水貂绿脓杆菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗的制作方法
水貂绿脓杆菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水貂绿脓杆菌疫苗，尤其涉及一种水貂 绿脓杆菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，又称绿脓杆菌，是一种条件性致病菌， 对外界环境适应能力很强，在潮湿环境下可以长期存活。绿脓杆菌能引起水貂发生急性传 染病，以出血性肺炎和败血症为主要特征，发病急，死亡快，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红 色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。常呈地 方性暴发流行，发病貂场死亡率在10%~50%，给养貂业造成了较大的经济损失。
[0003] 目前，对绿脓杆菌感染的治疗有抗菌素和免疫两种治疗方法。常用药物替米考星、 阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，这是由于长期使用抗菌素治疗水貂绿脓杆菌导致大 量耐药菌株的产生，并破坏了动物机体中正常菌群，引起继发感染，从而导致治疗失败。目 前已检测出11型绿脓杆菌，因此单一价态的水貂绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求。 传统的全菌苗和亚单位疫苗均为细菌的某一成分的整体结构，如外毒素或鞭毛蛋白；副作 用明显，如产生过敏反应，对水貂会造成严重的病理性损伤；而且制备方法烦琐，费时、费 力、产量极低，纯度更低。
[0004] 发明专利申请201210095852. 4公开了 "一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备 工艺"。该申请公开了一种由两种绿脓杆菌菌株制备的水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。将所 述绿脓杆菌菌株接种培养基通气扩增培养，收获培养物灭活后按1:1比例混合，加蜂胶制 备水貂蜂胶绿脓杆菌二价灭活疫苗。该发明所述的绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗为全菌苗，因此 极有可能产生副作用。如产生过敏反应，对水貂会造成严重的病理性损伤；而且制备方法烦 琐，费时、费力、产量极低，纯度更低。
【发明内容】
[0005] 针对目前水貂绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫需求的现状，本发明提供了一种水 紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗并对其免疫效果进行评价。
[0006] 本发明的技术方案是：exoA_fIiC嵌合蛋白，序列为由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 和序列为SEQ ID NO: 1的核苷酸序列；所述exoA-fliC嵌合蛋白的编码基因为水貂绿脓杆 菌exoA的I+II区与fliC的N端510bp ;所述嵌合蛋白能够引起针对水紹绿脓杆菌的保护 性免疫。
[0007] 优选的是，所述exoA-fliC嵌合蛋白经糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。
[0008] 水紹绿脓杆菌亚单位疫苗，包含药学有效量的exoA-fliC嵌合蛋白，所述疫苗能 够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上可接受的媒介物。所述疫苗中嵌 合蛋白的浓度为0. 350~0. 766mg/ml。
[0009] 所述疫苗中还含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml。所述蜂 胶干物质购买自滨州华宏生物制品有限责任公司。
[0010] 水紹绿脓杆菌exoA-f IiC嵌合蛋白经Western blot检测，发现重组蛋白具有与水 貂绿脓杆菌全菌制的抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性。
[0011] 术语"药学上可接受的媒介物"意指任何合适的常用于药物制剂的可接受的赋形 剂、佐剂、载体、稀释剂。
[0012] 水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，通过下述方法制备：向嵌合蛋白上清中加入蜂胶溶液， 使蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml ;充分搅拌使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋 白亚单位疫苗。所述重组蛋白上清中蛋白浓度为0. 350~0. 766mg/ml。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] (1)本发明得到的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗经皮下接种6-8周龄 的BALB/c小鼠，免疫4次后，于免疫后72天至9周取血测抗体，诱导产生了较高水平的 exoA-fliC特异性IgG抗体，其IgGl/IgG2a比值亦显著升高，明显倾向于Th2型免疫应答。 经皮下接种4-6月龄的健康貂，接种21d后取血测绿脓杆菌抗体，免疫组绿脓杆菌抗体全 部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。本结果显示制备的水貂绿脓杆菌 exoA-fliC基因工程亚单位疫苗可以引起水貂的免疫应答。
[0015] (2)本发明使用基因工程的方法制备水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗，不 但安全性大大提高，而且制备过程省时、省力、产量高。
【附图说明】
[0016] 图1是实施例1中exoA-fliC融合基因扩增结果；
[0017] 图2是实施例1中exoA-f IiC嵌合蛋白SDS-PAGE可溶性分析；
[0018] 图3是实施例1SDS-PAGE法分析exoA-fliC嵌合蛋白的纯度；
[0019] 图4是实施例2中exoA-fliC嵌合蛋白的western blot分析；
[0020] 图5是实施例5重组exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗免疫小鼠血清中特异性抗体 水平。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
[0022] 实施例1 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白的表达及纯化
[0023] 1、细菌基因组DNA的提取
[0024] 水貂绿脓杆菌山东分离株PASD01 (经PCR方法分型鉴定为鞭毛抗原基因 A型）过 夜培养5ml备用，取Iml菌液至灭菌I. 5ml的离心管中，8000r/min离心5分钟，弃去上清， 用IOOul的双蒸水重悬。沸水煮15分钟，放在-20°C或-80°C冰柜反复冻融3次。5000r/ min离心5分钟，收集上清，即为所提DNA。-20°C保存备用。
[0025] 2、引物设计和exoA基因、fliC基因的克隆、测序
[0026] (1)引物设计
[0027] 应用Primer 5. 0设计exoA(I区+11区）基因的上下游引物，根据铜绿假单胞菌 鞭毛蛋白8821型设计fliC基因的引物。在exoA基因的上游引物引入Bam HI酶切位点， 在fliC基因的下游引入Xho I酶切位点。引物序列分别是：
[0028] exoA 上游引物：5 ' -GGATCCGCCGAGGAAGCCTTCGAC-3 '
[0029] exoA 下游引物：5 ' -GTGTTGACGGTCAAGGCCATGCCGTCGCCGAGGAACTC-3 '
[0030] fliC 上游引物：5' -GAGTTCCTCGGCGACGGCATGGCCTTGACCGTCAACACCAAC-3'
[0031] fliC 下游引物：5' -CTCGAGTGTTCAGCGACTCTGCGCTCATCTC-3?
[0032] 下划线分别是Bam HI、Xho I酶切位点；
[0033] (2) exoA基因和fliC基因的扩增
[0034] 首先，以上述提取的细菌基因总DNA为模板，进行PCR扩增。
[0035] 扩增 exoA基因与 fliC基因的反应体系为：10XPfu Buffer with MgS042+2.5 yL， d NTP 2 μ L，上游引物 0.5 μ L，下游引物 0.5 μ L，模板 I μ L，Pfu DNA Polymerase 0.5 μ L， 灭菌去离子水14. 0 μ L，40%的甘油3 μ L，DMS01 μ L。
[0036] 扩增exoA基因的PCR反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性lmin，68. 2°C退火 1111；[11，72。(^延伸3111；[11，30。5^168,72。(^延伸20111；[11。
[0037] 扩增fliC基因的PCR反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性lmin，57. 9°C退火 lmin，72°C延伸2. 5min，30cycles，72°C延伸20min。反应完毕后取5 μ L的反应产物，1 %的 琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
[0038] (3) PCR产物回收
[0039] 灌制可上样100 y L的1. 0%琼脂糖凝胶，将PCR产物分别加入电泳上样孔中，指示 剂迀移至适当位置时停止电泳，在365nm紫外光下切下含目的片段的凝胶，移入1.5ml EP 管中，称取重量后，参照OMEGA公司的普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒说明书进行。
[0040] (4) exoA基因、fliC基因与T载体的连接
[0041] 将上述ex〇A，fliC基因片段胶回收产物进行加 A (Pfu高保真酶不可以自动加 A， 没法连普通的T载体），反应体系为：Taq酶0.5 μ L，10 X Buffer 1 μ L，d ΝΤΡ0. 5 μ L，胶回 收产物8 μ L。反应程序：72°C 20min。
[0042] 将加 A后的产物分别连到pMD19-T Vector上，连接体系为：pMD19-T Vector luL，目的基因片段4yL，Solution I 5yL，4°C连接过夜。将连接产物导入到DH5a感 受态细胞中，涂布于含有〇. lmg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板，37°C培养过夜；挑取单菌 落经菌液PCR及质粒酶切鉴定正确后测序，即得到插入序列正确的重组克隆载体，命名为 pMD19-T-exoA，pMD19-T-fliC。
[0043] 3、构建重组克隆载体 pMD19-T-exoA-f IiC
[0044] 将上述的pMD19-T-exoA，pMD19-T_fliC为模板，分别扩增exoA与fliC基因片段， exoA与fliC的PCR产物胶回收。以回收产物作为模板，以exoA的上游引物与fliC的下游 引物作为一对引物来扩增exoA-fIiC融合基因。
[0045] 反应体系为：10 XPfu Buffer with MgS042+2. 5 μ L，d NTP 2 μ L，exoA 上游引物 0.5yL，fliC下游弓丨物0.5yL，exoA胶回收产物2yL，fliC胶回收产物lyL，Pfu DNA Polymerase 0· 25 μ L，灭菌去离子水 12. 25 μ L，40% 的甘油 3 μ L，DMS01 μ L0
[0046] 反应程序：94°C 预变性 5min ;94°C 变性 lmin，68°C 退火 lmin，72°C 延伸 4min， 30cycles，72°C延伸20min。I %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果，产物经I %的琼脂糖凝胶 电泳割胶回收。exoA-fliC融合基因扩增结果如图1所示（泳道M为DL 5000DNA Marker， 泳道1为exoA-fIiC融合基因扩增产物，泳道2为阴性对照）。
[0047] 将上述回收的exoA-fliC融合基因片段胶回收产物进行加 A反应，反应体系如上 所述。将加 A产物连到pMD19-T Vector上，连接体系为：pMD19-T Vector lyL，目的基 因片段4yL，Solution I 5yL，4°C连接过夜。将连接产物导入到DH5a感受态中，经菌 液PCR及酶切鉴定，筛选阳性克隆进行测序。得到插入序列正确的重组克隆载体，命名为 pMD19-T-exoA-fliC。
[0048] 4、构建重组表达质粒pET30a-exoA-fliC
[0049] 利用限制性内切酶Bam HI、Xho I分别对阳性克隆质粒pMD19-T-exoA-fliC和表 达载体pET30a进行双酶切，胶回收后用T4DNA连接酶，16°C连接过夜。然后转化到DH5 α感 受态细胞中，涂布于含有〇. 〇5mg/ml卡那霉素的LB培养基平板，挑取单菌落经菌液PCR及 质粒酶切鉴定正确后送测序公司测序，测序结果如SEQ ID NO :1所示。
[0050] 5、exoA-fliC 嵌合蛋白在 E. coli BL21(DE3)中的表达
[0051] 将构建的表达重组质粒pET30a-exoA-fliC转化至E. coli BL21(DE3)中在含有 50 μ g/ml卡那霉素的IOml LB培养基中进行培养，培养18h后，转到含有50 μ g/ml卡那霉 素的100ml LB培养基中，37°C，180转/min摇菌培养。当OD6tltl等于0. 5时，用0. 9mmol/L 的IPTG进行诱导表达，37°C，180转/min继续诱导培养6h。7000 X g离心10min，用3ml的 裂解缓冲液进行溶解，在冰上进行超声处理，收集细菌。细胞裂解后，在SOOOXg下离心10 分钟，将上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，重组蛋白存在于超声破碎产物沉淀中，提示重 组exoA-fliC嵌合蛋白为包涵体表达。
[0052] SDS-PAGE 分析结果如图 2 所示（泳道 M 为 BluePlus ProteinMarker 14-100kDa， 泳道1为BL21 (DE3) /pET30a-exoA-f IiC IPTG诱导菌超声破碎上清，泳道2为BL21 (DE3) / pET30a-exoA_f IiC IPTG诱导菌超声破碎沉淀）。
[0053] 6、exoA-fliC包涵体蛋白的纯化
[0054] 用Ni-NTA亲和层析法纯化His-标记的嵌合蛋白，用8M的尿素进行变性。经超声 处理的沉淀（包涵体）用PBS和1 % Triton X-100洗3次，然后溶解在4-6毫升的8M尿 素裂解缓冲液中。将上清液与2ml的树脂混合，在室温下孵育混30分钟并转移到层析柱 中。污染的蛋白质用洗涤缓冲液（20mM磷酸钠，300mM的氯化钠，50mM的咪唑，pH 8. 0)从 柱子上洗脱下来。用洗脱缓冲液（20mM磷酸钠，300mM的NaCl和250mM的咪唑，pH 8. 0) 洗脱，收集蛋白质，即exoA-fliC嵌合蛋白。用61、41、211、说的尿素及？85(?!17.4)依次 进行梯度复性，通过SDS-PAGE法分析蛋白质的纯度。分析结果如图3所示（泳道M为 BluePlus ProteinMarker 14-100kDa，泳道 1 为 BL21(DE3)/pET30a-exoA-fliC IPTG 诱导 产物纯化前，泳道2为BL21(DE3)/pET30a-exoA-fliC IPTG诱导产物纯化后）。用核酸蛋白 分析仪评估蛋白质浓度，结果显示所获得的蛋白浓度为〇. 4mg/ml。实施例2 :水貂绿脓杆菌 exoA-fliC嵌合蛋白的鉴定
[0055] 采用免疫印迹法用来评价exoA-fliC嵌合蛋白的免疫学特性。具体方法为：将蛋 白产物用SDS-PAGE凝胶进行分离，并转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 37°C封 闭2h。用TBST漂洗后，以100倍稀释的兔抗水貂绿脓杆菌鞭毛蛋白血清作为一抗，37°C孵 育过夜，漂洗。加入1:3000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 20ml，37 °C孵育Ih，TBST漂洗3 次，6min/次，将ECL发光液加到PVDF膜上，去尽残液，放入X-光片夹中进行曝光。Western blot鉴定结果见图4所示（泳道1为BL21(DE3)/pET30a-exoA-fliC IPTG诱导产物，泳道 2为BL21 (DE3)/pET30a空载对照）。结果表明，重组蛋白具有与水貂绿脓杆菌全菌制备的 抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性。
[0056] 实施例3 :细菌半数致死量的测定
[0057] 30只BALB/c小鼠随机分成5组（每组6只小鼠），测定绿脓杆菌半数致死 量（LD 5tl)。小鼠腹腔注射绿脓杆菌，用SDOl株绿脓杆菌菌液分别以2. 5X 106, 5X 106， 7. 5X106，1X107，I. 25X 108CFU/ml浓度攻毒，观察记录IOd内小鼠的死亡率，用改良 寇式法计算SDO1株菌液的LD 5tl，通过计算可知SDO1株菌液对BALB/c小鼠的LD5tl为 3. 75X 106CFU/ml〇
[0058] 以同样的方法对4-6月龄的健康貂进行攻毒，通过计算，可知SDOl株菌液对水貂 的 LD5tl为 2. 83 X 10 6CFUAil。
[0059] 实施例4 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗的制备及检验
[0060] 疫苗制备：
[0061] 向重组蛋白上清中加入蜂胶溶液，使蜂胶干物质的含量为10_15mg/mL ;充分搅拌 使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋白亚单位疫苗。通过三个批次的试验制备相应批 次的蛋白亚单位疫苗，试验批号为201501、201502、201503。所述三个批次试验的蛋白上清 中蛋白浓度分别为0. 350mg/mL，0. 555mg/mL和0. 766mg/mL，所述蜂胶干物质的含量分别为 15mg/mL，10mg/mL 和 12. 5mg/mL〇
[0062] 疫苗成品检验：
[0063] (1)无菌检验
[0064] 参照《中华人民共和国兽用生物制品制造与检验规程》《中华人民共和国兽用生物 制品质量标准（2001版）》要求进行操作；
[0065] (2)物理性状检验
[0066] 分别在静止与摇匀状态下观察颜色、形态；
[0067] (3)超剂量安全检验
[0068] 将制备的3批疫苗201501、201502、201503分别取3ml免疫家兔，30d内观察接种 疫苗实验动物的采食、精神状态以及局部吸收状况，同时设立PBS对照组。
[0069] 结果显示，所有批次水貂出血性疫苗无菌检验均为阴性；3倍超剂量免疫接种，经 30d观察接种疫苗动物与对照组动物的采食、精神状况、局部吸收状况未出现明显异常变 化。
[0070] (4)最小免疫剂量测定
[0071] 将100只BALB/c小鼠，随机分为10组，每组10只。第1、5组分别皮下注射0. 025ml 水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗；第2、6组分别皮下注射0. 05ml亚单位疫 苗；第3、7组分别皮下注射0.1 ml亚单位疫苗；第4、8组分别皮下注射0. 2ml亚单位疫苗； 第9、10不做免疫。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚 单位疫苗。
[0072] 免疫21d后，第1、2、3、4组分别皮下注射SDOl菌株；第5、6、7、8组分别皮下注射 水貂绿脓杆菌山东分离株SD03菌株（经PCR方法分型鉴定为鞭毛抗原基因 B型）；观察记 录小鼠死亡情况，结果见表1所示。
[0073] 表1水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对小鼠的MID测定结果
[0074]
[0075] 结果显示，水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗不同剂量免疫小鼠21d 后，用含有2XLD5QSD01、SD03菌株分别攻毒，0. lml、0. 2ml免疫组均达到100%保护；0. 05ml 免疫组对SDOl菌株达到100 %保护，对SD03达到80 %的保护；0. 025ml免疫组对SDOl、SD03 菌株保护率为70 %、60 %;对照组全部死亡。根据实验结果，确定水貂绿脓杆菌菌exoA-f IiC 嵌合蛋白亚单位疫苗对小鼠的最小免疫剂量为〇. 〇5ml。
[007 6] 将50只水紹，随机分成10组，每组5只。第1、5组分别皮下注射0.1 ml水貂绿脓 杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗；第2、6组分别皮下注射0. 25ml亚单位疫苗；第3、7 组分别皮下注射0. 5ml亚单位疫苗；第4、8组分别皮下注射Iml亚单位疫苗；第9、10不做 免疫。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0077] 免疫21d后，第1、2、3、4组分别皮下注射SDOl菌株；第5、6、7、8组分别皮下注射 SD03菌株；观察记录小鼠死亡情况。结果见表2所示。
[0078] 结果显示，水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗不同剂量免疫水紹21d 后，用含有2XLD5(ISD01、SD03菌株分别攻毒，lml、0. 5ml免疫组均达到100%保护；0. 25ml 免疫组对SDOl菌株达到100 %保护，对SD03达到80%的保护；0.1 ml免疫组对SDOl、SD03 菌株保护率为80 %、60 %;对照组全部死亡。根据实验结果，确定水貂绿脓杆菌菌exoA-f IiC 嵌合蛋白亚单位疫苗对水貂的最小免疫剂量为〇. 25ml。
[0079] 分别采用201501批次和201502批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚 单位疫苗进行最小免疫剂量测定的相关实验，结果与采用201503批次的水貂绿脓杆菌 exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗一致。
[0080] 表2水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对水紹的MID测定结果
[0081]
[0082] 实施例5 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗免疫效果评价
[0083] 1.实验动物免疫
[0084] 将30只BALB/c健康小鼠，随机分为3组，每组10只。第1组皮下注射201503批 次的水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗0. 2ml。第2组皮下注射0. 2ml的蜂胶 佐剂，第3组皮下注射0. 2ml PBS作为空白对照组。
[0085] 2. ELISA 检测
[0086] (1)免疫后9周将各组小鼠摘除眼球并收集血清，_20°C保存备检。
[0087] (2)将exoA-fliC嵌合蛋白稀释至5 μ g/ml，100 μ 1/孔进行常规包被96孔板。
[0088] (3)各组小鼠血清样本用过滤后的无菌PBS按1:200倍比稀释，200 μ 1/孔加至每 列第一孔，每列第2至8孔分别加入100 μ I PBS，每个样本做复孔，然后从第一孔取100 μ 1 加到第2孔中依次进行倍比稀释至1:25600,空白对照孔加入包被缓冲液100 μ 1。
[0089] ⑷HRP标记兔抗鼠二抗的稀释度分别为：IgG 1:5000, IgGll: 10000， IgG2a:1:10000 ；
[0090] (5)结果处理：将每一个样本OD值减去空白对照孔OD值后，同一血清样品复孔取 平均OD值。其中以PBS阴性对照组的OD值为阴性对照（N)，免疫组为样本（P)，当血清P/ N值3 2. 1即可判断为阳性。抗体滴度以出现阳性结果的最高稀释倍数的倒数表示。
[0091] (6)结果计算于：各样品结果表示为Iogltl(抗体滴度），每个样品复孔间取平均值 即为该小鼠的实际值，同一小组内计算平均值和标准误，进行统计分析。IgGl :IgG2a以每 只小鼠的抗体滴度相比，同一组内结果以平均值土标准误表示并进行统计学分析。
[0092] 将15只健康水貂随机分为3组，每组5只。第1组皮下注射201503批次的水貂 绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗lml，第2组皮下注射Iml的蜂胶佐剂，第3组皮 下注射ImlPBS作为空白对照组。方法同小鼠抗体的测定。结果显示exoA-fliC嵌合蛋白 组水貂体内产生最高水平的特异性IgG抗体。实验结果见表3和图5。
[0093] 由实验结果可见：佐剂对照组中无明显的特异性IgG抗体及其亚类产生； exoA-fl iC嵌合蛋白组小鼠体内产生最高水平的不同类型抗体滴度，即IgG (1:12800)， IgG2a(l:1600)和 IgGl(l:6400)。exoA-fliC 组 IgGl/IgG2a 比值最高（4. 13±0.67)。
[0094] 表3小鼠体内IgG、IgGl、IgG2a抗体水平的测定结果
[0095]
[0096] 3.免疫攻毒保护试验
[0097] 表4水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对小鼠免疫保护试验定结果
[0098]
[0099] 将60只BALB/c健康小鼠，随机分为6组，每组10只。第1、2组分别皮下注射0. 2ml 水貂绿脓杆菌exoA-fliC基因工程亚单位疫苗，第3、4组分别皮下注射0. 2ml的蜂胶佐剂， 第5、6组皮下注射0. 2mlPBS作为空白对照组。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓 杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0100] 免疫后21d，第1、3、5组分别进行皮下注射2XLD5(ISD01菌株，第2、4、6组分别进 行皮下注射2XLD 5(ISD03菌株观察记录死亡情况。结果见表4。
[0101] 由表4可知，水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗免疫小鼠21d后，用 2 X LD5tlSDOl、SD03菌株分别攻毒，均可获得100%的保护率，佐剂组获得20 %、10%的保护 率，对照组全部死亡；结果表明水貂绿脓杆菌exoA-f IiC嵌合蛋白疫苗对小鼠对SDOI、SD03 有良好的免疫保护效果。
[0102] 表5水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对水紹免疫保护试验定结果
[0103]
[0104] 将30只水貂，随机分为6组，每组5只。第1、2组分别皮下注射Iml水貂绿脓杆 菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗，第3、4组分别皮下注射Iml的蜂胶佐剂，第5、6组皮下 注射ImlPBS作为空白对照组。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC 嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0105] 免疫后21d，第1、3、5组分别进行皮下注射SDOl菌株，第2、4、6组分别进行皮下注 射SD03菌株，观察记录死亡情况。结果见表5。
[0106] 由表5结果显示，攻毒的PBS空白对照组、蜂胶佐剂全部死亡，嵌合蛋白亚单位疫 苗对SDOl菌株攻毒水貂的保护率为100%，对鞭毛蛋白为b型的SD03菌株攻毒水貂的保护 率为100%，表明该嵌合蛋白亚单位疫苗对鞭毛蛋白为a、b型的菌株都有较强的免疫保护 作用。
[0107] 分别采用201501批次和201502批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位 疫苗进行免疫效果评价的相关实验，结果与采用201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌 合蛋白亚单位疫苗一致。
【主权项】
1. 嵌合蛋白exoA-fliC，其特征在于：序列为由SEQIDNO: 2的氨基酸序列和序列为 SEQIDN0:1的核苷酸序列；所述嵌合蛋白exoA-fliC的编码基因为水貂绿脓杆菌exoA的 I+II区与fliC的N端510bp;所述嵌合蛋白能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫。2. 根据权利要求1所述的嵌合蛋白exoA-fliC，其特征在于：所述嵌合蛋白exoA-fliC 经糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。3. 水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：包含药学有效量的权利要求1或2所述的 嵌合蛋白exoA-fliC，所述疫苗能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上 可接受的媒介物。4. 根据权利要求3所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中嵌合蛋 白的浓度为〇. 350~0. 766mg/mL。5. 根据权利要求3或4所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中还 含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml。6. 根据权利要求3或4所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包 括以下步骤：向exoA-fliC嵌合蛋白上清中加入蜂胶溶液，使蜂胶干物质的含量为10~ 15mg/mL;充分搅拌使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋白亚单位疫苗。7. 根据权利要求6所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述 exoA-fliC嵌合蛋白上清中蛋白浓度为0. 350~0. 766mg/mL。
【专利摘要】本发明提供了一种水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗，包含药学有效量的exoA-fliC嵌合蛋白。exoA-fliC嵌合蛋白的序列为由SEQ ID NO:2的氨基酸序列和序列为SEQ ID NO:1的核苷酸序列；所述exoA-fliC嵌合蛋白的编码基因为水貂绿脓杆菌exoA的I+II区与fliC的N端510bp。所述疫苗能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上可接受的媒介物。所述疫苗中嵌合蛋白的浓度为0.350～0.766mg/ml。所述疫苗中还含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10～15mg/ml。本发明使用基因工程的方法制备水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗，不但安全性大大提高，而且制备过程省时、省力、产量高。
【IPC分类】C07K19/00, C07K14/21, A61K39/104, A61P31/04
【公开号】CN104892768
【申请号】CN201510240573
【发明人】秦晓冰, 单虎, 马凤芹
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水貂绿脓杆菌疫苗，尤其涉及一种水貂 绿脓杆菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，又称绿脓杆菌，是一种条件性致病菌， 对外界环境适应能力很强，在潮湿环境下可以长期存活。绿脓杆菌能引起水貂发生急性传 染病，以出血性肺炎和败血症为主要特征，发病急，死亡快，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红 色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。常呈地 方性暴发流行，发病貂场死亡率在10%~50%，给养貂业造成了较大的经济损失。
[0003] 目前，对绿脓杆菌感染的治疗有抗菌素和免疫两种治疗方法。常用药物替米考星、 阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，这是由于长期使用抗菌素治疗水貂绿脓杆菌导致大 量耐药菌株的产生，并破坏了动物机体中正常菌群，引起继发感染，从而导致治疗失败。目 前已检测出11型绿脓杆菌，因此单一价态的水貂绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求。 传统的全菌苗和亚单位疫苗均为细菌的某一成分的整体结构，如外毒素或鞭毛蛋白；副作 用明显，如产生过敏反应，对水貂会造成严重的病理性损伤；而且制备方法烦琐，费时、费 力、产量极低，纯度更低。
[0004] 发明专利申请201210095852. 4公开了 "一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备 工艺"。该申请公开了一种由两种绿脓杆菌菌株制备的水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。将所 述绿脓杆菌菌株接种培养基通气扩增培养，收获培养物灭活后按1:1比例混合，加蜂胶制 备水貂蜂胶绿脓杆菌二价灭活疫苗。该发明所述的绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗为全菌苗，因此 极有可能产生副作用。如产生过敏反应，对水貂会造成严重的病理性损伤；而且制备方法烦 琐，费时、费力、产量极低，纯度更低。
【发明内容】
[0005] 针对目前水貂绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫需求的现状，本发明提供了一种水 紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗并对其免疫效果进行评价。
[0006] 本发明的技术方案是：exoA_fIiC嵌合蛋白，序列为由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 和序列为SEQ ID NO: 1的核苷酸序列；所述exoA-fliC嵌合蛋白的编码基因为水貂绿脓杆 菌exoA的I+II区与fliC的N端510bp ;所述嵌合蛋白能够引起针对水紹绿脓杆菌的保护 性免疫。
[0007] 优选的是，所述exoA-fliC嵌合蛋白经糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。
[0008] 水紹绿脓杆菌亚单位疫苗，包含药学有效量的exoA-fliC嵌合蛋白，所述疫苗能 够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上可接受的媒介物。所述疫苗中嵌 合蛋白的浓度为0. 350~0. 766mg/ml。
[0009] 所述疫苗中还含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml。所述蜂 胶干物质购买自滨州华宏生物制品有限责任公司。
[0010] 水紹绿脓杆菌exoA-f IiC嵌合蛋白经Western blot检测，发现重组蛋白具有与水 貂绿脓杆菌全菌制的抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性。
[0011] 术语"药学上可接受的媒介物"意指任何合适的常用于药物制剂的可接受的赋形 剂、佐剂、载体、稀释剂。
[0012] 水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，通过下述方法制备：向嵌合蛋白上清中加入蜂胶溶液， 使蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml ;充分搅拌使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋 白亚单位疫苗。所述重组蛋白上清中蛋白浓度为0. 350~0. 766mg/ml。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] (1)本发明得到的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗经皮下接种6-8周龄 的BALB/c小鼠，免疫4次后，于免疫后72天至9周取血测抗体，诱导产生了较高水平的 exoA-fliC特异性IgG抗体，其IgGl/IgG2a比值亦显著升高，明显倾向于Th2型免疫应答。 经皮下接种4-6月龄的健康貂，接种21d后取血测绿脓杆菌抗体，免疫组绿脓杆菌抗体全 部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。本结果显示制备的水貂绿脓杆菌 exoA-fliC基因工程亚单位疫苗可以引起水貂的免疫应答。
[0015] (2)本发明使用基因工程的方法制备水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗，不 但安全性大大提高，而且制备过程省时、省力、产量高。
【附图说明】
[0016] 图1是实施例1中exoA-fliC融合基因扩增结果；
[0017] 图2是实施例1中exoA-f IiC嵌合蛋白SDS-PAGE可溶性分析；
[0018] 图3是实施例1SDS-PAGE法分析exoA-fliC嵌合蛋白的纯度；
[0019] 图4是实施例2中exoA-fliC嵌合蛋白的western blot分析；
[0020] 图5是实施例5重组exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗免疫小鼠血清中特异性抗体 水平。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
[0022] 实施例1 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白的表达及纯化
[0023] 1、细菌基因组DNA的提取
[0024] 水貂绿脓杆菌山东分离株PASD01 (经PCR方法分型鉴定为鞭毛抗原基因 A型）过 夜培养5ml备用，取Iml菌液至灭菌I. 5ml的离心管中，8000r/min离心5分钟，弃去上清， 用IOOul的双蒸水重悬。沸水煮15分钟，放在-20°C或-80°C冰柜反复冻融3次。5000r/ min离心5分钟，收集上清，即为所提DNA。-20°C保存备用。
[0025] 2、引物设计和exoA基因、fliC基因的克隆、测序
[0026] (1)引物设计
[0027] 应用Primer 5. 0设计exoA(I区+11区）基因的上下游引物，根据铜绿假单胞菌 鞭毛蛋白8821型设计fliC基因的引物。在exoA基因的上游引物引入Bam HI酶切位点， 在fliC基因的下游引入Xho I酶切位点。引物序列分别是：
[0028] exoA 上游引物：5 ' -GGATCCGCCGAGGAAGCCTTCGAC-3 '
[0029] exoA 下游引物：5 ' -GTGTTGACGGTCAAGGCCATGCCGTCGCCGAGGAACTC-3 '
[0030] fliC 上游引物：5' -GAGTTCCTCGGCGACGGCATGGCCTTGACCGTCAACACCAAC-3'
[0031] fliC 下游引物：5' -CTCGAGTGTTCAGCGACTCTGCGCTCATCTC-3?
[0032] 下划线分别是Bam HI、Xho I酶切位点；
[0033] (2) exoA基因和fliC基因的扩增
[0034] 首先，以上述提取的细菌基因总DNA为模板，进行PCR扩增。
[0035] 扩增 exoA基因与 fliC基因的反应体系为：10XPfu Buffer with MgS042+2.5 yL， d NTP 2 μ L，上游引物 0.5 μ L，下游引物 0.5 μ L，模板 I μ L，Pfu DNA Polymerase 0.5 μ L， 灭菌去离子水14. 0 μ L，40%的甘油3 μ L，DMS01 μ L。
[0036] 扩增exoA基因的PCR反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性lmin，68. 2°C退火 1111；[11，72。(^延伸3111；[11，30。5^168,72。(^延伸20111；[11。
[0037] 扩增fliC基因的PCR反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性lmin，57. 9°C退火 lmin，72°C延伸2. 5min，30cycles，72°C延伸20min。反应完毕后取5 μ L的反应产物，1 %的 琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
[0038] (3) PCR产物回收
[0039] 灌制可上样100 y L的1. 0%琼脂糖凝胶，将PCR产物分别加入电泳上样孔中，指示 剂迀移至适当位置时停止电泳，在365nm紫外光下切下含目的片段的凝胶，移入1.5ml EP 管中，称取重量后，参照OMEGA公司的普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒说明书进行。
[0040] (4) exoA基因、fliC基因与T载体的连接
[0041] 将上述ex〇A，fliC基因片段胶回收产物进行加 A (Pfu高保真酶不可以自动加 A， 没法连普通的T载体），反应体系为：Taq酶0.5 μ L，10 X Buffer 1 μ L，d ΝΤΡ0. 5 μ L，胶回 收产物8 μ L。反应程序：72°C 20min。
[0042] 将加 A后的产物分别连到pMD19-T Vector上，连接体系为：pMD19-T Vector luL，目的基因片段4yL，Solution I 5yL，4°C连接过夜。将连接产物导入到DH5a感 受态细胞中，涂布于含有〇. lmg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板，37°C培养过夜；挑取单菌 落经菌液PCR及质粒酶切鉴定正确后测序，即得到插入序列正确的重组克隆载体，命名为 pMD19-T-exoA，pMD19-T-fliC。
[0043] 3、构建重组克隆载体 pMD19-T-exoA-f IiC
[0044] 将上述的pMD19-T-exoA，pMD19-T_fliC为模板，分别扩增exoA与fliC基因片段， exoA与fliC的PCR产物胶回收。以回收产物作为模板，以exoA的上游引物与fliC的下游 引物作为一对引物来扩增exoA-fIiC融合基因。
[0045] 反应体系为：10 XPfu Buffer with MgS042+2. 5 μ L，d NTP 2 μ L，exoA 上游引物 0.5yL，fliC下游弓丨物0.5yL，exoA胶回收产物2yL，fliC胶回收产物lyL，Pfu DNA Polymerase 0· 25 μ L，灭菌去离子水 12. 25 μ L，40% 的甘油 3 μ L，DMS01 μ L0
[0046] 反应程序：94°C 预变性 5min ;94°C 变性 lmin，68°C 退火 lmin，72°C 延伸 4min， 30cycles，72°C延伸20min。I %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果，产物经I %的琼脂糖凝胶 电泳割胶回收。exoA-fliC融合基因扩增结果如图1所示（泳道M为DL 5000DNA Marker， 泳道1为exoA-fIiC融合基因扩增产物，泳道2为阴性对照）。
[0047] 将上述回收的exoA-fliC融合基因片段胶回收产物进行加 A反应，反应体系如上 所述。将加 A产物连到pMD19-T Vector上，连接体系为：pMD19-T Vector lyL，目的基 因片段4yL，Solution I 5yL，4°C连接过夜。将连接产物导入到DH5a感受态中，经菌 液PCR及酶切鉴定，筛选阳性克隆进行测序。得到插入序列正确的重组克隆载体，命名为 pMD19-T-exoA-fliC。
[0048] 4、构建重组表达质粒pET30a-exoA-fliC
[0049] 利用限制性内切酶Bam HI、Xho I分别对阳性克隆质粒pMD19-T-exoA-fliC和表 达载体pET30a进行双酶切，胶回收后用T4DNA连接酶，16°C连接过夜。然后转化到DH5 α感 受态细胞中，涂布于含有〇. 〇5mg/ml卡那霉素的LB培养基平板，挑取单菌落经菌液PCR及 质粒酶切鉴定正确后送测序公司测序，测序结果如SEQ ID NO :1所示。
[0050] 5、exoA-fliC 嵌合蛋白在 E. coli BL21(DE3)中的表达
[0051] 将构建的表达重组质粒pET30a-exoA-fliC转化至E. coli BL21(DE3)中在含有 50 μ g/ml卡那霉素的IOml LB培养基中进行培养，培养18h后，转到含有50 μ g/ml卡那霉 素的100ml LB培养基中，37°C，180转/min摇菌培养。当OD6tltl等于0. 5时，用0. 9mmol/L 的IPTG进行诱导表达，37°C，180转/min继续诱导培养6h。7000 X g离心10min，用3ml的 裂解缓冲液进行溶解，在冰上进行超声处理，收集细菌。细胞裂解后，在SOOOXg下离心10 分钟，将上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，重组蛋白存在于超声破碎产物沉淀中，提示重 组exoA-fliC嵌合蛋白为包涵体表达。
[0052] SDS-PAGE 分析结果如图 2 所示（泳道 M 为 BluePlus ProteinMarker 14-100kDa， 泳道1为BL21 (DE3) /pET30a-exoA-f IiC IPTG诱导菌超声破碎上清，泳道2为BL21 (DE3) / pET30a-exoA_f IiC IPTG诱导菌超声破碎沉淀）。
[0053] 6、exoA-fliC包涵体蛋白的纯化
[0054] 用Ni-NTA亲和层析法纯化His-标记的嵌合蛋白，用8M的尿素进行变性。经超声 处理的沉淀（包涵体）用PBS和1 % Triton X-100洗3次，然后溶解在4-6毫升的8M尿 素裂解缓冲液中。将上清液与2ml的树脂混合，在室温下孵育混30分钟并转移到层析柱 中。污染的蛋白质用洗涤缓冲液（20mM磷酸钠，300mM的氯化钠，50mM的咪唑，pH 8. 0)从 柱子上洗脱下来。用洗脱缓冲液（20mM磷酸钠，300mM的NaCl和250mM的咪唑，pH 8. 0) 洗脱，收集蛋白质，即exoA-fliC嵌合蛋白。用61、41、211、说的尿素及？85(?!17.4)依次 进行梯度复性，通过SDS-PAGE法分析蛋白质的纯度。分析结果如图3所示（泳道M为 BluePlus ProteinMarker 14-100kDa，泳道 1 为 BL21(DE3)/pET30a-exoA-fliC IPTG 诱导 产物纯化前，泳道2为BL21(DE3)/pET30a-exoA-fliC IPTG诱导产物纯化后）。用核酸蛋白 分析仪评估蛋白质浓度，结果显示所获得的蛋白浓度为〇. 4mg/ml。实施例2 :水貂绿脓杆菌 exoA-fliC嵌合蛋白的鉴定
[0055] 采用免疫印迹法用来评价exoA-fliC嵌合蛋白的免疫学特性。具体方法为：将蛋 白产物用SDS-PAGE凝胶进行分离，并转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 37°C封 闭2h。用TBST漂洗后，以100倍稀释的兔抗水貂绿脓杆菌鞭毛蛋白血清作为一抗，37°C孵 育过夜，漂洗。加入1:3000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 20ml，37 °C孵育Ih，TBST漂洗3 次，6min/次，将ECL发光液加到PVDF膜上，去尽残液，放入X-光片夹中进行曝光。Western blot鉴定结果见图4所示（泳道1为BL21(DE3)/pET30a-exoA-fliC IPTG诱导产物，泳道 2为BL21 (DE3)/pET30a空载对照）。结果表明，重组蛋白具有与水貂绿脓杆菌全菌制备的 抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性。
[0056] 实施例3 :细菌半数致死量的测定
[0057] 30只BALB/c小鼠随机分成5组（每组6只小鼠），测定绿脓杆菌半数致死 量（LD 5tl)。小鼠腹腔注射绿脓杆菌，用SDOl株绿脓杆菌菌液分别以2. 5X 106, 5X 106， 7. 5X106，1X107，I. 25X 108CFU/ml浓度攻毒，观察记录IOd内小鼠的死亡率，用改良 寇式法计算SDO1株菌液的LD 5tl，通过计算可知SDO1株菌液对BALB/c小鼠的LD5tl为 3. 75X 106CFU/ml〇
[0058] 以同样的方法对4-6月龄的健康貂进行攻毒，通过计算，可知SDOl株菌液对水貂 的 LD5tl为 2. 83 X 10 6CFUAil。
[0059] 实施例4 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗的制备及检验
[0060] 疫苗制备：
[0061] 向重组蛋白上清中加入蜂胶溶液，使蜂胶干物质的含量为10_15mg/mL ;充分搅拌 使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋白亚单位疫苗。通过三个批次的试验制备相应批 次的蛋白亚单位疫苗，试验批号为201501、201502、201503。所述三个批次试验的蛋白上清 中蛋白浓度分别为0. 350mg/mL，0. 555mg/mL和0. 766mg/mL，所述蜂胶干物质的含量分别为 15mg/mL，10mg/mL 和 12. 5mg/mL〇
[0062] 疫苗成品检验：
[0063] (1)无菌检验
[0064] 参照《中华人民共和国兽用生物制品制造与检验规程》《中华人民共和国兽用生物 制品质量标准（2001版）》要求进行操作；
[0065] (2)物理性状检验
[0066] 分别在静止与摇匀状态下观察颜色、形态；
[0067] (3)超剂量安全检验
[0068] 将制备的3批疫苗201501、201502、201503分别取3ml免疫家兔，30d内观察接种 疫苗实验动物的采食、精神状态以及局部吸收状况，同时设立PBS对照组。
[0069] 结果显示，所有批次水貂出血性疫苗无菌检验均为阴性；3倍超剂量免疫接种，经 30d观察接种疫苗动物与对照组动物的采食、精神状况、局部吸收状况未出现明显异常变 化。
[0070] (4)最小免疫剂量测定
[0071] 将100只BALB/c小鼠，随机分为10组，每组10只。第1、5组分别皮下注射0. 025ml 水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗；第2、6组分别皮下注射0. 05ml亚单位疫 苗；第3、7组分别皮下注射0.1 ml亚单位疫苗；第4、8组分别皮下注射0. 2ml亚单位疫苗； 第9、10不做免疫。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚 单位疫苗。
[0072] 免疫21d后，第1、2、3、4组分别皮下注射SDOl菌株；第5、6、7、8组分别皮下注射 水貂绿脓杆菌山东分离株SD03菌株（经PCR方法分型鉴定为鞭毛抗原基因 B型）；观察记 录小鼠死亡情况，结果见表1所示。
[0073] 表1水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对小鼠的MID测定结果
[0074]
[0075] 结果显示，水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗不同剂量免疫小鼠21d 后，用含有2XLD5QSD01、SD03菌株分别攻毒，0. lml、0. 2ml免疫组均达到100%保护；0. 05ml 免疫组对SDOl菌株达到100 %保护，对SD03达到80 %的保护；0. 025ml免疫组对SDOl、SD03 菌株保护率为70 %、60 %;对照组全部死亡。根据实验结果，确定水貂绿脓杆菌菌exoA-f IiC 嵌合蛋白亚单位疫苗对小鼠的最小免疫剂量为〇. 〇5ml。
[007 6] 将50只水紹，随机分成10组，每组5只。第1、5组分别皮下注射0.1 ml水貂绿脓 杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗；第2、6组分别皮下注射0. 25ml亚单位疫苗；第3、7 组分别皮下注射0. 5ml亚单位疫苗；第4、8组分别皮下注射Iml亚单位疫苗；第9、10不做 免疫。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0077] 免疫21d后，第1、2、3、4组分别皮下注射SDOl菌株；第5、6、7、8组分别皮下注射 SD03菌株；观察记录小鼠死亡情况。结果见表2所示。
[0078] 结果显示，水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗不同剂量免疫水紹21d 后，用含有2XLD5(ISD01、SD03菌株分别攻毒，lml、0. 5ml免疫组均达到100%保护；0. 25ml 免疫组对SDOl菌株达到100 %保护，对SD03达到80%的保护；0.1 ml免疫组对SDOl、SD03 菌株保护率为80 %、60 %;对照组全部死亡。根据实验结果，确定水貂绿脓杆菌菌exoA-f IiC 嵌合蛋白亚单位疫苗对水貂的最小免疫剂量为〇. 25ml。
[0079] 分别采用201501批次和201502批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚 单位疫苗进行最小免疫剂量测定的相关实验，结果与采用201503批次的水貂绿脓杆菌 exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗一致。
[0080] 表2水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对水紹的MID测定结果
[0081]
[0082] 实施例5 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗免疫效果评价
[0083] 1.实验动物免疫
[0084] 将30只BALB/c健康小鼠，随机分为3组，每组10只。第1组皮下注射201503批 次的水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗0. 2ml。第2组皮下注射0. 2ml的蜂胶 佐剂，第3组皮下注射0. 2ml PBS作为空白对照组。
[0085] 2. ELISA 检测
[0086] (1)免疫后9周将各组小鼠摘除眼球并收集血清，_20°C保存备检。
[0087] (2)将exoA-fliC嵌合蛋白稀释至5 μ g/ml，100 μ 1/孔进行常规包被96孔板。
[0088] (3)各组小鼠血清样本用过滤后的无菌PBS按1:200倍比稀释，200 μ 1/孔加至每 列第一孔，每列第2至8孔分别加入100 μ I PBS，每个样本做复孔，然后从第一孔取100 μ 1 加到第2孔中依次进行倍比稀释至1:25600,空白对照孔加入包被缓冲液100 μ 1。
[0089] ⑷HRP标记兔抗鼠二抗的稀释度分别为：IgG 1:5000, IgGll: 10000， IgG2a:1:10000 ；
[0090] (5)结果处理：将每一个样本OD值减去空白对照孔OD值后，同一血清样品复孔取 平均OD值。其中以PBS阴性对照组的OD值为阴性对照（N)，免疫组为样本（P)，当血清P/ N值3 2. 1即可判断为阳性。抗体滴度以出现阳性结果的最高稀释倍数的倒数表示。
[0091] (6)结果计算于：各样品结果表示为Iogltl(抗体滴度），每个样品复孔间取平均值 即为该小鼠的实际值，同一小组内计算平均值和标准误，进行统计分析。IgGl :IgG2a以每 只小鼠的抗体滴度相比，同一组内结果以平均值土标准误表示并进行统计学分析。
[0092] 将15只健康水貂随机分为3组，每组5只。第1组皮下注射201503批次的水貂 绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗lml，第2组皮下注射Iml的蜂胶佐剂，第3组皮 下注射ImlPBS作为空白对照组。方法同小鼠抗体的测定。结果显示exoA-fliC嵌合蛋白 组水貂体内产生最高水平的特异性IgG抗体。实验结果见表3和图5。
[0093] 由实验结果可见：佐剂对照组中无明显的特异性IgG抗体及其亚类产生； exoA-fl iC嵌合蛋白组小鼠体内产生最高水平的不同类型抗体滴度，即IgG (1:12800)， IgG2a(l:1600)和 IgGl(l:6400)。exoA-fliC 组 IgGl/IgG2a 比值最高（4. 13±0.67)。
[0094] 表3小鼠体内IgG、IgGl、IgG2a抗体水平的测定结果
[0095]
[0096] 3.免疫攻毒保护试验
[0097] 表4水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对小鼠免疫保护试验定结果
[0098]
[0099] 将60只BALB/c健康小鼠，随机分为6组，每组10只。第1、2组分别皮下注射0. 2ml 水貂绿脓杆菌exoA-fliC基因工程亚单位疫苗，第3、4组分别皮下注射0. 2ml的蜂胶佐剂， 第5、6组皮下注射0. 2mlPBS作为空白对照组。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓 杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0100] 免疫后21d，第1、3、5组分别进行皮下注射2XLD5(ISD01菌株，第2、4、6组分别进 行皮下注射2XLD 5(ISD03菌株观察记录死亡情况。结果见表4。
[0101] 由表4可知，水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗免疫小鼠21d后，用 2 X LD5tlSDOl、SD03菌株分别攻毒，均可获得100%的保护率，佐剂组获得20 %、10%的保护 率，对照组全部死亡；结果表明水貂绿脓杆菌exoA-f IiC嵌合蛋白疫苗对小鼠对SDOI、SD03 有良好的免疫保护效果。
[0102] 表5水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对水紹免疫保护试验定结果
[0103]
[0104] 将30只水貂，随机分为6组，每组5只。第1、2组分别皮下注射Iml水貂绿脓杆 菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗，第3、4组分别皮下注射Iml的蜂胶佐剂，第5、6组皮下 注射ImlPBS作为空白对照组。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC 嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0105] 免疫后21d，第1、3、5组分别进行皮下注射SDOl菌株，第2、4、6组分别进行皮下注 射SD03菌株，观察记录死亡情况。结果见表5。
[0106] 由表5结果显示，攻毒的PBS空白对照组、蜂胶佐剂全部死亡，嵌合蛋白亚单位疫 苗对SDOl菌株攻毒水貂的保护率为100%，对鞭毛蛋白为b型的SD03菌株攻毒水貂的保护 率为100%，表明该嵌合蛋白亚单位疫苗对鞭毛蛋白为a、b型的菌株都有较强的免疫保护 作用。
[0107] 分别采用201501批次和201502批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位 疫苗进行免疫效果评价的相关实验，结果与采用201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌 合蛋白亚单位疫苗一致。
【主权项】
1. 嵌合蛋白exoA-fliC，其特征在于：序列为由SEQIDNO: 2的氨基酸序列和序列为 SEQIDN0:1的核苷酸序列；所述嵌合蛋白exoA-fliC的编码基因为水貂绿脓杆菌exoA的 I+II区与fliC的N端510bp;所述嵌合蛋白能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫。2. 根据权利要求1所述的嵌合蛋白exoA-fliC，其特征在于：所述嵌合蛋白exoA-fliC 经糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。3. 水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：包含药学有效量的权利要求1或2所述的 嵌合蛋白exoA-fliC，所述疫苗能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上 可接受的媒介物。4. 根据权利要求3所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中嵌合蛋 白的浓度为〇. 350~0. 766mg/mL。5. 根据权利要求3或4所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中还 含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml。6. 根据权利要求3或4所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包 括以下步骤：向exoA-fliC嵌合蛋白上清中加入蜂胶溶液，使蜂胶干物质的含量为10~ 15mg/mL;充分搅拌使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋白亚单位疫苗。7. 根据权利要求6所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述 exoA-fliC嵌合蛋白上清中蛋白浓度为0. 350~0. 766mg/mL。
【专利摘要】本发明提供了一种水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗，包含药学有效量的exoA-fliC嵌合蛋白。exoA-fliC嵌合蛋白的序列为由SEQ ID NO:2的氨基酸序列和序列为SEQ ID NO:1的核苷酸序列；所述exoA-fliC嵌合蛋白的编码基因为水貂绿脓杆菌exoA的I+II区与fliC的N端510bp。所述疫苗能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上可接受的媒介物。所述疫苗中嵌合蛋白的浓度为0.350～0.766mg/ml。所述疫苗中还含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10～15mg/ml。本发明使用基因工程的方法制备水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗，不但安全性大大提高，而且制备过程省时、省力、产量高。
【IPC分类】C07K19/00, C07K14/21, A61K39/104, A61P31/04
【公开号】CN104892768
【申请号】CN201510240573
【发明人】秦晓冰, 单虎, 马凤芹
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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