缓冲液洗涤柱后， 重组的带聚组氨酸标签的人PLVAP蛋白质用5倍柱体积的含6M尿素的洗脱缓冲液（50mM 磷酸钠、300mM NaCl，pH 7、500mM imidazol)洗脱。洗脱液中纯化的重组蛋白质在4°C下 针对含3M尿素的IX平衡/洗涤缓冲液透析至少4小时，然后缓冲液改变为含IM尿素的 IX平衡-洗绦缓冲液并在4°C下透析至少4小时。蛋白质浓度用Bradford染料结合分析 (Bi〇-Rad，Hercules，CA)测定。蛋白质然后在23°C下用每mg重组PLVAP蛋白1单位生物 素化凝血酶（Novagen)消化16小时以除去聚组氨酸-标签。生物素化凝血酶通过固相链 霉亲和素-琼脂糖从孵育除去。所得的重组水溶性人PLVAP (hPLVAP)针对没有尿素的IX 平衡-洗涤缓冲液（50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7)透析。测定蛋白质浓度且蛋白质通过 SDS-PAGE分析纯度（图5)。
[0174] mPLVAP(小鼠 PLVAP)的产生。质粒 pGEM-T Easy-mPLVAP48_438通过插入代表 截短的PLVAP (构成小鼠 PLVAP的细胞外结构域的氨基酸残基48-438)的PCR片段到 pGEM^'-T Easy载体（Promega Corp.)中而产生。这一 PCR片段使用以下引物对通过 PCR 从小鼠 PLVAP 的 cDNA 克隆（Invitrogen, Life Technologies Corp.)制备：
[0175] mPLVA P CDS NdeI F:
[0176] 5'CATATGTATGGCAATGTGCACGCCACC3'（SEQ ID N0:47)，和
[0177] mPLVAP 终止 Xho I R:
[0178] 5' CTCGAGATCCACAGGTGGGCGATTCTGGC3' （SEQ ID N0:48)。
[0179] 接着，在各末端含有NdeI和XhoI识别序列的编码PLVAP的氨基酸残基48-437 的 cDNA 片段从 pGEM?-T Easy-mPLVAP48_438切割并插入 pET-15b (Novagen-EMD Millipore, Darmstadt, Germany)中用于蛋白质表达。在通过DNA测序验证后，这一表达 构建体转化到大肠杆菌（R〇setta_gami2(DE3)pLysS)中。大肠杆菌Rosetta_gami2(DE3) pLysS中带His-标签的融合mPLVAP蛋白的表达在30°C下用ImM异丙基-β -D-硫代半乳 吡喃糖苷诱导16小时。在诱导后，细菌细胞通过在补充有8Μ尿素的平衡缓冲液（50mM磷 酸钠、300mM NaCl，pH 7)中超声处理进行裂解并通过在4°C下以15,652x g离心30分钟分 离成可溶性和不溶性部分。为纯化His-PLVAP48_438蛋白质，可溶性部分加载到TALON? Metal Affinity Resin (Clontech, Palo Alto, CA)上并用洗脱缓冲液（50mM 磷酸钠、300mM NaCl，pH 7, 500mM imidazole)洗脱。洗脱液中所得的小鼠 PLVAP48_438蛋白质针对PBS透析。 纯化的His-mPLVAP的SDS-PAGE分析显示于图5中。
[0180] 通过ELISA对CSR02-Fab-TF和MECA32-Fab-TF与相应人和小鼠 PLVAP的结合的 研宄
[0181] 为了确保重组抗-PLVAP-Fab-TF蛋白可以结合人或小鼠 PLVAP蛋白，开发和使 用了 ELISA分析。首先，ELISA板的各孔在4°C下用50 μ I PBS-叠氮化物（0.02% )中的 2. 5 μ g/ml人或小鼠重组PLVAP蛋白涂覆。之后，分析在室温下进行。在各孔用150 μ 1洗 涤缓冲液（含〇· 2% Tween-20的PBS)三次洗涤后，各孔用150 μ 1封闭缓冲液（含0· 2% BSA和0. 05 % Tween-20的PBS)封闭30分钟。在三次洗涤后，50 μ 1的抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF或抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF以不同的浓度一式两份添加到各孔中。所 有孔孵育45分钟并洗涤三次。洗涤的孔然后与在封闭缓冲液中1:500稀释的50 μ 1生物 素化抗-人TF抗体（R&D Systems Corp.)孵育45分钟。在三次洗涤后，各孔与5000χ稀 释的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物孵育30分钟。各孔然后与100 μ 1碱性磷酸酶底物孵 育60分钟并在微读板仪中405nm下测量各孔的吸光度。
[0182] 分析也改变成竞争结合分析。对于竞争结合分析，提高浓度的抗-PLVAP抗体或 Fab-TF与最佳量的生物素化抗-PLVAP单克隆抗体一起孵育以竞争与PLVAP的结合。在孵 育和洗涤后，与PLVAP结合的生物素化抗体用链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物和显色底物 定量。
[0183] 人组织因子活性的显色分析
[0184] 重组 CSR02-Fab-TF、MECA32-Fab-TF 和与人 TF 交联的 MECA32mAb 的 TF 活性使用 显色分析测量。这一分析基于TF与因子Vila的结合及TF/FVIIa复合物激活因子X(FX) 的能力。TF活性直接通过产生的FXa的量定量。产生的FXa随着405nm下吸光度的增加 按照对-硝基苯胺（PNA)从FXa特异性显色肽底物的释放而动态地测量。TF活性针对商 用水溶性重组TF标准（R&D systems Corp.)确定。显色TF活性分析基于由PhiIipp等报 告的方法。参见 Philipp J, Dienst A, Unruh Maike 等 "Soluble tissue factor induces coagulation on tumor endothelial cells in vivo if coadministered with low-dose lipopolysaccharides"Arte;rioscle;r Thromb Vase Biol. ;23:905_910(2003) 〇
[0185] SCID小鼠中的H印3B HCC异种移植物模型
[0186] !fep3B是人HCC细胞系。为了证明抗-PLVAP Fab-TF的治疗效力，我们在BALB/c C.B-17SCID小鼠中建立HEP3B异种移植物模型。！fep3B HCC异种移植物通过在用异氟烷吸 入全身麻醉下皮下注射4百万!fep3B细胞到5周龄雄性C. B-17SCID小鼠的右上肢内侧建 立。细胞悬浮在60 μ 1溶解于无血清的达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基（DMEM) (Life Technologies Corp.)中的冰冷 75% BD Mtrigel?(BDBioscience Corp.)中。注射 通过使用29号胰岛素注射器进行。
[0187] 用于注射的H印3B细胞培养在含有10%胎牛血清、1% GLUTA-MAX、1%抗生素-抗 霉菌剂和1% HEPES的DMEM中培养。所有试剂购自Life Technologies。用于注射的细胞 在它们达到80%汇合时收获。使用来自Life Technologies的胰蛋白酶-EDTA溶液按照制 造商的说明使细胞从培养瓶脱离，且肿瘤细胞在悬浮于用于注射的冰冻75% BDMtrigel? 中之前用DMEM洗涤一次。在注射后，小鼠常规地监测肿瘤异种移植物的生长。正常地，花 费五至六周的时间使得肿瘤变成可用于研宄。
[0188] 抗-PLVAP Fab-TF输注到给肿瘤供血的动脉中
[0189] 对于H印3B肿瘤异种移植物用抗-PLVAP MECA32-Fab-TF的治疗，携带H印3B肿瘤 异种移植物的小鼠使用MATRX?麻醉仪通过吸入异氟烷进行麻醉。小鼠在解剖显微镜下置 于仰卧体位。右腹股沟区域的毛发在输注前一天用Nair脱毛剂（Church&Dwight Co.)除 去。在用75%乙醇清洁皮肤后，0.5cm切口在肿瘤上方的右腹股沟区域形成。加深创口以 暴露右股动脉和静脉。然后右股动脉用6-0尼龙绳环绕。动脉轻柔地向近端拉出。用微型 剪在拉出处远端进行动脉切开术，且细33号针插入远端侧中。MECA32-Fab-TF或对照抗体 以每分钟约40 μ 1的速率缓慢输注。注射在密切观察下进行以确保没有泄漏。在输注后， 将针抽回。动脉切开位点用Histoacryl (TissueSeal, AnnArbor, MI)密封。除去用于拉出 的尼龙绳。在确认足够的止血后，切开伤口用连续缝合封闭。
[0190] 用于测量肿瘤体积和血流的3D超声检查和能量多普勒
[0191] Vevo 2 I 0 0 H i g h - R e s 〇 I u t i ο n Imaging System(Visual Sonics, Inc. ,Toronto, Canada)用于按照制造商的说明获得3D肿瘤图象。肿瘤的三个垂 直维度通过获取以下测量值确定。首先测量沿肿瘤X和Y轴的最大截面积上的两个垂直维 度。然后使用零售商提供的软件测定沿垂直于X和Y维度的Z轴的最大尺寸。肿瘤体积 使用以下对于椭圆物体的公式确定：体积=π /6x长度X宽度X高度。肿瘤血流图象按照 Vevo 2100High_Resolution Imaging System 的手册使用 3D 能量多普勒获取。
[0192] MECA32-Fab-TF 和 CSR02-Fab-TF 结合亲和力的测量
[0193] 用于测定抗-PLVAP-Fab-TF和靶PLVAP之间的结合亲和力的分析如前面章节所 述是基于显色TF活性分析。简而言之，ELISA板的各孔涂覆2. 5 μ g/ml水溶性重组人或小 鼠 PLVAP过夜。在如对于研宄CSR02-Fab-TF和MECA32-Fab-TF与PLVAP的结合的ELISA 所述洗涤和封闭后，涂覆有人或小鼠 PLVAP蛋白的孔与50 μ 1的0. 3125、0. 625、1. 25、2. 5、 5和10 μ g/ml的提高浓度的CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF -式两份孵育。在室温下孵 育3小时后，孔进行洗涤并使用如先前章节对于显色TF活性分析所述的TF标准曲线测定 孔中结合的TF活性的量。添加到各孔中的总CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF的浓度是已 知的且各孔中结合的CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF的浓度可以从分析结果计算。这些数 值然后使用Scatchard作图分析进行分析以确定CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF的结合 亲和力。参见，例如 Scatchard G. "The attractions of proteins for small molecules and ions"Ann NY Acad Sci. 51:660-672(1949) 〇
[0194] 使用MECA32抗-PLVAP单克隆抗体的HEP3B肿瘤异种移植物中PLVAP的免疫组织 化学（IHC)染色
[0195] 为研宄小鼠 Hep3B异种移植物中PLVAP的表达，甲醛固定的石蜡组织块的切片进 行处理以用于通过抗-PLVAP单克隆抗体的免疫组织化学染色。在按照常规程序组织脱 石蜡和再水化后，具有载体中的组织切片的载玻片置于烧杯中并浸入Target Retrieval Solution(Dako，Inc.Carpinteria，CA)中。烧杯置于高压蒸锅中并在121°C下加热10分 钟。在冷却后，载玻片转移到蒸馏水中。各载玻片上的切片然后用VentanaiView DAB检测 试剂盒（Ventana Medical Systems, Inc.)中的200-400 μ 1过氧化氢处理以淬灭内源性过 氧化物酶。在用Tris-缓冲盐水（TBS) (Dako)清洗载玻片后，切片在37°C下与含有0. 1% 胎牛血清的TBS(TBS-BSA)中稀释的5 yg MECA32抗-PLVAP单克隆抗体孵育60分钟。在 通过将载玻片浸没在TBS缓冲液中5分钟洗涤三次后，切片在室温下与按照供应商的推荐 稀释的生物素化二级抗体（例如，对于MECA32 mAb的生物素化山羊抗-大鼠 IgG)孵育15 分钟。载玻片上的切片如上所述类似地洗涤。载玻片上的切片与试剂盒中新制备的DAB 底物孵育30分钟。载玻片用蒸馏水清洗几次。在用Gill's苏木精溶液复染15秒后，载玻 片用TBS清洗，之后用蒸馏水清洗。在空气干燥切片后，切片用Permount介质和盖玻片覆 盖。
[0196] 结果
[0197] HCC和HEP3B异种移植物中的PLVAP表达
[0198] 我们早先的研宄显示PLVAP在HCC的血管内皮细胞上而不在非肿瘤性肝组织的血 管内皮细胞中差异表达。PLVAP的差异表达提供了为治疗目的靶向于HCC的可能。我们设 想使用抗-PLVAP单克隆抗体或其Fab片段作为共表达血液凝结触发组织因子蛋白的载体 而用于HCC治疗的新途径。据信这种治疗剂输注到给肿瘤供血的动脉中导致这种治疗抗体 或其Fab片段与HCC的血管内皮细胞结合，触发肿瘤血管中的血凝块形成和导致肿瘤的缺 血性坏死。
[0199] 为证明这一途径的可行性，我们使用HEP3B HCC细胞系在SCID小鼠中建立人HCC 异种移植物模型。我们然后通过使用MECA32抗-小鼠 PLVAP mAb的免疫组织化学（IHC)染 色确定血管内皮细胞是否生长到表达小鼠 PLVAP的HEP3B肿瘤异种移植物中。如图6B中 所示，SCID小鼠中HEP3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞事实上如人HCC -样表达PLVAP。 因此，HEP3B异种移植物可以用于研宄以证明与人组织因子偶联的抗-PLVAP mAb或其Fab 片段的抗肿瘤效应。
[0200] 与可溶性人TF偶联的MECA32 mAb对HEP3B异种移植物的作用
[0201] 首先，我们用与重组水溶性人组织因子偶联的MECA32 mAb(MECA32-TF)治疗携带 HEP3B异种移植物肿瘤的SCID小鼠。使用了人TF，因为人TF在人和小鼠两者中有效地触发 血液凝结，且人TF的cDNA可商购得到。各携带肿瘤的小鼠通过在解剖显微镜下输注100 μ 1 磷酸盐缓冲盐水（PBS)中的24 μ g MECA32-TF (治疗组）或20 μ gMECA32 mAb (对照组）到 给肿瘤供血的右股动脉中进行处理。略低量的MECA32 mAbOOyg)用于针对较高分子量 的MECA32-TF进行调节。3D能量多普勒用于在处理前和处理后48小时评估肿瘤血流。结 果显示治疗组中MECA32-TF处理后肿瘤内血流信号的显著降低而在对照组中没有降低（图 7)。肿瘤生长的后续监测显示MECA32-TF处理组中肿瘤生长的显著抑制而在对照组中没有 抑制（图8)。本研宄的结果证实，与人TF偶联的抗-PLVAP单克隆抗体有效地治疗HCC异 种移植物。
[0202] MECA32-Fab_TF 的产生和表征
[0203] 对于TF与MECA32 mAb的化学交联，困难的是一致地和可重现地控制与MECA32 mAb交联的TF蛋白质分子数目和位点。通过化学交联制备的MECA32-TF不产生均一的产 物。MECA32-TF偶联物的高分子量（大约170kDa)也导致长的循环半衰期，使得引起不良副 作用的可能性增加。
[0204] 为了得到具有较短半衰期的结构上明确限定的均一治疗生物制品以限制脱靶 副作用，我们开发了由抗-PLVAP mAb的Fab部分和与重链恒定结构域1的羧基端连 接的人组织因子的细胞外结构域组成的新的重组蛋白质。我们然后制备抗-鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF重组蛋白质（MECA32-Fab-TF)。描绘这一重组蛋白质的结构的示意图显示 于图9中。
[0205] 纯化的MECA32-Fab-TF用于与生物素化MECA32 mA竞争结合小鼠 PLVAP。这些 结果表明MECA32-Fab-TF事实上保留其结合PLVAP的能力（图10)。六个不同批次的 MECA-32-Fab-TF的Scatchard分析也显示对小鼠 PLVAP的高结合亲和力，Kd为5. 7±1. 4x 10-8Μ。连接在MECA32Fd的羧基末端的TF也是功能性的且可以与因子Vila相互作用以激 活因子X。测量的组织因子特异性活性为每毫克MECA32-Fab-TF 90±22 μ g(n = 6)。
[0206] MECA32-Fab-TF对SCID小鼠中HEP3B肿瘤异种移植物的作用
[0207] 为证明重组MECA32-Fab_TF的治疗效果，我们首先进行两项剂量-反应研宄。对 于这两项研宄，MECA32-Fab-TF输注到给肿瘤供血的股动脉中。治疗后72小时，处死治疗的 小鼠并收获肿瘤用于组织学检验。对于第一项研宄，三个不同剂量的MECA32-Fab-TF(3yg、 6yg和12yg)用于治疗携带肿瘤的小鼠且对照组用12yg不含组织因子的MECA32单克 隆抗体处理。每个剂量有三只小鼠。对于第二项研宄，所使用的MECA32-Fab-TF剂量是 2. 5 μ g、5 μ g和10 μ g。每个剂量有两只小鼠。这两项研宄的结果总结和显示在图11和12 中。这些研宄的结果揭示，来自用MECA32-Fab-TF治疗的小鼠的肿瘤在所有剂量下发生大 量缺血性坏死。但是，IOyg或更高的剂量产生更一致的结果。在对照组中没有观察到或观 察到极少的肿瘤坏死。这些研宄的结果表明抗-PLVAP-Fab-TF是非常强效的且可以在72 小时内以低至2. 5 μ g/小鼠的剂量诱导显著的缺血性肿瘤坏死。
[0208] 抗-mPLVAP MECA32-Fab-TF在输注后不同时间点对HEP3B肿瘤异种移植物的组织 学的影响
[0209] 如上所述的研宄显示治疗后72小时肿瘤发生明显的缺血性坏死。为了了解坏死 如何在用抗-mPLVAP Fab共表达TF治疗后诱导，我们输注MECA32-Fab-TF到给肿瘤供血的 动脉中并在输注10 μ g MECA32-Fab-TF后的2小时、4小时、24小时、48小时和72小时收获 HEP3B肿瘤。在各时间点有两只携带肿瘤的小鼠。在这一试验的同一天也处死两只未处理 的小鼠以作为〇时基线对照。
[0210] 如图13A中所示，我们的结果揭示，肿瘤血管中的纤维蛋白血栓块可以在治疗后2 小时发现。含纤维蛋白血栓块的血管的数目在治疗后4小时和24小时变得更显著。肿瘤 细胞在4小时时开始彼此分离而具有更大的清晰空间，且这一变化在24小时时变得更明显 (图13B)。具有核染色损失的明显缺血性坏死在处理后48小时观察到且在72小时变得 更显著（图13A和13B)。在处理前（0小时）肿瘤血管中没有观察到纤维蛋白血栓块（图 13A)。能量多普勒研宄也揭示在输注后2小时主要肿瘤血管中血流的终止并持续到72小 时（图14)。这些发现证实抗-PLVAP-Fab-TF事实上可以结合肿瘤血管内皮细胞的PLVAP， 在肿瘤血管中诱导血凝块形成，产生血流的阻断和引起肿瘤坏死。
[0211] 抗-PLVAP MECA32-Fab-TF对HEP3B肿瘤异种移植物生长的影响
[0212] 接下来，我们研宄抗-PLVAP Fab-TF治疗对肿瘤生长的治疗效果。进行了两项不同 的研宄。第一项研宄是在治疗后监测肿瘤生长25天。该研宄在治疗后25天终止，因为对 照组中肿瘤的大尺寸使得必须停止研宄。肿瘤尺寸使用3D-超声检查监测。总结于图15、 16A和16B中的结果显示，单次输注5 μ g或10 μ g的MECA32-Fab-TF有效地抑制肿瘤生长， 但10 μ g无 TF的对照MECA32抗体不抑制肿瘤生长。
[0213] 对于第二项研宄，携带HEP3B肿瘤异种移 植物的SCID小鼠用动脉内输注的10 μ g MECA32-Fab-TF(n = 4)或10 μ g MECA32单克隆抗体（η = 2)治疗。肿瘤生长用3D超声检查 监测。当ΗΕΡ3Β肿瘤生长到大约2000立方毫米时，处死携带肿瘤的小鼠。这一研宄允许我们 评估治疗组中肿瘤生长的延迟。图17中总结的结果显示在单次输注10 μ gMECA32-Fab-TF 到给肿瘤供血的动脉中后存在肿瘤生长的显著延迟。治疗组中的肿瘤与对照小鼠相比多 花费42天生长到1600mm3。对照组和治疗组之间肿瘤生长到1600mm 3的平均天数分别是 9. 8±3. 0 天和 51. 8±3· 2 天（图 17)。
[0214] 总之，这两项不同研宄的结果进一步证实抗-PLVAP-Fab-TF输注到给肿瘤供血的 动脉中有效地诱导肿瘤坏死和控制肿瘤生长。
[0215] 抗-PLVAP-Fab-TF的系统性施用对肿瘤生长的作用
[0216] 为了了解MECA32-Fab_TF通过外周静脉的系统性施用是否也可以实现相同的治 疗效果，我们将10 μ g或20 μ g的MECA32-Fab-TF注射到携带HEP3B肿瘤异种移植物的 SCID小鼠的尾静脉中并监测注射后的肿瘤生长。对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水注射。各治疗 组具有三只小鼠。表17中总结的结果显示，当MECA32-Fab-TF通过尾静脉施用时，对肿瘤 体积没有统计学显著的效果。因此，抗-PLVAP MECA32-Fab-TF输注到给肿瘤供血的动脉中 是诱导肿瘤坏死和实现治疗效果必需的。有可能MECA32-Fab-TF的系统性施用导致注射的 MECA32-Fab-TF的稀释和在到达肿瘤血管前MECA32-Fab-TF与其它器官（例如，肺、肾和胃 肠器官）的血管内皮细胞上的PLVAP结合。
[0217] 抗-人PLVAP Fab-TF的产生和表征
[0218] 为了 了解相似的治疗剂是否可以针对人PLVAP产生，使用针对存在于人PLVAP 羧基末端的氨基酸序列PPAGIPVAPSS中的抗原性表位的人源化抗-人PLVAP单克隆抗 体。这一人源化抗-人PLVAP单克隆抗体是先前开发的并描述于美国专利申请公开 No. US20110262349A1 中。这一抗-人 PLVAP-Fab-TF 偶联物命名为 CSR02-Fab-TF (图 9)。 我们然后进行一系列研宄以比较CSR02-Fab-TF与MECA32-Fab-TF的组织因子特异性活 性和与靶PLVAP的结合亲和力。我们的研宄结果显示抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF表现 为与抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF相比具有每毫克抗-PLVAP Fab-TF的更高TF活性 且CSR02-Fab-TF和MECA32-Fab-TF两者具有相似的结合亲和力（表1)。该发现表明， CSR02-Fab-TF如MECA32-Fab-TF -样可以以足够的亲和力结合其PLVAP靶标且携带足以启 动血液凝结的TF活性以实现治疗效果。
[0219] 表 L 抗-人 PLVAP CSR02-Fab-TF 和抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF 之间每毫克 抗-PLVAP Fab-TF的组织因子（TF)特异性活性和与PLVAP的结合亲和力的比较。
[0220]
[0222] 如表1中总结的，研宄了三个不同批次的CSR02-Fab_TF和六个不同批次的 MECA32-Fab-TF。结果显示两种Fab-TF具有相似的结合亲和力。然而，CSR02-Fab-TF具有 比MECA32-Fab-TF更高的特异性TF活性。结果指示，CSR02-Fab-TF具有足够的结合亲和 力和组织因子特异性活性以实现如MECA32-Fab-TF-样的治疗肝细胞癌的治疗效果。
[0223] 基于我们的Hep3B异种移植物模型中治疗时的平均肿瘤体积和有效诱导肿瘤坏 死所需的MECA32-Fab-TF剂量，我们估计抗-PLVAP-Fab-TF通过输注到给肿瘤供血的动脉 中以治疗HCC的有效治疗剂量为每毫升（立方厘米）15 μ g-100 μ g。
[0224] 为进一步证明产生的CSR02-Fab_TF可以结合人HCC的血管内皮细胞，我们使 CSR02-Fab-TF生物素化并使用这一 Fab-TF研宄其与人HCC的血管内皮细胞的结合。我们的 研宄结果显示生物素化的CSR02-Fab-TF事实上结合HCC的血管内皮细胞且不结合非肿瘤 性肝组织的血管内皮细胞（图18)。这一研宄的结果证实CSR02-Fab-TF如MECA32-Fab-TF 一样可通过输注到给肿瘤供血的动脉中用于治疗患者的HCC。
[0225] 基于PLVAP在HCC的血管中和不在非肿瘤性肝组织中差异表达的知识，我们开发 了用于通过共表达抗-PLVAP单克隆抗体或其Fab片段上的人组织因子蛋白治疗HCC的新 的治疗剂。我们证明携带人组织因子的可溶性细胞外结构域的完整抗体及其Fab片段事实 上都可以在单次输注到给肿瘤供血的动脉中后诱导肿瘤坏死和抑制肿瘤生长。
[0226] 因为可溶性组织因子与抗-PLVAP抗体的化学偶联不能再现地控制相同数目组织 因子在相同位点与各抗体交联，因此我们建立重组的具有Fd链的羧基末端的抗-PLVAP 单克隆抗体Fab片段共表达人组织因子细胞外结构域，并使用这一重组蛋白作为治疗HCC 的治疗剂。为证明这种治疗剂事实上可以用于治疗HCC，首先建立携带源自HEP3B人肝 细胞癌细胞系的肿瘤的SCID小鼠并用于概念验证（proof-of-conc印t)研宄。我们然 后使用MECA32抗-小鼠 PLVAP杂交瘤产生抗-PLVAP-Fab-TF的小鼠形式。有必要开发 抗-PLVAP-Fab-TF的小鼠形式，因为生长到人HCC异种移植物中的血管来源于小鼠并表达 小鼠 PLVAP。我们表达抗-PLVAP Fab-TF的人和小鼠形式上的人组织因子，因为人组织因 子可以激活小鼠凝血因子VII并在小鼠中诱导血液凝结。我们进行的CSR02-Fab-TF和 MECA32-Fab-TF之间的对比研宄确认它们都可以以足够的亲和性结合其PLVAP靶标并携带 足够的组织因子活性以触发血液凝结和实现治疗效果。
[0227] 我们的研宄结果证明我们开发的重组抗-PLVAP-Fab-TF具有用于在将这一新型 治疗剂直接输注到给肿瘤供血的动脉中而非经外周静脉的系统性静脉内施用后通过触发 肿瘤血管中血凝块的形成、阻断肿瘤血流和诱导肿瘤坏死来治疗HCC的治疗效果。本申请 中描述的研宄也证实抗-人PLVAP单克隆抗体或其Fab片段共表达组织因子蛋白可以用于 治疗显示PLVAP表达限制于肿瘤血管的肿瘤（如成胶质细胞瘤）。
[0228] 应当理解，对于本申请中描述一些参数的所有数字边界限定，如"约"、"至少"、"小 于"和"大于"，所述描述也必然地包括以所述值为界的任何范围。因此，例如，至少1、2、3、 4或5的描述也尤其记述1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5和4-5的范围等。
[0229] 对于本文中引用的所有专利、申请或其它参考文献，如非专利文献和参照序列信 息，应当理解其为所有目的以及对于所引用的主题通过引用并入。在其中通过引用并入的 文献和本申请之间存在冲突的情况中，以本申请为准。与本申请中公开的参照基因序列相 关的所有信息，如Gene ID或登录号（通常指NCBI登录号），包括例如基因组基因座、基因 组序列、功能注释、等位基因变体及参照mRNA(包括，例如，外显子边界或反应元件）和蛋 白质序列（如保守结构域结构、Homologene类目等等）以及化学基准（例如，Pub Chem化 合物、Pub Chem物质或Pub Chem Bioassay类目，包括其中的注释如结构和分析等等），通 过引用全文并入本文。
[0230] 用于本申请中的标题仅为方便的目的而不影响本申请的解释。
[0231] 本发明提供的各方面的优选特征可加以必要变更以应用于本发明的所有其它方 面，且通过（不限于）从属权利要求示例，并且也包括本发明特定实施方式和方面（包括工 作实施例）的单个特征（例如，元件，包括数值范围和示例性实施方式）的组合和排列。例 如，工作实施例中示例的特定实验参数可以适应用于要求保护的发明点而不脱离本发明。 例如，对于所公开的材料，尽管这些化合物的各不同单个化合物及总体的组合和排列中的 特定指称可以不明确地公开，但其在本文中各自具体地设想和描述。因此，如果元素 A、B 和C的类以及元素 D、E和F的类和元素 A-D的组合实例被公开，则即使各元素未单独地阐 述，则其各自单独地或总体地设想到。因此，在这一实例中，特别地设想组合a-e、a-f、b-d、 B-E、B-F、C-D、C-E和C-F的各组合并应当认为其从A、B和C ;D、E和F及示例组合A-D的 公开中公开。类似地，这些中的任何亚集或组合也特别地设想和公开。因此，例如，A-E、B-F 和C-E的亚组特别地设想到并应当认为其从A、B和C ;D、E和F及示例组合A-D的公开中 公开。这一概念适用于本申请的所有方面，包括物质组合物的元素和制备或使用该组合物 的步骤。
[0232] 如本领域普通技术人员按照本说明书的教导所认识的，本发明的前述方面可以以 任何组合或排列主张以达到相对于现有技术新颖和非显而易见的程度一因此在一个元素 在本领域普通技术人员已知的一篇和多篇参考文献中描述的情况下，它们可以特别地通过 特征或特征组合的否定式限制或放弃从所要求保护的发明中排除。
[0233] 尽管本发明特别地参照其示例实施方式显示和描述，本领域技术人员理解，可以 对其进行形式和细节的各种改变而不脱离所附权利要求涵盖的本发明的范围。
【主权项】
1. 一种包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中所述抗体特异性地结合哺乳动物 PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。2. 如权利要求1的偶联物，其中所述凝结剂是凝血蛋白。3. 如权利要求2的偶联物，其中所述凝血蛋白是组织因子。4. 如权利要求3的偶联物，其中所述组织因子包含与SEQIDNO: 1具有至少40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；更优选与5￡0IDN0:1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性；还更优选与5￡0 1〇勵：1具 有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。5. -种包含通过肽键与抗体偶联的组织因子的偶联物，该组织因子与SEQIDNO: 1具 有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，其中所述 抗体特异性地结合人PLVAP蛋白的细胞外结构域中的表位。6. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述哺乳动物PLVAP蛋白包含与SEQIDNO:2 具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列； 更优选与SEQIDN0:2具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，还更优选与 SEQIDN0:2 具有至 95、96、97、98、99%或更高同一性。7. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体特异性地结合选自PPAGIPVAPSSG或 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM的表位。8. 如权利要求7的偶联物，其中所述抗体特异性地结合表位PPAGIPVAPSSG。9. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体化学交联。10. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过肽键连接。11. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体是包含轻链可变区和重链可变区的 免疫球蛋白且其中所述凝结剂是凝血蛋白。12. 如权利要求11的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过在包含重链可变区的蛋白 质的羧基末端与所述凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。13. 如权利要求11的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过在包含轻链可变区的蛋白 质的羧基末端与所述凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。14. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝结剂是凝血蛋白且所述凝血蛋白与抗 体经由接头肽通过肽键连接。15. 如权利要求14的偶联物，其中所述接头肽包含（Gly4-Ser)n，其中n是1、2、3、4、5 或6;更优选其中n是3。16. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体是包含以下的免疫球蛋白： i) 包含含有SEQIDN0:3的氨基酸序列的可变区中的CDR的重链可变区和包含含有 SEQIDN0:4的氨基酸序列的可变区中的CDR的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变区和 重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换；或 ii) 包含含有SEQIDN0:5的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含含有 SEQIDN0:6的氨基酸序列的可变区中的CDR的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变区和 重链可变区在各⑶R中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换。17. 如权利要求16的偶联物，其中所述轻链可变区和/或重链可变区是人源化的。18. 如权利要求17的偶联物，其中所述轻链可变区和重链可变区由以下给出： i) 选自SEQIDN0:7、8、9、10或11的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区是SEQ IDNO: 11;和选自SEQIDNO: 12、13或14的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可变区是 SEQIDNO:13 ;或 ii) 选自SEQIDNO: 15、16、17、18或19的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区 是SEQIDNO: 19;和选自SEQIDN0:20、21或22的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可 变区是SEQIDNO:22。19. 如权利要求14的偶联物，其中所述偶联物包含与SEQIDNO:23具有至少80、85、 90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列。20. -种药物组合物，包含前述权利要求任一项的偶联物，其中该组合物进一步包含合 适的载体、赋形剂和/或造影剂。21. 如权利要求20的药物组合物或如权利要求1-19任一项的偶联物，其为适合施用于 受试者的剂型。22. -种核酸，其编码权利要求1-8或10-19任一项的偶联物。23. -种载体，其包含权利要求22的核酸。24. -种宿主细胞，其包含如权利要求23的载体或如权利要求22的核酸。25. 如权利要求24的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞，更特别地其中所述细 菌细胞是大肠杆菌。26. 如权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞是选自真菌如酵母，包括芽殖酵母；昆虫 细胞如SfO、Sf21或highfive细胞；或哺乳动物细胞如CH0、VER0或COS细胞的真核细胞。27. -种制备权利要求1-8或10-19任一项的偶联物的方法，包括在支持权利要求 24-26任一项的宿主细胞表达所述偶联物的条件下培养所述宿主细胞和分离所表达的偶联 物。28. -种在需要的哺乳动物受试者中治疗具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤、减小具有 PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的体积或者诱导具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的血栓形成和 肿瘤坏死的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-19任一项的偶联物或 权利要求20或21的药物组合物。29. 如权利要求28的方法，其中所述肿瘤是HCC且HCC肿瘤体积在施用所述偶联物后 通过血栓形成和坏死来减小。30. 如权利要求28或29的方法，其中所述受试者是人。31. 如权利要求28-30任一项的方法，其中所述偶联物血管内施用到所述受试者的肿 瘤。32. 如权利要求28-31任一项的方法，其中所述偶联物直接输注到一个或多个给肿瘤 供血的动脉中。33. -种在需要的人类受试者中治疗HCC的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量 的权利要求1-19任一项的偶联物或权利要求20或21的药物组合物，其中所述偶联物或组 合物直接输注到一个或多个给肿瘤供血的动脉中。34. 如权利要求28-33任一项的方法，其中所述受试者同时或顺序经受一种或多种化 疗剂、放射疗法、肿瘤内酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治 疗。35. 如权利要求34的方法，其中所述偶联物与一种或多种化疗剂一起施用于所述受试 者。36. 如权利要求35的方法，其中所述一种或多种化疗剂包括治疗有效量的过索拉非 尼、贝伐单抗或其它抗血管生成治疗药。37. 如权利要求35的方法，其中所述偶联物在进一步包含所述一种或多种化疗剂的药 物组合物中施用于所述受试者。38. 如权利要求28-37任一项的方法，其中所述具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤是成胶 质细胞瘤。39. 如权利要求28-38任一项的方法，其中所述偶联物以约5-约200yg/cm3肿瘤，更 特别地约10-约150yg/cm3肿瘤和更特别地约15-约100yg/cm3肿瘤的剂量施用。40. 如权利要求28-39任一项的方法，其中所述偶联物以单一剂量施用。41. 如权利要求28-39任一项的方法，其中所述偶联物以2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多 个剂量施用。42. 如权利要求41的方法，其中所述多个剂量在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者1、 2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月或更长时间段内施用。
【专利摘要】一种用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品。本发明特别地提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中所述抗体特异性地结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。这些试剂特异性地靶向HCC肿瘤并治疗HCC。本发明还提供使用这些偶联物的方法，如通过施用本发明提供的偶联物或本发明提供的组合物如药物组合物治疗HCC的方法。PTA-996320090408PTA-996420090408
【IPC分类】C12N15/62, C12P21/00, A61K38/36, C07K19/00, A61P35/00, A61K47/48
【公开号】CN104892767
【申请号】CN201410648801
【发明人】高国彰, 王芸馨
【申请人】中国合成橡胶股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年11月14日
【公告号】CA2871114A1, EP2915545A1, US20150140021
【专利说明】用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年11月15日提交的美国临时申请No. 61/904,951的利益。上 述申请的全部教导通过引用并入本文。
[0003] 通过引用并入ASCII文本文件中的材料
[0004] 本申请通过引用并入在与本申请同时提交的以下ASCII文本文件中包含的序列 表：
[0005] a)文件名：序列表.txt ;建立于2014年10月28日，大小38KB。
[0006] 发明背景
[0007] 原发性肝癌在全世界是男性中第五常见的癌症和在女性中是第七常见的癌症。在 全球范围内，它是男性中癌症死亡的第二位的主要原因和在女性中癌症死亡的第六位的主 要原因。肝细胞癌（HCC)占原发性肝癌的85%。HCC在东南亚和撒哈拉以南非洲中是地方 病。西方国家中的发病率在近年中提高并预期继续提高。HCC在美国对于男性和女性是癌 症死亡的第五位和第九位的主要原因。HCC的五年总生存率仅为15%。
[0008] 鉴于这一疾病的高发病率及其对患者、其支持系统和大多数社团造成的巨大负 担，迫切地需要患有中期和晚期疾病的HCC患者的治疗中的进一步改善一更特别地，存在 着对于可以发生特异性地靶向HCC肿瘤且例如减小肿瘤的体积以治疗HCC和/或消除肿瘤 的药剂以及制备和使用该药剂的方法的需要。
【发明内容】
[0009] 本发明特别地提供特异性地靶向HCC肿瘤的血管内皮细胞和治疗HCC的药剂以及 使用这些药剂的相关方法。在第一方面中，本发明提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物， 其中所述抗体特异性地结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。
[0010] 在一些实施方式中，凝结剂是凝血蛋白。在更特别的实施方式中，凝血蛋白是组织 因子（tissue factor)。在还更特别的实施方式中，组织因子包含与SEQ ID NO: 1具有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；例 如，与SEQ ID N0:1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性；例如，与SEQID NO: 1具有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。
[0011] 在相关的方面中，本发明提供包含通过肽键与抗体偶联的具有与SEQ ID NO: 1至 少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列的 组织因子的偶联物，其中所述抗体特异性地结合人PLVAP蛋白的细胞外结构域中的表位。
[0012] 在前述任何方面和实施方式中，哺乳动物PLVAP蛋白可以包含与SEQ ID N0:2具 有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；更 优选与SEQ ID N0:2具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，还更优选与SEQ ID N0:2具有至95、96、97、98、99%或更高同一性。
[0013] 对于前述任何方面和实施方式，所述抗体可以特异性地结合选自 PPAGIPVAPSSG(SEQ ID N0:25)或 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM(SEQ ID N0:26)的表位。 在更特别的实施方式中，所述抗体特异性地结合表位PPAGIPVAPSSG(SEQ ID N0:25)。
[0014] 对于前述任何方面和实施方式的偶联物，在一些实施方式中，凝血蛋白和抗体化 学交联。在其它实施方式中，凝血蛋白和抗体通过肽键连接。
[0015] 在前述任何一个方面和实施方式的偶联物中，抗体可以是包含轻链可变区和重链 可变区的免疫球蛋白。在更特别的实施方式中，凝血蛋白和抗体通过在包含重链可变区的 蛋白质的羧基末端与凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。在其它实施方式中，凝血蛋白 和抗体通过在包含轻链可变区的蛋白质的羧基末端与凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连 接。
[0016] 在一些实施方式中，在前述任何一个方面或实施方式的偶联物中，凝血蛋白和抗 体经由接头肽通过肽键连接。在更特别的实施方式中，接头肽包含（Gly 4-Ser)n，其中η是 1、2、3、4、5或6 ;更优选其中η是3。
[0017] 在特定实施方式中，前述任何一个方面或实施方式的偶联物中，抗体是包含以下 的免疫球蛋白：
[0018] i)包含含有SEQ ID ΝΟ:3的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含含 有SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列的可变区中的⑶R的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变 区和重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换；或
[0019] ii)包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含 含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列的可变区中的⑶R的轻链可变区，任选地其中所述轻链可 变区和重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换。
[0020] 在更特别的实施方式中，轻链可变区和/或重链可变区是人源化的。在还更特别 的实施方式中，轻链可变区和重链可变区由以下给出：
[0021] i)选自SEQ ID N0:7、8、9、10或11的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区 是SEQ ID NO: 11;和选自SEQ ID NO: 12、13或14的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可 变区是SEQ ID NO: 13 ;或
[0022] ii)选自SEQ ID N0:15、16、17、18或19的重链可变区，更特别地其中所述重链可 变区是SEQ ID NO: 19;和选自SEQ ID N0:20、21或22的轻链可变区，更特别地其中所述轻 链可变区是SEQ ID N0:22。
[0023] 前述任何方面和实施方式的特定实施方式中，偶联物包含与SEQ ID NO: 23具有至 少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列。
[0024] 在相关的方面中，本发明提供编码前述任何一个方面和实施方式的偶联物的核 酸。在特别的实施方式中，本发明提供的核酸包含在载体中。在相关的实施方式中，载体可 以是在宿主细胞中，且在特定的实施方式中，宿主细胞是细菌细胞（例如大肠杆菌）。在其 它实施方式中，宿主细胞是真核细胞（例如，真菌如酵母，包括芽殖酵母；昆虫细胞如SfO、 Sf21或high five细胞；或哺乳动物细胞如CHO、VERO或COS细胞）。
[0025] 在另一个相关的方面中，本发明提供包含前述任何方面和实施方式的偶联物的药 物组合物，其中该组合物进一步包含合适的载体、赋形剂和/或造影剂。在更特别的实施方 式中，该组合物为适合施用于受试者的剂型。
[0026] 在另一个方面，本发明提供通过在支持前述任何一个方面和实施方式的宿主细胞 表达偶联物的条件下培养所述宿主细胞并分离表达的偶联物来制备前述任何一个方面和 实施方式的偶联物的方法。
[0027] 在再另一个实施方式中，本发明提供在需要的哺乳动物受试者中治疗具有PLVAP 阳性脉管系统的肿瘤、治疗肝细胞癌（HCC)、减小具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的体积或 者诱导具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的血栓形成和肿瘤坏死的方法。在这些方法中，向 受试者（例如，人）提供（例如，通过任何合适的方式施用）治疗有效量的前述任何一个方 面和实施方式的偶联物或前述任何一个方面和实施方式的药物组合物。
[0028] 在一些实施方式中，HCC肿瘤体积在所述偶联物诱导的血栓形成和肿瘤坏死后减 小。
[0029] 在特定实施方式中，偶联物血管内施用到受试者的肿瘤，例如HCC。在更特别的实 施方式中，偶联物直接输注到一个或多个给肿瘤供血的动脉中。
[0030] 在一些实施方式中，受试者同时或顺序经受一种或多种化疗剂、放射疗法、肿瘤内 酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治疗。在更特别的实施方 式中，偶联物与一种或多种化疗剂一起施用于受试者。在更特别的实施方式中，一种或多种 化疗剂包括治疗有效量的过索拉非尼（参见，例如PubChem 216239)、贝伐单抗或其它抗血 管生成（antiangeogenic)治疗药。在特定实施方式中，偶联物在进一步包含一种或多种化 疗剂的药物组合物中施用于受试者。
[0031] 在一些实施方式中，偶联物以约5-约200 μ g/cm3肿瘤，更特别地约10-约150 μ g/ cm3肿瘤和更特别地约15-约100 μ g/cm 3肿瘤的剂量施用。
[0032] 在特定实施方式中，偶联物以单一剂量施用。在其它实施方式中，偶联物以2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多个剂量施用。在更特别的实施方式中，所述剂量在1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10天或者1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月或更长时间段内施用。
[0033] 附图简要说明
[0034] 本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的图形。具有彩色图形的本专利或专 利申请公开的拷贝在请求和支付必要费用时由专利局提供。
[0035] 前述内容从如附图中显示的本发明以下示例实施方式的更详细说明来看是清楚 的。
[0036] 图1是电泳凝胶的照片，其显示纯化的带GST标签的人组织因子蛋白的SDS-PAGE 分析。使用10%聚丙烯酰胺凝胶。3微克的带GST标签的重组人组织因子（GST-hTF)加载 到凝胶上。
[0037] 图2是随蛋白质浓度变化的OD 405nm的曲线图，通过酶联免疫分析证明与人 组织因子化学偶联的MECA32(MECA32-hTF)与人PLVAP的结合。分析板的各孔涂覆有小 鼠 PLVAP蛋白的水溶性细胞外结构域。在封闭后，涂覆的孔与提高浓度的MECA32-hTF - 起孵育。一个孔与人组织因子（hTF) -起孵育。MECA32-hTF与PLVAP的结合用来自R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)的生物素化抗-hTF抗体和来自 Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL)的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物检测。结果显示MECA32-hTF结合小鼠 PLVAP并携带可用抗-hTF抗体检测的hTF。没有抗体的对照可溶性hTF(实心圆）不能结 合PLVAP和被检测。
[0038] 图3A和3B是显示MECA32-Fab-TF表达载体的构建的示意图。
[0039] 图4是CSR02-Fab_TF的表达构建体的示意图。
[0040] 图5是重组人PLVAP和小鼠 PLVAP的SDS-PAGE的照片。重组人PLVAP (5 μ g)和 小鼠 PLVAP(2. 5 μ g)用12%聚丙烯酰胺凝胶进行分析。
[0041] 图6A和6B是显示SCID小鼠的H印3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞中PLVAP 表达的免疫组织化学（IHC)染色的显微照片。MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体（10 μ g/ ml)用于IHC染色（图B)。左图是用作为阴性对照的相同浓度正常大鼠 IgG染色的相同块 的切片（图A)。结果显示H印3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞与人HCC -样对于PLVAP 表达阳性染色（图B中通过箭头所指的黑棕色沉淀）。肿瘤血管内皮细胞表达的PLVAP因 此可以被靶定以评估MECA32-TF和MECA32-Fab-TF的治疗效果。相同的血管不能用对照大 鼠 IgG染色（图A中的箭头）。
[0042] 图7显示通过超声检查获得的肿瘤中血流的照片，其表明与重组人组织因子偶联 的抗-PLVAP MECA32单克隆抗体（mAb) (MECA32-TF)对肿瘤血流的影响。肿瘤血流用3D能 量多普勒（Power Doppler)超声检查评估。能量多普勒检查在治疗前48小时和治疗后48 小时进行。结果显示血流在用20 μ g MECA32-TF处理的组中显著变小（白色箭头）但在用 24 μ g MECA32 mAb处理的对照组中没有变小。红色血流信号在处理前存在于肿瘤内部。
[0043] 图8是肿瘤体积随时间的线图，其表明MECA32-TF输注对肿瘤生长的影响。该图中 显示的结果来自图7中描述的相同试验。携带H印3B肿瘤异种移植物的SCID小鼠通过输 注20yg MECA32-TF到给肿瘤供血的动脉中进行处理。对照组用24yg MECA32 mAb处理。 肿瘤体积在第〇天处理之前和之后使用3D超声检查监测。对照组中的小鼠之一在初次处 理后第20天由于快速发展的肿瘤生长而死亡(f)。处理组和对照组的生长率使用线性混合 效应模型进行比较并显著不同（P = 0. 0002)。该研宄的结果（图7和8)证明与组织因子 偶联的抗-PLVAP抗体能够阻断肿瘤血流并有效地抑制肿瘤生长。实心圆（·）：MECA32mAb 对照（η = 3);交叉（X) :MECA32-TF 处理组（η = 3)。
[0044] 图 9 是提供重组抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF 和抗-人 PLVAPCSR02-Fab-TF 偶 联物的结构示意图的图片。两种抗-PLVAP Fab-TF之间的主要差异在于在MECA32-Fab-TF 的κ轻链的C末端具有组氨酸标签（His-标签）。引入组氨酸标签用于纯化目的。 CSR02-Fab-TF不需要组氨酸标签来进行纯化。
[0045] 图10是相对于竞争抗体浓度的OD 405nm的线图，其通过竞争酶联免疫分析表明 MECA32-Fab-TF结合小鼠 PLVAP。ELISA板的孔涂覆重组的水溶性小鼠 PLVAP (2. 5 μ g/ml) 过夜。在用含有牛血清白蛋白的缓冲液封闭孔后，提高浓度的大鼠 IgG(0. 5 μ g/ml-50 μ g/ ml)、MECA32-Fab-TF(0· 5 μ g/ml-50 μ g/ml)或 MECA32 mAb(0· 05 μ g/ml-5 μ g/ml)与 0. 25 μ g/ml的生物素化MECA32 mAb -起孵育。生物素化MECA32 mAb与PLVAP的结合用链 霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物和显色底物测量。结果显示MECA32 mAb和MECA32-Fab-TF 两者可以与生物素化MECA32 mAb竞争结合小鼠 PLVAP，大鼠 IgG对照不结合竞争结合小鼠 PLVAP。如所预期的，MECA32 mAb对于与小鼠 PLVAP的结合具有比MECA32-Fab-TF高一个 数量级的效力，因为MECA32-Fab-TF的结合亲和力比MECA32 mAb低一个数量级。
[0046] 图11是显示通过MECA32-Fab-TF (3、6和12 μ g)和对照MECA32单克隆抗体 (12 μ g)诱导H印3B肿瘤异种移植物肿瘤坏死的一组显微照片。在输注MECA32-Fab-TF或 MECA32 mAb到给肿瘤供血的动脉中后，肿瘤异种移植物在处理后72收获并送交组织学切 片。显示的显微照片对于所有三个不同剂量的MECA32-Fab-TF显示肿瘤的大量坏死（以粉 红色突出显示的区域）。其余区域的有活性肿瘤组织以蓝色突出显示。来自对照组的所有 三个肿瘤是100%有活性的，如右栏所示。处理的肿瘤的坏死区域通过衡量全肿瘤图象和坏 死区域的剪切块来计算，并以百分比表示。肿瘤边界用红线和蓝描画轮廓。各处理组中有 二只小鼠。
[0047] 图12是显示通过MECA32-Fab-TF(2. 5、5和10 μ g)和对照MECA32单克隆抗体 (IOyg)诱导ifep3B肿瘤异种移植物肿瘤坏死的一组显微照片。本研宄与图11中所示的 相似。主要差别是用于处理Hep3B肿瘤异种移植物的剂量。同样，肿瘤在输注到给肿瘤供 血的动脉中后72小时收获并送交组织学切片。各组中有两只小鼠。同样，结果显示处理后 所有三个剂量下的显著肿瘤坏死。以粉红色突出显示的各处理肿瘤中的坏死区域如图11 中所描述的以总肿瘤切片的百分比确定。肿瘤边界用红线和蓝线描画轮廓。方块区域放大 (40x和IOOx)并显示在右侧以显示残留的存活肿瘤细胞（箭头）。各肿瘤中显示的百分比 是相对于肿瘤总截面的相对坏死面积。
[0048] 图13A和13B是显示输注10 μ g MECA32-Fab-TF后2、4、24、48和72小时肿瘤组 织学的变化的显微照片组。切片用苏木精和曙红染色。在图13A中，血管中纤维蛋白血栓 块的出现（箭头）在输注后2小时观察到。含有纤维蛋白血栓块的血管的数目在之后变得 更突出（箭头）。在处理前（〇小时）肿瘤血管中没有观察到纤维蛋白血栓块。在48和72 小时肿瘤组织变得完全坏死。显微照片以IOOx放大率获取。在图13B中，肿瘤细胞显示在 处理后4小时彼此之间具有增大的清晰空间的轻微分离。这一变化在24小时变得更显著。 具有蓝色核染色损失的明确坏死在处理后48小时变得明显，并在72小时变得更显著。显 微照片以200x放大率获取。
[0049] 图14是通过超声检查获得的肿瘤血流的一组照片，其显示输注IOyg MECA32-Fab-TF后不同时间点肿瘤血流的改变。肿瘤血流在处理前和处理后通过3D能量多 普勒评估。各时间点有两只小鼠。小鼠在处理后的3D能量多普勒研宄后立即处死。此处 显示具有来自处理前和处理后的各时间点的两只小鼠之一的能量多普勒信号（红色）的声 谱图。处理前48小时收集的肿瘤的声谱图显示在左侧。处理后声谱图显示在右侧，其中肿 瘤血流信号在处理后2小时消失并持续直到处理后72小时。
[0050] 图15是肿瘤体积随时间的线图，其显示动脉内输注MECA32-Fab-TF对H印3B肿瘤 异种移植物生长的作用。携带H印3B人肝细胞癌异种移植物的SCID小鼠在第0天用单次 输注的10 μ g对照MECA32单克隆抗体（mAb)和5或10 μ g MECA32-Fab-TF处理。肿瘤体 积从第0天的处理开始的_2、9和24天使用3D超声检查测量。在第-2天对于MECA32mAb 对照组和两个MECA32-Fab-TF处理组（10和5 μ g)测量的平均初始肿瘤体积分别是26. 8、 29. 0和23. 1mm3。各组的肿瘤体积表示为以mm3计的平均值土SD。处理组和对照组的不同生 长率使用线性混合效应模型进行比较。P值对于5 μ g处理组和对照组之间的比较及10 μ g 处理组和对照组之间的比较分别是0. 0003和0. 0001。
[0051] 图16A显示在用MECA32 mAb或MECA32-Fab-TF初次处理后25天切除的H印3B肿 瘤的照片和重量（图A)。各处理组和对照组的平均肿瘤重量（平均值土SEM)作为条形图 显示于图16B中。各MECA32-Fab-TF处理组的肿瘤重量通过t检验与对照组的肿瘤重量进 行比较。10 μ g和5 μ g MECA32-Fab-TF处理组的p值分别是0· 01和0· 03。
[0052] 图17是肿瘤体积随时间的线图，其显示系统性施用MECA-32-Fab-TF对H印3B月中 瘤异种移植物生长的作用。对于处理组小鼠通过尾静脉用MECA32-Fab-TF的系统性施用进 行处理或对于对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水的系统性施用进行处理。肿瘤生长在第O天的处 理之前和之后通过用测径器测量三个垂直的维度进行监测。所有三个组的最终肿瘤体积通 过ANOVA进行比较。结果显示所有三个组之间没有显著差异，p值为0. 96。这三个组的平均 肿瘤体积（平均值±SEM)是 1844±840mm3(对照）、1867±602mm3(20μgMECA32-Fab-TF) 和 1617±559mm3(10 μ g MECA32-Fab-TF)。
[0053] 图18是一组显微照片，其显示来自三个病例的人肝细胞癌（HCC)和相邻非肿瘤性 肝组织的切片用生物素化CSR02-Fab-TF的免疫组织化学染色。在左栏显示的三个HCC切 片中所有血管对于PLVAP染色阳性（箭头），在血管内皮细胞中具有棕色沉淀。相反，肝窦 状隙、门静脉和肝静脉内层的内皮细胞（菱形）显示阴性染色而没有可检测的PLVAP表达。
[0054] 图19是SEQ ID N0:2的注释序列，其中完整NP_112600. l(hPLVAP)的细胞外区域 加下划线。
[0055] 图 20 是 SEQ ID NO: 3>KFCC-GY4_VH_domain_4 的注释序列，其中 CDR 加下划线。
[0056] 图 21 是 SEQ ID N0:4>KFCC-GY4_VL_domain_9 的注释序列，其中 CDR 加下划线。
[0057] 图22是SEQ ID NO: 5>KFCC-GY5_VH_14的注释序列，其中CDR加下划线。
[0058] 图23是SEQ ID N0:6>KFCC-GY5_VL_19的注释序列，其中CDR加下划线。
[0059] 图24是SEQ ID N0:23,重组CSR02-Fd-TF插入序列，的注释序列，其中Fd(I-IH) 的VH结构域加下划线，Fd(115-216)的CHl结构域加粗，铰链（217-225)加双下划线，接头 (226-239)通过小写字母表示，且人组织因子的细胞外结构域（240-458)为斜体。
[0060] 本发明的详细描述
[0061] 本发明的示例实施方式的说明如下。特定术语的定义在整个说明书中适用。
[0062] 本发明提供的偶联物和组合物
[0063] 本发明提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中该抗体特异性地结合哺乳动 物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。这样的偶联物称为"本发明提供的偶联物"、"本发明 的偶联物"等，而包含该偶联物的组合物（如药物组合物）称为"本发明提供的组合物"等。 该申请也可以指称"本发明提供的偶联物和组合物"以描述"本发明提供的偶联物"和"本 发明提供的组合物"。
[0064] "凝结剂"促进哺乳动物循环系统中，即在功能性凝血级联和血小板激活途径的存 在下，血栓的体内形成。肽"凝结剂"是"凝血蛋白"。凝血级联的示例性成分包括，例如，组织 因子、哈格曼因子（人GeneID No. 2161)、血浆促凝血酶原激酶（人GeneID No. 2160)、凝血 酶（人GeneID No. 2147)、克里斯马斯因子（人GeneID No. 2158)、稳定因子VII (人GeneID No. 2155)和纤维蛋白稳定因子（人 GeneID No. 2162, 2165);也参见人 GeneID No. 2156、 2157和2159。血小板激活途径的示例性成分包括，例如，ADP、血清素、血小板激活因子 (PAF ;人 GeneID No. 7941)、Von Willebrand 因子（vWF ;人 GeneID No. 7450)、血小板因子 4(人GeneID No. 5196)和血栓烷A2 (TXA2))。凝结剂可以是凝血级联的成分或产物（即，内 源性、外源性或共同途径的成分）或血小板激活途径的成分或产物以及异源蛋白质，包括 凝血毒素，如convulxin(参见例如，分别对于α和β亚基参照蛋白质序列的uniprot ID 093426和093427)和Russellysin(参见例如，uniprot Q7LZ61)，只要该试剂促进血栓形 成，例如在功能性凝血级联和血小板激活途径的存在下。
[0065] 在特别的实施方式中，凝结剂是凝血蛋白。凝血蛋白可以以单体或寡聚体（如 二聚体或三聚体）或者以较高阶结构的聚合物处于偶联物中。在更特别的实施方式中， 凝血蛋白是组织因子。"组织因子"，也称为因子III、促凝血酶原激酶和⑶142,是促进血 栓形成的因子VII的受体。组织因子以人GeneID No. 2152为例，且众多的同源物是已 知的（参见 HomoloGene ID 1511)，包括人：NP_001984. 1、小鼠：NP_034301. 3、黑猩猩： XP_001156450. 1和狗NP_001019811. 1的蛋白质。人蛋白质包括基序（如在同源物间保守 的一对纤连蛋白3型结构域（C100065)以及一对WKS基序（Uniprot P13726. 1))和干扰素 结合区域（保守结构域CDD:204189)。在特别的实施方式中，组织因子是组织因子的可溶性 细胞外部分，以SEQ ID N0:1为例，其是NP_001984. 1的氨基酸33-251，和可通过与来自其 它生物体的同源序列比对确认的对应序列，以及其功能性变体，包括置换和截短（例如1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10个残基或更多个残基的置换和截短）。在一些实施方式中，组织因子 包含与 SEQ ID NO: 1 具有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或 更高同一性的氨基酸；更优选与SEQ ID NO: 1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更 高同一性；还更优选与SEQ ID N0:1具有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。具有改变 的活性水平的变体组织因子也可以作为单体用于本发明中，或者在一些实施方式中，作为 多聚体如二聚体用于本发明中。它们包括"凝血缺陷"组织因子（如美国专利No. 6, 156, 321 中所述的，其通过引用并入），其比原始组织因子活性低100倍或更多，例如关于激活因子 VII0
[0066] "抗体"包括免疫球蛋白（及其抗原结合片段）及可以与免疫球蛋白类似地适 应和使用的非免疫球蛋白骨架一所谓的抗体模拟物。示例性抗体模拟物包括基于纤连蛋 白3结构域（Fn3结构域；也称为单体（monobody);参见，例如Koide和Koide, Methods Mol. Biol. 352:95 - 109) (2007))、蛋白 A 的 Z 结构域（也称为亲和体（aff ibody);参 见，例如 Nygren FEBS 275(11) :2668 - 76(2008))、γ-B 晶体或泛素 （afflins ;参 见，例如 Ebersbach 等 J. Mol. Biol. 372 (1) : 172 - 85 (2007))、脂笼蛋白（Iipocalins) (anticalins ;参见，例如 Skerra, FEBS J.，275(11) :2677 - 83(2008))的那些；膜受 体的A结构域（高亲和性多聚体（avimers);参见，例如Silverman等Nat. Biotechn ol. 23(12) :1556 - 61 (2005));销蛋白（ankryn)重复序列（darpins;参见，例如 Stumpp 等，Drug Discov. Todayl3 (15 - 16) :695 - 701 (2008)) ;Fyn 的 SH3 结构域（fynomers; 参见，例如 Grabulovski 等，J Biol Chem 282 (5) : 3196 - 3204 (2007))和 Kunitz 型结 构域（Kunitz 结构域肽；参见，例如 Nixon 和 Wood CR, Curr Opin Drug Discov Devel 9(2) :261 - 8(2006)) 〇
[0067] 用于本发明提供的偶联物中的抗体特异性结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结 构域表位。哺乳动物PLVAP的示例性细胞外结构域表位包括对应于PLVAP的细胞外结构域 (SEQ ID Ν0:2中约氨基酸49及之后）的区域（例如，如通过序列比对评价的，如BLASTp、 ClustalWXOBALT等等，使用默认参数），或更特别地在PLVAP的C-末端，如SEQ ID NO: 24 中约氨基酸238及之后（NP_115774. 2,小鼠 PLVAP参照序列，例如由SEQ ID N0:24的氨基酸 238-413的氨基酸序列组成的肽），或者在SEQ ID N0:2(人PLVAP参照序列，NP_112600. 1) 的约氨基酸370-约442中包含的序列，如SEQ ID NO: 2的氨基酸378-404或SEQ ID NO: 2 的氨基酸431-442。在特别的实施方式中，用于本发明提供的偶联物中的抗体特异性结 合SEQ ID NO:2的氨基酸378-404或SEQ ID NO:2的氨基酸431-442中的表位；和/或 这些中任一的对应灵长类动物同源物，如来自食蟹猴（Macaca fascicularis)的相应序列 (ΧΡ_005588437· 1)和来自猕猴（Macaca mulatta)的相应序列（AFH29537. 1)。
[0068] 在特别的实施方式中，抗体是免疫球蛋白。"免疫球蛋白"指的是全长免疫球蛋白 以及免疫球蛋白的抗原结合片段，如Fab、F(ab'）2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能 的其它免疫球蛋白片段。免疫球蛋白在其抗原结合结构域中具有至少3个CDR(互补决定 区），且在更特别的实施方式中，4、5或6个⑶R。且还更特别地，抗原结合结构域中具有6 个CDR。用于本发明中的免疫球蛋白包括，例如人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、兔和鸡抗 体。免疫球蛋白可以是多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化 的、骆驼源化的、单域的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的或CDR-移植的。用于本发 明中的特定免疫球蛋白包括具有由鼠杂交瘤KFCC-GY4 (ATCC专利保藏号PTA-9963,于2009 年4月8日保藏于美国典型培养物保藏中心，地址：10801University Boulevard，Manass as, VA, 20110-2209,美国）或鼠杂交瘤 KFCC-GY5(ATCC 专利保藏号 PTA-9964,于 2009 年 4月8日保藏于美国典型培养物保藏中心，地址：10801University Boulevard, Manassas, VA，20110-2209,美国）产生的抗体的⑶R或其保守置换的那些，例如在特别的实施方式中， 在抗体结合结构域中具有最多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个 保守氨基酸置换（更特别地1、2、3、4、5或更多个置换），例如，在各⑶R中最多约1、2、3或 4个保守置换；更特别地在各CDR中最多1或2个保守置换。在特定实施方式中，免疫球蛋 白包含人源化重链和轻链可变结构域。KFCC-GY4和KFCC-GY5抗体，包括其可变结构域和 CDR的氨基酸序列，描述于美国专利申请公开号US 2011/0085973(首次描述在小鼠中产 生的该单克隆抗体）和US 2011/0262349(描述特定的嵌合和人源化变体）中，这两者通过 引用全文并入本文。也参见SEQ ID NO: 3-22,其提供了可变结构域序列，及这些抗体的鉴定 的 CDR0
[0069] "PLVAP"也称为质膜囊泡相关蛋白、PVUFELS和gp68,是在肿瘤脉管系统（如HCC 肿瘤脉管系统）中表达的蛋白质，并描述于人Gene ID No. 83483中。PLVAP已经在七种 生物体中鉴别（参见 HomoloGene ID 10578)，如人（ΝΡ_112600·1，也参见 SEQ ID N0:2)、 黑猩猩（XP_512490. 3)、小鼠（NP_115774. 2)和狗（XP_541953. 3)，并包含 PV-I 结构域 (pfam06637)。在一些实施方式中，特异性结合PLVAP (如哺乳动物PLVAP)的抗体结合PLVAP 的细胞外结构域，其对应于SEQ ID N0:2的大致氨基酸49-442或51-442。在特别的实施方 式中，哺乳动物PLVAP包含与SEQ ID N0:2(或其细胞外结构域）具有至少50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列 ；更优选与SEQIDN0:2(或 其细胞外结构域）具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性 ；更优选与SEQID 勵:2(或其细胞外结构域）具有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。在一些实施方式中， PLVAP蛋白包括相对于SEQ ID N0:2或其细胞外结构域的置换（例如，1、2、3、4、5个或更多 个残基）和/或截短（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个残基）。
[0070] 与本发明协同使用的接头肽可以通过肽键偶联抗体和凝结剂（例如凝血蛋白）一 例如，抗体（例如，免疫球蛋白的一个可变结构域）和凝血蛋白可以表达为单一多肽链。接 头肽的长度可以变化，例如从约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或者更 多个氨基酸到例如约75、100、150、200、250或300个氨基酸。在一些实施方式中，接头包含 铰链区，与在天然发生的免疫球蛋白中发现的富半胱氨酸和富脯氨酸结构域类似，且任选 包括另外的接头肽，如（Gly4-Ser)3，以分隔抗体（例如免疫球蛋白）和凝结剂（例如凝血 蛋白）。
[0071] 本发明提供的偶联物可以任选地包含标记，如可检测标记，如荧光、酶或放射性标 记。在特定实施方式中，发明提供的偶联物是生物素化的。
[0072] 在相关的方面，本发明提供编码本发明提供的偶联物的核酸、包含该核酸的载体 及包含该核酸和载体的宿主细胞。示例性的核酸包括编码与本发明提供的偶联物（在特别 的实施方式中，包括具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的偶联物）至少80、85、90、95、96、97、 98、99 %或更多相同的蛋白质的核酸。在其它实施方式中，核酸可以在高严格性杂交条件下 与编码本发明提供的偶联物的核酸杂交。"高严格性杂交"条件是：65°C下至少约6X SSC和 1% SDS。首次洗涤在约42°C下用0.1 X SSC中的约20% (v/v)甲酰胺进行10分钟，后续 洗涤在65°C下用0. 2X SSC和0. 1% SDS进行。在特别的实施方式中，本发明提供的核酸可 以是密码子修饰的，例如针对用于产生偶联物的特定宿主细胞。编码本发明提供的核酸的 载体可以包含例如表达本发明提供的偶联物所需的附加序列（如调控序列、启动子和增强 子）以及某些合适的辅助序列，如一个或多个复制起点、一个或多个选择标记和整合序列 (例如，用于整合到宿主基因组中，其通过随机整合、可转座元件或位点特异性整合，例如通 过同源重组，如通过靶向核酸酶）。
[0073] 在相关的方面中，本发明提供制备本发明提供的偶联物的方法，例如通过在支持 宿主细胞表达偶联物的条件下（例如，如果启动子是诱导型的，则通过添加诱导剂，等等） 培养包含本发明提供的核酸的宿主细胞，并随后分离表达的偶联物。合适的宿主包括细菌 细胞（例如，大肠杆菌）以及真核细胞，如真菌，如酵母（包括裂殖酵母）；昆虫细胞，如SfO、 Sf21或high five细胞；或哺乳动物细胞，如CH0、VER0或COS细胞，或间充质干细胞（MSC)。
[0074] 本发明提供的偶联物可以有利地配制到组合物如药物组合物中一例如，其中本发 明提供的偶联物与合适的载体或赋形剂复合的情况。任何合适的药用载体可以用于本发明 中。在特别的实施方式中，载体将促进偶联物的稳定性（例如当冻干用于储存或运输时）， 并在溶液（如重构后的水溶液）中时支持本发明提供的偶联物的稳定性，以与最佳的药学 实践一致。药物组合物可以包括以下一种或多种：缓冲剂（如组氨酸、磷酸盐或琥珀酸盐缓 冲剂）、增量剂或粘接剂（如甘氨酸或山梨醇，或者糖，如蔗糖、葡萄糖、乳糖或果糖）、张力 调节剂（如无机盐，如氯化钠、磷酸钾或磷酸钠）、防腐剂、湿润剂、乳化剂等等。
[0075] 在特别的实施方式中，本发明提供的偶联物配制成适合直接施用（例如通过经血 管施用，如经动脉施用）到HCC肿瘤脉管系统的药物组合物。在特别的实施方式中，本发明 提供的偶联物可以配制到脂醇油中。在其它实施方式中，本发明提供的偶联物可以用具有 约45 μ m和约90 μ m之间的平均直径的微粒如1VALON?栓塞颗粒配制。当施用于处理 的肿瘤时，存在这类赋形剂的情况下注射可以提高本发明提供的偶联物的利用度，例如通 过在注射后诱导肿瘤血管内血液的停滞。
[0076] 在一些实施方式中，本发明提供的组合物可以包括相容的水溶性造影剂（用于放 射照相、MRI或超声应用）以例如允许通过荧光检查评估本发明提供的偶联物在处理的肿 瘤中的分布和/或评估暴露于本发明提供的偶联物的肿瘤的完整性。< br>[0077] 本发明提供的药物组合物可以制备成用于分配和施用于需要的受试者的剂型 (与本发明提供的方法协调一致），包括多种剂型的试剂盒，其可以包含一个或多个填充有 本发明药物组合物的一种或多种成分的容器。任选地与这种容器相关的可以是按照管理药 物或生物制品的制造、使用或销售的政府部门规定的形式的通告，该通告表明政府部门对 于制造、使用和销售用于人类施用的批准。包装和试剂盒可以标记关于施用方式、药物施用 的顺序（例如，在多药剂试剂盒的情况中单独地、顺序地或同时地）等等的信息。包装或试 剂盒也可以包括用于提醒患者采取治疗的装置。包装或试剂盒可以是联合治疗的单一单位 剂量或它可以是多个单位剂量。特别地，化合物可以是分离的、以任何组合混合在一起、存 在于单一形式中，例如小瓶或药片。出于本发明的目的，单位剂量意图指取决于各化合物的 单独药效学并以FDA批准的剂量在标准时程中施用的剂量。
[0078] 本发明提供的偶联物、本发明提供的药物组合物和包含该偶联物和药物组合物的 本发明提供的试剂盒因此可用于治疗罹患具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤（如HCC)的受 试者的方法中以及使具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤可视化的方法中。
[0079] 治疗方法
[0080] 本发明提供的偶联物和药物组合物可以用于例如在需要的哺乳动物受试者中治 疗具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤（如HCC或成胶质细胞瘤）、治疗肝细胞癌（HCC)、减小 具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤的肿瘤体积或诱导具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤的血 栓形成和肿瘤坏死的方法。这些方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明提供的偶联物 或本发明提供的组合物。
[0081] "受试者"是指哺乳动物，更特别地人类患者（男性或女性），且在更特别的实施方 式中，患HCC、成胶质细胞瘤或任何具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤的人类患者。而受试者 可以为任何生命阶段或任何年龄，例如新生儿、婴儿、幼儿、儿童、年轻成人、成人或老人；在 特别的实施方式中，受试者是成年的，例如成年人，即约18岁或更大，例如约18-70、20-60、 25-55、25-50、30-50、25-65岁以及大于约30、40、50、60、70、80或90岁。在更特别的实施方 式中，受试者是60岁或更大，如更特别地65岁或更大。在还更特别的实施方式中，受试者 是约70-约79岁。
[0082] 如本文中使用的，术语"治疗"、"处理"或"疗法"意思是对抗医学状况（例如，HCC 或具有PLVAP-阳性脉管系统的肿瘤）以使得医学状况按照临床可接受的标准得到改善。例 如，HCC的改善包括减小的肿瘤体积、减小的肿瘤血流、肿瘤坏死和/或细胞凋亡、正常化的 肝功能等等。
[0083] "治疗有效量"是足以在施用的条件下实现所需的治疗或预防效果的量，如 足以治疗HCC的量。疗法的有效性可以通过本领域技术人员使用标准测量和常规方 法确定。在特别的实施方式中，偶联物以约5-约200 μ g/cm3肿瘤的剂量施用，更特 别地约10-约150 μ g/cm3肿瘤，和更特别地约15-约100 μ g/cm 3肿瘤。在一种生物 体（如本文中提供的小鼠实例）中发现有效的剂量可以使用已经方法转换用于另一 生物体（如人类）。参见，例如 Reagan-Shaw 等，FASEB J. 22:659-61 (2008) ;Schein 等，Clin.Pharmacol. Ther. 11:3-40(1970)和 Freireich 等，Cancer Chemother. Reports 50(4) :219-244(1966)。例如，基于动物给药的以mg/kg计的人等效剂量（HED)可以通过以 下等式给出：HED (mg/kg)=动物剂量（mg/kg) X (Kmsfe /ΚπιΛ )，其中Km =重量/表面积（kg/ m2)。基于上述等式的示例性转换因子显示于表A中。
[0084] 表 A
[0085]
[0086] 本发明提供的偶联物和本发明提供的药物组合物可以通过任何合适的方式提供 (例如，施用）于受试者，在特别的实施方式中包括血管内施用于受试者的肿瘤，例如偶联 物直接输注到HCC的一个或多个给肿瘤供血的血管中。
[0087] 通过本发明提供的方法治疗的受试者可以同时或顺序经受一种或多种化疗剂、 放射疗法、肿瘤内酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治疗。 在特定实施方式中，一种或多种化疗剂包括治疗有效量的索拉非尼（参见，例如PubChem 216239)、贝伐单抗或其它抗血管生成治疗药。对于组合方法，本发明提供的偶联物（或本 发明提供的组合物）可以同时（在单一组合物中或在单独的组合物中）或顺序地（在另一 治疗之前或之后）施用。
[0088] 在其中所述方法采用包括造影剂的本发明提供的组合物的情况中，在一些实施方 式中，本发明提供的方法可以包括使用造影剂可视化肿瘤（例如，HCC或成胶质细胞瘤）的 步骤，例如通过X-射线（包括CAT扫描）、MRI或超声。
[0089] 受试者可以以单一剂量或在其它实施方式中以多个剂量（例如，以2、3、4、5、6、7、 8、9、10个或更多个剂量）施用本发明提供的偶联物或组合物。当施用多个剂量时，该剂量 可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月的时 间段内施用。
[0090] 发生HCC的高风险组可以包括以下受试者：HBV-阳性；HCV-阳性；具有受损的肝 功能；具有肝硬化；具有 TP53 (OMIM 191170)、MET (OMIM 164860)、CTNNBl (OMIM 116806)、 CASP8(0MM601763)、PIK3CA (0ΜΙΜ 171834)、AXINl (0ΜΙΜ 603816)、PDGFRL (0ΜΙΜ 604584) 和APC(C)MM 611731)的一个或多个的突变；α-1-抗胰蛋白酶缺陷（ΟΜΜ 613490);血色 素沉着（0ΜΜ 235200);酪氨酸血症（0ΜΜ 276700)及前述的组合。因此，在特定实施方式 中，本发明提供的方法需要提供患有（或疑似具有）HCC的受试者（其具有这些突变中的一 种或多种），例如受试者在施用本发明提供的偶联物之前确认为具有突变之一（或者与HCC 的更高致病性相关的任何突变）。
[0091] 本发明提供的偶联物和本发明提供的组合物可以通过任何合适的途径或通过任 何合适的方式施用于受试者（如人）。例如，偶联物或组合物可以血管内施用于受试者的 HCC，例如通过直接输注到一个或多个给肿瘤供血的血管中，如肝动脉或股动脉或通过肝门 静脉。本发明提供的偶联物和本发明提供的组合物单独地或与一种或多种化疗剂（如索拉 非尼（参见，例如PubChem 216239)、贝伐单抗或其它抗血管生成治疗药中的一种或多种） 一起（在相同组合物中，或者同时或顺序施用）施用于受试者。
[0092] 在任何本发明提供的方法中，偶联物以约5 μ g/cm3肿瘤至约200 μ g/cm3肿瘤的剂 量施用，更特别地约10-约150 μ g/cm3肿瘤，且更特别地约15-约100 μ g/cm 3肿瘤。本发 明提供的偶联物或本发明提供的组合物可以以单一剂量或以多个剂量（例如，以2、3、4、5、 6、 7、8、9、10个或更多个剂量）施用。多个剂量可以是在任何可用的时期如1、2、3、4、5、6、 7、 8、9或10天或者1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月内。
[0093] 示例
[0094] PLVAP基因表达限制于HCC的血管内皮细胞且不存在于非肿瘤性肝组织中。PLVAP 蛋白是血管内皮孔和小窝的结构蛋白。未知它参与信号传导。抗-PLVAP抗体处理最近报 告为在小鼠中影响跨血管内皮细胞的白细胞运输。
[0095] 在本专利申请中，我们描述了通过利用在HCC的血管内皮细胞中而不在非肿瘤性 肝组织中PLVAP的差异表达来开发用于治疗HCC的新型治疗生物制品。对于我们的方式， 我们通过共表达在抗-PLVAP抗体或其Fab片段上的人组织因子蛋白开发这一治疗性生物 制品。人组织因子是血液凝固的强力触发剂。我们将开发的这种治疗剂输注到HCC的血管 中可以导致其与肿瘤血管内皮细胞结合并在HCC的所有血管中触发血凝块形成。HCC肿瘤 血管的血栓形成导致肿瘤血液供应的剥夺和缺血性坏死。使用SCID小鼠中的HCC异种移 植物模型，我们证明所开发的抗-PLVAP单克隆抗体或其Fab片段与人组织因子输注到给肿 瘤供血的动脉中成功地诱导肿瘤异种移植物的大量缺血性坏死并抑制肿瘤生长。通过外周 静脉系统施用这种治疗剂是无效的。因此，这种新的药剂输注到给肿瘤供血的动脉中对于 实现治疗效果是优选的。
[0096] 材料和方法
[0097] 大鼠抗-小鼠 PLVAP MECA32单克隆抗体（mAb)
[0098] MECA 32 杂交瘤获自衣阿华州大学的 Developmental Studies hybridoma Bank (Iowacity, ΙΑ)。杂交瘤细胞在含有 10 % 低-IgG 胎牛血清、I % GLUTA-Max (Life Technologies, Carlsbad, CA)、1 % 抗生素-抗霉菌剂（Life Technologies)和 1 % HEPES(Life Technologies)的 RPMI 培养基中培养。大鼠抗-小鼠 PLVAP MECA32 mAb 使 用来自GE Healthcare Life Sciences的HiTrap Protein G柱按照制造商的说明从MECA 32杂交瘤细胞的稠培养上清液纯化。纯化的抗体透析到磷酸盐缓冲盐水（PBS)，pH 7. 4中。 抗体的浓度对于lmg/ml使用1. 37的消光系统通过280nm波长处的吸光度测定。
[0099] 人组织因子蛋白的水溶性细胞外结构域的产生
[0100] 为产生人组织因子蛋白（hTF)的重组水溶性细胞外结构域，人组织因子蛋白 细胞外结构域cDNA的PCR片段（氨基酸残基33-251)从人组织因子的全长cDNA克隆 (NM001993. 2) (OriGene Corp. ,Rockville, MD)制备。用于PCR的引物分别在正向和反向引 物两者的5'端包含BamHl和Sail的限制性序列。扩增的cDNA片段插入pGEX€-6P-l 质粒（GEHeathcare Life Sciences)中并用谷胱甘肽（GST)标记。上述表达构建体通过 DNA 测序验证并转化到大肠杆菌菌株 SHuffle? T7Express(New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA)中用于产生hTF。大肠杆菌转化体接种在选择性培养基上。之后，随机选择 l-2mm的集落并在30°C下接种到含有100 y g/ml氨苄青霉素的4ml 2xYT培养基中和在 230rpm搅拌孵育器中孵育过夜。下一天，过夜培养物接种到含有100 μ g/ml氨苄青霉素的 400ml 2xYT培养基中并继续在30°C下230rpm搅拌孵育器中生长过夜。当600nm的吸光 度达到约0. 6~0. 8时，异丙基β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG)添加达到0. 4mM的最 终浓度以诱导蛋白质产生。振摇在30°C下持续约20小时。在用IPTG诱导后，细胞通过离 心（10, OOOx g;20min)收获并在室温下在含溶菌酶和Benzonase核酸酶（Novagen)的具 有0. 2% Tween 80的lx PBS中进行裂解2小时。细胞裂解产物在4°C下以10, OOOrpm离 心30分钟。收集上清液并作为可溶性部分过滤。
[0101] 带GST标签的重组人组织因子（GST-hTF)按照制造商的说明从GSTrap FF柱（GE Helathcare Life Sciences, Piscataway, NJ)纯化。含有 GST-hTF 的洗脱级分用 SDS-聚丙 稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)鉴定、合并和在PBS中透析。纯化蛋白质的浓度使用Bradford 蛋白质分析（Bio-Rad laboratories, Hercules, CA)和使用牛血清白蛋白作为标准测定。纯 化的GST-hTF在SDS-PAGE凝胶（10% polyacrylamid)中显示具有预期的50kDa分子量的 蛋白质条带（图1)。纯化蛋白质的组织因子活性使用显色分析针对商用人组织因子进行分 析。纯化的GST-hTF针对商用hTF标准进行分析并具有每微克蛋白3ug的hTF活性。这一 hTF活性分析的过程在后面章节中详细描述。
[0102] 重组GST-hTF与大鼠抗-小鼠 PLVAP MECA32单克隆抗体的偶联
[0103] 首先，纯化的MECA32 mAb在含有0· 5M NaCl的0· IM MES缓冲液pH 6. 0中透析。 MES是2- (N-吗啉代）乙磺酸。抗体使用相同的MES缓冲液调节到lmg/ml。向Iml的MECA32 mAb中，添加 I. 2mg EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）和3. 3mg的 硫代-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺）。在温和涡旋以溶解添加的试剂后，混合物在室温下 孵育一小时。用PBS偶联缓冲液预平衡的Zeba脱盐柱用于回收活化的MECA32 mAb。PBS 偶联缓冲液由140mM NaCl、10mM磷酸钠和3mM KCl组成，pH 7. 4-7. 5。接下来，相等数量的 GST-hTF(0. 66ml中0. 33mg)添加到活化的MECA32-mAb中。混合物在室温下旋转混合器上 孵育3小时。反应然后通过添加羟胺到IOmM的最终浓度淬灭。与人组织因子蛋白偶联的 抗体针对Ix磷酸盐缓冲盐水深度地透析以除去所有小的有机化学物质。抗体的浓度通过 280nm的吸光度测定。对于lmg/ml使用1. 37的消光系数测定抗体浓度。与人组织因子偶 联的抗体使用显色分析测量组织因子活性。购自R&D Systems (Minneapolis, MN)的重组人 组织因子作为标准品用于该分析中。纯化的MECA32单克隆抗体的TF偶联物（MECA32-TF) 针对与小鼠 PLVAP的结合及与小鼠 PLVAP结合的抗体上人组织因子的存在进行分析（图 2) 〇
[0104] 用于表达MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达 hTF(MECA32-Fab-TF)的质粒构建体的开发
[0105] 用于产生MECA32-Fab-TF的质粒构建体的制备在四个步骤中完成。第一步是制 备MECA32 mAb轻链可变结构域（VL)和MECA32 mAb重链可变结构域（VH)的cDNA，并确定 其DNA序列用于制备在第二步中使用的引物。第二步是制备在羧基末端具有His-标签的 MECA32mAbK轻链的全长cDNA，并插入pET26b质粒载体中。第三步是制备3'端具有接头 序列的MECA32 mAb重链的VHl和CHl结构域（Fd)加铰链区的cDNA，及用于hTF和5'端接 头序列的cDNA。然后重叠 PCR用于将两个cDNA连结在一起。MECA32-Fd-铰链-接头-TF 的这一 cDNA插入pET26b质粒载体中。第四步是从第二和第三步制备的质粒构建双顺反子 质粒载体。这四个步骤在下面更详细地描述并总结于图3A和3B中。
[0106] 第一步：克隆MECA32 mAb κ轻链的VL结构域和MECA32 mAb重链的VH结构域的 cDNA用于核酸测序
[0107] 编码MECA32 mAb轻链可变结构域（VL)和重链可变结构域（VH)的CDNA使用 FirstChoice RLM-RACE试剂盒（Ambion, Inc. ,Austin, TX)按照制造商的说明制备。简而 言之，从MECA32杂交瘤分离的总RNA用作模板以通过反转录PCR分别地使用与VL结构域 相接的κ轻链恒定结构域的核苷酸序列互补的引物（5' TGTCCTGATCAGTAACACTGTCC3'） (SEQ ID N0:27)和与VH结构域相接的重链CHl结构域的核苷酸序列互补的引物 (5, TGAGAGTGTAGAGTCCAGACTGCAGG3'）（SEQ ID N0:28)扩增。
[0108] 分析PCR产物并使用 Qiaquick凝胶提取试剂盒（Qiagen, Mississauga, Ontario, C anada)从I. 5%琼脂糖凝胶分离。纯化的PCR片段插入到质粒载体pGEM-T-easy (Promega ，Madison, WI, USA)中并转化到大肠杆菌菌株YE707-J (Yeastern Biotech, Taipei, Taiwan) 中。包含VL和VH结构域的插入序列的质粒从转化的大肠杆菌制备并用于确定VL和VH结 构域的DNA序列。然后序列用于设计引物以用于第二和第三步中。
[0109] 第二步：制备由MECA32 mAbK轻链和His-标签组成的cDNA并插入pET-26b质粒 载体中
[0110] 来自第一步的VL链的序列用于设计适宜的引物以获得MECA32抗体的全长κ轻 链cDNA序列。首先，MECA32 mAb的全长κ链cDNA使用以下所列引物通过RT-PCR从MECA32 杂交瘤细胞的总RNA产生：
[0111] 正向引物：5'GATCCTGACATCCAGATGACCCAGACTCC3'（SEQ ID N0:29)，和
[0112] 反向引物：5' CACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3'（SEQ ID N0:30)。
[0113] 具有BamHI和Sal I限制性位点的纯化PCR片段插入在CK结构域的羧基末端具 有（His)6-标签的质粒载体pET26b中且这一质粒命名为pET26b-M32K (图3A)。
[0114] 第三步：MECA32-Fd-铰链-接头-TF cDNA的制备和插入pET26b质粒载体中
[0115] 我们首先使用来自MECA32杂交瘤细胞的cDNA模板和以下引物对通过PCR制备由 MECA32 mAb FcU铰链区加接头序列组成的cDNA :
[0116] 正向引物：5'GACATCCAGATGACCCAGACTCC3'（SEQ ID N0:31)，和
[0117] 铰链接头反向引物：
[0118] 5' AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGTACATCCACAAGGATTGCATTCC3' （SEQ ID N0:32)。
[0119] 接下来，我们使用克隆的hTF cDNA模板和以下引物对通过PCR制备由（Gly4Ser)3 接头序列和人组织因子细胞外结构域（AA. 33-251) (hTF)组成的cDNA :
[0120] hTF接头正向引物：
[0121] 5' GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG3' （SEQ ID NO:33)，和
[0122] TF 反向引物：5'CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3'（SEQ ID NO:34)。
[0123] 两种PCR产物通过重叠延伸连结。最终的融合PCR产物插入到pET_26b载体中。 这一载体命名为 pET26b-M32-Fd-TF (图 3A)。
[0124] 第四步：含MECA32 Fd-铰链-(Gly4Ser)3接头-TF和具有His-标签的MECA32 κ 轻链两者的双顺反子质粒载体的构建
[0125] 我们使用pET26b-M32-Fd-TF作为模板和以下引物对通过PCR产生DNA片段：
[0126] 26b-RBS-F:
[0127] 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3' （SEQ ID NO:35)，和
[0128] 26b-终止-R:
[0129] 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3' （SEQ ID NO:36)。
[0130] 这一 DNA片段包括核糖体结合序列（rbs)、MECA32 mAb重链的VHl和CH1、铰链区、 接头序列、hTF和终止密码子。这一片段然后插入pET26b-M32K的Xba I限制性位点中。整 个插入片段的序列使用染料-脱氧（dye-deoxy)方法通过DNA测序验证。这一质粒构建体 命名为 pET26b MECA32-Fab-TF (图 3B)并转化到大肠杆菌 SHuffle T7Express 菌株（New England Biolabs Corp.)中用于蛋白质表达。总结用于产生MECA32_Fab_TF的这一双顺序 子质粒表达载体的构建步骤的示意图显示于图3A和3B中。
[0131] MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体的Fab共表达人组织因子（MECA32-Fab-TF)的 产生
[0132] 为产生MECA32-Fab-TF，新鲜大肠杆菌培养物的集落（l-2mm)在30°C，230rpm下接 种到含有30 μ g/ml卡那霉素的4ml 2xYT培养基中过夜。第二天早晨，过夜培养物接种到 含有30μg/ml卡那霉素的400ml 2χΥΤ培养基中并继续在30°C，250rpm下生长。当600nm 的吸光度达到~〇. 6-0. 8时，添加异丙基β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG)到0. 4mM的最 终浓度用于诱导重组蛋白质产生。振摇在30°C下持续约20h。
[0133] 细胞通过在室温下以1000 Ox g离心20min收获并用于分离包涵体。细胞浆悬浮在 4ml 含有 150mM NaCl、ImM MgCl2、0. 17mg/mlPMSF 和 2mg/ml 鸡蛋清溶菌酶（Sigma)的 IOmM Tris/HCl, pH 7. 5中。添加 Benzonase (250单位；EM Science)且悬浮液在室温下温和地混 合1. 5小时，然后以12000x g离心15min。沉淀重悬浮在含有ImMEDTA和3% Nonidet P40 的 IOmM Tris/HCl，pH 7.5(2ml)中，以 50%功率超声处理 Imin 并以 12000g离心 20min。沉 淀重悬浮在水中，以50%功率超声处理20-30秒并以12000g离心20min。重复用水洗涤， 且高度富集包涵体的最终沉淀通过在室温下温和混合过夜而悬浮在含有6M盐酸胍、0. 5M NaCl、20mM磷酸盐和IOmM 2-巯基乙醇的缓冲液，pH 8中。溶液保持在室温下过夜，然后 在6M尿素/50mMTris/HCl，pH 8中稀释到约lmg/ml的蛋白质浓度并在4°C下针对10-20 体积的相同缓冲液透析过夜。然后，透析改变到含2M尿素、50mM Tris/HCl、300mM NaCl、 2.5mM GSH、0.5mM GSSG的缓冲液，pH 8(折叠缓冲液）中。在透析2天后，缓冲液用新鲜的 折叠缓冲液替换且透析再继续2天。接下来，透析缓冲液改变为IM尿素、50mM Tris-HCl、 300mM NaCl的缓冲液，pH8且透析再继续一天。透析然后在具有顺序降低的尿素浓度的相 同缓冲液中进行，〇. 8M尿素6小时，0. 56M尿素过夜和0. 28M尿素6小时。最后，透析在没 有尿素的折叠缓冲液中进行并持续过夜。重折叠的上清液加载到氮川三乙酸镍（Ni-NTA ;GE Healthcare)柱上并用 50mM 磷酸钠和 0· 3M NaCl，pH 7. 0 中的 500mM immidazol 洗脱。重 组 MECA32_Fab_TF 进一步通过 HiLoadl6/60Superdex 75 制备级（GE Healthcare)凝胶过 滤柱色谱纯化。含靶MECA32-Fab-TF的洗脱液通过SDS-PAGE分析并合并。MECA32-Fab-TF 通过ELISA表征以确认与小鼠 PLVAP的结合。MECA32-Fab-TF的组织因子特异性活性使用 显色TF分析测量。
[0134] 用于表达重组CSR02抗-人PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达水溶性人组织因 子（CSR02-Fab-TF)的质粒构建体的开发
[0135] 我们也产生与MECA32-Fab-TF类似的重组抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF蛋白。这 一蛋白质基于抗-人PLVAP mAb CSR02开发。这一重组蛋白质的结构基本上类似于如上所 述的MECA32-Fab-TF，除了不同的Ab结构域和在κ轻链的羧基端不存在His-标签外。除 去His-标签，因为his-标签不是CSR02-Fab-TF的纯化所需的。CSR02-Fab-TF通过使用 抗-人 κ 轻链KappaSelect 亲和柱色谱（GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 纯化。CSR02mAb是抗人PLVAP的人源化单克隆抗体。
[0136] 用于制备产生CSR02-Fab_TF的质粒构建体的过程类似于制备用于 MECA32-Fab-TF的质粒构建体而具有一些改变。先前对于克隆cDNA以获得抗体重链和轻 链5' -端的DNA序列所描述的第一步省略，因为CSR02mAb重链和轻链的cDNA序列是早已 知道的。因此，仅需要三个步骤来制备CSR02-Fab-TF表达构建体。这三个步骤描述如下。
[0137] 第一步：CSR02 mAb轻链cDNA插入pET26b质粒载体中
[0138] 来自产生CSR02 mAb的NSO细胞系的总RNA使用寡-dT作为引物反转录为cDNA。 CSR02的κ轻链cDNA使用寡-dT引发的cDNA作为模板和以下所示的引物对通过PCR产 生：
[0139] CSR02-VK3F-26b F Nde I 正向引物：
[0140] 5'TATGGATGTTGTGATGACCCAATCTCCA 3' （SEQ ID NO:37)
[0141] κ-R-26b_Not I 反向引物：
[0142] 5，GGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTG 3, （SEQ ID NO:38)。
[0143] 纯化的CSR02mAb轻链的PCR DNA片段然后插入质粒载体pET26b的Nde I和Not I位点中以产生pET26b-cVK3。
[0144] 第二步：插入有用于表达由CSR02 mAb的VHUCHl和铰链区加上（Gly4Ser)3接头 区域和人组织因子的细胞外结构域（AA. 33-251) (hTF)构成的融合多肽的cDNA的pET26b 质粒构建体的构建
[0145] 这一质粒使用从NSO细胞系制备的cDNA和克隆的人组织因子cDNA作为模板通过 PCR构建。以下的引物对用于PCR :
[0146] I)用于CSR02mAb重链的VHl-CHl-铰链区和接头区域的引物对：
[0147] VH5-pro26b-NdeI_F 正向引物：
[0148] 5'TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG 3' （SEQ ID N0:39)，和
[0149] 铰链接头R:
[0150] 5'AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGCATGATGGGCATGGGGGACC 3' （SEQ ID NO:40).
[0151] II)用于接头序列-hTF-加用于插入的限制性位点的引物对：
[0152] hTF 接头 F:
[0153] 5'GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG 3' （SEQ ID N0:41)
[0154] hTF R-Not I:
[0155] 5'GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG 3' （SEQ ID N0:42)。
[0156] 从如上所述的这两个PCR反应产生的PCR片段进一步融合并通过重叠延伸进行扩 增。融合的cDNA插入pET26b质粒载体中，其命名为pET26b-VH5-Fd-TF。
[0157] 第三步：含用于CSR02 mAb Fd-铰链-(Gly4Ser)3接头-TF和CSR02 mAb κ轻链两 者的cDNA的双顺反子质粒载体的构建
[0158] 我们使用作为模板的pET-26b-VH5-Fd-TF和以下引物对通过PCR产生DNA片段：
[0159] 26b-RBS-F:
[0160] 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3' （SEQ ID N0:43)，和
[0161] 26b-终止-R:
[0162] 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3' （SEQ ID N0:44)。
[0163] 扩增的DNA片段包括核糖体结合位点（rbs) ;CSR02重链的VHl、CHl和铰链序列； 接头序列；可溶性人组织因子；和终止密码子。这一 DNA插入pET26b-cVK3载体的Xba I位 点中以得到新的双顺反子质粒载体，命名为pET26b CSR02-Fab-TF(图4)。这一质粒用于 在单一启动子的控制下表达κ轻链和融合重链。整个插入片段的序列使用染料-脱氧方 法通过DNA测序验证。
[0164] 重组CSR02抗-人PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达水溶性人组织因子 (CSR〇2_Fab_TF)的产生
[0165] 重组 CSR02_Fab_TF 蛋白质的表达。大肠杆菌 Shuffle T7Express (New England Biolabs)的转化通过将感受态细胞与pET-26b CSR02-Fab-TF质粒DNA -起在冰上孵育 5min，在42°C水浴中精确地加热30秒和随后置于冰上2分钟来进行。在接种到选择性培养 基上之前，转化体在30°C下孵育，同时与SOC培养基（0. 5%酵母提取物、2%胰蛋白酶化蛋 白胨、IOmM NaCl、2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgS04、20mM 葡萄糖）以 250rpm 振摇 60min。 CSR02-Fab-TF的表达在30°C或37°C下用0. 05mM的异丙基-β -D-硫代半乳吡喃糖苷诱导 16小时。在诱导后，细菌细胞在室温下在溶菌酶和Benzonase核酸酶存在下通过具有0. 2% Tween 80的lx PBS进行裂解2小时。细胞裂解产物通过在4°C下以1000 Orpm离心30分 钟收获。收集上清液并过滤以分离可溶性部分。
[0166] CSR02_Fab_TF 通过 KappaSelect 和 Capto AdhereMmultimodal 柱色谱纯化。 KappaSelect柱（Iml)用磷酸盐缓冲盐水（PBS)，pH 7. 4(0.0 lM磷酸盐缓冲液，0.0027M KC1，0. 14M NaCl)平衡。含有CSR02-Fab-TF的大肠杆菌细胞裂解产物以lml/min的流率加 载。在应用样品后，柱用平衡缓冲液洗涤直到0D280降低到基线。结合的蛋白质的其余部 分用含有〇. 25M蔗糖的0.1 M甘氨酸缓冲液，pH 2. 7洗脱。洗脱液立即通过添加每1ml洗 脱液50 μ 1的IM Tris-基础缓冲液，pH 9. 0调节到生理pH。
[0167] 从KappaSelect 柱洗脱的 CSR02-Fab-TF进一步用 20mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 预平 衡的 Capto Adhere 柱（5ml)纯化。从 KappaSelect 柱洗脱的 CSR02-Fab_TF 样品用 20mM Tris缓冲液，pH 7. 5稀释50倍并随后以lml/min的流率加载到Capto Adhere柱上。在应 用样品后，柱用平衡缓冲液洗涤直到0D280降低到基线。结合的CSR02-Fab-TF蛋白然后用 含有200mM NaCl的20mM Tris缓冲液，pH 7. 5洗脱。
[0168] 可溶性重组人和小鼠 PLVAP蛋白（hPLVAP和mPLVAP)的产生
[0169] (hPLVAP)的产生。质粒 pGEM'T Easy - hPLVAP51_442通过插入代表截 短的PLVAP (构成小鼠 PLVAP细胞外结构域的氨基酸残基51-442)的PCR片段到 pGEM?-T Easy载体（Promega)中产生。这一 PCR片段使用以下引物对通过PCR从人 PLVAP(NM_031310)的 cDNA 克隆（OriGene, Rockville, MD)产生：
[0170] 5' - |CATATG| aACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3' (SEQ ID NO:45)，和
[0171] 5? - 0GATCC| TGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3? (SEQ ID NO: 46)。
[0172] 为构建质粒pET-15b-hPLVAP51-442以产生重组PLVAP蛋白，在末端具有Ndel/Bam HI识别序列（加框的序列）的编码PLVAP的氨基酸残基51-442的cDNA片段从pGEM?-T Easy - hPLVAP51_442切割并插入pET-15b (Novagen)中。上述表达构建体通过DNA测序验证 并转化到大肠杆菌（R〇setta_gami2(DE3)pLysS)(EMD Millipore Corp.)中。
[0173] 如以下所述产生和纯化带His-标签的hPLVAP融合蛋白。来自新鲜培养物的转化 的大肠杆菌的集落（l -2mm)在37°C下以230rpm接种到含有100 μ g/ml氨节青霉素、34 μ g/ ml氯霉素、12. 5 μ g/ml四环素的4ml TB培养基中过夜。过夜培养物接种到含有100 μ g/ ml氨苄青霉素、34 μ g/ml氯霉素、12. 5 μ g/ml四环素的400ml TB培养基中并在37°C下以 250rpm继续生长。当600nm的吸光度达到约0. 6~0. 8时，添加异丙基β -D-I-硫代半乳 吡喃糖苷（IPTG)到I. 66mM的最终浓度以诱导蛋白质产生。在30°C下继续振摇约20h。细 胞通过在4°C下以1000 Og离心30分钟收获。细胞沉淀重悬浮在12ml补充有8M尿素的平 衡-洗涤缓冲液（50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7，10mM imidazol)中并储存在-20°C下至 少2小时。解冻的样品超声处理10秒，各次超声处理之间具有30秒中断以降低粘度直到 其变成透明的。细胞悬浮液在4°C下以10, 000 - 12, OOOx g离心20min以使任何不溶性材 料成团。来自前一步骤的上清液应用于用补充有8M尿素的10倍柱体积平衡-洗涤缓冲液 平衡的TALON树脂柱（Clontech)。在用10-20倍柱体积的IX平衡-洗涤缓冲液洗涤柱后， 重组的带聚组氨酸标签的人PLVAP蛋白质用5倍柱体积的含6M尿素的洗脱缓冲液（50mM 磷酸钠、300mM NaCl，pH 7、500mM imidazol)洗脱。洗脱液中纯化的重组蛋白质在4°C下 针对含3M尿素的IX平衡/洗涤缓冲液透析至少4小时，然后缓冲液改变为含IM尿素的 IX平衡-洗绦缓冲液并在4°C下透析至少4小时。蛋白质浓度用Bradford染料结合分析 (Bi〇-Rad，Hercules，CA)测定。蛋白质然后在23°C下用每mg重组PLVAP蛋白1单位生物 素化凝血酶（Novagen)消化16小时以除去聚组氨酸-标签。生物素化凝血酶通过固相链 霉亲和素-琼脂糖从孵育除去。所得的重组水溶性人PLVAP (hPLVAP)针对没有尿素的IX 平衡-洗涤缓冲液（50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7)透析。测定蛋白质浓度且蛋白质通过 SDS-PAGE分析纯度（图5)。
[0174] mPLVAP(小鼠 PLVAP)的产生。质粒 pGEM-T Easy-mPLVAP48_438通过插入代表 截短的PLVAP (构成小鼠 PLVAP的细胞外结构域的氨基酸残基48-438)的PCR片段到 pGEM^'-T Easy载体（Promega Corp.)中而产生。这一 PCR片段使用以下引物对通过 PCR 从小鼠 PLVAP 的 cDNA 克隆（Invitrogen, Life Technologies Corp.)制备：
[0175] mPLVA P CDS NdeI F:
[0176] 5'CATATGTATGGCAATGTGCACGCCACC3'（SEQ ID N0:47)，和
[0177] mPLVAP 终止 Xho I R:
[0178] 5' CTCGAGATCCACAGGTGGGCGATTCTGGC3' （SEQ ID N0:48)。
[0179] 接着，在各末端含有NdeI和XhoI识别序列的编码PLVAP的氨基酸残基48-437 的 cDNA 片段从 pGEM?-T Easy-mPLVAP48_438切割并插入 pET-15b (Novagen-EMD Millipore, Darmstadt, Germany)中用于蛋白质表达。在通过DNA测序验证后，这一表达 构建体转化到大肠杆菌（R〇setta_gami2(DE3)pLysS)中。大肠杆菌Rosetta_gami2(DE3) pLysS中带His-标签的融合mPLVAP蛋白的表达在30°C下用ImM异丙基-β -D-硫代半乳 吡喃糖苷诱导16小时。在诱导后，细菌细胞通过在补充有8Μ尿素的平衡缓冲液（50mM磷 酸钠、300mM NaCl，pH 7)中超声处理进行裂解并通过在4°C下以15,652x g离心30分钟分 离成可溶性和不溶性部分。为纯化His-PLVAP48_438蛋白质，可溶性部分加载到TALON? Metal Affinity Resin (Clontech, Palo Alto, CA)上并用洗脱缓冲液（50mM 磷酸钠、300mM NaCl，pH 7, 500mM imidazole)洗脱。洗脱液中所得的小鼠 PLVAP48_438蛋白质针对PBS透析。 纯化的His-mPLVAP的SDS-PAGE分析显示于图5中。
[0180] 通过ELISA对CSR02-Fab-TF和MECA32-Fab-TF与相应人和小鼠 PLVAP的结合的 研宄
[0181] 为了确保重组抗-PLVAP-Fab-TF蛋白可以结合人或小鼠 PLVAP蛋白，开发和使 用了 ELISA分析。首先，ELISA板的各孔在4°C下用50 μ I PBS-叠氮化物（0.02% )中的 2. 5 μ g/ml人或小鼠重组PLVAP蛋白涂覆。之后，分析在室温下进行。在各孔用150 μ 1洗 涤缓冲液（含〇· 2% Tween-20的PBS)三次洗涤后，各孔用150 μ 1封闭缓冲液（含0· 2% BSA和0. 05 % Tween-20的PBS)封闭30分钟。在三次洗涤后，50 μ 1的抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF或抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF以不同的浓度一式两份添加到各孔中。所 有孔孵育45分钟并洗涤三次。洗涤的孔然后与在封闭缓冲液中1:500稀释的50 μ 1生物 素化抗-人TF抗体（R&D Systems Corp.)孵育45分钟。在三次洗涤后，各孔与5000χ稀 释的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物孵育30分钟。各孔然后与100 μ 1碱性磷酸酶底物孵 育60分钟并在微读板仪中405nm下测量各孔的吸光度。
[0182] 分析也改变成竞争结合分析。对于竞争结合分析，提高浓度的抗-PLVAP抗体或 Fab-TF与最佳量的生物素化抗-PLVAP单克隆抗体一起孵育以竞争与PLVAP的结合。在孵 育和洗涤后，与PLVAP结合的生物素化抗体用链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物和显色底物 定量。
[0183] 人组织因子活性的显色分析
[0184] 重组 CSR02-Fab-TF、MECA32-Fab-TF 和与人 TF 交联的 MECA32mAb 的 TF 活性使用 显色分析测量。这一分析基于TF与因子Vila的结合及TF/FVIIa复合物激活因子X(FX) 的能力。TF活性直接通过产生的FXa的量定量。产生的FXa随着405nm下吸光度的增加 按照对-硝基苯胺（PNA)从FXa特异性显色肽底物的释放而动态地测量。TF活性针对商 用水溶性重组TF标准（R&D systems Corp.)确定。显色TF活性分析基于由PhiIipp等报 告的方法。参见 Philipp J, Dienst A, Unruh Maike 等 "Soluble tissue factor induces coagulation on tumor endothelial cells in vivo if coadministered with low-dose lipopolysaccharides"Arte;rioscle;r Thromb Vase Biol. ;23:905_910(2003) 〇
[0185] SCID小鼠中的H印3B HCC异种移植物模型
[0186] !fep3B是人HCC细胞系。为了证明抗-PLVAP Fab-TF的治疗效力，我们在BALB/c C.B-17SCID小鼠中建立HEP3B异种移植物模型。！fep3B HCC异种移植物通过在用异氟烷吸 入全身麻醉下皮下注射4百万!fep3B细胞到5周龄雄性C. B-17SCID小鼠的右上肢内侧建 立。细胞悬浮在60 μ 1溶解于无血清的达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基（DMEM) (Life Technologies Corp.)中的冰冷 75% BD Mtrigel?(BDBioscience Corp.)中。注射 通过使用29号胰岛素注射器进行。
[0187] 用于注射的H印3B细胞培养在含有10%胎牛血清、1% GLUTA-MAX、1%抗生素-抗 霉菌剂和1% HEPES的DMEM中培养。所有试剂购自Life Technologies。用于注射的细胞 在它们达到80%汇合时收获。使用来自Life Technologies的胰蛋白酶-EDTA溶液按照制 造商的说明使细胞从培养瓶脱离，且肿瘤细胞在悬浮于用于注射的冰冻75% BDMtrigel? 中之前用DMEM洗涤一次。在注射后，小鼠常规地监测肿瘤异种移植物的生长。正常地，花 费五至六周的时间使得肿瘤变成可用于研宄。
[0188] 抗-PLVAP Fab-TF输注到给肿瘤供血的动脉中
[0189] 对于H印3B肿瘤异种移植物用抗-PLVAP MECA32-Fab-TF的治疗，携带H印3B肿瘤 异种移植物的小鼠使用MATRX?麻醉仪通过吸入异氟烷进行麻醉。小鼠在解剖显微镜下置 于仰卧体位。右腹股沟区域的毛发在输注前一天用Nair脱毛剂（Church&Dwight Co.)除 去。在用75%乙醇清洁皮肤后，0.5cm切口在肿瘤上方的右腹股沟区域形成。加深创口以 暴露右股动脉和静脉。然后右股动脉用6-0尼龙绳环绕。动脉轻柔地向近端拉出。用微型 剪在拉出处远端进行动脉切开术，且细33号针插入远端侧中。MECA32-Fab-TF或对照抗体 以每分钟约40 μ 1的速率缓慢输注。注射在密切观察下进行以确保没有泄漏。在输注后， 将针抽回。动脉切开位点用Histoacryl (TissueSeal, AnnArbor, MI)密封。除去用于拉出 的尼龙绳。在确认足够的止血后，切开伤口用连续缝合封闭。
[0190] 用于测量肿瘤体积和血流的3D超声检查和能量多普勒
[0191] Vevo 2 I 0 0 H i g h - R e s 〇 I u t i ο n Imaging System(Visual Sonics, Inc. ,Toronto, Canada)用于按照制造商的说明获得3D肿瘤图象。肿瘤的三个垂 直维度通过获取以下测量值确定。首先测量沿肿瘤X和Y轴的最大截面积上的两个垂直维 度。然后使用零售商提供的软件测定沿垂直于X和Y维度的Z轴的最大尺寸。肿瘤体积 使用以下对于椭圆物体的公式确定：体积=π /6x长度X宽度X高度。肿瘤血流图象按照 Vevo 2100High_Resolution Imaging System 的手册使用 3D 能量多普勒获取。
[0192] MECA32-Fab-TF 和 CSR02-Fab-TF 结合亲和力的测量
[0193] 用于测定抗-PLVAP-Fab-TF和靶PLVAP之间的结合亲和力的分析如前面章节所 述是基于显色TF活性分析。简而言之，ELISA板的各孔涂覆2. 5 μ g/ml水溶性重组人或小 鼠 PLVAP过夜。在如对于研宄CSR02-Fab-TF和MECA32-Fab-TF与PLVAP的结合的ELISA 所述洗涤和封闭后，涂覆有人或小鼠 PLVAP蛋白的孔与50 μ 1的0. 3125、0. 625、1. 25、2. 5、 5和10 μ g/ml的提高浓度的CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF -式两份孵育。在室温下孵 育3小时后，孔进行洗涤并使用如先前章节对于显色TF活性分析所述的TF标准曲线测定 孔中结合的TF活性的量。添加到各孔中的总CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF的浓度是已 知的且各孔中结合的CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF的浓度可以从分析结果计算。这些数 值然后使用Scatchard作图分析进行分析以确定CSR02-Fab-TF或MECA32-Fab-TF的结合 亲和力。参见，例如 Scatchard G. "The attractions of proteins for small molecules and ions"Ann NY Acad Sci. 51:660-672(1949) 〇
[0194] 使用MECA32抗-PLVAP单克隆抗体的HEP3B肿瘤异种移植物中PLVAP的免疫组织 化学（IHC)染色
[0195] 为研宄小鼠 Hep3B异种移植物中PLVAP的表达，甲醛固定的石蜡组织块的切片进 行处理以用于通过抗-PLVAP单克隆抗体的免疫组织化学染色。在按照常规程序组织脱 石蜡和再水化后，具有载体中的组织切片的载玻片置于烧杯中并浸入Target Retrieval Solution(Dako，Inc.Carpinteria，CA)中。烧杯置于高压蒸锅中并在121°C下加热10分 钟。在冷却后，载玻片转移到蒸馏水中。各载玻片上的切片然后用VentanaiView DAB检测 试剂盒（Ventana Medical Systems, Inc.)中的200-400 μ 1过氧化氢处理以淬灭内源性过 氧化物酶。在用Tris-缓冲盐水（TBS) (Dako)清洗载玻片后，切片在37°C下与含有0. 1% 胎牛血清的TBS(TBS-BSA)中稀释的5 yg MECA32抗-PLVAP单克隆抗体孵育60分钟。在 通过将载玻片浸没在TBS缓冲液中5分钟洗涤三次后，切片在室温下与按照供应商的推荐 稀释的生物素化二级抗体（例如，对于MECA32 mAb的生物素化山羊抗-大鼠 IgG)孵育15 分钟。载玻片上的切片如上所述类似地洗涤。载玻片上的切片与试剂盒中新制备的DAB 底物孵育30分钟。载玻片用蒸馏水清洗几次。在用Gill's苏木精溶液复染15秒后，载玻 片用TBS清洗，之后用蒸馏水清洗。在空气干燥切片后，切片用Permount介质和盖玻片覆 盖。
[0196] 结果
[0197] HCC和HEP3B异种移植物中的PLVAP表达
[0198] 我们早先的研宄显示PLVAP在HCC的血管内皮细胞上而不在非肿瘤性肝组织的血 管内皮细胞中差异表达。PLVAP的差异表达提供了为治疗目的靶向于HCC的可能。我们设 想使用抗-PLVAP单克隆抗体或其Fab片段作为共表达血液凝结触发组织因子蛋白的载体 而用于HCC治疗的新途径。据信这种治疗剂输注到给肿瘤供血的动脉中导致这种治疗抗体 或其Fab片段与HCC的血管内皮细胞结合，触发肿瘤血管中的血凝块形成和导致肿瘤的缺 血性坏死。
[0199] 为证明这一途径的可行性，我们使用HEP3B HCC细胞系在SCID小鼠中建立人HCC 异种移植物模型。我们然后通过使用MECA32抗-小鼠 PLVAP mAb的免疫组织化学（IHC)染 色确定血管内皮细胞是否生长到表达小鼠 PLVAP的HEP3B肿瘤异种移植物中。如图6B中 所示，SCID小鼠中HEP3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞事实上如人HCC -样表达PLVAP。 因此，HEP3B异种移植物可以用于研宄以证明与人组织因子偶联的抗-PLVAP mAb或其Fab 片段的抗肿瘤效应。
[0200] 与可溶性人TF偶联的MECA32 mAb对HEP3B异种移植物的作用
[0201] 首先，我们用与重组水溶性人组织因子偶联的MECA32 mAb(MECA32-TF)治疗携带 HEP3B异种移植物肿瘤的SCID小鼠。使用了人TF，因为人TF在人和小鼠两者中有效地触发 血液凝结，且人TF的cDNA可商购得到。各携带肿瘤的小鼠通过在解剖显微镜下输注100 μ 1 磷酸盐缓冲盐水（PBS)中的24 μ g MECA32-TF (治疗组）或20 μ gMECA32 mAb (对照组）到 给肿瘤供血的右股动脉中进行处理。略低量的MECA32 mAbOOyg)用于针对较高分子量 的MECA32-TF进行调节。3D能量多普勒用于在处理前和处理后48小时评估肿瘤血流。结 果显示治疗组中MECA32-TF处理后肿瘤内血流信号的显著降低而在对照组中没有降低（图 7)。肿瘤生长的后续监测显示MECA32-TF处理组中肿瘤生长的显著抑制而在对照组中没有 抑制（图8)。本研宄的结果证实，与人TF偶联的抗-PLVAP单克隆抗体有效地治疗HCC异 种移植物。
[0202] MECA32-Fab_TF 的产生和表征
[0203] 对于TF与MECA32 mAb的化学交联，困难的是一致地和可重现地控制与MECA32 mAb交联的TF蛋白质分子数目和位点。通过化学交联制备的MECA32-TF不产生均一的产 物。MECA32-TF偶联物的高分子量（大约170kDa)也导致长的循环半衰期，使得引起不良副 作用的可能性增加。
[0204] 为了得到具有较短半衰期的结构上明确限定的均一治疗生物制品以限制脱靶 副作用，我们开发了由抗-PLVAP mAb的Fab部分和与重链恒定结构域1的羧基端连 接的人组织因子的细胞外结构域组成的新的重组蛋白质。我们然后制备抗-鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF重组蛋白质（MECA32-Fab-TF)。描绘这一重组蛋白质的结构的示意图显示 于图9中。
[0205] 纯化的MECA32-Fab-TF用于与生物素化MECA32 mA竞争结合小鼠 PLVAP。这些 结果表明MECA32-Fab-TF事实上保留其结合PLVAP的能力（图10)。六个不同批次的 MECA-32-Fab-TF的Scatchard分析也显示对小鼠 PLVAP的高结合亲和力，Kd为5. 7±1. 4x 10-8Μ。连接在MECA32Fd的羧基末端的TF也是功能性的且可以与因子Vila相互作用以激 活因子X。测量的组织因子特异性活性为每毫克MECA32-Fab-TF 90±22 μ g(n = 6)。
[0206] MECA32-Fab-TF对SCID小鼠中HEP3B肿瘤异种移植物的作用
[0207] 为证明重组MECA32-Fab_TF的治疗效果，我们首先进行两项剂量-反应研宄。对 于这两项研宄，MECA32-Fab-TF输注到给肿瘤供血的股动脉中。治疗后72小时，处死治疗的 小鼠并收获肿瘤用于组织学检验。对于第一项研宄，三个不同剂量的MECA32-Fab-TF(3yg、 6yg和12yg)用于治疗携带肿瘤的小鼠且对照组用12yg不含组织因子的MECA32单克 隆抗体处理。每个剂量有三只小鼠。对于第二项研宄，所使用的MECA32-Fab-TF剂量是 2. 5 μ g、5 μ g和10 μ g。每个剂量有两只小鼠。这两项研宄的结果总结和显示在图11和12 中。这些研宄的结果揭示，来自用MECA32-Fab-TF治疗的小鼠的肿瘤在所有剂量下发生大 量缺血性坏死。但是，IOyg或更高的剂量产生更一致的结果。在对照组中没有观察到或观 察到极少的肿瘤坏死。这些研宄的结果表明抗-PLVAP-Fab-TF是非常强效的且可以在72 小时内以低至2. 5 μ g/小鼠的剂量诱导显著的缺血性肿瘤坏死。
[0208] 抗-mPLVAP MECA32-Fab-TF在输注后不同时间点对HEP3B肿瘤异种移植物的组织 学的影响
[0209] 如上所述的研宄显示治疗后72小时肿瘤发生明显的缺血性坏死。为了了解坏死 如何在用抗-mPLVAP Fab共表达TF治疗后诱导，我们输注MECA32-Fab-TF到给肿瘤供血的 动脉中并在输注10 μ g MECA32-Fab-TF后的2小时、4小时、24小时、48小时和72小时收获 HEP3B肿瘤。在各时间点有两只携带肿瘤的小鼠。在这一试验的同一天也处死两只未处理 的小鼠以作为〇时基线对照。
[0210] 如图13A中所示，我们的结果揭示，肿瘤血管中的纤维蛋白血栓块可以在治疗后2 小时发现。含纤维蛋白血栓块的血管的数目在治疗后4小时和24小时变得更显著。肿瘤 细胞在4小时时开始彼此分离而具有更大的清晰空间，且这一变化在24小时时变得更明显 (图13B)。具有核染色损失的明显缺血性坏死在处理后48小时观察到且在72小时变得 更显著（图13A和13B)。在处理前（0小时）肿瘤血管中没有观察到纤维蛋白血栓块（图 13A)。能量多普勒研宄也揭示在输注后2小时主要肿瘤血管中血流的终止并持续到72小 时（图14)。这些发现证实抗-PLVAP-Fab-TF事实上可以结合肿瘤血管内皮细胞的PLVAP， 在肿瘤血管中诱导血凝块形成，产生血流的阻断和引起肿瘤坏死。
[0211] 抗-PLVAP MECA32-Fab-TF对HEP3B肿瘤异种移植物生长的影响
[0212] 接下来，我们研宄抗-PLVAP Fab-TF治疗对肿瘤生长的治疗效果。进行了两项不同 的研宄。第一项研宄是在治疗后监测肿瘤生长25天。该研宄在治疗后25天终止，因为对 照组中肿瘤的大尺寸使得必须停止研宄。肿瘤尺寸使用3D-超声检查监测。总结于图15、 16A和16B中的结果显示，单次输注5 μ g或10 μ g的MECA32-Fab-TF有效地抑制肿瘤生长， 但10 μ g无 TF的对照MECA32抗体不抑制肿瘤生长。
[0213] 对于第二项研宄，携带HEP3B肿瘤异种移 植物的SCID小鼠用动脉内输注的10 μ g MECA32-Fab-TF(n = 4)或10 μ g MECA32单克隆抗体（η = 2)治疗。肿瘤生长用3D超声检查 监测。当ΗΕΡ3Β肿瘤生长到大约2000立方毫米时，处死携带肿瘤的小鼠。这一研宄允许我们 评估治疗组中肿瘤生长的延迟。图17中总结的结果显示在单次输注10 μ gMECA32-Fab-TF 到给肿瘤供血的动脉中后存在肿瘤生长的显著延迟。治疗组中的肿瘤与对照小鼠相比多 花费42天生长到1600mm3。对照组和治疗组之间肿瘤生长到1600mm 3的平均天数分别是 9. 8±3. 0 天和 51. 8±3· 2 天（图 17)。
[0214] 总之，这两项不同研宄的结果进一步证实抗-PLVAP-Fab-TF输注到给肿瘤供血的 动脉中有效地诱导肿瘤坏死和控制肿瘤生长。
[0215] 抗-PLVAP-Fab-TF的系统性施用对肿瘤生长的作用
[0216] 为了了解MECA32-Fab_TF通过外周静脉的系统性施用是否也可以实现相同的治 疗效果，我们将10 μ g或20 μ g的MECA32-Fab-TF注射到携带HEP3B肿瘤异种移植物的 SCID小鼠的尾静脉中并监测注射后的肿瘤生长。对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水注射。各治疗 组具有三只小鼠。表17中总结的结果显示，当MECA32-Fab-TF通过尾静脉施用时，对肿瘤 体积没有统计学显著的效果。因此，抗-PLVAP MECA32-Fab-TF输注到给肿瘤供血的动脉中 是诱导肿瘤坏死和实现治疗效果必需的。有可能MECA32-Fab-TF的系统性施用导致注射的 MECA32-Fab-TF的稀释和在到达肿瘤血管前MECA32-Fab-TF与其它器官（例如，肺、肾和胃 肠器官）的血管内皮细胞上的PLVAP结合。
[0217] 抗-人PLVAP Fab-TF的产生和表征
[0218] 为了 了解相似的治疗剂是否可以针对人PLVAP产生，使用针对存在于人PLVAP 羧基末端的氨基酸序列PPAGIPVAPSS中的抗原性表位的人源化抗-人PLVAP单克隆抗 体。这一人源化抗-人PLVAP单克隆抗体是先前开发的并描述于美国专利申请公开 No. US20110262349A1 中。这一抗-人 PLVAP-Fab-TF 偶联物命名为 CSR02-Fab-TF (图 9)。 我们然后进行一系列研宄以比较CSR02-Fab-TF与MECA32-Fab-TF的组织因子特异性活 性和与靶PLVAP的结合亲和力。我们的研宄结果显示抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF表现 为与抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF相比具有每毫克抗-PLVAP Fab-TF的更高TF活性 且CSR02-Fab-TF和MECA32-Fab-TF两者具有相似的结合亲和力（表1)。该发现表明， CSR02-Fab-TF如MECA32-Fab-TF -样可以以足够的亲和力结合其PLVAP靶标且携带足以启 动血液凝结的TF活性以实现治疗效果。
[0219] 表 L 抗-人 PLVAP CSR02-Fab-TF 和抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF 之间每毫克 抗-PLVAP Fab-TF的组织因子（TF)特异性活性和与PLVAP的结合亲和力的比较。
[0220]
[0222] 如表1中总结的，研宄了三个不同批次的CSR02-Fab_TF和六个不同批次的 MECA32-Fab-TF。结果显示两种Fab-TF具有相似的结合亲和力。然而，CSR02-Fab-TF具有 比MECA32-Fab-TF更高的特异性TF活性。结果指示，CSR02-Fab-TF具有足够的结合亲和 力和组织因子特异性活性以实现如MECA32-Fab-TF-样的治疗肝细胞癌的治疗效果。
[0223] 基于我们的Hep3B异种移植物模型中治疗时的平均肿瘤体积和有效诱导肿瘤坏 死所需的MECA32-Fab-TF剂量，我们估计抗-PLVAP-Fab-TF通过输注到给肿瘤供血的动脉 中以治疗HCC的有效治疗剂量为每毫升（立方厘米）15 μ g-100 μ g。
[0224] 为进一步证明产生的CSR02-Fab_TF可以结合人HCC的血管内皮细胞，我们使 CSR02-Fab-TF生物素化并使用这一 Fab-TF研宄其与人HCC的血管内皮细胞的结合。我们的 研宄结果显示生物素化的CSR02-Fab-TF事实上结合HCC的血管内皮细胞且不结合非肿瘤 性肝组织的血管内皮细胞（图18)。这一研宄的结果证实CSR02-Fab-TF如MECA32-Fab-TF 一样可通过输注到给肿瘤供血的动脉中用于治疗患者的HCC。
[0225] 基于PLVAP在HCC的血管中和不在非肿瘤性肝组织中差异表达的知识，我们开发 了用于通过共表达抗-PLVAP单克隆抗体或其Fab片段上的人组织因子蛋白治疗HCC的新 的治疗剂。我们证明携带人组织因子的可溶性细胞外结构域的完整抗体及其Fab片段事实 上都可以在单次输注到给肿瘤供血的动脉中后诱导肿瘤坏死和抑制肿瘤生长。
[0226] 因为可溶性组织因子与抗-PLVAP抗体的化学偶联不能再现地控制相同数目组织 因子在相同位点与各抗体交联，因此我们建立重组的具有Fd链的羧基末端的抗-PLVAP 单克隆抗体Fab片段共表达人组织因子细胞外结构域，并使用这一重组蛋白作为治疗HCC 的治疗剂。为证明这种治疗剂事实上可以用于治疗HCC，首先建立携带源自HEP3B人肝 细胞癌细胞系的肿瘤的SCID小鼠并用于概念验证（proof-of-conc印t)研宄。我们然 后使用MECA32抗-小鼠 PLVAP杂交瘤产生抗-PLVAP-Fab-TF的小鼠形式。有必要开发 抗-PLVAP-Fab-TF的小鼠形式，因为生长到人HCC异种移植物中的血管来源于小鼠并表达 小鼠 PLVAP。我们表达抗-PLVAP Fab-TF的人和小鼠形式上的人组织因子，因为人组织因 子可以激活小鼠凝血因子VII并在小鼠中诱导血液凝结。我们进行的CSR02-Fab-TF和 MECA32-Fab-TF之间的对比研宄确认它们都可以以足够的亲和性结合其PLVAP靶标并携带 足够的组织因子活性以触发血液凝结和实现治疗效果。
[0227] 我们的研宄结果证明我们开发的重组抗-PLVAP-Fab-TF具有用于在将这一新型 治疗剂直接输注到给肿瘤供血的动脉中而非经外周静脉的系统性静脉内施用后通过触发 肿瘤血管中血凝块的形成、阻断肿瘤血流和诱导肿瘤坏死来治疗HCC的治疗效果。本申请 中描述的研宄也证实抗-人PLVAP单克隆抗体或其Fab片段共表达组织因子蛋白可以用于 治疗显示PLVAP表达限制于肿瘤血管的肿瘤（如成胶质细胞瘤）。
[0228] 应当理解，对于本申请中描述一些参数的所有数字边界限定，如"约"、"至少"、"小 于"和"大于"，所述描述也必然地包括以所述值为界的任何范围。因此，例如，至少1、2、3、 4或5的描述也尤其记述1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5和4-5的范围等。
[0229] 对于本文中引用的所有专利、申请或其它参考文献，如非专利文献和参照序列信 息，应当理解其为所有目的以及对于所引用的主题通过引用并入。在其中通过引用并入的 文献和本申请之间存在冲突的情况中，以本申请为准。与本申请中公开的参照基因序列相 关的所有信息，如Gene ID或登录号（通常指NCBI登录号），包括例如基因组基因座、基因 组序列、功能注释、等位基因变体及参照mRNA(包括，例如，外显子边界或反应元件）和蛋 白质序列（如保守结构域结构、Homologene类目等等）以及化学基准（例如，Pub Chem化 合物、Pub Chem物质或Pub Chem Bioassay类目，包括其中的注释如结构和分析等等），通 过引用全文并入本文。
[0230] 用于本申请中的标题仅为方便的目的而不影响本申请的解释。
[0231] 本发明提供的各方面的优选特征可加以必要变更以应用于本发明的所有其它方 面，且通过（不限于）从属权利要求示例，并且也包括本发明特定实施方式和方面（包括工 作实施例）的单个特征（例如，元件，包括数值范围和示例性实施方式）的组合和排列。例 如，工作实施例中示例的特定实验参数可以适应用于要求保护的发明点而不脱离本发明。 例如，对于所公开的材料，尽管这些化合物的各不同单个化合物及总体的组合和排列中的 特定指称可以不明确地公开，但其在本文中各自具体地设想和描述。因此，如果元素 A、B 和C的类以及元素 D、E和F的类和元素 A-D的组合实例被公开，则即使各元素未单独地阐 述，则其各自单独地或总体地设想到。因此，在这一实例中，特别地设想组合a-e、a-f、b-d、 B-E、B-F、C-D、C-E和C-F的各组合并应当认为其从A、B和C ;D、E和F及示例组合A-D的 公开中公开。类似地，这些中的任何亚集或组合也特别地设想和公开。因此，例如，A-E、B-F 和C-E的亚组特别地设想到并应当认为其从A、B和C ;D、E和F及示例组合A-D的公开中 公开。这一概念适用于本申请的所有方面，包括物质组合物的元素和制备或使用该组合物 的步骤。
[0232] 如本领域普通技术人员按照本说明书的教导所认识的，本发明的前述方面可以以 任何组合或排列主张以达到相对于现有技术新颖和非显而易见的程度一因此在一个元素 在本领域普通技术人员已知的一篇和多篇参考文献中描述的情况下，它们可以特别地通过 特征或特征组合的否定式限制或放弃从所要求保护的发明中排除。
[0233] 尽管本发明特别地参照其示例实施方式显示和描述，本领域技术人员理解，可以 对其进行形式和细节的各种改变而不脱离所附权利要求涵盖的本发明的范围。
【主权项】
1. 一种包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中所述抗体特异性地结合哺乳动物 PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。2. 如权利要求1的偶联物，其中所述凝结剂是凝血蛋白。3. 如权利要求2的偶联物，其中所述凝血蛋白是组织因子。4. 如权利要求3的偶联物，其中所述组织因子包含与SEQIDNO: 1具有至少40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；更优选与5￡0IDN0:1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性；还更优选与5￡0 1〇勵：1具 有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。5. -种包含通过肽键与抗体偶联的组织因子的偶联物，该组织因子与SEQIDNO: 1具 有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，其中所述 抗体特异性地结合人PLVAP蛋白的细胞外结构域中的表位。6. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述哺乳动物PLVAP蛋白包含与SEQIDNO:2 具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列； 更优选与SEQIDN0:2具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，还更优选与 SEQIDN0:2 具有至 95、96、97、98、99%或更高同一性。7. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体特异性地结合选自PPAGIPVAPSSG或 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM的表位。8. 如权利要求7的偶联物，其中所述抗体特异性地结合表位PPAGIPVAPSSG。9. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体化学交联。10. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过肽键连接。11. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体是包含轻链可变区和重链可变区的 免疫球蛋白且其中所述凝结剂是凝血蛋白。12. 如权利要求11的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过在包含重链可变区的蛋白 质的羧基末端与所述凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。13. 如权利要求11的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过在包含轻链可变区的蛋白 质的羧基末端与所述凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。14. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝结剂是凝血蛋白且所述凝血蛋白与抗 体经由接头肽通过肽键连接。15. 如权利要求14的偶联物，其中所述接头肽包含（Gly4-Ser)n，其中n是1、2、3、4、5 或6;更优选其中n是3。16. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体是包含以下的免疫球蛋白： i) 包含含有SEQIDN0:3的氨基酸序列的可变区中的CDR的重链可变区和包含含有 SEQIDN0:4的氨基酸序列的可变区中的CDR的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变区和 重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换；或 ii) 包含含有SEQIDN0:5的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含含有 SEQIDN0:6的氨基酸序列的可变区中的CDR的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变区和 重链可变区在各⑶R中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换。17. 如权利要求16的偶联物，其中所述轻链可变区和/或重链可变区是人源化的。18. 如权利要求17的偶联物，其中所述轻链可变区和重链可变区由以下给出： i) 选自SEQIDN0:7、8、9、10或11的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区是SEQ IDNO: 11;和选自SEQIDNO: 12、13或14的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可变区是 SEQIDNO:13 ;或 ii) 选自SEQIDNO: 15、16、17、18或19的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区 是SEQIDNO: 19;和选自SEQIDN0:20、21或22的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可 变区是SEQIDNO:22。19. 如权利要求14的偶联物，其中所述偶联物包含与SEQIDNO:23具有至少80、85、 90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列。20. -种药物组合物，包含前述权利要求任一项的偶联物，其中该组合物进一步包含合 适的载体、赋形剂和/或造影剂。21. 如权利要求20的药物组合物或如权利要求1-19任一项的偶联物，其为适合施用于 受试者的剂型。22. -种核酸，其编码权利要求1-8或10-19任一项的偶联物。23. -种载体，其包含权利要求22的核酸。24. -种宿主细胞，其包含如权利要求23的载体或如权利要求22的核酸。25. 如权利要求24的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞，更特别地其中所述细 菌细胞是大肠杆菌。26. 如权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞是选自真菌如酵母，包括芽殖酵母；昆虫 细胞如SfO、Sf21或highfive细胞；或哺乳动物细胞如CH0、VER0或COS细胞的真核细胞。27. -种制备权利要求1-8或10-19任一项的偶联物的方法，包括在支持权利要求 24-26任一项的宿主细胞表达所述偶联物的条件下培养所述宿主细胞和分离所表达的偶联 物。28. -种在需要的哺乳动物受试者中治疗具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤、减小具有 PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的体积或者诱导具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的血栓形成和 肿瘤坏死的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-19任一项的偶联物或 权利要求20或21的药物组合物。29. 如权利要求28的方法，其中所述肿瘤是HCC且HCC肿瘤体积在施用所述偶联物后 通过血栓形成和坏死来减小。30. 如权利要求28或29的方法，其中所述受试者是人。31. 如权利要求28-30任一项的方法，其中所述偶联物血管内施用到所述受试者的肿 瘤。32. 如权利要求28-31任一项的方法，其中所述偶联物直接输注到一个或多个给肿瘤 供血的动脉中。33. -种在需要的人类受试者中治疗HCC的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量 的权利要求1-19任一项的偶联物或权利要求20或21的药物组合物，其中所述偶联物或组 合物直接输注到一个或多个给肿瘤供血的动脉中。34. 如权利要求28-33任一项的方法，其中所述受试者同时或顺序经受一种或多种化 疗剂、放射疗法、肿瘤内酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治 疗。35. 如权利要求34的方法，其中所述偶联物与一种或多种化疗剂一起施用于所述受试 者。36. 如权利要求35的方法，其中所述一种或多种化疗剂包括治疗有效量的过索拉非 尼、贝伐单抗或其它抗血管生成治疗药。37. 如权利要求35的方法，其中所述偶联物在进一步包含所述一种或多种化疗剂的药 物组合物中施用于所述受试者。38. 如权利要求28-37任一项的方法，其中所述具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤是成胶 质细胞瘤。39. 如权利要求28-38任一项的方法，其中所述偶联物以约5-约200yg/cm3肿瘤，更 特别地约10-约150yg/cm3肿瘤和更特别地约15-约100yg/cm3肿瘤的剂量施用。40. 如权利要求28-39任一项的方法，其中所述偶联物以单一剂量施用。41. 如权利要求28-39任一项的方法，其中所述偶联物以2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多 个剂量施用。42. 如权利要求41的方法，其中所述多个剂量在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者1、 2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月或更长时间段内施用。
【专利摘要】一种用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品。本发明特别地提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中所述抗体特异性地结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。这些试剂特异性地靶向HCC肿瘤并治疗HCC。本发明还提供使用这些偶联物的方法，如通过施用本发明提供的偶联物或本发明提供的组合物如药物组合物治疗HCC的方法。PTA-996320090408PTA-996420090408
【IPC分类】C12N15/62, C12P21/00, A61K38/36, C07K19/00, A61P35/00, A61K47/48
【公开号】CN104892767
【申请号】CN201410648801
【发明人】高国彰, 王芸馨
【申请人】中国合成橡胶股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年11月14日
【公告号】CA2871114A1, EP2915545A1, US20150140021
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