一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT-N-cadS3及其应用
一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT-N-cad S3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种具有提高学习记忆能力的多肽 TAT-N-cad S3及其应用。
【背景技术】
[0002] 在神经系统中，突触是两个神经元相连并传递信息的部位，突触的形成和功能对 神经环路和大脑的高级功能至关重要。当神经冲动传导至轴突末梢，到达突触前，引起突触 前递质释放，作用于突触后受体，引起下游细胞内信号通路的激活，完成信号在神经元间的 传递。突触的发生、成熟和可塑性对神经环路和神经系统的功能至关重要，其分子机制直接 关联于学习记忆等大脑尚级功能，并在精神分裂症、孤独症、帕金森氏症和阿尔兹海默症等 多种疾病的发病过程中起到关键作用。因此，研宄突触功能的关键调节机制对于理解大脑 的工作原理以及寻求神经系统相关疾病的治疗手段显得尤为重要。
[0003] 细胞粘附分子（Cell adhesion molecules, CAMs)如神经型 1?粘素（N-cadherin) 在突触的发育、突触的靶向识别和突触功能的稳定性中发挥了重要作用。神经型钙粘素分 布在成熟突触活性带和致密斑周围，一方面通过其胞内段与catenin家族的蛋白形成复合 体，连接细胞骨架，另一方面通过自身的各个结构域与突触前后膜上的受体和通道结合，从 而调控受体分子的膜表达和功能等。然而，神经型钙粘素的翻译后调控机制却知之甚少。
[0004] 蛋白激酶D(Protein kinase D, PKD)是一类在进化上高度保守的丝苏氨酸蛋白激 酶，它属于妈调蛋白激酶超家族（Calmodulin-dependent protein kinases，CaMKs)。在哺 乳动物中，PKD包含三个亚型：PKD1、PKD2和PKD3。PKDl是于1994年最先在人和小鼠中克 隆得到的亚型。在神经系统中，PKDl在神经元发育早期调控神经元极性的形成；在神经元 发育中期，PKDl参与树突囊泡转运和树突分叉的调控。PKD蛋白在哺乳动物神经系统中的 高表达和高活性一直持续至神经系统发育晚期和成年之后。因此，探讨PKDl对突触发育和 功能的调节机制和对学习记忆能力的影响，为开发相应的提高记忆能力和治疗AD等神经 退行性疾病的药物提供了重要的理论基础和实验依据，已成为神经科学领域的研宄热点。
【发明内容】
[0005] 本发明所用解决的问题是如何提高学习记忆能力。
[0006] 为解决上述问题，我们提供了 一种具有提高学习记忆能力的多肽，名称为 TAT-N-cadS3,为如下 al)或 a2)或 a3):
[0007] al)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；
[0008] a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-23位所示的多肽；
[0009] a3)序列表中序列1的第14位、第16位和第17位的氨基酸残基保持不变，al)或 a2)所示的多肽经过1至5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学 习记忆能力作用的衍生多肽。
[0010] 其中，序列表的序列1由23个氨基酸组成，序列表的序列1的第1-9位氨基酸 残基组成将待转运分子导入细胞内甚至是细胞核内的区域，该区域可以被具有相同作用 的其它序列替换；序列表的序列1的第10-23位氨基酸残基构成可以抑制细胞内PKDl对 N-cadherin蛋白氨基酸序列第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的区域，其中，序 列表的序列1的第14位、第16位和第17位丝氨酸为PKDl的磷酸化位点。
[0011] 编码所述TAT-N_cadS3的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0012] 以上任一所述"编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子"可为如下1)或2)或3)所示 的DNA分子：
[0013] 1)核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；
[0014] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述 TAT-N-cadS3 的 DNA 分子；
[0015] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TAT-N-cadS3的 DNA分子。
[0016] 含有编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基 因细胞系也属于本发明的保护范围。
[0017] 本发明还保护抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872 位丝氨酸磷酸化的物质的应用，可为如下Cl)或C2):
[0018] Cl)提尚学习记忆能力；
[0019] C2)制备提尚学习记忆能力的广品。
[0020] 所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。
[0021] 所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位丝氨酸 磷酸化的物质具体可为如下（Dl)、（D2)或（D3):
[0022] (Dl)所述 TAT-N_cadS3 ;
[0023] (D2)所述"编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子"；
[0024] (D3)含有编码所述TAT-N_cadS3的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或 转基因细胞系。
[0025] 本发明还保护一种产品，其活性成分为抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869 位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的物质；所述产品的功能可为如下Cl)或C2):
[0026] Cl)提尚学习记忆能力；
[0027] C2)制备提尚学习记忆能力的广品。
[0028] 所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。
[0029] 所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位丝氨酸 磷酸化的物质具体可为如下（Dl)、（D2)或（D3):
[0030] (Dl)所述 TAT-N_cadS3 ;
[0031] (D2)所述"编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子"；
[0032] (D3)含有编码所述TAT-N_cadS3的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或 转基因细胞系。
[0033] 以上任一所述产品可为药物。
[0034] 以上任一所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 所述转基因细胞系、转基因组织和转基因器官均不包括繁殖材料。
[0036] 实验证明，本发明提供的TAT-N-cad S3可提高学习记忆能力。给予了 TAT-N-cad S3 (干扰PKDl对N-cadherin磷酸化）的大鼠，其在水迷宫训练阶段表现为能更快找到隐藏 在水下的平台，具有更强的学习记忆能力。
【附图说明】
[0037] 图1为体外磷酸化实验以及Western blot结果。
[0038] 图2为过表达N-cad mut对PKDl与N-cadherin结合能力的影响。
[0039] 图3为过表达N-cad mut对N-cadherin细胞膜表面定位的影响。
[0040] 图4为TAT-N-cadS3及对照肽TAT-N-cadS3A的氨基酸序列。
[0041] 图5为在体外培养的皮层神经元中TAT-N-cadS3对PKDl与N-cadherin结合能力 的影响。
[0042] 图6为在体外培养的皮层神经元中TAT-N-cadS3对N-cadherin细胞膜表面定位 的影响。
[0043] 图7为水迷宫行为测试中四个象限和平台的位置情况。
[0044] 图8为TAT-N_cadS3对学习记忆能力的影响。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三 次重复，结果取平均值。
[0046] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 下述实施例中的Western blot结果采用Quantity One软件进行灰度扫描。
[0049] 下述实施例中所用的液体配制方法具体如下：
[0050] 解剖液：蔗糖 7. 5g/L，葡萄糖 3. Og/L，NaC16. 8g/L，KC10. 4g/L，Na2HPO4 · 12H20 0· 24g/L，KH2P040. 03g/L，HEPES(Sigma 公司产品）2. 3464g/L ;溶剂为水；pH 为 7. 2-7. 4。使 用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，于 4°C保存。
[0051] DMEM培养液：将高糖DMEM固体培养基（Gibco公司产品）13. 5g和NaHC033. 7g/L 依次溶于水，pH为7. 2-7. 4,定容至1L。使用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，于4°C保存。
[0052] 神经元完全培养基：向Neurobasal培养基（Gibco公司产品）中加入B 27Supplement(Git)Co 公司产品）2% (体积百分比）和GlutaMAX I(100X)(Gibco 公司产 品）1% (体积百分比）得到的培养基。
[0053] 细胞裂解液：Tris-HCl (pH 7. 5) 50mM，NaCl 250mM，EDTA 10mM，NP-400. 5% (体积 百分比），PMSF lmM，NaF 4mM;溶剂为水。
[0054] 激酶反应液：Tris-HCl (pH 7· 6) 30mM，MgCl2IOmM, DTT 0· ImM，[γ-32Ρ]ΑΤΡ 10yCi/50yl ;溶剂为水。
[0055] 激酶缓冲液：Tris-HCl (pH 7· 6) 30mM，MgCl2IOmM ;溶剂为水。
[0056] 染色液（100ml):甲醇45ml、乙酸10ml、考马斯亮蓝0. 25g和蒸馏水45ml。
[0057] 脱色液（100mL):甲醇45ml、乙酸IOml和蒸馏水45ml。
[0058] 干胶液（100mL):乙醇10ml、甘油4ml和蒸馏水86ml。
[0059] 下述实施例中的大鼠的单克隆抗体MNCD2为Developmental Studies Hybridoma Bank公司产品；PKDl抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品；小鼠的单克隆抗体 anti-N-cadherin 3B9和小鼠的单克隆抗体anti-Human Tfr，均为invitrogen公司产 品；小鼠的单克隆抗体anti-β-actin为北京中杉金桥生物技术公司产品；胰酶：Trypsin 0· 25%，Invitrogen 公司产品。
[0060] 实施例1、多肽TAT-N-cadS3的发现
[0061] 野生型N-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表序列4所示，（在下文中简称 N-cadherin 或 N-cad) 〇
[0062] -、PKDl 磷酸化 N-cadherin 869、871 和 872 位丝氨酸
[0063] 针对N-cadherin胞内C端的不同结构域构建了一系列截短突变体，体外磷酸化 实验显示N-cadherin中747-872位的氨基酸序列能够被PKDl磷酸化，而N-cadherin中 747-867位的氨基酸序列不能被PKDl磷酸化（图1中A)，表明PKDl对于N-cadherin的磷 酸化残基位于N-cadherin的氨基酸序列第868-872位。
[0064] 将野生型多肽747-906 (野生型多肽747-906的氨基酸序列为N-cadherin的氨基 酸序列第747-906位）中869、871和872位的丝氨酸突变为丙氨酸，得到多肽747-906的 突变体，称为多肽N-cad 747-906mut。体外磷酸化实验显示，野生型多肽747-906能够被 PKDl磷酸化，而多肽N-cad 747-906mut不能被PKDl磷酸化（图1中B)。结果表明，PKDl 对 N-cadherin 的磷酸化位点为 Ser869、Ser871 和 Ser872。
[0065] 将 N-cadherin 中 Ser869、Ser871 和 Ser872 突变为丙氨酸，得到 N-cadherin 的突 变体，在下文中简称为N-cad muto
[0066] 二、N-cad mut对PKDl结合能力的影响
[0067] 在N2A细胞中过表达N-cadherin和N-cad mut，然后进行免疫共沉淀实验。结果 表明N-cad mut与PKDl的结合能力显著降低（图2)，为N-cadherin与PKDl的结合能力的 1/2〇
[0068] 三、N-cad mut使N-cadherin在神经元细胞膜表面定位的表达量减少
[0069] 在N2A细胞中过表达N-cadherin和多肽N-cad mut，然后进行生物素标记细胞膜 表面蛋白的实验。结果表明，过表达N-cad mut使N-cadherin在神经元细胞膜表面定位的 表达量显著减少（图3)，为过表达N-cadherin使N-cadherin在神经元细胞膜表面定位的 表达量的1/3。
[0070] 针对PKDl对N-cadherin的三个磷酸化位点设计并构建了可干扰其磷酸化的多肽 TAT-N-cad S3,在下文中简称TAT-N-cad S3。将TAT-N-cad S3 中磷酸化位点 Ser869、Ser871 和Ser872突变为丙氨酸，得到对照肽TAT-N-cad S3A，在下文中简称TAT-N-cad S3A (图4)。
[0071] TAT-N-cad S3的核苷酸序列如序列表中的序列3所示，编码如序列表中的序列1 第10-23位所示的氨基酸序列；TAT-N-cad S3A的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0072] 分别合成 TAT-N-cad S3 和 TAT-N-cad S3A。
[0073] 实施例 2、TAT-N-cad S3 的功能
[0074] 一、孕18天大鼠皮层神经元的制备
[0075] 用于制备皮层神经元的大鼠品种为SD大鼠。
[0076] 试验准备：试验前一天在培养皿中加入浓度为lmg/ml的多聚赖氨酸，置于37°C孵 箱过夜，试验当天用无菌Milli-Q水洗涤后使用；含10% FBS的DMEM培养基置于37°C孵箱 平衡。
[0077] 1、断颈处死处于孕18天的孕鼠，快速取出胎鼠。
[0078] 2、在解剖液中将胎鼠快速断头。
[0079] 3、将胎鼠的头放入盛有解剖液的培养皿中，使用两把小镊撕开头皮和颅骨，取出 完整脑组织。
[0080] 4、将脑组织转移至冰盒上盛有解剖液的培养皿中，在体视镜下分离皮层组织（从 背侧开始，用镊子分开左右大脑半球，从内向外翻开皮层，用剪刀垂直剪断海马外缘，使大 脑皮层与其他部分分离）。
[0081] 5、将皮层组织放入培养皿，加入1ml 0. 25%的胰酶，于37°C孵箱中消化0. 5h。
[0082] 6、将皮层组织转移至含10% FBS、1%氨苄青霉素和1%卡那霉素的DMEM培养基 中，用Iml的移液枪将皮层组织块轻柔的吹散，沉降5分钟，吸取上清至含10% FBS的DMEM 培养基中，获得皮层神经元细胞悬液。
[0083] 7、将皮层神经元细胞悬液加入铺有多聚赖氨酸的培养皿中培养3-4小时，然后改 用神经元完全培养基培养，此后每3天进行半换液。
[0084] 二、TAT-N-cad S3 抑制 PKDl 与 N-cadherin 的结合
[0085] 1、分别将TAT-N-cad S3和TAT-N-cad S3A加入体外培养皮层神经元的培养基中， 终浓度为3 μ M，处理皮层神经元12h。
[0086] 2、完成步骤1后，分别取皮层神经元提取总蛋白，分别得到TAT-N-cad S3皮层神 经元总蛋白溶液和TAT-N-cad S3A皮层神经元总蛋白溶液。
[0087] 3、免疫共沉淀。
[0088] (1)用预冷的 pH 7. 2PBS 缓冲液清洗珠子（protein A-Sepharose CL-4, Amersham Pharmacia，CAT#17_5280)3 次，2000rpmX2min 离心，弃上清；
[0089] (2)完成步骤（1)后，40 μ 1珠子与PKDl抗体共同孵育，4°C混悬3h ;
[0090] (3)完成步骤⑵后，加入步骤2得到的皮层神经元总蛋白溶液（TAT-N-cad S3皮 层神经元总蛋白溶液或TAT-N-cad S3A皮层神经元总蛋白溶液，含500 μ g皮层神经元总蛋 白），4 C混悬过夜；
[0091] (4)完成步骤⑶后，用预冷的含0· 1% (体积百分比）Triton X-100的TBS缓冲 液清洗珠子6次，2000rpmX 2min离心，去除非特异结合；
[0092] (5)完成步骤⑷后，弃上清，加入6 X SDS-PAGE电泳上样缓冲液，煮沸（使与珠子 结合的蛋白释放），取上清；
[0093] (6)将步骤（5)得到的上清进行SDS-PAGE和Western blot (采用大鼠的单克隆 抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，采用PKDl抗体作为一抗检测PKDl)，结果见图5A的 IP。
[0094] (7)将步骤2得到的皮层神经元总蛋白溶液 （含50 μ g皮层神经元总蛋白）进行 SDS-PAGE和Western blot (采用大鼠的单克隆抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，采用 PKDl抗体作为一抗检测PKD1，将β -actin蛋白作为内参），结果见图5中A的Input。
[0095] 对Western blot结果采用Quantity One软件进行灰度扫描后，根据IP灰度值和 Input灰度值计算结合强度：结合强度=IP灰度值/Input灰度值。结合强度见图中5B。 实验表明TAT-N-cad S3能够显著地降低PKDl与N-cadherin结合能力，而TAT-N-cad S3A 不能抑制PKDl与N-cadherin结合。
[0096] 三、TAT-N-cad S3使N-cadherin在细胞膜表面定位的表达量减少
[0097] 1、分别将TAT-N-cad S3和TAT-N-cad S3A加入体外培养皮层神经元的培养基中， 终浓度为3 μ M，处理皮层神经元12h。
[0098] 2、完成步骤1后，取皮层神经元，采用EZ link-NHS-LC-biotin标记试剂盒 (Pierce公司产品，产品目录号为CAT#21335)和UltraLinkoR Immobilized NeutrAvidinTM Protein Plus(Pierce公司产品，产品目录号为CAT#53151)标记细胞膜表面蛋白，借助生 物素纯化细胞膜表面蛋白。
[0099] 3、完成步骤1后，分别取皮层神经元提取总蛋白，分别得到TAT-N-cad S3皮层神 经元总蛋白和TAT-N-cad S3A皮层神经元总蛋白；
[0100] 4、分别将细胞膜表面蛋白和皮层神经元总蛋白进行SDS-PAGE和Western blot (采用大鼠的单克隆抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，细胞膜表面蛋白采用Tfr 蛋白为内参，总蛋白采用β-actin蛋白为内参）。
[0101] Western blot 结果见图 6 中 A。将 TAT-N-cad S3A 处理组细胞膜上 N-cadherin 的含量作为1，计算TAT-N-cad S3处理组细胞膜上N-cadherin的相对含量，结果见图6中 B0
[0102] 通过生物素标记细胞膜表面蛋白的检测发现TAT-N-cad S3处理体外培养的皮层 神经元12h能够使神经元细胞膜表面N-cadherin的表达量显著减少。相对于TAT-N-cad S3A处理，TAT-N-cad S3处理体外培养的皮层神经元12h能够使神经元细胞膜表面 N-cadherin的表达量降低至2/5。
[0103] 四、干扰PKDl对N-cadherin的磷酸化增强大鼠学习记忆能力
[0104] 本步骤中的大鼠为健康雄性SD大鼠，体重为90-100g。
[0105] 为了验证PKDl对N-cadherin的磷酸化是否直接影响了大鼠的学习记忆，对大鼠 进行了海马依赖的学习记忆能力测试，即水迷宫行为学测试。
[0106] 对大鼠双侧海马的CAl区域进行核团定位埋管（坐标：AP:+3. 6mm，L(R) : ±2mm， DV: 2. 9mm)，待其恢复5天之后进行给药和水迷宫的行为测试。每天在进行水迷宫游泳训练 的12h前双侧海马注射多肽TAT-N-cad S3或对照肽TAT-N-cad S3A，连续五天。注射要求 为：双侧海马注射 TAT-N-cad S3 (或 TAT-N-cad S3A)的体积为 0. 5 μ 1，TAT-N-cad S3 (或 TAT-N-cad S3A)的浓度为20 μ g/μ 1，注射速度为0.2 μ 1/min。在第六天将平台撤除并进 行水迷宫的行为测试。
[0107] 水迷宫行为测定的实验步骤如下：
[0108] 1)在一个直径150cm深60cm的黑色圆缸里注入32cm深的水，水温恒定在 22± 1°C，水面分为四个象限，一个直径为12cm的平台置于第三象限，位于水下Icm处（见 图7,图7中I为第一象限，II为第二象限，III为第三象限，IV为第三象限，A为平台）。实验 的第一天，同一只大鼠分别在四个不同象限入水寻找水下平台。大鼠寻找平台的时间上限 为120s，如果120s大鼠未找到平台，则需指引到平台上，每只大鼠在平台上的时间为30s， 以方便其进行空间学习和记忆。每只大鼠从不同象限入水的时间间隔为20min。水迷宫上 方安置一摄像头监视大鼠寻到水下平台的时间。
[0109] 2)重复步骤1连续5天，每天大鼠从不同象限入水的顺序均有所改动，记录大鼠的 逃避潜伏期。
[0110] 3)实验第六天，撤掉水下平台，将大鼠从第一象限放入水迷宫，记录大鼠第一次穿 越水下平台区域的时间、穿过水下平台区域的次数以及在第三象限的时间和路程。
[0111] 结果见图8。结果显示，给予了 TAT-N-cad S3干扰PKDl对Ν-cadherin磷酸化 的大鼠，其在水迷宫训练阶段表现为能更快找到隐藏在水下的平台（图8中A)，表明给予 TAT-N-cad S3的大鼠具有更强的学习记忆能力。在第6天撤除水下平台的测试实验中，分 别给予TAT-N-cad S3和TAT-N-cad S3的两组大鼠的第一次穿越目标区域的时间、穿越目 标区域的次数、目标象限的总时间和总路程等均无统计学差异（图8中B和C)。
【主权项】
1. 一种多肽，为如下al)或a2)或a3): al)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽； a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-23位所示的多肽； a3)序列表中序列1的第14位、第16位和第17位的氨基酸残基保持不变，al)或a2) 所示的多肽经过1至5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学习记 忆能力作用的衍生多肽。2. 编码权利要求1所述多肽的核酸分子。3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3) 所不的DNA分子： 1) 核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述多肽 的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述多肽的DNA 分子。4. 含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系。5. 抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化 的物质的应用为如下Cl)或C2): Cl)提尚学习记忆能力； C2)制备提尚学习记忆能力的广品。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述N-cadherin蛋白如序列表序列4所示。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白 第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的物质为如下（Dl)、（D2)或（D3): (Dl)权利要求1所述的多肽； (D2)权利要求2或3所述核酸分子； (D3)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系。8. -种产品，其活性成分为抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和 第872位丝氨酸磷酸化的物质；所述产品的功能为如下Cl)或C2): Cl)提尚学习记忆能力； C2)制备提尚学习记忆能力的广品。9. 如权利要求8所述的产品，其特征在于：所述N-cadherin蛋白如序列表序列4所示。10. 如权利要求9所述的产品，其特征在于：所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白 第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的物质为如下（Dl)、（D2)或（D3): (Dl)权利要求1所述的多肽； (D2)权利要求2或3所述核酸分子； (D3)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系。
【专利摘要】本发明公开了一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT-N-cad S3及其应用。该多肽TAT-N-cad S3为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-23位所示的多肽；a3)序列表中序列1的第14位、第16位和第17位的氨基酸残基保持不变，将a1)或a2)所示的多肽经过1至5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学习记忆能力作用的衍生多肽。实验证明，该多肽可提高学习记忆能力。
【IPC分类】C07K19/00, A61K47/48, A61K38/17, A61P25/00, C12N15/62
【公开号】CN104892771
【申请号】CN201510342161
【发明人】王韵, 岑程, 李文琪, 李刚, 罗丽达
【申请人】北京大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种具有提高学习记忆能力的多肽 TAT-N-cad S3及其应用。
【背景技术】
[0002] 在神经系统中，突触是两个神经元相连并传递信息的部位，突触的形成和功能对 神经环路和大脑的高级功能至关重要。当神经冲动传导至轴突末梢，到达突触前，引起突触 前递质释放，作用于突触后受体，引起下游细胞内信号通路的激活，完成信号在神经元间的 传递。突触的发生、成熟和可塑性对神经环路和神经系统的功能至关重要，其分子机制直接 关联于学习记忆等大脑尚级功能，并在精神分裂症、孤独症、帕金森氏症和阿尔兹海默症等 多种疾病的发病过程中起到关键作用。因此，研宄突触功能的关键调节机制对于理解大脑 的工作原理以及寻求神经系统相关疾病的治疗手段显得尤为重要。
[0003] 细胞粘附分子（Cell adhesion molecules, CAMs)如神经型 1?粘素（N-cadherin) 在突触的发育、突触的靶向识别和突触功能的稳定性中发挥了重要作用。神经型钙粘素分 布在成熟突触活性带和致密斑周围，一方面通过其胞内段与catenin家族的蛋白形成复合 体，连接细胞骨架，另一方面通过自身的各个结构域与突触前后膜上的受体和通道结合，从 而调控受体分子的膜表达和功能等。然而，神经型钙粘素的翻译后调控机制却知之甚少。
[0004] 蛋白激酶D(Protein kinase D, PKD)是一类在进化上高度保守的丝苏氨酸蛋白激 酶，它属于妈调蛋白激酶超家族（Calmodulin-dependent protein kinases，CaMKs)。在哺 乳动物中，PKD包含三个亚型：PKD1、PKD2和PKD3。PKDl是于1994年最先在人和小鼠中克 隆得到的亚型。在神经系统中，PKDl在神经元发育早期调控神经元极性的形成；在神经元 发育中期，PKDl参与树突囊泡转运和树突分叉的调控。PKD蛋白在哺乳动物神经系统中的 高表达和高活性一直持续至神经系统发育晚期和成年之后。因此，探讨PKDl对突触发育和 功能的调节机制和对学习记忆能力的影响，为开发相应的提高记忆能力和治疗AD等神经 退行性疾病的药物提供了重要的理论基础和实验依据，已成为神经科学领域的研宄热点。
【发明内容】
[0005] 本发明所用解决的问题是如何提高学习记忆能力。
[0006] 为解决上述问题，我们提供了 一种具有提高学习记忆能力的多肽，名称为 TAT-N-cadS3,为如下 al)或 a2)或 a3):
[0007] al)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；
[0008] a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-23位所示的多肽；
[0009] a3)序列表中序列1的第14位、第16位和第17位的氨基酸残基保持不变，al)或 a2)所示的多肽经过1至5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学 习记忆能力作用的衍生多肽。
[0010] 其中，序列表的序列1由23个氨基酸组成，序列表的序列1的第1-9位氨基酸 残基组成将待转运分子导入细胞内甚至是细胞核内的区域，该区域可以被具有相同作用 的其它序列替换；序列表的序列1的第10-23位氨基酸残基构成可以抑制细胞内PKDl对 N-cadherin蛋白氨基酸序列第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的区域，其中，序 列表的序列1的第14位、第16位和第17位丝氨酸为PKDl的磷酸化位点。
[0011] 编码所述TAT-N_cadS3的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0012] 以上任一所述"编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子"可为如下1)或2)或3)所示 的DNA分子：
[0013] 1)核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；
[0014] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述 TAT-N-cadS3 的 DNA 分子；
[0015] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TAT-N-cadS3的 DNA分子。
[0016] 含有编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基 因细胞系也属于本发明的保护范围。
[0017] 本发明还保护抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872 位丝氨酸磷酸化的物质的应用，可为如下Cl)或C2):
[0018] Cl)提尚学习记忆能力；
[0019] C2)制备提尚学习记忆能力的广品。
[0020] 所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。
[0021] 所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位丝氨酸 磷酸化的物质具体可为如下（Dl)、（D2)或（D3):
[0022] (Dl)所述 TAT-N_cadS3 ;
[0023] (D2)所述"编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子"；
[0024] (D3)含有编码所述TAT-N_cadS3的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或 转基因细胞系。
[0025] 本发明还保护一种产品，其活性成分为抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869 位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的物质；所述产品的功能可为如下Cl)或C2):
[0026] Cl)提尚学习记忆能力；
[0027] C2)制备提尚学习记忆能力的广品。
[0028] 所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。
[0029] 所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位丝氨酸 磷酸化的物质具体可为如下（Dl)、（D2)或（D3):
[0030] (Dl)所述 TAT-N_cadS3 ;
[0031] (D2)所述"编码所述TAT-N-cadS3的核酸分子"；
[0032] (D3)含有编码所述TAT-N_cadS3的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或 转基因细胞系。
[0033] 以上任一所述产品可为药物。
[0034] 以上任一所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 所述转基因细胞系、转基因组织和转基因器官均不包括繁殖材料。
[0036] 实验证明，本发明提供的TAT-N-cad S3可提高学习记忆能力。给予了 TAT-N-cad S3 (干扰PKDl对N-cadherin磷酸化）的大鼠，其在水迷宫训练阶段表现为能更快找到隐藏 在水下的平台，具有更强的学习记忆能力。
【附图说明】
[0037] 图1为体外磷酸化实验以及Western blot结果。
[0038] 图2为过表达N-cad mut对PKDl与N-cadherin结合能力的影响。
[0039] 图3为过表达N-cad mut对N-cadherin细胞膜表面定位的影响。
[0040] 图4为TAT-N-cadS3及对照肽TAT-N-cadS3A的氨基酸序列。
[0041] 图5为在体外培养的皮层神经元中TAT-N-cadS3对PKDl与N-cadherin结合能力 的影响。
[0042] 图6为在体外培养的皮层神经元中TAT-N-cadS3对N-cadherin细胞膜表面定位 的影响。
[0043] 图7为水迷宫行为测试中四个象限和平台的位置情况。
[0044] 图8为TAT-N_cadS3对学习记忆能力的影响。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三 次重复，结果取平均值。
[0046] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 下述实施例中的Western blot结果采用Quantity One软件进行灰度扫描。
[0049] 下述实施例中所用的液体配制方法具体如下：
[0050] 解剖液：蔗糖 7. 5g/L，葡萄糖 3. Og/L，NaC16. 8g/L，KC10. 4g/L，Na2HPO4 · 12H20 0· 24g/L，KH2P040. 03g/L，HEPES(Sigma 公司产品）2. 3464g/L ;溶剂为水；pH 为 7. 2-7. 4。使 用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，于 4°C保存。
[0051] DMEM培养液：将高糖DMEM固体培养基（Gibco公司产品）13. 5g和NaHC033. 7g/L 依次溶于水，pH为7. 2-7. 4,定容至1L。使用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，于4°C保存。
[0052] 神经元完全培养基：向Neurobasal培养基（Gibco公司产品）中加入B 27Supplement(Git)Co 公司产品）2% (体积百分比）和GlutaMAX I(100X)(Gibco 公司产 品）1% (体积百分比）得到的培养基。
[0053] 细胞裂解液：Tris-HCl (pH 7. 5) 50mM，NaCl 250mM，EDTA 10mM，NP-400. 5% (体积 百分比），PMSF lmM，NaF 4mM;溶剂为水。
[0054] 激酶反应液：Tris-HCl (pH 7· 6) 30mM，MgCl2IOmM, DTT 0· ImM，[γ-32Ρ]ΑΤΡ 10yCi/50yl ;溶剂为水。
[0055] 激酶缓冲液：Tris-HCl (pH 7· 6) 30mM，MgCl2IOmM ;溶剂为水。
[0056] 染色液（100ml):甲醇45ml、乙酸10ml、考马斯亮蓝0. 25g和蒸馏水45ml。
[0057] 脱色液（100mL):甲醇45ml、乙酸IOml和蒸馏水45ml。
[0058] 干胶液（100mL):乙醇10ml、甘油4ml和蒸馏水86ml。
[0059] 下述实施例中的大鼠的单克隆抗体MNCD2为Developmental Studies Hybridoma Bank公司产品；PKDl抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品；小鼠的单克隆抗体 anti-N-cadherin 3B9和小鼠的单克隆抗体anti-Human Tfr，均为invitrogen公司产 品；小鼠的单克隆抗体anti-β-actin为北京中杉金桥生物技术公司产品；胰酶：Trypsin 0· 25%，Invitrogen 公司产品。
[0060] 实施例1、多肽TAT-N-cadS3的发现
[0061] 野生型N-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表序列4所示，（在下文中简称 N-cadherin 或 N-cad) 〇
[0062] -、PKDl 磷酸化 N-cadherin 869、871 和 872 位丝氨酸
[0063] 针对N-cadherin胞内C端的不同结构域构建了一系列截短突变体，体外磷酸化 实验显示N-cadherin中747-872位的氨基酸序列能够被PKDl磷酸化，而N-cadherin中 747-867位的氨基酸序列不能被PKDl磷酸化（图1中A)，表明PKDl对于N-cadherin的磷 酸化残基位于N-cadherin的氨基酸序列第868-872位。
[0064] 将野生型多肽747-906 (野生型多肽747-906的氨基酸序列为N-cadherin的氨基 酸序列第747-906位）中869、871和872位的丝氨酸突变为丙氨酸，得到多肽747-906的 突变体，称为多肽N-cad 747-906mut。体外磷酸化实验显示，野生型多肽747-906能够被 PKDl磷酸化，而多肽N-cad 747-906mut不能被PKDl磷酸化（图1中B)。结果表明，PKDl 对 N-cadherin 的磷酸化位点为 Ser869、Ser871 和 Ser872。
[0065] 将 N-cadherin 中 Ser869、Ser871 和 Ser872 突变为丙氨酸，得到 N-cadherin 的突 变体，在下文中简称为N-cad muto
[0066] 二、N-cad mut对PKDl结合能力的影响
[0067] 在N2A细胞中过表达N-cadherin和N-cad mut，然后进行免疫共沉淀实验。结果 表明N-cad mut与PKDl的结合能力显著降低（图2)，为N-cadherin与PKDl的结合能力的 1/2〇
[0068] 三、N-cad mut使N-cadherin在神经元细胞膜表面定位的表达量减少
[0069] 在N2A细胞中过表达N-cadherin和多肽N-cad mut，然后进行生物素标记细胞膜 表面蛋白的实验。结果表明，过表达N-cad mut使N-cadherin在神经元细胞膜表面定位的 表达量显著减少（图3)，为过表达N-cadherin使N-cadherin在神经元细胞膜表面定位的 表达量的1/3。
[0070] 针对PKDl对N-cadherin的三个磷酸化位点设计并构建了可干扰其磷酸化的多肽 TAT-N-cad S3,在下文中简称TAT-N-cad S3。将TAT-N-cad S3 中磷酸化位点 Ser869、Ser871 和Ser872突变为丙氨酸，得到对照肽TAT-N-cad S3A，在下文中简称TAT-N-cad S3A (图4)。
[0071] TAT-N-cad S3的核苷酸序列如序列表中的序列3所示，编码如序列表中的序列1 第10-23位所示的氨基酸序列；TAT-N-cad S3A的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0072] 分别合成 TAT-N-cad S3 和 TAT-N-cad S3A。
[0073] 实施例 2、TAT-N-cad S3 的功能
[0074] 一、孕18天大鼠皮层神经元的制备
[0075] 用于制备皮层神经元的大鼠品种为SD大鼠。
[0076] 试验准备：试验前一天在培养皿中加入浓度为lmg/ml的多聚赖氨酸，置于37°C孵 箱过夜，试验当天用无菌Milli-Q水洗涤后使用；含10% FBS的DMEM培养基置于37°C孵箱 平衡。
[0077] 1、断颈处死处于孕18天的孕鼠，快速取出胎鼠。
[0078] 2、在解剖液中将胎鼠快速断头。
[0079] 3、将胎鼠的头放入盛有解剖液的培养皿中，使用两把小镊撕开头皮和颅骨，取出 完整脑组织。
[0080] 4、将脑组织转移至冰盒上盛有解剖液的培养皿中，在体视镜下分离皮层组织（从 背侧开始，用镊子分开左右大脑半球，从内向外翻开皮层，用剪刀垂直剪断海马外缘，使大 脑皮层与其他部分分离）。
[0081] 5、将皮层组织放入培养皿，加入1ml 0. 25%的胰酶，于37°C孵箱中消化0. 5h。
[0082] 6、将皮层组织转移至含10% FBS、1%氨苄青霉素和1%卡那霉素的DMEM培养基 中，用Iml的移液枪将皮层组织块轻柔的吹散，沉降5分钟，吸取上清至含10% FBS的DMEM 培养基中，获得皮层神经元细胞悬液。
[0083] 7、将皮层神经元细胞悬液加入铺有多聚赖氨酸的培养皿中培养3-4小时，然后改 用神经元完全培养基培养，此后每3天进行半换液。
[0084] 二、TAT-N-cad S3 抑制 PKDl 与 N-cadherin 的结合
[0085] 1、分别将TAT-N-cad S3和TAT-N-cad S3A加入体外培养皮层神经元的培养基中， 终浓度为3 μ M，处理皮层神经元12h。
[0086] 2、完成步骤1后，分别取皮层神经元提取总蛋白，分别得到TAT-N-cad S3皮层神 经元总蛋白溶液和TAT-N-cad S3A皮层神经元总蛋白溶液。
[0087] 3、免疫共沉淀。
[0088] (1)用预冷的 pH 7. 2PBS 缓冲液清洗珠子（protein A-Sepharose CL-4, Amersham Pharmacia，CAT#17_5280)3 次，2000rpmX2min 离心，弃上清；
[0089] (2)完成步骤（1)后，40 μ 1珠子与PKDl抗体共同孵育，4°C混悬3h ;
[0090] (3)完成步骤⑵后，加入步骤2得到的皮层神经元总蛋白溶液（TAT-N-cad S3皮 层神经元总蛋白溶液或TAT-N-cad S3A皮层神经元总蛋白溶液，含500 μ g皮层神经元总蛋 白），4 C混悬过夜；
[0091] (4)完成步骤⑶后，用预冷的含0· 1% (体积百分比）Triton X-100的TBS缓冲 液清洗珠子6次，2000rpmX 2min离心，去除非特异结合；
[0092] (5)完成步骤⑷后，弃上清，加入6 X SDS-PAGE电泳上样缓冲液，煮沸（使与珠子 结合的蛋白释放），取上清；
[0093] (6)将步骤（5)得到的上清进行SDS-PAGE和Western blot (采用大鼠的单克隆 抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，采用PKDl抗体作为一抗检测PKDl)，结果见图5A的 IP。
[0094] (7)将步骤2得到的皮层神经元总蛋白溶液 （含50 μ g皮层神经元总蛋白）进行 SDS-PAGE和Western blot (采用大鼠的单克隆抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，采用 PKDl抗体作为一抗检测PKD1，将β -actin蛋白作为内参），结果见图5中A的Input。
[0095] 对Western blot结果采用Quantity One软件进行灰度扫描后，根据IP灰度值和 Input灰度值计算结合强度：结合强度=IP灰度值/Input灰度值。结合强度见图中5B。 实验表明TAT-N-cad S3能够显著地降低PKDl与N-cadherin结合能力，而TAT-N-cad S3A 不能抑制PKDl与N-cadherin结合。
[0096] 三、TAT-N-cad S3使N-cadherin在细胞膜表面定位的表达量减少
[0097] 1、分别将TAT-N-cad S3和TAT-N-cad S3A加入体外培养皮层神经元的培养基中， 终浓度为3 μ M，处理皮层神经元12h。
[0098] 2、完成步骤1后，取皮层神经元，采用EZ link-NHS-LC-biotin标记试剂盒 (Pierce公司产品，产品目录号为CAT#21335)和UltraLinkoR Immobilized NeutrAvidinTM Protein Plus(Pierce公司产品，产品目录号为CAT#53151)标记细胞膜表面蛋白，借助生 物素纯化细胞膜表面蛋白。
[0099] 3、完成步骤1后，分别取皮层神经元提取总蛋白，分别得到TAT-N-cad S3皮层神 经元总蛋白和TAT-N-cad S3A皮层神经元总蛋白；
[0100] 4、分别将细胞膜表面蛋白和皮层神经元总蛋白进行SDS-PAGE和Western blot (采用大鼠的单克隆抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，细胞膜表面蛋白采用Tfr 蛋白为内参，总蛋白采用β-actin蛋白为内参）。
[0101] Western blot 结果见图 6 中 A。将 TAT-N-cad S3A 处理组细胞膜上 N-cadherin 的含量作为1，计算TAT-N-cad S3处理组细胞膜上N-cadherin的相对含量，结果见图6中 B0
[0102] 通过生物素标记细胞膜表面蛋白的检测发现TAT-N-cad S3处理体外培养的皮层 神经元12h能够使神经元细胞膜表面N-cadherin的表达量显著减少。相对于TAT-N-cad S3A处理，TAT-N-cad S3处理体外培养的皮层神经元12h能够使神经元细胞膜表面 N-cadherin的表达量降低至2/5。
[0103] 四、干扰PKDl对N-cadherin的磷酸化增强大鼠学习记忆能力
[0104] 本步骤中的大鼠为健康雄性SD大鼠，体重为90-100g。
[0105] 为了验证PKDl对N-cadherin的磷酸化是否直接影响了大鼠的学习记忆，对大鼠 进行了海马依赖的学习记忆能力测试，即水迷宫行为学测试。
[0106] 对大鼠双侧海马的CAl区域进行核团定位埋管（坐标：AP:+3. 6mm，L(R) : ±2mm， DV: 2. 9mm)，待其恢复5天之后进行给药和水迷宫的行为测试。每天在进行水迷宫游泳训练 的12h前双侧海马注射多肽TAT-N-cad S3或对照肽TAT-N-cad S3A，连续五天。注射要求 为：双侧海马注射 TAT-N-cad S3 (或 TAT-N-cad S3A)的体积为 0. 5 μ 1，TAT-N-cad S3 (或 TAT-N-cad S3A)的浓度为20 μ g/μ 1，注射速度为0.2 μ 1/min。在第六天将平台撤除并进 行水迷宫的行为测试。
[0107] 水迷宫行为测定的实验步骤如下：
[0108] 1)在一个直径150cm深60cm的黑色圆缸里注入32cm深的水，水温恒定在 22± 1°C，水面分为四个象限，一个直径为12cm的平台置于第三象限，位于水下Icm处（见 图7,图7中I为第一象限，II为第二象限，III为第三象限，IV为第三象限，A为平台）。实验 的第一天，同一只大鼠分别在四个不同象限入水寻找水下平台。大鼠寻找平台的时间上限 为120s，如果120s大鼠未找到平台，则需指引到平台上，每只大鼠在平台上的时间为30s， 以方便其进行空间学习和记忆。每只大鼠从不同象限入水的时间间隔为20min。水迷宫上 方安置一摄像头监视大鼠寻到水下平台的时间。
[0109] 2)重复步骤1连续5天，每天大鼠从不同象限入水的顺序均有所改动，记录大鼠的 逃避潜伏期。
[0110] 3)实验第六天，撤掉水下平台，将大鼠从第一象限放入水迷宫，记录大鼠第一次穿 越水下平台区域的时间、穿过水下平台区域的次数以及在第三象限的时间和路程。
[0111] 结果见图8。结果显示，给予了 TAT-N-cad S3干扰PKDl对Ν-cadherin磷酸化 的大鼠，其在水迷宫训练阶段表现为能更快找到隐藏在水下的平台（图8中A)，表明给予 TAT-N-cad S3的大鼠具有更强的学习记忆能力。在第6天撤除水下平台的测试实验中，分 别给予TAT-N-cad S3和TAT-N-cad S3的两组大鼠的第一次穿越目标区域的时间、穿越目 标区域的次数、目标象限的总时间和总路程等均无统计学差异（图8中B和C)。
【主权项】
1. 一种多肽，为如下al)或a2)或a3): al)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽； a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-23位所示的多肽； a3)序列表中序列1的第14位、第16位和第17位的氨基酸残基保持不变，al)或a2) 所示的多肽经过1至5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学习记 忆能力作用的衍生多肽。2. 编码权利要求1所述多肽的核酸分子。3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3) 所不的DNA分子： 1) 核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述多肽 的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述多肽的DNA 分子。4. 含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系。5. 抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化 的物质的应用为如下Cl)或C2): Cl)提尚学习记忆能力； C2)制备提尚学习记忆能力的广品。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述N-cadherin蛋白如序列表序列4所示。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白 第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的物质为如下（Dl)、（D2)或（D3): (Dl)权利要求1所述的多肽； (D2)权利要求2或3所述核酸分子； (D3)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系。8. -种产品，其活性成分为抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白第869位、第871位和 第872位丝氨酸磷酸化的物质；所述产品的功能为如下Cl)或C2): Cl)提尚学习记忆能力； C2)制备提尚学习记忆能力的广品。9. 如权利要求8所述的产品，其特征在于：所述N-cadherin蛋白如序列表序列4所示。10. 如权利要求9所述的产品，其特征在于：所述抑制细胞内PKDl对N-cadherin蛋白 第869位、第871位和第872位丝氨酸磷酸化的物质为如下（Dl)、（D2)或（D3): (Dl)权利要求1所述的多肽； (D2)权利要求2或3所述核酸分子； (D3)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系。
【专利摘要】本发明公开了一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT-N-cad S3及其应用。该多肽TAT-N-cad S3为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-23位所示的多肽；a3)序列表中序列1的第14位、第16位和第17位的氨基酸残基保持不变，将a1)或a2)所示的多肽经过1至5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学习记忆能力作用的衍生多肽。实验证明，该多肽可提高学习记忆能力。
【IPC分类】C07K19/00, A61K47/48, A61K38/17, A61P25/00, C12N15/62
【公开号】CN104892771
【申请号】CN201510342161
【发明人】王韵, 岑程, 李文琪, 李刚, 罗丽达
【申请人】北京大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
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