一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用
一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表达质粒与应用，属于 医学微生物或生物制药领域。
【背景技术】
[0002] 化脓链球菌是一类常见的细菌，可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感 染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小 球肾炎等变态反应。
[0003] 化脓链球菌的溶血素（Str印tolysin 0, SL0)能够与人及其它动物的细胞膜上 的胆固醇相结合，结合到细胞膜上的SLO蛋白会形成环状寡聚体，形成大的孔道，导致细 胞膜溶解，另外，SLO具有极强的抗原性且易在体内残留，刺激人体及其它动物产生抗体 (anti-SLO, AS0)，ASO集聚，导致变态反应。
[0004] SLO作为检测试剂，可以用来检测患者体内的ASO ;其次，可以作为治疗肿瘤和杀 死肿瘤细胞的药物，另外，SLO作为成孔蛋白，在动物基因工程和蛋白工程领域，用作动物细 胞转基因和转蛋白工具。
[0005] 目前SLO蛋白的基因工程重组技术主要存在以下缺陷：SLO蛋白对宿主具有毒性， 表达量低和生产过程中SLO检测方法相对繁琐。
【发明内容】
[0006] 本发明针对SLO重组蛋白对宿主具有毒性，表达量低和SLO蛋白检测相对繁琐的 问题，提供了一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表达质粒与应用。
[0007] 本发明的第一个目的是提供了 一种溶血素融合蛋白（PeLa-EK-IOHi s-SLO， PEHSL0)，该溶血素融合蛋白PEHSLO具有果胶酸裂解酶和溶血素蛋白活性；PHlSLO内部有 肠激酶的酶切位点，可以根据需要切除果胶酸裂解酶；另外，还含有10个组氨基酸序列，为 蛋白纯化提供有效的亲和基团。
[0008] 所述溶血素融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0009] 编码所述溶血素融合蛋白的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,可在大肠杆菌 中高效表达溶血素融合蛋白PEHSL0。
[0010] 所述溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本发明的一种实施 方式中，如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 所述npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，使用了曲 霉果胶酸裂解酶酶活性区Pela序列、大肠杆菌肠激酶位点序列、10个组氨基酸和化脓链球 菌溶血素 slo活性区与抗原区序列。而且曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列和化脓链 球菌溶血素 slo活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背景下的密码子优化和增加蛋白表明 基团亲水性等原理，进行了优化设计。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO或使用所述 npela-ek-10his-slo融合基因构建的表达质粒。
[0013] 所述质粒，在本发明的一种实施方式中，为npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌 或转基因细胞系。
[0015] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为 宿主，pET-28a⑴为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo〇
[0016] 本发明的第四个目的是提供一种检测溶血素 SLO的方法，所述方法是融合表达果 胶酸裂解酶和溶血素蛋白，通过检测果胶酶活性定性和定量分析溶血素 SL0。所述融合表达 是融合表达编码氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的基因。
[0017] 本发明的第五个目的是提供一种提高SLO可溶性表达的方法。所述方法是以大肠 杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的溶血素融 合基因 npela-ek-10his-slo。
[0018] 本发明还要求保护所述溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO蛋白生产、SLO检测、SLO抗 体制品制备、抗癌药物生产、基因工程或蛋白工程等领域的应用。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] (1)本发明设计并合成了溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,构建了含该 npela-ek-lOhis-slo融合基因的表达质粒和含该表达质粒的工程菌，该工程菌可以表达溶 血素融合蛋白（PeLa-EK-10His-SL0，PEHSL0)。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白 PEHSLO对宿主细胞毒性低，20°C条件下表达48h后，npela-ek-10his-slo工程菌0D600可 以达到2. 5,高于slo独立表达的工程菌（0D600 :1.60);说明融合表达可以降低SLO蛋白对 宿主具有毒性。
[0021] (2)本发明的工程菌表达的溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性 和SLO抗原性；该工程菌果胶酶产率为5. 6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL， 可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为I. 2mg/mL培养液，占到细胞总蛋白的30 %，相比slo 胞内独立表达（可溶性目标蛋白占胞内蛋白的5% )，可溶性目标蛋白产量上升达400% ; 说明融合表达可以提尚SLO蛋白的表达量。
[0022] (3)在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和 定量分析，一次果胶酶检测所需时间为〇. 3h，检测成本为0. 15元人民币，避免使用免疫学 (一次检测所需时间为l〇h，检测成本为500. 00元人民币）和溶血法检测（一次检测所需 时间为I. 〇h，检测成本为0. 50元人民币），相对于经测定免疫学和溶血法检测，检测时间分 别缩短9. 5h和0. 5h，检测成本分别节省499. 85元和0. 35元人民币，经测定IUnit果胶酶 活性对应于0. 2mg左右的蛋白量和7. OX IO4Unit溶血酶活性。本发明的方法可以简便SLO 的检测，缩短检测时间、降低检测成本。
【附图说明】
[0023] 图 1 :设计的 npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)质粒结构图；
[0024] 图 2 :npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)酶切鉴定图；I. DNA Marker， 2. npela-ek-10his-slo/pET_28a，3. npela-ek-10his-slo/pET_28a (+)双酶切；
[0025] 图 3 :重组表达 Pela-EK-IOHis-SLO 的 SDS-PAGE 图谱；1.蛋白 Marker， 2. npela-slo/pET28a(+)/BL21 (DE3)的胞内上清，3.纯化的 Pela-EK-10His-SL0。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本 发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册 所述的条件进行操作。
[0027] 实施例1溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo设计与表达质粒设计
[0028] 所述核苷酸序列使用了曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列、大肠杆菌肠激酶 位点序列、10个组氨基酸和化脓链球菌溶血素 Slo活性区与抗原区序列，而且曲霉果胶酸 裂解酶酶活性区pela序列和化脓链球菌溶血素 Sl0活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背 景下的密码子优化和增加蛋白表明基团亲水性等原理，进行了优化设计。在果胶酸裂解酶 酶pela序列的上游添加 Noc I位点序列，在果胶酸裂解酶酶pela序列下游加上肠激酶序 列、10个组氨酸序列和Nde I位点序列；Nde I位点序列下游，连接slo基因序列，slo下 游加上BamH I序列，构建的融合基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.1所示，表达质粒npela-ek-10his-sl〇-pET-28a(+)的核苷酸序列如SEQ ID N0.3。npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)质粒结构如图 1 所不。
[0029] 本发明加入果胶酸裂解酶pela序列的目的，是利用该Pela蛋白在大肠杆菌中可 以高效表达出活性蛋白同时对宿主毒性低的优越性，提高SLO蛋白的可溶性，降低SLO蛋 白对宿主的毒性，同时提供一种低成本和短时间的目标蛋白检测方法；加肠激酶序列的作 用是可以根据应用需要出发，提供切除果胶酸裂解酶Pela的便利；加入10个组氨酸序列， 是为了提供Ni-亲和层析的亲和基团，由于是加在二个蛋白基团之间，根据本本发明的需 要，10个组氨基，能保证有效结合，同时在40mM咪唑浓度下可以有效洗脱，不必使用常规的 500mM咪唑，可以减少成本。
[0030] 实施例2溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中npela-ek-lOhis序列的合成与 克隆
[0031] 使用化学合成和Over-Lap PCR的方法合成血红素融合基因 npela-ek-10his-slo 的 npela-ek-10his 部分（SEQ ID NO. 2 的 l_992bp)，合成 npela-ek-10his 片段，上游加 上Noc I位点，下游加上Nde I序列将合成的片段与PMD18T载体连接，转化JM109,转 化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37 °C培养过夜，得到单克隆转化子 npela-ek-10his/PMD18T/JM109,经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定，测定的序 列和设计序列完全相同。
[0032] 实施例3溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中slo序列的合成与克隆
[0033] 使用化学合成和Over-Lap PCR的方法合成血红素融合基因 npela-ek-10his-slo 的slo部分（SEQ ID NO. 2的992-2483bp)，上游加上Nde I位点，下游加上BamH I序列， 将合成的slo基因与PMD18T载体连接，转化JM109,转化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的 LB平板，经过37°C培养过夜，得到单克隆转化子slo/PMD18T/JM109,经过菌落PCR鉴定，质 粒酶切鉴定和测序鉴定，表明新合成的slo基因全长为1485bp，编码495氨基酸，测定的序 列和设计序列完全相同，提取slo/PMD18T备用。
[0034] 实施例 4 npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)表达载体构建
[0035] 用于实现融合基因在大肠杆菌中表达的载体是pET_28a(+)，但对构架有较 大改变，不使用pET-28a(+)的二个His-tag和Thrombin序列，将pET-28a(+)质粒和 npela-ek-10his/PMD18T用Noc I和Nde I切，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连 接产物转化E. coli JM109感受态细胞，经过37°C培养过夜，挑选转化子，通过菌落PCR鉴 定，质粒酶切鉴定（见图2)和测序鉴定，保存鉴定的npela- ek-10hiS/pET-28a(+)E.C〇li JM109 菌，提取 npela-ek-10his/pET_28a(+)备用。将 npela-ek-10his/pET_28a(+)质粒和 slo/PMD18T用Nde I和BamH I切，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连接产物转化 E. coli JM109感受态细胞，在100g/mL卡那霉素的LB平板，经过37°C培养过夜，挑选转化 子，通过菌 落PCR鉴定，质粒酶切鉴定（见图2)和测序鉴定（序列如SEQ ID NO. 3所示），保 存鉴定的 npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)E· coli JM109 菌，提取 npela-ek-10his-slo/ pET-28a(+)备用。
[0036] 实施例5表达溶血素融合蛋白PelA-EK-IOHis-SLO的工程菌构建
[0037] 将质粒 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)转化大肠杆菌宿主 BL21 (DE3)，再在 100g/mL卡那霉素的LB平板，经过37°C培养过夜，经过菌落PCR鉴定，得到单克隆转化子 npela-ek-10his-slo/pET-28a (+)/BL21(DE3)〇
[0038] 实施例6溶血素融合蛋白Pela-EK-IOHis-SLO表达与分离纯化
[0039] 将 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21 (DE3)接种在 LB 培养基中 37°C液体培 养过夜，后接入 TB (甘油 5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，Κ2ΗΡ0412· 54g/L，ΚΗ2Ρ042· 31g/ L)发酵液体培养基，37°C培养到细菌006(|(|到0. 8,用0. 5mM IPTG (异丙基硫代β -D半乳 糖苷）诱导，降温至20°C培养，表达48h。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白PEHSLO 对宿主细胞毒性低，20°C条件下表达48h后，npela-ek-10his-slo工程菌0D600可以达到 2. 5,高于slo独立表达的工程菌（0D600 :1. 60);该工程菌表达的溶血素融合蛋白PEHSLO 同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性；该工程菌果胶酶产率为5. 6Unit/mL培养液，溶 血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为I. 2mg/mL培养液，占到 细胞总蛋白的30%，相比slo独立表达（占胞内蛋白的5% )，可溶性目标蛋白产量上升达 400 % 〇
[0040] 实施例7溶血素融合蛋白Pela-EK-IOHis-SLO的分离纯化
[0041] 将 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达后的培养液离心，得到上 清用〇. 45m膜过滤，过滤后的溶液按照1 :1的比例和2X Binging buffer(10mM咪挫， IM NaCl，40mM Tris-HCL)混勾备用；His-tag亲和层析柱用5倍柱体积的IX charging buffer(50mM NiSO4)处理后，再用倍柱体积 IX Binding buffer(5mM咪挫，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)平衡；上样品后用10倍柱体积IX Binging buffer洗柱，再用5倍柱体积IX Washing buffer(10mM 咪挫，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗柱；用 6 倍柱体积 IX Elution buffer (40mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脱。重组表达的溶血素融合蛋白PEHSLO 的SDS-PAGE图谱如图3所示。
[0042] 实施例8溶血素融合蛋白PEHSLO的果胶酶活性测定
[0043] 检测上清的酶活，果胶酸裂解酶活性检测的反应体系为：0.5mL反应液，内含 25mmol/L Tris/HCl(pH 8·0)，0·1% 果胶酸，lmmol/L 0&(：12和141^上清，在50°〇反应 lOmin，反应结束后，加 ImL 0.02mol/L HCl终止反应，然后在235nm检测光吸收值的变化。 一个酶活单位定义为每min释放的1 μ mol不饱和半乳糖酸酸（unsaturated galacturonic acid)的酶量。在235nm，不饱和半乳糖醛酸光吸收系数为4600/^1^!!'
[0044] 在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定 量分析，一次果胶酶检测所需时间为〇. 5h，检测成本为0. 15元人民币，避免使用免疫学（一 次免疫学检测所需时间为l〇h，检测成本为500. 00元人民币）和溶血法检测（一次溶血酶 检测所需时间为I. 〇h，检测成本为0. 50元人民币），相对于经测定免疫学和溶血法检测，检 测时间分别缩短9. 5h和0. 5h，检测成本分别节省499. 85元和0. 35元人民币，经测定IUnit 果胶酶活性对应于〇. 2mg左右的蛋白量和7. OX IO4Unit溶血酶活性。
[0045] 实施例9溶血素融合蛋白PEHSLO的融血活性测定
[0046] 溶血素融合蛋白样品可用溶液A(溶液A :36mM H3PO4,126mM NaCl，Ig/ L BSA(bovine serum albumin)，pH 7· 0)进行系列梯度稀释。将 0· 5ml 的 150mM 2-mercaptoethanol与Iml稀释样品混勾，30°C孵育15min，然后每管加0· 5ml含绵羊红细 胞的A溶液（I. 58X 108cell/ml) 30°C下反应20min，离心后，用541nm检测上清中血红蛋白 的浓度，IU定义为在该实验条件下，引起上述反应体系中红细胞溶解的最小酶量，经测定， 融合蛋白Pela-EK-IOHis-SLO具有溶血性，酶活为4 X IO5UniVmL培养基左右。Western实 验结果为阳性，表明融合蛋白PEHSLO具有抗原性。
[0047] 实施例10溶血素融合蛋白PEHSLO在诊断试剂生产中的应用
[0048] 用 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达的融合蛋白可以用 作临床检测患者体内ASO(抗SLO蛋白的抗体）的重要生物学试剂。利用融合蛋白 PelA-EK-lOHis-SLO、偶联辣根过氧化物酶的二抗和邻苯二胺，定量分析患者体内的SLO抗 体（ASO)的量。
[0049] 实施例11溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO抗体制品生产中的应用
[0050] 将融合蛋白用肠激酶消化后，再用亲和层析纯化，得到SLO蛋白，用200 μ g SLO蛋 白免疫牛等敏感动物，首次注射后大约3周后，用50 μ g SLO蛋白加强免疫一次，在大约14 天后左右，抗体的滴度会达到最大值，抽取血样，获得血清，制备成多抗。
[0051] 可参考下列文献：
[0052] I. Kimoto H, Fujii Y, Hirano S, Yokota Y, Taketo A. Expression of recombinant Streptolysin 0 and specific antibody production. J Mol Microbiol Biotechnol. 2005 ；10(1):64-8.
[0053] 2. Velazquez BjMassaldi H1Battistoni J1Chabalgoity JA. Construction and expression of recombinant streptolysin-〇 and preevaluation ofits use in immunoassays. Clin Diagn Lab Tmmunol. 2005May ；12(5):683-4.
[0054] 实施例12溶血素融合蛋白PEHSLO在动物基因工程领域中作为打孔试剂，转移核 酸与蛋白
[0055] 将动物细胞悬浮在Hank平衡盐溶液中（配方为：8g/L NaCl, 0. 4g/L KC1，lg/L葡 萄糖，60mg/L KH2PO4, 47. 5mg/L Na2HPO4, NaHCO3, 0· 35g/L，30mM H印es，pH 至 7· 2,定容到 1L)，加入一定量的PEKSLO蛋白，在37°C，处理15min。
[0056] 实施例13溶血素融合蛋白PEHSLO可以作为药物封闭乳腺癌细胞EGF受体蛋白 ErbBl
[0057] 用终浓度为lOunit/ml的SLO Hank平衡盐溶液，处理乳腺癌细胞I. 5h。
[0058] 可参考下列文献：
[0059] Hall EH1Gurel V1Dahlberg AE1McMichael J1Brautigan DL. Inhibition of human breast cancer Matrigel invasion by Streptolysin 0 activation ofthe EGF receptor ErbBLCell Signal. 2011Dec;23 (12) :1972-7.
[0060] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种溶血素融合蛋白PEHSLO,其特征在于，所述溶血素融合蛋白PEHSLO含果胶酸裂 解酶和溶血素蛋白序列；编码所述果胶酸裂解酶和溶血素蛋白的氨基酸序列之间还含有肠 激酶酶切位点序列和10个组氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的溶血素融合蛋白PEHSL0,其特征在于，所述溶血素融合蛋白 的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。3. 根据权利要求1所述的溶血素融合蛋白PEHSL0,其特征在于，编码所述溶血素融合 蛋白PEHSLO的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。4. 表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的质粒。5. 根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所 不O6. 表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌。7. 表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的转基因细胞系。8. -种检测溶血素融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法是融合表达果胶酸裂解酶 和溶血素蛋白，通过检测果胶酶活性定性和定量分析溶血素融合蛋白PEHSL0。9. 一种提高溶血素SLO可溶性表达的方法，其特征在于，所述方法是以大肠杆菌 BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQIDNO. 2的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo〇10. 权利要求1所述溶血素融合蛋白PEHSLO在溶血素蛋白SLO生产、SLO抗体制品生 产、SLO抗体检测试剂生产或抗癌药物生产中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用，属于医学微生物或生物制药领域。本发明在大肠杆菌中表达了该溶血素融合蛋白PEHSLO，发现该溶血素融合蛋白PEHSLO表达量提高且对宿主细胞毒性低。溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性，该工程菌果胶酶产率为5.6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为1.2mg/mL培养液。在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定量分析，避免使用免疫学和溶血法检测，简化了检测方法、缩短了检测时间、节约了检测成本。溶血素融合蛋白PEHSLO还可以应用于溶血素蛋白SLO生产、SLO抗体制品生产、SLO抗体检测试剂生产或抗癌药物生产。
【IPC分类】G01N33/53, C12R1/19, C07K19/00, C07K14/315, C12N1/21, A61K38/16, A61P35/00, C12N15/70, C12N9/88
【公开号】CN104892769
【申请号】CN201510268710
【发明人】赵庆新, 王建, 崔刚, 王欢莉, 康贻军, 沈敏
【申请人】盐城师范学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表达质粒与应用，属于 医学微生物或生物制药领域。
【背景技术】
[0002] 化脓链球菌是一类常见的细菌，可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感 染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小 球肾炎等变态反应。
[0003] 化脓链球菌的溶血素（Str印tolysin 0, SL0)能够与人及其它动物的细胞膜上 的胆固醇相结合，结合到细胞膜上的SLO蛋白会形成环状寡聚体，形成大的孔道，导致细 胞膜溶解，另外，SLO具有极强的抗原性且易在体内残留，刺激人体及其它动物产生抗体 (anti-SLO, AS0)，ASO集聚，导致变态反应。
[0004] SLO作为检测试剂，可以用来检测患者体内的ASO ;其次，可以作为治疗肿瘤和杀 死肿瘤细胞的药物，另外，SLO作为成孔蛋白，在动物基因工程和蛋白工程领域，用作动物细 胞转基因和转蛋白工具。
[0005] 目前SLO蛋白的基因工程重组技术主要存在以下缺陷：SLO蛋白对宿主具有毒性， 表达量低和生产过程中SLO检测方法相对繁琐。
【发明内容】
[0006] 本发明针对SLO重组蛋白对宿主具有毒性，表达量低和SLO蛋白检测相对繁琐的 问题，提供了一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表达质粒与应用。
[0007] 本发明的第一个目的是提供了 一种溶血素融合蛋白（PeLa-EK-IOHi s-SLO， PEHSL0)，该溶血素融合蛋白PEHSLO具有果胶酸裂解酶和溶血素蛋白活性；PHlSLO内部有 肠激酶的酶切位点，可以根据需要切除果胶酸裂解酶；另外，还含有10个组氨基酸序列，为 蛋白纯化提供有效的亲和基团。
[0008] 所述溶血素融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0009] 编码所述溶血素融合蛋白的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,可在大肠杆菌 中高效表达溶血素融合蛋白PEHSL0。
[0010] 所述溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本发明的一种实施 方式中，如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 所述npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，使用了曲 霉果胶酸裂解酶酶活性区Pela序列、大肠杆菌肠激酶位点序列、10个组氨基酸和化脓链球 菌溶血素 slo活性区与抗原区序列。而且曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列和化脓链 球菌溶血素 slo活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背景下的密码子优化和增加蛋白表明 基团亲水性等原理，进行了优化设计。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO或使用所述 npela-ek-10his-slo融合基因构建的表达质粒。
[0013] 所述质粒，在本发明的一种实施方式中，为npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌 或转基因细胞系。
[0015] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为 宿主，pET-28a⑴为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo〇
[0016] 本发明的第四个目的是提供一种检测溶血素 SLO的方法，所述方法是融合表达果 胶酸裂解酶和溶血素蛋白，通过检测果胶酶活性定性和定量分析溶血素 SL0。所述融合表达 是融合表达编码氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的基因。
[0017] 本发明的第五个目的是提供一种提高SLO可溶性表达的方法。所述方法是以大肠 杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的溶血素融 合基因 npela-ek-10his-slo。
[0018] 本发明还要求保护所述溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO蛋白生产、SLO检测、SLO抗 体制品制备、抗癌药物生产、基因工程或蛋白工程等领域的应用。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] (1)本发明设计并合成了溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,构建了含该 npela-ek-lOhis-slo融合基因的表达质粒和含该表达质粒的工程菌，该工程菌可以表达溶 血素融合蛋白（PeLa-EK-10His-SL0，PEHSL0)。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白 PEHSLO对宿主细胞毒性低，20°C条件下表达48h后，npela-ek-10his-slo工程菌0D600可 以达到2. 5,高于slo独立表达的工程菌（0D600 :1.60);说明融合表达可以降低SLO蛋白对 宿主具有毒性。
[0021] (2)本发明的工程菌表达的溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性 和SLO抗原性；该工程菌果胶酶产率为5. 6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL， 可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为I. 2mg/mL培养液，占到细胞总蛋白的30 %，相比slo 胞内独立表达（可溶性目标蛋白占胞内蛋白的5% )，可溶性目标蛋白产量上升达400% ; 说明融合表达可以提尚SLO蛋白的表达量。
[0022] (3)在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和 定量分析，一次果胶酶检测所需时间为〇. 3h，检测成本为0. 15元人民币，避免使用免疫学 (一次检测所需时间为l〇h，检测成本为500. 00元人民币）和溶血法检测（一次检测所需 时间为I. 〇h，检测成本为0. 50元人民币），相对于经测定免疫学和溶血法检测，检测时间分 别缩短9. 5h和0. 5h，检测成本分别节省499. 85元和0. 35元人民币，经测定IUnit果胶酶 活性对应于0. 2mg左右的蛋白量和7. OX IO4Unit溶血酶活性。本发明的方法可以简便SLO 的检测，缩短检测时间、降低检测成本。
【附图说明】
[0023] 图 1 :设计的 npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)质粒结构图；
[0024] 图 2 :npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)酶切鉴定图；I. DNA Marker， 2. npela-ek-10his-slo/pET_28a，3. npela-ek-10his-slo/pET_28a (+)双酶切；
[0025] 图 3 :重组表达 Pela-EK-IOHis-SLO 的 SDS-PAGE 图谱；1.蛋白 Marker， 2. npela-slo/pET28a(+)/BL21 (DE3)的胞内上清，3.纯化的 Pela-EK-10His-SL0。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本 发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册 所述的条件进行操作。
[0027] 实施例1溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo设计与表达质粒设计
[0028] 所述核苷酸序列使用了曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列、大肠杆菌肠激酶 位点序列、10个组氨基酸和化脓链球菌溶血素 Slo活性区与抗原区序列，而且曲霉果胶酸 裂解酶酶活性区pela序列和化脓链球菌溶血素 Sl0活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背 景下的密码子优化和增加蛋白表明基团亲水性等原理，进行了优化设计。在果胶酸裂解酶 酶pela序列的上游添加 Noc I位点序列，在果胶酸裂解酶酶pela序列下游加上肠激酶序 列、10个组氨酸序列和Nde I位点序列；Nde I位点序列下游，连接slo基因序列，slo下 游加上BamH I序列，构建的融合基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.1所示，表达质粒npela-ek-10his-sl〇-pET-28a(+)的核苷酸序列如SEQ ID N0.3。npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)质粒结构如图 1 所不。
[0029] 本发明加入果胶酸裂解酶pela序列的目的，是利用该Pela蛋白在大肠杆菌中可 以高效表达出活性蛋白同时对宿主毒性低的优越性，提高SLO蛋白的可溶性，降低SLO蛋 白对宿主的毒性，同时提供一种低成本和短时间的目标蛋白检测方法；加肠激酶序列的作 用是可以根据应用需要出发，提供切除果胶酸裂解酶Pela的便利；加入10个组氨酸序列， 是为了提供Ni-亲和层析的亲和基团，由于是加在二个蛋白基团之间，根据本本发明的需 要，10个组氨基，能保证有效结合，同时在40mM咪唑浓度下可以有效洗脱，不必使用常规的 500mM咪唑，可以减少成本。
[0030] 实施例2溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中npela-ek-lOhis序列的合成与 克隆
[0031] 使用化学合成和Over-Lap PCR的方法合成血红素融合基因 npela-ek-10his-slo 的 npela-ek-10his 部分（SEQ ID NO. 2 的 l_992bp)，合成 npela-ek-10his 片段，上游加 上Noc I位点，下游加上Nde I序列将合成的片段与PMD18T载体连接，转化JM109,转 化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37 °C培养过夜，得到单克隆转化子 npela-ek-10his/PMD18T/JM109,经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定，测定的序 列和设计序列完全相同。
[0032] 实施例3溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中slo序列的合成与克隆
[0033] 使用化学合成和Over-Lap PCR的方法合成血红素融合基因 npela-ek-10his-slo 的slo部分（SEQ ID NO. 2的992-2483bp)，上游加上Nde I位点，下游加上BamH I序列， 将合成的slo基因与PMD18T载体连接，转化JM109,转化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的 LB平板，经过37°C培养过夜，得到单克隆转化子slo/PMD18T/JM109,经过菌落PCR鉴定，质 粒酶切鉴定和测序鉴定，表明新合成的slo基因全长为1485bp，编码495氨基酸，测定的序 列和设计序列完全相同，提取slo/PMD18T备用。
[0034] 实施例 4 npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)表达载体构建
[0035] 用于实现融合基因在大肠杆菌中表达的载体是pET_28a(+)，但对构架有较 大改变，不使用pET-28a(+)的二个His-tag和Thrombin序列，将pET-28a(+)质粒和 npela-ek-10his/PMD18T用Noc I和Nde I切，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连 接产物转化E. coli JM109感受态细胞，经过37°C培养过夜，挑选转化子，通过菌落PCR鉴 定，质粒酶切鉴定（见图2)和测序鉴定，保存鉴定的npela- ek-10hiS/pET-28a(+)E.C〇li JM109 菌，提取 npela-ek-10his/pET_28a(+)备用。将 npela-ek-10his/pET_28a(+)质粒和 slo/PMD18T用Nde I和BamH I切，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连接产物转化 E. coli JM109感受态细胞，在100g/mL卡那霉素的LB平板，经过37°C培养过夜，挑选转化 子，通过菌 落PCR鉴定，质粒酶切鉴定（见图2)和测序鉴定（序列如SEQ ID NO. 3所示），保 存鉴定的 npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)E· coli JM109 菌，提取 npela-ek-10his-slo/ pET-28a(+)备用。
[0036] 实施例5表达溶血素融合蛋白PelA-EK-IOHis-SLO的工程菌构建
[0037] 将质粒 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)转化大肠杆菌宿主 BL21 (DE3)，再在 100g/mL卡那霉素的LB平板，经过37°C培养过夜，经过菌落PCR鉴定，得到单克隆转化子 npela-ek-10his-slo/pET-28a (+)/BL21(DE3)〇
[0038] 实施例6溶血素融合蛋白Pela-EK-IOHis-SLO表达与分离纯化
[0039] 将 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21 (DE3)接种在 LB 培养基中 37°C液体培 养过夜，后接入 TB (甘油 5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，Κ2ΗΡ0412· 54g/L，ΚΗ2Ρ042· 31g/ L)发酵液体培养基，37°C培养到细菌006(|(|到0. 8,用0. 5mM IPTG (异丙基硫代β -D半乳 糖苷）诱导，降温至20°C培养，表达48h。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白PEHSLO 对宿主细胞毒性低，20°C条件下表达48h后，npela-ek-10his-slo工程菌0D600可以达到 2. 5,高于slo独立表达的工程菌（0D600 :1. 60);该工程菌表达的溶血素融合蛋白PEHSLO 同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性；该工程菌果胶酶产率为5. 6Unit/mL培养液，溶 血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为I. 2mg/mL培养液，占到 细胞总蛋白的30%，相比slo独立表达（占胞内蛋白的5% )，可溶性目标蛋白产量上升达 400 % 〇
[0040] 实施例7溶血素融合蛋白Pela-EK-IOHis-SLO的分离纯化
[0041] 将 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达后的培养液离心，得到上 清用〇. 45m膜过滤，过滤后的溶液按照1 :1的比例和2X Binging buffer(10mM咪挫， IM NaCl，40mM Tris-HCL)混勾备用；His-tag亲和层析柱用5倍柱体积的IX charging buffer(50mM NiSO4)处理后，再用倍柱体积 IX Binding buffer(5mM咪挫，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)平衡；上样品后用10倍柱体积IX Binging buffer洗柱，再用5倍柱体积IX Washing buffer(10mM 咪挫，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗柱；用 6 倍柱体积 IX Elution buffer (40mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脱。重组表达的溶血素融合蛋白PEHSLO 的SDS-PAGE图谱如图3所示。
[0042] 实施例8溶血素融合蛋白PEHSLO的果胶酶活性测定
[0043] 检测上清的酶活，果胶酸裂解酶活性检测的反应体系为：0.5mL反应液，内含 25mmol/L Tris/HCl(pH 8·0)，0·1% 果胶酸，lmmol/L 0&(：12和141^上清，在50°〇反应 lOmin，反应结束后，加 ImL 0.02mol/L HCl终止反应，然后在235nm检测光吸收值的变化。 一个酶活单位定义为每min释放的1 μ mol不饱和半乳糖酸酸（unsaturated galacturonic acid)的酶量。在235nm，不饱和半乳糖醛酸光吸收系数为4600/^1^!!'
[0044] 在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定 量分析，一次果胶酶检测所需时间为〇. 5h，检测成本为0. 15元人民币，避免使用免疫学（一 次免疫学检测所需时间为l〇h，检测成本为500. 00元人民币）和溶血法检测（一次溶血酶 检测所需时间为I. 〇h，检测成本为0. 50元人民币），相对于经测定免疫学和溶血法检测，检 测时间分别缩短9. 5h和0. 5h，检测成本分别节省499. 85元和0. 35元人民币，经测定IUnit 果胶酶活性对应于〇. 2mg左右的蛋白量和7. OX IO4Unit溶血酶活性。
[0045] 实施例9溶血素融合蛋白PEHSLO的融血活性测定
[0046] 溶血素融合蛋白样品可用溶液A(溶液A :36mM H3PO4,126mM NaCl，Ig/ L BSA(bovine serum albumin)，pH 7· 0)进行系列梯度稀释。将 0· 5ml 的 150mM 2-mercaptoethanol与Iml稀释样品混勾，30°C孵育15min，然后每管加0· 5ml含绵羊红细 胞的A溶液（I. 58X 108cell/ml) 30°C下反应20min，离心后，用541nm检测上清中血红蛋白 的浓度，IU定义为在该实验条件下，引起上述反应体系中红细胞溶解的最小酶量，经测定， 融合蛋白Pela-EK-IOHis-SLO具有溶血性，酶活为4 X IO5UniVmL培养基左右。Western实 验结果为阳性，表明融合蛋白PEHSLO具有抗原性。
[0047] 实施例10溶血素融合蛋白PEHSLO在诊断试剂生产中的应用
[0048] 用 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达的融合蛋白可以用 作临床检测患者体内ASO(抗SLO蛋白的抗体）的重要生物学试剂。利用融合蛋白 PelA-EK-lOHis-SLO、偶联辣根过氧化物酶的二抗和邻苯二胺，定量分析患者体内的SLO抗 体（ASO)的量。
[0049] 实施例11溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO抗体制品生产中的应用
[0050] 将融合蛋白用肠激酶消化后，再用亲和层析纯化，得到SLO蛋白，用200 μ g SLO蛋 白免疫牛等敏感动物，首次注射后大约3周后，用50 μ g SLO蛋白加强免疫一次，在大约14 天后左右，抗体的滴度会达到最大值，抽取血样，获得血清，制备成多抗。
[0051] 可参考下列文献：
[0052] I. Kimoto H, Fujii Y, Hirano S, Yokota Y, Taketo A. Expression of recombinant Streptolysin 0 and specific antibody production. J Mol Microbiol Biotechnol. 2005 ；10(1):64-8.
[0053] 2. Velazquez BjMassaldi H1Battistoni J1Chabalgoity JA. Construction and expression of recombinant streptolysin-〇 and preevaluation ofits use in immunoassays. Clin Diagn Lab Tmmunol. 2005May ；12(5):683-4.
[0054] 实施例12溶血素融合蛋白PEHSLO在动物基因工程领域中作为打孔试剂，转移核 酸与蛋白
[0055] 将动物细胞悬浮在Hank平衡盐溶液中（配方为：8g/L NaCl, 0. 4g/L KC1，lg/L葡 萄糖，60mg/L KH2PO4, 47. 5mg/L Na2HPO4, NaHCO3, 0· 35g/L，30mM H印es，pH 至 7· 2,定容到 1L)，加入一定量的PEKSLO蛋白，在37°C，处理15min。
[0056] 实施例13溶血素融合蛋白PEHSLO可以作为药物封闭乳腺癌细胞EGF受体蛋白 ErbBl
[0057] 用终浓度为lOunit/ml的SLO Hank平衡盐溶液，处理乳腺癌细胞I. 5h。
[0058] 可参考下列文献：
[0059] Hall EH1Gurel V1Dahlberg AE1McMichael J1Brautigan DL. Inhibition of human breast cancer Matrigel invasion by Streptolysin 0 activation ofthe EGF receptor ErbBLCell Signal. 2011Dec;23 (12) :1972-7.
[0060] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种溶血素融合蛋白PEHSLO,其特征在于，所述溶血素融合蛋白PEHSLO含果胶酸裂 解酶和溶血素蛋白序列；编码所述果胶酸裂解酶和溶血素蛋白的氨基酸序列之间还含有肠 激酶酶切位点序列和10个组氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的溶血素融合蛋白PEHSL0,其特征在于，所述溶血素融合蛋白 的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。3. 根据权利要求1所述的溶血素融合蛋白PEHSL0,其特征在于，编码所述溶血素融合 蛋白PEHSLO的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。4. 表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的质粒。5. 根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所 不O6. 表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌。7. 表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的转基因细胞系。8. -种检测溶血素融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法是融合表达果胶酸裂解酶 和溶血素蛋白，通过检测果胶酶活性定性和定量分析溶血素融合蛋白PEHSL0。9. 一种提高溶血素SLO可溶性表达的方法，其特征在于，所述方法是以大肠杆菌 BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQIDNO. 2的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo〇10. 权利要求1所述溶血素融合蛋白PEHSLO在溶血素蛋白SLO生产、SLO抗体制品生 产、SLO抗体检测试剂生产或抗癌药物生产中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用，属于医学微生物或生物制药领域。本发明在大肠杆菌中表达了该溶血素融合蛋白PEHSLO，发现该溶血素融合蛋白PEHSLO表达量提高且对宿主细胞毒性低。溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性，该工程菌果胶酶产率为5.6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为1.2mg/mL培养液。在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定量分析，避免使用免疫学和溶血法检测，简化了检测方法、缩短了检测时间、节约了检测成本。溶血素融合蛋白PEHSLO还可以应用于溶血素蛋白SLO生产、SLO抗体制品生产、SLO抗体检测试剂生产或抗癌药物生产。
【IPC分类】G01N33/53, C12R1/19, C07K19/00, C07K14/315, C12N1/21, A61K38/16, A61P35/00, C12N15/70, C12N9/88
【公开号】CN104892769
【申请号】CN201510268710
【发明人】赵庆新, 王建, 崔刚, 王欢莉, 康贻军, 沈敏
【申请人】盐城师范学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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