绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸lem及其制备方法和用图
绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸lem及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说，涉及一种从绿萼梅中提取得到的一高 甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM、其制备方法及在制备天然抑菌剂的应用。
【背景技术】
[0002] 随着生活水平的提高，食品安全问题越来越引起人们的重视。在食品生产过程中， 为了延长食品的保质期，常需要添加防腐抗菌剂。据调查研宄，人们常用的苯甲酸钠、山梨 酸钾等化学添加剂具有致癌性、致畸性和易引起食物中毒等毒副作用。因而，广谱、高效、安 全防腐抗菌剂的开发应用受到了人们的广泛关注。多糖是构成生命的四大基本物质之一， 具有许多生物活性，包括抗感染、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗病毒等作用。已有多项研宄 显示多糖具有抑菌作用，甲酯其具有良好的生物相容性和生物无毒性等特性，是一种较为 理想的天然防腐抗菌剂。
[0003] 绿萼梅为蔷薇科植物梅Prunus mume (Sieb. ) Sieb. et Zucc.的干燥花蕾。原产我 国西南及台湾，主产江苏和浙江，现在四川和湖北。绿萼梅味酸，涩，性平，归肝、胃、肺经，具 有舒肝，和胃，化痰之功效。其花色洁白，香味极浓，有"花中君子"的美称，最大特点就是能 够理气，调理脾胃，疏理气血，但却不会伤阴，老少皆宜，非常难得，常用于郁闷心烦、肝胃气 痛、食欲不振等症。此外，绿萼梅水外用还能预防面部血瘀形成斑点。多糖作绿萼梅生物活 性的重要组成部分，其结构及活性尚无报道。本发明在对绿萼梅多糖进行提取的基础上，对 其结构及抑菌活性进行了测定，以期为绿萼梅多糖开发天然抑菌剂提供理论基础。
【发明内容】
[0004] 本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以绿萼梅为原料获得了一种绿 萼梅多糖，其主要成分为半乳糖醛酸，具体为高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM(发明人定 义该多糖为LEM)，活性实验表明高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM具有很好的抑菌效果。 其在制备抑菌作用的药物及功能食品中具有潜在的应用价值。
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其结构式如 下：
[0006]
[0007] 均聚半乳糖醛酸为只有半乳糖醛酸单一单糖重复组成的多糖，其中R为半乳糖醛 酸C6位的羟基被部分甲酯化。
[0008] 其中，所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的重均分子量范围为I-IOOkDa ;优选 为 l-50kDa ;更优选为 3-10kDa ;
[0009] 本发明的另一目的是提供本所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法， 其包括以下步骤：
[0010] a.多糖提取：干燥的绿萼梅经乙醇脱脂，加入去离子水，加热条件下提取，过滤， 残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩得浓缩液，加入3倍于 浓缩液体积的乙醇进行醇沉，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提绿萼梅粗多糖。
[0011] b.多糖脱色：取绿萼梅粗多糖，水溶解，离心，上清用2M NaOH溶液调节pH至9. 0， 加入30%过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7%，搅拌脱色3h ;脱色结束后用盐酸调 节溶液pH至中性，经透析除去溶液中的离子和小分子物质，冷冻干燥即得甲酯取代的均聚 半乳糖醛酸LEM。
[0012] 步骤a所述乙醇脱脂的过程为：按料液比（g/L)l:10-l:30的比例加入浓度为 65-85%，pH值2. 0-3. 0的乙醇溶液进行脱脂处理2-4次，脱脂条件为：水浴温度60-80°C， 脱脂时间l_3h，然后挤压除去乙醇。
[0013] 步骤a中干燥的绿萼梅与每次加入的去离子水的料液比（g/L)为1:10-1:30,加热 条件下提取的加热温度95-100°C水浴中，每次提取1-3小时。
[0014] 步骤a中所述醇沉使用的乙醇为浓度95%的pH2. 0-3. 0的乙醇。
[0015] 在步骤b中，透析优选为MW3500(截留分子量3500)的透析袋。
[0016] 本发明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的抑菌作用。
[0017] 本发明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM在制备天然抑 菌剂中的用途。
【附图说明】：
[0018] 图1为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的高效凝胶色谱图；
[0019] 图2为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的13C-NMR谱图；
[0020] 图3为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的HSQC谱图；
[0021] 图4为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LHM抑菌作用结果。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本 发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和 修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求中包括的变通和修改。
[0023] 实施例1 :绿萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备
[0024] a.多糖提取：
[0025] 称取绿萼梅200g，按料液比（g/L) 1:20的比例加入浓度为75%，pH值2.0的乙 醇溶液进行脱脂处理三次，脱脂条件为：水浴温度70°C，脱脂时间2h ;上述脱脂后的绿萼梅 经挤压除去内部残留乙醇溶液，再加入蒸馏水4L，96°C水浴中搅拌提取三次，每次提取3小 时，共提取3次；三次滤液合并，减压浓缩至200mL ;浓缩液边搅拌边缓慢加入三倍体积的 95%乙醇溶液（pH值2. 0)进行醇沉，室温静置3-4h ;上述溶液经1000 rpm离心收集沉淀， 沉淀物再以少量无水乙醇洗涤三次；沉淀物置85°C烘箱干燥得绿萼梅粗多糖。其中：pH = 2. 0的乙醇是用盐酸将乙醇的pH调节至2-3制得。
[0026] b.多糖脱色：
[0027] 干燥的绿萼梅粗多糖以料液比I :100加水搅拌溶解，离心弃去沉淀；上清用2M NaOH溶液调节pH至9. 0，加入30 %过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7 %，搅拌脱色 3h;脱色结束后用盐酸调节溶液pH至中性，经透析（透析袋，MW 3500)除去溶液中的离子 和小分子物质，冷冻干燥即得所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM。
[0028] c.多糖结构鉴定：
[0029] 经高效凝胶渗透色谱法（HPGPC)测定所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM相对分 子质量为6. 9kDa。将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、PMP衍生化，萃取、浓缩后送 入高效液相色谱分析。单糖组成分析结果显示，其主要含半乳糖醛酸。结合核磁共振分析 (参见图2和图3)，确定LEM为一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
[0030] d.多糖结构解析：
[0031] 经高效凝胶色谱法析（HPGPC)分析表明LEM的分子量为6. 9kDa。单糖组成分析 表明LEM主要含有半乳糖醛酸。13C-NMR谱中（图2)，位于δ 101. 64及δ 100. 80的端基 碳信号，分别为甲基取代的半乳糖醛酸Cl信号及未取代的半乳糖醛酸Cl信号；δ 69. 84， 3 69.01，6 80.25和6 71.94分别为〇2，〇3，〇4，〇5的信号。此外，在6 54.14处在54.59口口111 处具有明显的糖醛酸羧基甲酯化的甲基碳原子信号，在δ 171. 99处为甲酯化的半乳糖醛 酸C6的信号峰。从上述结果可以发现LEM为一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
[0032] 实施例2.绿萼梅多糖LEM抑菌实验
[0033] 1)检定菌：接Newman (Staphylococcus aureus)单克隆于TSB培养基中振摇过 夜，接MPAOl (Pseudomonas aeruginosa)单克隆于LB培养基中振摇过夜。过夜培养的菌 稀释至 I 0D(Newman:108cfu/ml/MPA01:109cfu/ml)左右备用。
[0034] 2)检定平板的制备：分别向TSA/LB平板上均匀涂布50 μ 1稀释好的检定菌备用。
[0035] 3)样品的加入：于检定平板上滴加样品10 μ 1，并滴加10 μ 1无菌dd H2O作为阴 性对照，样品滴加后于无菌台中吹干。
[0036] 4)检定平板的培养：检定平板于37°C培养箱中倒置培养12_24h后观察结果。
[0037] 实验结果表明，该绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM能显著抑制金黄色葡萄 球菌的生长（见图4)，可作为潜在的天然抑菌剂开发利用。
【主权项】
1. 一种绿萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其化学结构式为：R = OMe 或 0H，酯化度为 50-100 %。 ，2. 如权利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其特征在于：重均分子量范围 为 I-IOOkDa ;优选为 l-50kDa ;更优选为 3-10kDa。3. 权利要求1或2所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其特征在于，包 括以下步骤： a. 多糖提取：干燥的绿萼梅经乙醇脱脂，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣 再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩得浓缩液，加入3倍于浓缩 液体积的乙醇进行醇沉，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提绿萼梅粗多糖； b. 多糖脱色：取绿萼梅粗多糖，水溶解，离心，上清用2M NaOH溶液调节pH至9.0,加入 30%过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7%，搅拌脱色3h ;脱色结束后用盐酸调节溶 液pH至中性，经透析除去溶液中的离子和小分子物质，冷冻干燥即得甲酯取代的均聚半乳 糖醛酸LEM。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a所述乙醇脱脂的过程为：按料 液比（g/L) 1:10-1:30的比例加入浓度为65-85 %，pH值2. 0-3. 0的乙醇溶液进行脱脂处理 2-4次，脱脂条件为：水浴温度60-80°C，脱脂时间l_3h，然后挤压除去乙醇。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a中干燥的绿萼梅与每次加入 的去离子水的料液比（g/L)为1:10-1:30,加热条件下提取的加热温度95-100°C水浴中，每 次提取1-3小时。6. 根据权利要求1或2所述的绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM在制备天然抑菌 剂的用途。
【专利摘要】本发明提供了从绿萼梅中获得的高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM、其制备方法和抑菌用途。具体而言，首先从绿萼梅中提取粗多糖，经过氧化氢脱色后，通过色谱及波谱鉴定后得一高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM。生物活性实验表明该多糖具有抑制金黄色葡糖球菌生长的作用，具有潜在的制备天然抑菌剂的用途。
【IPC分类】A01P1/00, A61P31/10, A01P3/00, A23L1/09, A61K31/715, A61P31/04, A01N43/16, C08B37/00
【公开号】CN104892786
【申请号】CN201510299821
【发明人】丁侃, 王培培, 董艳萍, 姚健
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月3日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说，涉及一种从绿萼梅中提取得到的一高 甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM、其制备方法及在制备天然抑菌剂的应用。
【背景技术】
[0002] 随着生活水平的提高，食品安全问题越来越引起人们的重视。在食品生产过程中， 为了延长食品的保质期，常需要添加防腐抗菌剂。据调查研宄，人们常用的苯甲酸钠、山梨 酸钾等化学添加剂具有致癌性、致畸性和易引起食物中毒等毒副作用。因而，广谱、高效、安 全防腐抗菌剂的开发应用受到了人们的广泛关注。多糖是构成生命的四大基本物质之一， 具有许多生物活性，包括抗感染、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗病毒等作用。已有多项研宄 显示多糖具有抑菌作用，甲酯其具有良好的生物相容性和生物无毒性等特性，是一种较为 理想的天然防腐抗菌剂。
[0003] 绿萼梅为蔷薇科植物梅Prunus mume (Sieb. ) Sieb. et Zucc.的干燥花蕾。原产我 国西南及台湾，主产江苏和浙江，现在四川和湖北。绿萼梅味酸，涩，性平，归肝、胃、肺经，具 有舒肝，和胃，化痰之功效。其花色洁白，香味极浓，有"花中君子"的美称，最大特点就是能 够理气，调理脾胃，疏理气血，但却不会伤阴，老少皆宜，非常难得，常用于郁闷心烦、肝胃气 痛、食欲不振等症。此外，绿萼梅水外用还能预防面部血瘀形成斑点。多糖作绿萼梅生物活 性的重要组成部分，其结构及活性尚无报道。本发明在对绿萼梅多糖进行提取的基础上，对 其结构及抑菌活性进行了测定，以期为绿萼梅多糖开发天然抑菌剂提供理论基础。
【发明内容】
[0004] 本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以绿萼梅为原料获得了一种绿 萼梅多糖，其主要成分为半乳糖醛酸，具体为高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM(发明人定 义该多糖为LEM)，活性实验表明高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM具有很好的抑菌效果。 其在制备抑菌作用的药物及功能食品中具有潜在的应用价值。
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其结构式如 下：
[0006]
[0007] 均聚半乳糖醛酸为只有半乳糖醛酸单一单糖重复组成的多糖，其中R为半乳糖醛 酸C6位的羟基被部分甲酯化。
[0008] 其中，所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的重均分子量范围为I-IOOkDa ;优选 为 l-50kDa ;更优选为 3-10kDa ;
[0009] 本发明的另一目的是提供本所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法， 其包括以下步骤：
[0010] a.多糖提取：干燥的绿萼梅经乙醇脱脂，加入去离子水，加热条件下提取，过滤， 残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩得浓缩液，加入3倍于 浓缩液体积的乙醇进行醇沉，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提绿萼梅粗多糖。
[0011] b.多糖脱色：取绿萼梅粗多糖，水溶解，离心，上清用2M NaOH溶液调节pH至9. 0， 加入30%过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7%，搅拌脱色3h ;脱色结束后用盐酸调 节溶液pH至中性，经透析除去溶液中的离子和小分子物质，冷冻干燥即得甲酯取代的均聚 半乳糖醛酸LEM。
[0012] 步骤a所述乙醇脱脂的过程为：按料液比（g/L)l:10-l:30的比例加入浓度为 65-85%，pH值2. 0-3. 0的乙醇溶液进行脱脂处理2-4次，脱脂条件为：水浴温度60-80°C， 脱脂时间l_3h，然后挤压除去乙醇。
[0013] 步骤a中干燥的绿萼梅与每次加入的去离子水的料液比（g/L)为1:10-1:30,加热 条件下提取的加热温度95-100°C水浴中，每次提取1-3小时。
[0014] 步骤a中所述醇沉使用的乙醇为浓度95%的pH2. 0-3. 0的乙醇。
[0015] 在步骤b中，透析优选为MW3500(截留分子量3500)的透析袋。
[0016] 本发明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的抑菌作用。
[0017] 本发明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM在制备天然抑 菌剂中的用途。
【附图说明】：
[0018] 图1为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的高效凝胶色谱图；
[0019] 图2为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的13C-NMR谱图；
[0020] 图3为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的HSQC谱图；
[0021] 图4为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LHM抑菌作用结果。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本 发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和 修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求中包括的变通和修改。
[0023] 实施例1 :绿萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备
[0024] a.多糖提取：
[0025] 称取绿萼梅200g，按料液比（g/L) 1:20的比例加入浓度为75%，pH值2.0的乙 醇溶液进行脱脂处理三次，脱脂条件为：水浴温度70°C，脱脂时间2h ;上述脱脂后的绿萼梅 经挤压除去内部残留乙醇溶液，再加入蒸馏水4L，96°C水浴中搅拌提取三次，每次提取3小 时，共提取3次；三次滤液合并，减压浓缩至200mL ;浓缩液边搅拌边缓慢加入三倍体积的 95%乙醇溶液（pH值2. 0)进行醇沉，室温静置3-4h ;上述溶液经1000 rpm离心收集沉淀， 沉淀物再以少量无水乙醇洗涤三次；沉淀物置85°C烘箱干燥得绿萼梅粗多糖。其中：pH = 2. 0的乙醇是用盐酸将乙醇的pH调节至2-3制得。
[0026] b.多糖脱色：
[0027] 干燥的绿萼梅粗多糖以料液比I :100加水搅拌溶解，离心弃去沉淀；上清用2M NaOH溶液调节pH至9. 0，加入30 %过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7 %，搅拌脱色 3h;脱色结束后用盐酸调节溶液pH至中性，经透析（透析袋，MW 3500)除去溶液中的离子 和小分子物质，冷冻干燥即得所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM。
[0028] c.多糖结构鉴定：
[0029] 经高效凝胶渗透色谱法（HPGPC)测定所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM相对分 子质量为6. 9kDa。将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、PMP衍生化，萃取、浓缩后送 入高效液相色谱分析。单糖组成分析结果显示，其主要含半乳糖醛酸。结合核磁共振分析 (参见图2和图3)，确定LEM为一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
[0030] d.多糖结构解析：
[0031] 经高效凝胶色谱法析（HPGPC)分析表明LEM的分子量为6. 9kDa。单糖组成分析 表明LEM主要含有半乳糖醛酸。13C-NMR谱中（图2)，位于δ 101. 64及δ 100. 80的端基 碳信号，分别为甲基取代的半乳糖醛酸Cl信号及未取代的半乳糖醛酸Cl信号；δ 69. 84， 3 69.01，6 80.25和6 71.94分别为〇2，〇3，〇4，〇5的信号。此外，在6 54.14处在54.59口口111 处具有明显的糖醛酸羧基甲酯化的甲基碳原子信号，在δ 171. 99处为甲酯化的半乳糖醛 酸C6的信号峰。从上述结果可以发现LEM为一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
[0032] 实施例2.绿萼梅多糖LEM抑菌实验
[0033] 1)检定菌：接Newman (Staphylococcus aureus)单克隆于TSB培养基中振摇过 夜，接MPAOl (Pseudomonas aeruginosa)单克隆于LB培养基中振摇过夜。过夜培养的菌 稀释至 I 0D(Newman:108cfu/ml/MPA01:109cfu/ml)左右备用。
[0034] 2)检定平板的制备：分别向TSA/LB平板上均匀涂布50 μ 1稀释好的检定菌备用。
[0035] 3)样品的加入：于检定平板上滴加样品10 μ 1，并滴加10 μ 1无菌dd H2O作为阴 性对照，样品滴加后于无菌台中吹干。
[0036] 4)检定平板的培养：检定平板于37°C培养箱中倒置培养12_24h后观察结果。
[0037] 实验结果表明，该绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM能显著抑制金黄色葡萄 球菌的生长（见图4)，可作为潜在的天然抑菌剂开发利用。
【主权项】
1. 一种绿萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其化学结构式为：R = OMe 或 0H，酯化度为 50-100 %。 ，2. 如权利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其特征在于：重均分子量范围 为 I-IOOkDa ;优选为 l-50kDa ;更优选为 3-10kDa。3. 权利要求1或2所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其特征在于，包 括以下步骤： a. 多糖提取：干燥的绿萼梅经乙醇脱脂，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣 再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩得浓缩液，加入3倍于浓缩 液体积的乙醇进行醇沉，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提绿萼梅粗多糖； b. 多糖脱色：取绿萼梅粗多糖，水溶解，离心，上清用2M NaOH溶液调节pH至9.0,加入 30%过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7%，搅拌脱色3h ;脱色结束后用盐酸调节溶 液pH至中性，经透析除去溶液中的离子和小分子物质，冷冻干燥即得甲酯取代的均聚半乳 糖醛酸LEM。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a所述乙醇脱脂的过程为：按料 液比（g/L) 1:10-1:30的比例加入浓度为65-85 %，pH值2. 0-3. 0的乙醇溶液进行脱脂处理 2-4次，脱脂条件为：水浴温度60-80°C，脱脂时间l_3h，然后挤压除去乙醇。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a中干燥的绿萼梅与每次加入 的去离子水的料液比（g/L)为1:10-1:30,加热条件下提取的加热温度95-100°C水浴中，每 次提取1-3小时。6. 根据权利要求1或2所述的绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM在制备天然抑菌 剂的用途。
【专利摘要】本发明提供了从绿萼梅中获得的高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM、其制备方法和抑菌用途。具体而言，首先从绿萼梅中提取粗多糖，经过氧化氢脱色后，通过色谱及波谱鉴定后得一高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM。生物活性实验表明该多糖具有抑制金黄色葡糖球菌生长的作用，具有潜在的制备天然抑菌剂的用途。
【IPC分类】A01P1/00, A61P31/10, A01P3/00, A23L1/09, A61K31/715, A61P31/04, A01N43/16, C08B37/00
【公开号】CN104892786
【申请号】CN201510299821
【发明人】丁侃, 王培培, 董艳萍, 姚健
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月3日
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