香菇多糖及其提取纯化方法
香菇多糖及其提取纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于香菇多糖的提取纯化领域，具体涉及一种能保持香菇多糖活性三螺旋 结构、产率高、多糖含量高、经济环保的香菇多糖提取纯化方法及在该方法下制备得到的香 菇多糖。
【背景技术】
[0002] 香葫多糖（Ientinan)是伞葫科真菌香葫子实体中提取得到的一种多糖，是由 β- (1，3)_糖苷键连接的主链和β- (1，6)糖苷键连接的支链组成的葡聚糖。最新研宄 表明：香菇多糖具有抗肿瘤作用，香菇多糖可通过调节人休内有免疫功能的T细胞活性， 从而产生细胞介导的抗肿瘤效果，并且对正常的细胞无毒副作用。香菇多糖还对大多数生 物体的SOD的活性有促进作用，能特异化清除人体超氧自由基[02]，对机体的保护有抗衰 老、抗炎病、抗自身免疫病、抗辐射等积极作用，所以香菇多糖是抗衰老、抗癌和提高免疫功 能的有效成份之一。由于香菇多糖的医学功效广泛且几乎没有任何副作用，因而被认为是 继手术、放疗、化疗之后的第4种生物免疫疗法。
[0003] 然而，目前对于香菇多糖的提取纯化存在如下几个难题：（1)香菇多糖的提取纯 化产率非常低；（2)采用大量有机溶剂(如氯仿、正丁醇等)，容易造成环境污染以及成本的 提高；（3)活性成分受提取纯化过程影响严重，产率的提高通常造成活性的丧失。
[0004] CN1978467A和CN101643514A虽然避免了有机溶剂的大量使用，但其产率分别仅 为2. 4g/25kg和0. 67% ;CN103724447A虽然获得了超过1%的产率(纯化率乘以提取率)，但 使用了大量氯苯和Sevage试剂，不仅生产成本高昂且环境污染性极大；CN103694366A虽然 避免了有机溶剂的大量使用，但多糖含量和产率均很低。
[0005] 包含上述研宄的现有技术采用了各种方法(如水提取、酶解提取、水提取与酶解提 取联用、醇沉、过层析柱等）对香菇多糖进行提取纯化，但均未同时解决提高产率、避免环境 污染和控制成本的三大难题。更进一步而言，现有技术在尚未解决上述难题的前提下，更无 法攻克在解决上述难题下还使得香菇多糖保持活性三螺旋结构的更重大的难题。
[0006] 鉴于上述研宄现状，本领域亟需寻找一种能保持香菇多糖活性三螺旋结构、产率 高、多糖含量高、经济环保的香菇多糖提取纯化方法。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种香菇多糖的提取纯化方法，其 特征在于，所述方法包括步骤： 1) 将香菇子实体切碎或粉碎； 2) 提取：采用碱水提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05~0. 1 %的 碱性蛋白酶，于45~60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0~7. 0,灭活， 得到一次酶解液；向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05~0. 1 %中性蛋白酶，于40~60 °C下搅拌酶解1~5小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50%-90 % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置至少2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋 酸洗涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。
[0008] 本发明的发明人经过大量实验摸索发现，采用如上提取纯化方法，在避免使用大 量有机溶剂的基础上，还可以获得非常优秀的产率，更重要的是获得的香菇多糖的活性三 螺旋结构没有丧失。
[0009] 由于在提取多糖的同时，将会产生副产物(如碱性蛋白）。本发明的发明人通过摸 索发现，在利用碱性蛋白酶的同时加一定比例的中性蛋白酶，可得很好的提取效果。
[0010] 另外，采用浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液可以得到很好的多糖 收率。
[0011] 优选的，步骤2)中的提取方法为：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓 度为0. 5%-2% (w/v)的氢氧化钠水溶液，室温搅拌提取2-3 h，调pH至中性，过滤，得到提取 液。
[0012] 优选的，步骤3)中所述碱性蛋白酶的酶活不小于40万U/g，所述中性蛋白酶的酶 活不小于10万u/g。
[0013] 优选的，步骤5)中用20 -50 % (v/v)醋酸洗涤的方法为：加入3~4倍粗多糖干 样体积的浓度为20 -50 % (v/v)醋酸，搅拌1-2 min，静置20 min后，于5000 rpm下离心 10 min，得到香菇多糖中间体沉淀。
[0014] 优选的，步骤6)中所述醇沉方法为：加入乙醇，至乙醇终浓度为50%_90 % (v/v)， 进行沉淀，静置2~4小时后离心取沉淀用无水乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0015] 优选的，所述方法在步骤5)之后还包括脱色步骤：向步骤5)所得香菇多糖中间体 加入碱水复溶，上离子交换树脂收集洗脱液，得脱色液。具体为：将香菇多糖中间体用浓度 为4%~10% (w/v)氢氧化钠水溶液复溶，加入量为10~20倍香菇多糖中间体干重，得到 香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,超滤脱去大部分盐后上样于阴离子交换树脂 柱，利用纯化水洗脱，收集洗脱液；洗脱液上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗脱，收集洗脱 液，得到脱色提取液。
[0016] 优选的，在脱色步骤之后还包括控制多糖分子量步骤：将所得脱色液依次经过微 滤、超滤、浓缩，得到浓缩液。具体为：脱色提取液用2微米微滤膜过滤，得初滤液；对初滤液 用20000Da的中空纤维膜进行超滤；浓缩至3~6倍香菇多糖中间体干重量体积，取出，得 到浓缩液。
[0017] 本发明的另一个目的在于提供由上述方法制备得到的香菇多糖，该香菇多糖为类 白色粉末，含量96~102%，旋光度为0~17°，红外光谱无 α构型吸收峰，具有活性三螺 旋结构，重均分子量为40~80万Da。
[0018] 本发明的有益效果： 1) 本发明避免了有机溶剂的大量使用，环保性高，生产成本低； 2) 本发明精制香菇多糖含量和产率显著优于现有技术； 3) 本发明所得香菇多糖具有活性三螺旋结构； 4) 本发明制备工艺简单、设备要求不苛刻，十分利于工业化。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所得香菇多糖的红外光谱结果； 图2为本发明所得香菇多糖的三螺旋结构分析图。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0021] 实施例1 1) 将香菇子实体切碎； 2) 提取：采用1%氢氧化钠水溶液，2000转/分搅拌提取2h 提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05 %的碱性蛋 白酶，于60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0,灭活，得到一次酶解液； 向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05 %中性蛋白酶，于60 °C下搅拌酶解5小时，灭活， 得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50% % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为50 % (v/v)醋酸洗涤， 得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 加入无水乙醇至终浓度60%，4°C静置12h，5000转/分离心6分钟，得到精制香菇多 糖。
[0022] 实施例2 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)氢氧化 钠水溶液，室温搅拌提取2h，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入0. 1 %的碱性蛋白酶，于45 °C下 搅拌酶解1小时，将酶解液的pH值调至7. 0,灭活，得到一次酶解液；向一次酶解液加入0. 1 %中性蛋白酶，于45 °C下搅拌酶解1小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置3小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为50 % (v/v)醋酸洗涤， 得到香菇多糖中间体沉淀； 6)加入乙醇，至乙醇终浓度为50% (v/v)，进行沉淀，静置4小时后离心取沉淀用无水 乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0023] 实施例3 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)氢氧化 钠水溶液，室温搅拌提取3h)，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 08 %的碱性蛋 白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，将酶解液的pH值调至6. 5,灭活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子实体重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，灭活，得到 脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为80 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置4小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋酸洗 涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 加入乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v)，进行沉淀，静置2小时后离心取沉淀用无水 乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0024] 实施例4 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的氢氧化钠水溶液0. 5%-2% (w/ V )，室温搅拌提取（2. 5h )，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加香菇子实体重量入0. 08 %的碱性蛋 白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，将酶解液的pH值调至6. 5,灭活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子实体重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，灭活，得到 脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为80 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置4小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋酸洗 涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 将香菇多糖中间体用氢氧化钠水溶液复溶（4%~10%)，加入量为10倍香菇干重， 得到香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,上样于阴离子交换树脂柱，利用纯化水 洗脱，收集洗脱液，调节PH值后，超滤脱去大部分盐后上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗 脱，收集洗脱液，得到脱色提取液。
[0025] 7)加入乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v)，进行沉淀，静置2小时后离心取沉淀用 无水乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0026] 实施例5 除步骤6)中，氢氧化钠的加入量为香菇干重的20倍，其余与实施例4 一致。
[0027] 实施例6 除步骤6)中，氢氧化钠的加入量为香菇干重的15倍，其余与实施例4 一致。
[0028] 实施例7 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的氢氧化钠水溶液0. 5%-2% (w/ v)，室温搅拌提取3h，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 08 %的碱性蛋 白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，将酶解液的pH值调至6. 5,灭活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子实体重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，灭活，得到 脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为80 % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置4小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋酸洗 涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 将香菇多糖中间体用氢氧化钠水溶液复溶（4%~10%)，加入量为10倍香菇干重， 得到香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,上样于阴离子交换树脂柱，利用纯化水 洗脱，收集洗脱液，调节PH值后，超滤脱去大部分盐后上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗 脱，收集洗脱液，得到脱色提取液。
[0029] 7)将所得脱色液依次经过微滤、超滤、浓缩，得到浓缩液。具体为：脱色提取液用2 微米微滤膜过滤，得初滤液；对初滤液进行超滤；浓缩至3~6倍香菇多糖中间体干重量体 积，取出，得到浓缩液。
[0030] 8)加入乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v)，进行沉淀，静置2小时后离心取沉淀用 无水乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0031] 实验例1 香菇多糖的含量测定方法：精密量取香菇多糖对照品和供试品个25mg，分别加 0· 5mol/l氢氧化钠溶液，研磨，加入0· 5mol/l盐酸，调节pH至6~7,加纯水定容500ml，配 制成5ug/ml的对照品溶液和供试品溶液；精密量取对照品溶液和供试品溶液3ml，分别沿 管壁缓缓加至已精密加入〇. 2%蒽酮硫酸溶液5ml的试管中，剧烈振摇，立即至沸水浴中加 热，自振摇起计时，准确反应6min，充分反应后将试管移至冰浴冷却至室温。以水为空白，用 紫外分光光度计测定625nm波长处的吸收度，计算，即得。 香菇多糖的分子量测定方法：分子量通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件确定。色 谱条件：凝胶色谱柱，流动相为磷酸缓冲液，流速lml/1，柱温：30摄氏度，进样量200ul，标 样：不同分子量的香菇多糖标准品，检测器：示差检测器。
[0032] 标准曲线绘制：取5个分子量不同的标样各5mg，分别加0. 5mol/L氢氧化钠溶 液0. 5ml使溶胀，研磨，溶解，分别再滴加0. 5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7~8,加水至 2. 0ml，摇匀，过滤，制成每1ml中含2. Omg的溶液。分别吸取200 μ 1进样，记录色谱图，应 用GPC软件绘制标准曲线，其回归方程为：Y = 8. 0596-0. 0524X，r = 0.9999。
[0033] 测定方法：取香菇多糖样品5mg，按照上述方法测定其分子量及分子量分布。
[0034] 香菇多糖三螺旋结构测定方法：刚果红是一种酸性染料，它可与具有三股螺旋链 构象的多糖形成络合物，络合物的最大吸收波长同刚果红相比发生红移。在NaOH浓度为 0.0 mol/L到0. lmol/L时，最大吸收波长红移，表明样品能与刚果红形成络合物，样品有规 则的螺旋构象；NaOH浓度继续增大时，最大吸收波长明显下降，表明多糖三螺旋结构解体， 变成无规则的线团形式。
[0035] 称取5mg多糖样品，加入2. Oml蒸馏水和2. 0ml80umol/L的刚果红试剂，加入 lmol/L的NaOH溶液，使溶液中NaOH终浓度由0· Omol/L逐渐升高到0· 5mol/L，并用紫外可 见记录光谱仪进行扫描，测得各NaOH浓度条件下的最大吸收波长，以NaOH浓度为横坐标， 最大吸收波长为纵坐标作图。以最大吸收波长红移值随碱浓度变化规律反映是否为三螺旋 结构。 如图2所示，低浓度的碱溶液中，多糖呈三螺旋结构，与刚果红试剂产生络合，使得最 大吸收波长红移，随着碱浓度的增加，三螺旋结构被破坏，络合作用减弱甚至消失，红移程 度越来越小，碱浓度〇. 3M后红移消失。
[0036] 综上，本发明工艺稳定，提取纯化的香菇多糖产率高、含量高且具有活性三螺旋结 构。
[0037] 上述方法制得的香菇多糖质量分析结果：
【主权项】
1. 一种香菇多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述方法包括步骤： 1) 将香菇子实体切碎或粉碎； 2) 提取：采用碱水提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05~0. 1 %的 碱性蛋白酶，于45~60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0~7. 0,灭活， 得到一次酶解液；向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05~0. 1 %中性蛋白酶，于40~60 °C下搅拌酶解1~5小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50%-90 % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置至少2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋 酸洗涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中的提取方法为：加入体积为香菇 子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)的氢氧化钠水溶液，室温搅拌提取2-3 h，调pH至中性，过滤，得到提取液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述碱性蛋白酶的酶活不小于 40万U/g，所述中性蛋白酶的酶活不小于10万U/g。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中用20 -50 % (v/v)醋酸洗涤的 方法为：加入3~4倍粗多糖干样体积的浓度为20 -50 % (v/v)醋酸，搅拌1-2min，静置 20min后，于5000rpm下离心10min，得到香葫多糖中间体沉淀。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述醇沉方法为：加入乙醇，至 乙醇终浓度为50%-90 % (v/v)，进行沉淀，静置2~4小时后离心取沉淀用无水乙醇洗涤， 干燥得到精制香菇多糖。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤5)之后还包括脱色步骤： 向步骤5)所得香菇多糖中间体加入碱水复溶，上离子交换树脂收集洗脱液，得脱色液。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在脱色步骤之后还包括控制多糖分子量 步骤：将所得脱色液依次经过微滤、超滤、浓缩，得到浓缩液。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脱色步骤方法为：将香菇多糖中间体 用浓度为4%~10%(w/v)氢氧化钠水溶液复溶，加入量为10~20倍香菇多糖中间体干重， 得到香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,超滤脱去大部分盐后上样于阴离子交换 树脂柱，利用纯化水洗脱，收集洗脱液；洗脱液上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗脱，收集 洗脱液，得到脱色提取液。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述控制多糖分子量步骤为：脱色提取液 用2微米微滤膜过滤，得初滤液；对初滤液用20000Da的中空纤维膜进行超滤；浓缩至3~ 6倍香菇多糖中间体干重量体积，取出，得到浓缩液。10. 由权利要求1-9任一项所述方法制备得到的香菇多糖，其特征在于，所述香菇多糖 为类白色粉末，含量96~102%，旋光度为0~17°，红外光谱无a构型吸收峰，具有活性 三螺旋结构，重均分子量为40~80万Da。
【专利摘要】本发明提供了一种香菇多糖的提取纯化方法，该方法包括步骤：1）将香菇子实体切碎或粉碎；2）采用碱水提取，过滤得到提取液；3）用碱性蛋白酶和中性蛋白酶脱蛋白；4）向所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50%-90%（v/v），进行沉淀，得到粗多糖；5）利用浓度为10%(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液进行纯化；6）采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。本发明还提供了由上述方法制备得到的香菇多糖。本发明避免有机溶剂的大量使用，经济环保；香菇多糖含量和产率高、具有活性三螺旋结构。
【IPC分类】C08B37/00
【公开号】CN104892791
【申请号】CN201510365038
【发明人】何正有, 邹昆, 刘婧, 屠银芳, 李维, 姚洁, 蒋用, 林明, 毕建军
【申请人】成都大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明属于香菇多糖的提取纯化领域，具体涉及一种能保持香菇多糖活性三螺旋 结构、产率高、多糖含量高、经济环保的香菇多糖提取纯化方法及在该方法下制备得到的香 菇多糖。
【背景技术】
[0002] 香葫多糖（Ientinan)是伞葫科真菌香葫子实体中提取得到的一种多糖，是由 β- (1，3)_糖苷键连接的主链和β- (1，6)糖苷键连接的支链组成的葡聚糖。最新研宄 表明：香菇多糖具有抗肿瘤作用，香菇多糖可通过调节人休内有免疫功能的T细胞活性， 从而产生细胞介导的抗肿瘤效果，并且对正常的细胞无毒副作用。香菇多糖还对大多数生 物体的SOD的活性有促进作用，能特异化清除人体超氧自由基[02]，对机体的保护有抗衰 老、抗炎病、抗自身免疫病、抗辐射等积极作用，所以香菇多糖是抗衰老、抗癌和提高免疫功 能的有效成份之一。由于香菇多糖的医学功效广泛且几乎没有任何副作用，因而被认为是 继手术、放疗、化疗之后的第4种生物免疫疗法。
[0003] 然而，目前对于香菇多糖的提取纯化存在如下几个难题：（1)香菇多糖的提取纯 化产率非常低；（2)采用大量有机溶剂(如氯仿、正丁醇等)，容易造成环境污染以及成本的 提高；（3)活性成分受提取纯化过程影响严重，产率的提高通常造成活性的丧失。
[0004] CN1978467A和CN101643514A虽然避免了有机溶剂的大量使用，但其产率分别仅 为2. 4g/25kg和0. 67% ;CN103724447A虽然获得了超过1%的产率(纯化率乘以提取率)，但 使用了大量氯苯和Sevage试剂，不仅生产成本高昂且环境污染性极大；CN103694366A虽然 避免了有机溶剂的大量使用，但多糖含量和产率均很低。
[0005] 包含上述研宄的现有技术采用了各种方法(如水提取、酶解提取、水提取与酶解提 取联用、醇沉、过层析柱等）对香菇多糖进行提取纯化，但均未同时解决提高产率、避免环境 污染和控制成本的三大难题。更进一步而言，现有技术在尚未解决上述难题的前提下，更无 法攻克在解决上述难题下还使得香菇多糖保持活性三螺旋结构的更重大的难题。
[0006] 鉴于上述研宄现状，本领域亟需寻找一种能保持香菇多糖活性三螺旋结构、产率 高、多糖含量高、经济环保的香菇多糖提取纯化方法。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种香菇多糖的提取纯化方法，其 特征在于，所述方法包括步骤： 1) 将香菇子实体切碎或粉碎； 2) 提取：采用碱水提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05~0. 1 %的 碱性蛋白酶，于45~60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0~7. 0,灭活， 得到一次酶解液；向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05~0. 1 %中性蛋白酶，于40~60 °C下搅拌酶解1~5小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50%-90 % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置至少2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋 酸洗涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。
[0008] 本发明的发明人经过大量实验摸索发现，采用如上提取纯化方法，在避免使用大 量有机溶剂的基础上，还可以获得非常优秀的产率，更重要的是获得的香菇多糖的活性三 螺旋结构没有丧失。
[0009] 由于在提取多糖的同时，将会产生副产物(如碱性蛋白）。本发明的发明人通过摸 索发现，在利用碱性蛋白酶的同时加一定比例的中性蛋白酶，可得很好的提取效果。
[0010] 另外，采用浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液可以得到很好的多糖 收率。
[0011] 优选的，步骤2)中的提取方法为：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓 度为0. 5%-2% (w/v)的氢氧化钠水溶液，室温搅拌提取2-3 h，调pH至中性，过滤，得到提取 液。
[0012] 优选的，步骤3)中所述碱性蛋白酶的酶活不小于40万U/g，所述中性蛋白酶的酶 活不小于10万u/g。
[0013] 优选的，步骤5)中用20 -50 % (v/v)醋酸洗涤的方法为：加入3~4倍粗多糖干 样体积的浓度为20 -50 % (v/v)醋酸，搅拌1-2 min，静置20 min后，于5000 rpm下离心 10 min，得到香菇多糖中间体沉淀。
[0014] 优选的，步骤6)中所述醇沉方法为：加入乙醇，至乙醇终浓度为50%_90 % (v/v)， 进行沉淀，静置2~4小时后离心取沉淀用无水乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0015] 优选的，所述方法在步骤5)之后还包括脱色步骤：向步骤5)所得香菇多糖中间体 加入碱水复溶，上离子交换树脂收集洗脱液，得脱色液。具体为：将香菇多糖中间体用浓度 为4%~10% (w/v)氢氧化钠水溶液复溶，加入量为10~20倍香菇多糖中间体干重，得到 香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,超滤脱去大部分盐后上样于阴离子交换树脂 柱，利用纯化水洗脱，收集洗脱液；洗脱液上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗脱，收集洗脱 液，得到脱色提取液。
[0016] 优选的，在脱色步骤之后还包括控制多糖分子量步骤：将所得脱色液依次经过微 滤、超滤、浓缩，得到浓缩液。具体为：脱色提取液用2微米微滤膜过滤，得初滤液；对初滤液 用20000Da的中空纤维膜进行超滤；浓缩至3~6倍香菇多糖中间体干重量体积，取出，得 到浓缩液。
[0017] 本发明的另一个目的在于提供由上述方法制备得到的香菇多糖，该香菇多糖为类 白色粉末，含量96~102%，旋光度为0~17°，红外光谱无 α构型吸收峰，具有活性三螺 旋结构，重均分子量为40~80万Da。
[0018] 本发明的有益效果： 1) 本发明避免了有机溶剂的大量使用，环保性高，生产成本低； 2) 本发明精制香菇多糖含量和产率显著优于现有技术； 3) 本发明所得香菇多糖具有活性三螺旋结构； 4) 本发明制备工艺简单、设备要求不苛刻，十分利于工业化。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所得香菇多糖的红外光谱结果； 图2为本发明所得香菇多糖的三螺旋结构分析图。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0021] 实施例1 1) 将香菇子实体切碎； 2) 提取：采用1%氢氧化钠水溶液，2000转/分搅拌提取2h 提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05 %的碱性蛋 白酶，于60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0,灭活，得到一次酶解液； 向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05 %中性蛋白酶，于60 °C下搅拌酶解5小时，灭活， 得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50% % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为50 % (v/v)醋酸洗涤， 得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 加入无水乙醇至终浓度60%，4°C静置12h，5000转/分离心6分钟，得到精制香菇多 糖。
[0022] 实施例2 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)氢氧化 钠水溶液，室温搅拌提取2h，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入0. 1 %的碱性蛋白酶，于45 °C下 搅拌酶解1小时，将酶解液的pH值调至7. 0,灭活，得到一次酶解液；向一次酶解液加入0. 1 %中性蛋白酶，于45 °C下搅拌酶解1小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置3小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为50 % (v/v)醋酸洗涤， 得到香菇多糖中间体沉淀； 6)加入乙醇，至乙醇终浓度为50% (v/v)，进行沉淀，静置4小时后离心取沉淀用无水 乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0023] 实施例3 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)氢氧化 钠水溶液，室温搅拌提取3h)，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 08 %的碱性蛋 白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，将酶解液的pH值调至6. 5,灭活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子实体重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，灭活，得到 脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为80 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置4小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋酸洗 涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 加入乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v)，进行沉淀，静置2小时后离心取沉淀用无水 乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0024] 实施例4 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的氢氧化钠水溶液0. 5%-2% (w/ V )，室温搅拌提取（2. 5h )，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加香菇子实体重量入0. 08 %的碱性蛋 白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，将酶解液的pH值调至6. 5,灭活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子实体重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，灭活，得到 脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为80 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置4小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋酸洗 涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 将香菇多糖中间体用氢氧化钠水溶液复溶（4%~10%)，加入量为10倍香菇干重， 得到香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,上样于阴离子交换树脂柱，利用纯化水 洗脱，收集洗脱液，调节PH值后，超滤脱去大部分盐后上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗 脱，收集洗脱液，得到脱色提取液。
[0025] 7)加入乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v)，进行沉淀，静置2小时后离心取沉淀用 无水乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0026] 实施例5 除步骤6)中，氢氧化钠的加入量为香菇干重的20倍，其余与实施例4 一致。
[0027] 实施例6 除步骤6)中，氢氧化钠的加入量为香菇干重的15倍，其余与实施例4 一致。
[0028] 实施例7 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的氢氧化钠水溶液0. 5%-2% (w/ v)，室温搅拌提取3h，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 08 %的碱性蛋 白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，将酶解液的pH值调至6. 5,灭活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子实体重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，灭活，得到 脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为80 % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置4小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋酸洗 涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 将香菇多糖中间体用氢氧化钠水溶液复溶（4%~10%)，加入量为10倍香菇干重， 得到香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,上样于阴离子交换树脂柱，利用纯化水 洗脱，收集洗脱液，调节PH值后，超滤脱去大部分盐后上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗 脱，收集洗脱液，得到脱色提取液。
[0029] 7)将所得脱色液依次经过微滤、超滤、浓缩，得到浓缩液。具体为：脱色提取液用2 微米微滤膜过滤，得初滤液；对初滤液进行超滤；浓缩至3~6倍香菇多糖中间体干重量体 积，取出，得到浓缩液。
[0030] 8)加入乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v)，进行沉淀，静置2小时后离心取沉淀用 无水乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0031] 实验例1 香菇多糖的含量测定方法：精密量取香菇多糖对照品和供试品个25mg，分别加 0· 5mol/l氢氧化钠溶液，研磨，加入0· 5mol/l盐酸，调节pH至6~7,加纯水定容500ml，配 制成5ug/ml的对照品溶液和供试品溶液；精密量取对照品溶液和供试品溶液3ml，分别沿 管壁缓缓加至已精密加入〇. 2%蒽酮硫酸溶液5ml的试管中，剧烈振摇，立即至沸水浴中加 热，自振摇起计时，准确反应6min，充分反应后将试管移至冰浴冷却至室温。以水为空白，用 紫外分光光度计测定625nm波长处的吸收度，计算，即得。 香菇多糖的分子量测定方法：分子量通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件确定。色 谱条件：凝胶色谱柱，流动相为磷酸缓冲液，流速lml/1，柱温：30摄氏度，进样量200ul，标 样：不同分子量的香菇多糖标准品，检测器：示差检测器。
[0032] 标准曲线绘制：取5个分子量不同的标样各5mg，分别加0. 5mol/L氢氧化钠溶 液0. 5ml使溶胀，研磨，溶解，分别再滴加0. 5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7~8,加水至 2. 0ml，摇匀，过滤，制成每1ml中含2. Omg的溶液。分别吸取200 μ 1进样，记录色谱图，应 用GPC软件绘制标准曲线，其回归方程为：Y = 8. 0596-0. 0524X，r = 0.9999。
[0033] 测定方法：取香菇多糖样品5mg，按照上述方法测定其分子量及分子量分布。
[0034] 香菇多糖三螺旋结构测定方法：刚果红是一种酸性染料，它可与具有三股螺旋链 构象的多糖形成络合物，络合物的最大吸收波长同刚果红相比发生红移。在NaOH浓度为 0.0 mol/L到0. lmol/L时，最大吸收波长红移，表明样品能与刚果红形成络合物，样品有规 则的螺旋构象；NaOH浓度继续增大时，最大吸收波长明显下降，表明多糖三螺旋结构解体， 变成无规则的线团形式。
[0035] 称取5mg多糖样品，加入2. Oml蒸馏水和2. 0ml80umol/L的刚果红试剂，加入 lmol/L的NaOH溶液，使溶液中NaOH终浓度由0· Omol/L逐渐升高到0· 5mol/L，并用紫外可 见记录光谱仪进行扫描，测得各NaOH浓度条件下的最大吸收波长，以NaOH浓度为横坐标， 最大吸收波长为纵坐标作图。以最大吸收波长红移值随碱浓度变化规律反映是否为三螺旋 结构。 如图2所示，低浓度的碱溶液中，多糖呈三螺旋结构，与刚果红试剂产生络合，使得最 大吸收波长红移，随着碱浓度的增加，三螺旋结构被破坏，络合作用减弱甚至消失，红移程 度越来越小，碱浓度〇. 3M后红移消失。
[0036] 综上，本发明工艺稳定，提取纯化的香菇多糖产率高、含量高且具有活性三螺旋结 构。
[0037] 上述方法制得的香菇多糖质量分析结果：
【主权项】
1. 一种香菇多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述方法包括步骤： 1) 将香菇子实体切碎或粉碎； 2) 提取：采用碱水提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05~0. 1 %的 碱性蛋白酶，于45~60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0~7. 0,灭活， 得到一次酶解液；向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05~0. 1 %中性蛋白酶，于40~60 °C下搅拌酶解1~5小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50%-90 % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置至少2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋 酸洗涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中的提取方法为：加入体积为香菇 子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)的氢氧化钠水溶液，室温搅拌提取2-3 h，调pH至中性，过滤，得到提取液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述碱性蛋白酶的酶活不小于 40万U/g，所述中性蛋白酶的酶活不小于10万U/g。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中用20 -50 % (v/v)醋酸洗涤的 方法为：加入3~4倍粗多糖干样体积的浓度为20 -50 % (v/v)醋酸，搅拌1-2min，静置 20min后，于5000rpm下离心10min，得到香葫多糖中间体沉淀。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述醇沉方法为：加入乙醇，至 乙醇终浓度为50%-90 % (v/v)，进行沉淀，静置2~4小时后离心取沉淀用无水乙醇洗涤， 干燥得到精制香菇多糖。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤5)之后还包括脱色步骤： 向步骤5)所得香菇多糖中间体加入碱水复溶，上离子交换树脂收集洗脱液，得脱色液。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在脱色步骤之后还包括控制多糖分子量 步骤：将所得脱色液依次经过微滤、超滤、浓缩，得到浓缩液。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脱色步骤方法为：将香菇多糖中间体 用浓度为4%~10%(w/v)氢氧化钠水溶液复溶，加入量为10~20倍香菇多糖中间体干重， 得到香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,超滤脱去大部分盐后上样于阴离子交换 树脂柱，利用纯化水洗脱，收集洗脱液；洗脱液上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗脱，收集 洗脱液，得到脱色提取液。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述控制多糖分子量步骤为：脱色提取液 用2微米微滤膜过滤，得初滤液；对初滤液用20000Da的中空纤维膜进行超滤；浓缩至3~ 6倍香菇多糖中间体干重量体积，取出，得到浓缩液。10. 由权利要求1-9任一项所述方法制备得到的香菇多糖，其特征在于，所述香菇多糖 为类白色粉末，含量96~102%，旋光度为0~17°，红外光谱无a构型吸收峰，具有活性 三螺旋结构，重均分子量为40~80万Da。
【专利摘要】本发明提供了一种香菇多糖的提取纯化方法，该方法包括步骤：1）将香菇子实体切碎或粉碎；2）采用碱水提取，过滤得到提取液；3）用碱性蛋白酶和中性蛋白酶脱蛋白；4）向所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50%-90%（v/v），进行沉淀，得到粗多糖；5）利用浓度为10%(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液进行纯化；6）采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。本发明还提供了由上述方法制备得到的香菇多糖。本发明避免有机溶剂的大量使用，经济环保；香菇多糖含量和产率高、具有活性三螺旋结构。
【IPC分类】C08B37/00
【公开号】CN104892791
【申请号】CN201510365038
【发明人】何正有, 邹昆, 刘婧, 屠银芳, 李维, 姚洁, 蒋用, 林明, 毕建军
【申请人】成都大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
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