一种表面糖修饰聚合物胶束及其制备方法和应用
一种表面糖修饰聚合物胶束及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表面糖修饰聚合物胶束及其制备方法和应用，属于药物和药剂学 领域。
【背景技术】
[0002] 化疗作为现阶段应用于癌症治疗最有效的方法之一。其效果往往不够理想，主要 原因在于化疗的靶向给药性能差，同时易造成对正常组织的毒副作用，并且在长期使用过 程中，化疗容易产生耐药性。药物载体的应用则可以通过实现抗癌药物靶向输送进而达到 治疗癌症的目的。近年来，许多载体材料如聚合物胶束、纳米脂质体、树枝状大分子以及有 机无机杂化纳米粒子等已经被广泛开发并开展了将其用作靶向输送药物载体，以达到治疗 癌症的目的的研宄。
[0003] 双亲性聚合物可以在水中自组装形成聚合物胶束，其内核为疏水性空腔可用于疏 水性药物的包载，具有增加所载药物稳定性，延长其体内循环时间的功能。同时，所形成聚 合物胶束具有适宜的粒径，可通过增强渗透滞留（EPR)效应富集于肿瘤部位（被动靶向作 用），从而减少抗癌药物对正常组织的不良反应。但仅依靠被动靶向作用来实现载体对癌细 胞生长的选择性抑制则有所欠缺，故为了进一步增强纳米载体的靶向性，通常对其表面进 行靶向分子修饰，如利用键连抗体、多肽、叶酸等能够特异性识别癌细胞表面过度表达受体 的性质，载体可以通过受体识别方式被癌细胞摄取，从而实现载体选择性输送所载药物至 癌细胞的目的，进而降低抗癌药物的毒副作用。
【发明内容】
[0004] 甘露糖受体为多凝集素受体，可通过受体识别的方式结合以甘露糖、N-乙酰氨基 葡萄糖和岩藻糖为末端的糖类分子。近年来，已经有报道证明将甘露糖分子修饰于药物载 体表面，可以利用其识别癌细胞表面过度表达的受体从而实现靶向输送药物至癌细胞。但 以糖类分子修饰聚合物胶束实现癌细胞的靶向药物输送同时降低抗癌药物对正常细胞毒 副作用的研宄尚未见报道。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种糖修饰聚合物，该聚合物以修饰的糖类分子为亲 水性部分，聚合物碳链为疏水性部分，在水中自组装形成胶束，同时完成疏水性药物的包 载，其组成如式1所示：
[0006]
[0007] 上面的式1中：
[0008] Z为选自如下的一个或多个相同或不同的化学功能团或功能片段：甘露糖、半乳 糖、葡萄糖、乳糖，以及末端为上述分子的其他糖类分子；
[0009] b为选自如下的糖类与聚合物的连接键：醋键（一COO-)、酰胺键（一CONR1-，R 1 =H，CH3,或 一 CH2 -）、二硫键（一 S一 S一）、酿键（一0-）、碳氣键（一C一N(R2)-，R2 =
H，CH3,或013012等）以及1，3-三氮唑环（
[0010] η 为 10-300。
[0011] 式1中包含聚合物的结构，在本发明的一种实施方式中，为聚甲基丙烯酸缩水甘 油酯。
[0012] 所述Ζ，在本发明的一种实施方式中，为甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、 1，2, 3, 4, 6-五-O-乙酰基-D-甘露糖、2, 3, 4, 6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-a -D-甘 露糖、炔丙基-a-D-吡喃甘露糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a-D-半乳糖、 1，2, 3, 4, 6_五-〇-乙醜基-D-半乳糖、块丙基-a -D-吡喃半乳糖、1，2, 3, 4, 6_五-〇-乙醜 基-D-葡萄糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖、炔丙基-a -D-吡喃葡萄 糖等。
[0013] 所述的聚合物，在本发明的一种实施方式中，为D-甘露糖修饰聚甲基丙烯酸缩水 甘油酯。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种所述聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法 包括如下步骤：
[0015] (1)制备聚合度一定的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；
[0016] (2)将（1)中所得聚合物进行叠氮基或氨基或巯基修饰；
[0017] (3)将（2)中所得聚合物进行表面糖类分子修饰。
[0018] 所述步骤（1)中的聚合度为10-300。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述糖类为甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及乳糖中的一 种或多种，以及末端为这些分子的糖类。
[0020] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：
[0021] (1)将一定量的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA)，用二甲基亚砜（DMSO)溶解。在氩 气保护条件下，先后加入溴化亚铜（CuBr)和联吡啶（Bpy)。最后用微量进样器加入α-溴 丙酸甲酯（MBrP)引发剂，密封氩气保护，反应后用一定量四氢呋喃（THF)终止反应。通过 中性氧化铝柱除去铜配体，将滤液浓缩后，在甲醇中沉淀，干燥所得沉淀物为聚甲基丙烯酸 缩水甘油酯（PGM)。
[0022] (2)将（1)中制得PGMA，一定量叠氮钠，催化量的氯化铵溶解于Ν，Ν'-二甲基甲酰 胺（DMF)中，密封，50°C油浴反应，过滤除去固体杂质，将滤液浓缩后，在水中沉淀，干燥沉 淀物得到叠氮基取代的PGM(PGM-N 3)。
[0023] (3)将⑵中所得PGM-N3溶于DMF中，通氩气去除体系内氧气。另将糖类分子和 硫酸铜溶于蒸馏水中，在氩气保护条件下，加入抗坏血酸钠。将上面DMF和水溶液混合，密 封，在油浴60°C反应，过滤除去不溶物后透析（Mw 2000)，冷冻干燥透析袋内溶液得到糖修 饰的聚合物。
[0024] 本发明所用聚合物的合成可用现有任何合成聚合物的方法，如活性自由基聚合 (包括原子转移自由基聚合（ATRP)、可逆加成-裂解链转移自由基聚合（RAFT)等）、阴离子 聚合等。
[0025] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述聚合物制备得到的表面糖修饰聚合物 胶束。
[0026] 所述表面糖修饰聚合物胶束的粒径，在本发明的一种实施方式中，在10_500nm之 间。
[0027] 所述表面糖修饰聚合物胶束的平均粒径，在本发明的一种实施方式中，在 10_200nm。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，Z形成表面糖修饰聚合物胶束的亲水部分，同时充当 主动靶向基团。
[0029] 所述表面糖修饰聚合物胶束，在本发明的一种实施方式中，是按如下方法制备得 到的：通过透析和凝胶色谱纯化，通过控制聚合物分子在水溶液中的浓度高于临界胶束浓 度后，超声处理促进胶束形成，即得聚合物胶束溶液。测得所得聚合物胶束为球形、均匀分 布，粒径范围10 -500nm之间。
[0030] 本发明的第四个目的是提供所述表面糖修饰聚合物胶束在作为药物载体方面的 应用。
[0031] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将药物包裹在表面糖修饰聚合物胶束 内部，进而提高药物的水溶性、同时利用胶束表面糖的识别细胞表面糖受体作用，完成对所 载药物的靶向运输。包裹药物方法是：将药物与聚合物分子溶解于DMSO中，添加水促进药 物包载，透析除去DMSO,冻干即得载药聚合物胶束。
[0032] 所述药物，在本发明的一种实施方式中，为抗癌药物、抗病毒药物、治疗糖尿病的 药物、或治疗心脑血管疾病的药物。
[0033] 所述药物，在本发明的一种实施方式中，具体地，为阿霉素或喜树碱。
[0034] 本发明的有益效果：
[0035] (1)本发明的聚合物制备得到的表面糖类修饰聚合物胶束为球形，均匀分布；
[0036] (2)传统胶束载药体系，因其生物相容性较差，且容易造成全身性分布，对正常组 织造成较大毒副作用。而本发明制备的聚合物胶束具有较低的细胞毒性，在实验条件下，聚 合物胶束和人乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育72小时，细胞存活率高于90% ;
[0037] (3)本发明的表面键连糖类的聚合物胶束，能够特异性识别癌细胞表面受体，通过 受体识别作用选择性进入癌细胞，将所载抗癌药物释放，药物进入细胞核后抑制癌细胞生 长；表面无糖类分子修饰的聚合物胶束进入乳腺癌细胞内较少，而表面有糖类分子修饰的 聚合物胶束能够快速进入乳腺癌细胞。
【附图说明】
[0038] 图I !PGMA-Mannose的核磁共振氢谱；
[0039] 图2 :PGMA_Mannose的凝胶渗透色谱图；
[0040] 图3 :PGMA-Mannose空白胶束透射电镜照片（A)和粒径分布图（B);
[0041] 图4 :人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肾上皮HEK293细胞在不同浓度聚合物胶束 PGM-Mannose存在条件下培养72小时后的相对存活率；
[0042] 图5 :荧光共聚焦显微镜照片证明1小时培养后少量载药聚合物胶束被人肾上皮 细胞HEK293摄取；A :DAPI染色的细胞核；B :D0X荧光成像；C :前两种成像的合并图；
[0043] 图6 :荧光共聚焦显微镜照片证明1小时培养后大量载药聚合物胶束被人乳腺癌 细胞MDA-MB-231摄取；A :DAPI染色的细胞核；B :D0X荧光成像；C :前两种成像的合并图。
【具体实施方式】
[ 0044] 缩写：
[0045] PGMA，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；GMA，甲基丙烯酸缩水甘油酯；MBrP，α -溴丙酸 甲酯；CuBr，溴化亚铜；Bpy，联吡啶；THF，四氢呋喃；PGMA-N3，叠氮基取代的聚甲基丙烯酸 缩水甘油酯；PGMA-Mannose，D-甘露糖修饰聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；TMSOTf，三氟甲磺酸 三甲基娃脂；PGMA-Galactose，半乳糖修饰聚甲基丙稀酸缩水甘油醋；PGMA-Glucose，葡萄 糖修饰聚甲基丙烯酸缩水甘油酯。
[0046] 实施例1 :1，2, 3, 4, 6-五-0-乙酰基-D-甘露糖的合成
[0047] 在250mL烧瓶中加入80mL的吡啶溶液，5. 4g的D-甘露糖，以及70mL醋酸酐后，室 温搅拌反应，期间以薄层色谱法（TLC)检测反应，结果显示反应完全后。将烧瓶内溶液转移 至1000 mL分液漏斗，加入IOOmL二氯甲烧溶液进行萃取，以水（3 X IOOmL)，饱和碳酸氢钠 (3 X IOOmL)，以及IM盐酸洗涤后，取二氯甲烷层。以饱和食盐水（2 X IOOmL)，无水硫酸钠进 行干燥，过滤除去无水硫酸钠，并旋转蒸发除去溶剂，真空干燥后得到1，2, 3, 4, 6-六-0-乙 酰基-D-甘露糖。
[0048] 实施例2 :2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-甘露糖的合成
[0049] 将4. 8g化合物2与一定量的预活化分子筛加入250mL烧瓶中，于真空泵上抽真空 3h后，将烧瓶密封，向烧瓶内加入无水二氯甲烧60mL，在整个体系置于冰浴上，搅拌15min 后。在氩气保护条件下，向烧瓶内加入2. 8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf)。加完试剂 后，撤去冰浴，密封氩气保护反应2d。TLC检测反应完毕后，向体系中加入，50mL饱和K 2CO3 终止反应。将烧瓶内混合物转移至500mL分液漏斗中，以饱和K2CO3(50mLX 3)洗涤，饱和 NaCl (50mLX 3)，无水硫酸钠干燥后，过滤除去固体无水硫酸钠后，旋转蒸发浓缩所得液体， 经硅胶柱分离纯化，得白色粉末为2, 3, 4, 6-六-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-甘露糖。
[0050] 实施例3 :炔丙基-a -D-吡喃甘露糖的合成
[0051] 向IOOmL的烧瓶中，加入Ig化合物3,20mL的甲醇，以及催化量甲醇钠。反应30min 后，经TLC检测反应完全。加入氢型阳离子交换树脂中和溶液酸性，过滤除去固体树脂，旋 转蒸发除去剩余溶剂，真空干燥12h后，得到白色粉末即为最终产物炔丙基-a -D-吡喃甘 露糖。
[0052] 实施例4 :1，2, 3, 4, 6-五-O-乙酰基-D-半乳糖的合成
[0053] 在250mL烧瓶中加入80mL的吡啶溶液，5. 4g的D-半乳糖，以及70mL醋酸酐后，室 温搅拌反应，期间以薄层色谱法（TLC)检测反应，结果显示反应完全后。将烧瓶内溶液转移 至1000 mL分液漏斗，加入IOOmL二氯甲烧溶液进行萃取，以水（3 X IOOmL)，饱和碳酸氢钠 (3 X IOOmL)，以及IM盐酸洗涤后，取二氯甲烷层。以饱和食盐水（2 X IOOmL)，无水硫酸钠进 行干燥，过滤除去无水硫酸钠，并旋转蒸发除去溶剂，真空干燥后得到1，2, 3, 4, 6-六-0-乙 酰基-D-半乳糖。
[0054] 实施例5 :2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-半乳糖的合成
[0055] 将4. 8g化合物2与一定量的预活化分子筛加入250mL烧瓶中，于真空泵上抽真空 3h后，将烧瓶密封，向烧瓶内加入无水二氯甲烧60mL，在整个体系置于冰浴上，搅拌15min 后。在氩气保护条件下，向烧瓶内加入2. 8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf)。加完试剂 后，撤去冰浴，密封氩气保护反应2d。TLC检测反应完毕后，向体系中加入，50mL饱和K 2CO3 终止反应。将烧瓶内混合物转移至500mL分液漏斗中，以饱和K2CO3(50mLX 3)洗涤，饱和 NaCl (50mLX 3)，无水硫酸钠干燥后，过滤除去固体无水硫酸钠后，旋转蒸发浓缩所得液体， 经硅胶柱分离纯化，得白色粉末为2, 3, 4, 6-六-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-半乳糖。
[0056] 实施例6 :炔丙基-a -D-吡喃半乳糖的合成
[0057] 向IOOmL的烧瓶中，加入Ig化合物3,20mL的甲醇，以及催化量甲醇钠。反应30min 后，经TLC检测反应完全。加入氢型阳离子交换树脂中和溶液酸性，过滤除去固体树脂，旋 转蒸发除去剩余溶剂，真空干燥12h后，得到白色粉末即为最终产物炔丙基-a -D-吡喃半 乳糖。
[0058] 实施例7 :1，2, 3, 4, 6-五-0-乙酰基-D-葡萄糖的合成
[0059] 在250mL烧瓶中加入80mL的吡啶溶液，5. 4g的D-葡萄糖，以及70mL醋酸酐后，室 温搅拌反应，期间以薄层色谱法（TLC)检测反应，结果显示反应完全后。将烧瓶内溶液转移 至1000 mL分液漏斗，加入IOOmL二氯甲烧溶液进行萃取，以水（3 X IOOmL)，饱和碳酸氢钠 (3 X IOOmL)，以及IM盐酸洗涤后，取二氯甲烷层。以饱和食盐水（2 X IOOmL)，无水硫酸钠进 行干燥，过滤除去无水硫酸钠，并旋转蒸发除去溶剂，真空干燥后得到1，2, 3, 4, 6-六-0-乙 酰基_D_葡萄糖。
[0060] 实施例8 :2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖的合成
[0061 ] 将4. 8g化合物2与一定量的预活化分子筛加入250mL烧瓶中，于真空泵上抽真空 3h后，将烧瓶密封，向烧瓶内加入无水二氯甲烧60mL，在整个体系置于冰浴上，搅拌15min 后。在氩气保护条件下，向烧瓶内加入2. 8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf)。加完试剂 后，撤去冰浴，密封氩气保护反应2d。TLC检测反应完毕后，向体系中加入，50mL饱和K 2CO3 终止反应。将烧瓶内混合物转移至500mL分液漏斗中，以饱和K2CO3(50mLX 3)洗涤，饱和 NaCl (50mLX 3)，无水硫酸钠干燥后，过滤除去固体无水硫酸钠后，旋转蒸发浓缩所得液体， 经硅胶柱分离纯化，得白色粉末为2, 3, 4, 6-六-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖。
[0062] 实施例9 :炔丙基-a -D-吡喃葡萄糖的合成
[0063] 向IOOmL的烧瓶中，加入Ig化合物3,20mL的甲醇，以及催化量甲醇钠。反应30min 后，经TLC检测反应完全。加入氢型阳离子交换树脂中和溶液酸性，过滤除去固体树脂，旋 转蒸发除去剩余溶剂，真空干燥12h后，得到白色粉末即为最终产物炔丙基-a -D-吡喃葡 萄糖。
[0064] 实施例10 :PGMA的合成
[0065] 向50mL烧瓶中加入准确称取的I. 5g的GMA单体（预先通过快速硅胶柱除去阻聚 剂），接着用2. 5mL二甲基亚砜（DMSO)溶解。向烧瓶内通氩气15min，去除体系中氧气。然 后在氩气保护条件下，先后加入64. 4mg的CuBr催化剂和189. 7mg的Bpy配体。最后用微量 进样器向无氧体系中加入81 μ L引发剂MBrP，密封氩气保护条件下，40°C反应2h。反应完成 后，打开密封体系，向烧瓶中加入IOmL THF终止反应。当溶液从棕色变成墨绿色时，将混合 物溶液通过中性氧化铝柱子以除去铜配体，得无色液体，将所得滤液浓缩后，于大体积甲醇 中沉淀，35°C条件下干燥所得沉淀物即可得到白色固体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGM)。 通过控制GMA单体和引发剂MBrP的比例，分别制得不同聚合度的PGMA。
[0066] 实施例11 !PGMA-N3的合成
[0067] 将100.0 mg的PGMA固体，56. Omg的氯化铵粉末，以及68. 5mg的叠氮化钠，加至 50mL烧瓶中，接着继续向烧瓶内加入7mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)液体，将烧瓶密封处理， 50°C油浴反应，12h后，过滤除去反应体系的固体杂质，浓缩所得滤液后，于大体积水中沉 淀，真空干燥所得沉淀物即可得到叠氮基取代的PGM(PGM-N 3)。
[0068] 实施例12 !PGMA-NH2的合成
[0069] 将PGMA固体，钯碳粉末，以及甲醇溶液，加至烧瓶中，置换烧瓶内气体为氢气，添 加氢气球，反应12h后，过滤除去反应体系的固体杂质，浓缩所得滤液后，于大体积水中沉 淀，真空干燥所得沉淀物即可得到氨基取代的PGM(PGM-NH 2)。
[0070] 按类似方法，可制备得到连接键b为巯基（-SH)以及羧基（-COOH)的化合物。
[0071] 实施例 13 :PGMA-Mannose 的合成
[0072] 将60.0 mg的PGMA-队固体置于50mL的烧瓶中，向烧瓶内加入15mL DMF溶液，搅拌 至固体溶解，向烧瓶内通氩气15min以去除体系内氧气。另将125. 2mg的炔丙基-a -D-吡 喃甘露糖粉末和90. 5mg的五水硫酸铜晶体加入5mL蒸馏水中，震荡搅拌使其彻底溶解，向 体系内通氩气15min，以除去烧瓶内氧气，接着在氩气保护条件下，向体系内加入248. Img 的抗坏血酸钠粉末。将上述除尽氧气的DMF溶液体系与水溶液体系混合，密封，氩气保护的 条件下，60°C反应24h。反应完成后，将体系内混合物通过过滤除去不溶物后，浓缩所得滤 液，以双蒸水为透析液透析（MW 2000) 2d后，过滤除去透析产生的固体，冷冻干燥所得滤液 即可得到目标双亲性化合物PGMA-Mannose。核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱证明了所制得 PGM-Mannose的化学结构和相对分子量（如图1和图2)。
[0073] 用PGMA-Mannose制成的聚合物胶束为球形，均匀分布（如图3, A、B)，而且具有较 低的细胞毒性，在实验条件下，聚合物胶束和人乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育72小时， 细胞存活率高于92% (如图4所示）。采用实施例6或9合成的糖分子，也具有类似效果。
[0074] 实施例 14 :PGMA-CONH-Mannose 的合成
[0075] 将60.0 mg的PGMA-NH^体置于50mL的烧瓶中，向烧瓶内加入15mL DMF溶液，搅 拌至固体溶解，向溶液中加入羧基修饰甘露糖，密封，氩气保护的条件下，60°C反应24h。反 应完成后，将体系内混合物通过过滤除去不溶物后，浓缩所得滤液，以双蒸水为透析液透析 (MW 2000) 2d后，过滤除去透析产生的固体，冷冻干燥所得滤液即可得到目标双亲性化合物 PGMA-CONH-Mannose。
[0076] 用PGM-CONH-Mannose制备的糖修饰聚合物胶束：粒径均一；细胞毒性低，与人乳 腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育72小时，细胞存活率高于92% ;与其他表面无糖类分子修 饰的聚合物胶束相比，能够快速进入乳腺癌细胞。采用实施例6或9合成的糖分子，也具有 类似效果。
[0077] 实施例15 !PGM-Mannose胶束包载阿霉素
[0078] 首先称取IOmg PGMA-Mannose样品，加入ImL DMS0,搅拌2h至完全溶解，向其中 加入100 μ L预先配置的阿霉素溶液。搅拌5min后，在剧烈搅拌的条件下，向其中缓慢滴加 ImL双蒸水，透析袋透析除去DMSO溶剂（Mw = 1000, 24h)。过滤透析袋内液体，将所得液体 冷冻干燥，即为包载阿霉素的PGM-Mannose胶束样品。
[0079] 同时，包载阿霉素的PGMA-Mannose胶束，能够特异性选择癌细胞表面受体，通过 受体识别作用选择性进入癌细胞，经过细胞内溶酶体等作用，将所载抗癌药物释放进入细 胞核，达到抑制癌细胞生长的目的。通过激光共聚焦显微镜测试证明了在1小时的培养时 间内，表面无糖类分子修饰的聚合物胶束进入乳腺癌细胞内较少（如图5所示），而表面有 糖类分子修饰的聚合物胶束能够快速进入乳腺癌细胞（如图6所示）。
[0080] 实施例16 !PGMA-Galactose胶束包载阿霉素
[0081] 首先称取IOmg PGMA-Galactose样品，加入ImL DMS0,搅拌2h至完全溶解，向其中 加入100 μ L预先配置的阿霉素溶液。搅拌5min后，在剧烈搅拌的条件下，向其中缓慢滴加 ImL双蒸水，透析袋透析除去DMSO溶剂（Mw = 1000, 24h)。过滤透析袋内液体，将所得液体 冷冻干燥，即为包载阿霉素的PGM-Galactose胶束样品。
[0082] 实施例17 !PGMA-Glucose胶束包载阿霉素
[0083] 首先称取IOmg PGMA-Glucose样品，加入ImL DMS0,搅拌2h至完全溶解，向其中 加入100 μ L预先配置的阿霉素溶液。搅拌5min后，在剧烈搅拌的条件下，向其中缓慢滴加 ImL双蒸水，透析袋透析除去DMSO溶剂（Mw = 1000, 24h)。过滤透析袋内液体，将所得液体 冷冻干燥，即为包载阿霉素的PGM-Gluc0se胶束样品。
[0084] 实施例18 !PGMA-Mannose胶束包载喜树碱
[0085] 用喜树碱代替实施案例15中的阿霉素，其它操作同实施例15。制备得到包载喜树 碱的PGMA-Mannose胶束样品。
[0086] 实施例19 :载药胶束的细胞内吞
[0087] 选取对数期生长的两种细胞分别接种于细胞培养皿内，置培养箱孵育24h使其 贴壁。加入含有载药胶束（40 μ g/mL)的培养液继续培养一定的时间。弃去培养液，用 pH 7. 4的磷酸盐缓冲液（PBS)清洗2次。将细胞用4. 0%甲醛在室温下固定15min。PBS 清洗2次后，用f，6_二脒基-2-苯基吲哚（DAPiayg/mL)染细胞核15min。用激光 共聚焦显微镜观察载药胶束在细胞内部的分布状态，激发波长为405/561nm，发射波长为 417-477/570-1000nm。
[0088] 实施例20 :空白胶束毒性评价
[0089] 采用MTT法考察载药胶束的细胞毒性。将MDA-MB-231或HEK293的细胞悬液种植 于96孔板中，每孔10000个细胞。在培养箱中培养24h后，用pH 7. 4的PBS清洗2次，加 入含载药胶束或原药阿霉素的培养基，使体系中所含的阿霉素的质量浓度为2 μ g/mL。培养 一定的时间后，用pH 7. 4的PBS清洗2次，每孔加入100 μ L MTT溶液（lmg/mL)继续培养 处。弃去孔内培养液，每孔加入10(^1^01^0，振荡101^11，应用酶标仪在49011111处测量各孔 的吸光值（OD)，计算细胞存活率。
[0090] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种糖修饰聚合物，其特征在于，所述糖修饰聚合物具有式1所示的结构： 其中，η为10-300 ;Z为以下任意一个或者多个相同或不同的分子组合得到的化学功能团或功能片段：甘 露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖或含以上分子的糖类； b为以下任意糖类与聚合物的连接键中的一种：酯键、酰胺键、二硫键、醚键、碳氮键或 1，3-三氮唑环2. 根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述式1中的Z为以下任意一种：甘 露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、1，2, 3, 4, 6-五-O-乙酰基-D-甘露糖、2, 3, 4, 6-四-O-乙酰 基-1-炔丙基-a -D-甘露糖、炔丙基-a -D-吡喃甘露糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔 丙基-a -D-半乳糖、1，2, 3, 4, 6_五-〇-乙醜基-D-半乳糖、块丙基-a -D-吡喃半乳糖、 1，2, 3, 4, 6-五-0-乙酰基-D-葡萄糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖、 块丙基_ α _D_吡喃匍萄糖。3. 根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述式1中的b为酯键、酰胺键、二硫键 或1，3_三氮唑环。4. 一种权利要求1-3任一所述聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步 骤： (1) 制备聚合度一定的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯； (2) 将（1)中所得聚合物进行叠氮基或氨基或巯基修饰； (3) 将（2)中所得聚合物进行表面糖类分子修饰。5. -种利用权利要求1-3任一所述聚合物制备得到的表面糖修饰聚合物胶束。6. 根据权利要求5所述的表面糖修饰聚合物胶束，其特征在于，所述胶束的粒径在 10-500nm 之间。7. 根据权利要求5所述的表面糖修饰聚合物胶束，其特征在于，所述聚合物胶束是按 以下方法制备得到的：通过透析和凝胶色谱纯化，通过控制聚合物分子在水溶液中的浓度 高于临界胶束浓度后，超声处理促进胶束形成，即得聚合物胶束溶液。8. 权利要求5所述表面糖修饰聚合物胶束在作为药物载体方面的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为抗癌药物、抗病毒药物、治疗 糖尿病的药物或治疗心脑血管疾病的药物。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为阿霉素或喜树碱。
【专利摘要】本发明公开了一种表面糖修饰聚合物胶束及其制备方法和应用，属于药物和药剂学领域。本发明所述聚合物为双亲性大分子，即以表面修饰糖类为亲水部分，以聚合物碳链为疏水性部分，在水中能够自组装形成胶束同时完成对疏水性药物的包载，同时表面修饰的糖类分子具有选择性识别肿瘤细胞表面受体，达到靶向输送所载药物的特点。本发明的表面糖修饰聚合物胶束不仅低毒性，而且能通过识别癌细胞表面过度表达的糖受体实现靶向药物输送的目的，降低其对正常组织毒副作用，可作为各类抗癌药物的输送载体。
【IPC分类】C08F8/00, A61K31/4745, A61K9/51, C08F8/30, A61P35/00, C08F120/28, A61K31/704
【公开号】CN104892807
【申请号】CN201510295535
【发明人】尹健, 汪舒婷, 张权, 叶舟
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表面糖修饰聚合物胶束及其制备方法和应用，属于药物和药剂学 领域。
【背景技术】
[0002] 化疗作为现阶段应用于癌症治疗最有效的方法之一。其效果往往不够理想，主要 原因在于化疗的靶向给药性能差，同时易造成对正常组织的毒副作用，并且在长期使用过 程中，化疗容易产生耐药性。药物载体的应用则可以通过实现抗癌药物靶向输送进而达到 治疗癌症的目的。近年来，许多载体材料如聚合物胶束、纳米脂质体、树枝状大分子以及有 机无机杂化纳米粒子等已经被广泛开发并开展了将其用作靶向输送药物载体，以达到治疗 癌症的目的的研宄。
[0003] 双亲性聚合物可以在水中自组装形成聚合物胶束，其内核为疏水性空腔可用于疏 水性药物的包载，具有增加所载药物稳定性，延长其体内循环时间的功能。同时，所形成聚 合物胶束具有适宜的粒径，可通过增强渗透滞留（EPR)效应富集于肿瘤部位（被动靶向作 用），从而减少抗癌药物对正常组织的不良反应。但仅依靠被动靶向作用来实现载体对癌细 胞生长的选择性抑制则有所欠缺，故为了进一步增强纳米载体的靶向性，通常对其表面进 行靶向分子修饰，如利用键连抗体、多肽、叶酸等能够特异性识别癌细胞表面过度表达受体 的性质，载体可以通过受体识别方式被癌细胞摄取，从而实现载体选择性输送所载药物至 癌细胞的目的，进而降低抗癌药物的毒副作用。
【发明内容】
[0004] 甘露糖受体为多凝集素受体，可通过受体识别的方式结合以甘露糖、N-乙酰氨基 葡萄糖和岩藻糖为末端的糖类分子。近年来，已经有报道证明将甘露糖分子修饰于药物载 体表面，可以利用其识别癌细胞表面过度表达的受体从而实现靶向输送药物至癌细胞。但 以糖类分子修饰聚合物胶束实现癌细胞的靶向药物输送同时降低抗癌药物对正常细胞毒 副作用的研宄尚未见报道。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种糖修饰聚合物，该聚合物以修饰的糖类分子为亲 水性部分，聚合物碳链为疏水性部分，在水中自组装形成胶束，同时完成疏水性药物的包 载，其组成如式1所示：
[0006]
[0007] 上面的式1中：
[0008] Z为选自如下的一个或多个相同或不同的化学功能团或功能片段：甘露糖、半乳 糖、葡萄糖、乳糖，以及末端为上述分子的其他糖类分子；
[0009] b为选自如下的糖类与聚合物的连接键：醋键（一COO-)、酰胺键（一CONR1-，R 1 =H，CH3,或 一 CH2 -）、二硫键（一 S一 S一）、酿键（一0-）、碳氣键（一C一N(R2)-，R2 =
H，CH3,或013012等）以及1，3-三氮唑环（
[0010] η 为 10-300。
[0011] 式1中包含聚合物的结构，在本发明的一种实施方式中，为聚甲基丙烯酸缩水甘 油酯。
[0012] 所述Ζ，在本发明的一种实施方式中，为甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、 1，2, 3, 4, 6-五-O-乙酰基-D-甘露糖、2, 3, 4, 6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-a -D-甘 露糖、炔丙基-a-D-吡喃甘露糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a-D-半乳糖、 1，2, 3, 4, 6_五-〇-乙醜基-D-半乳糖、块丙基-a -D-吡喃半乳糖、1，2, 3, 4, 6_五-〇-乙醜 基-D-葡萄糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖、炔丙基-a -D-吡喃葡萄 糖等。
[0013] 所述的聚合物，在本发明的一种实施方式中，为D-甘露糖修饰聚甲基丙烯酸缩水 甘油酯。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种所述聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法 包括如下步骤：
[0015] (1)制备聚合度一定的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；
[0016] (2)将（1)中所得聚合物进行叠氮基或氨基或巯基修饰；
[0017] (3)将（2)中所得聚合物进行表面糖类分子修饰。
[0018] 所述步骤（1)中的聚合度为10-300。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述糖类为甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及乳糖中的一 种或多种，以及末端为这些分子的糖类。
[0020] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：
[0021] (1)将一定量的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA)，用二甲基亚砜（DMSO)溶解。在氩 气保护条件下，先后加入溴化亚铜（CuBr)和联吡啶（Bpy)。最后用微量进样器加入α-溴 丙酸甲酯（MBrP)引发剂，密封氩气保护，反应后用一定量四氢呋喃（THF)终止反应。通过 中性氧化铝柱除去铜配体，将滤液浓缩后，在甲醇中沉淀，干燥所得沉淀物为聚甲基丙烯酸 缩水甘油酯（PGM)。
[0022] (2)将（1)中制得PGMA，一定量叠氮钠，催化量的氯化铵溶解于Ν，Ν'-二甲基甲酰 胺（DMF)中，密封，50°C油浴反应，过滤除去固体杂质，将滤液浓缩后，在水中沉淀，干燥沉 淀物得到叠氮基取代的PGM(PGM-N 3)。
[0023] (3)将⑵中所得PGM-N3溶于DMF中，通氩气去除体系内氧气。另将糖类分子和 硫酸铜溶于蒸馏水中，在氩气保护条件下，加入抗坏血酸钠。将上面DMF和水溶液混合，密 封，在油浴60°C反应，过滤除去不溶物后透析（Mw 2000)，冷冻干燥透析袋内溶液得到糖修 饰的聚合物。
[0024] 本发明所用聚合物的合成可用现有任何合成聚合物的方法，如活性自由基聚合 (包括原子转移自由基聚合（ATRP)、可逆加成-裂解链转移自由基聚合（RAFT)等）、阴离子 聚合等。
[0025] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述聚合物制备得到的表面糖修饰聚合物 胶束。
[0026] 所述表面糖修饰聚合物胶束的粒径，在本发明的一种实施方式中，在10_500nm之 间。
[0027] 所述表面糖修饰聚合物胶束的平均粒径，在本发明的一种实施方式中，在 10_200nm。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，Z形成表面糖修饰聚合物胶束的亲水部分，同时充当 主动靶向基团。
[0029] 所述表面糖修饰聚合物胶束，在本发明的一种实施方式中，是按如下方法制备得 到的：通过透析和凝胶色谱纯化，通过控制聚合物分子在水溶液中的浓度高于临界胶束浓 度后，超声处理促进胶束形成，即得聚合物胶束溶液。测得所得聚合物胶束为球形、均匀分 布，粒径范围10 -500nm之间。
[0030] 本发明的第四个目的是提供所述表面糖修饰聚合物胶束在作为药物载体方面的 应用。
[0031] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将药物包裹在表面糖修饰聚合物胶束 内部，进而提高药物的水溶性、同时利用胶束表面糖的识别细胞表面糖受体作用，完成对所 载药物的靶向运输。包裹药物方法是：将药物与聚合物分子溶解于DMSO中，添加水促进药 物包载，透析除去DMSO,冻干即得载药聚合物胶束。
[0032] 所述药物，在本发明的一种实施方式中，为抗癌药物、抗病毒药物、治疗糖尿病的 药物、或治疗心脑血管疾病的药物。
[0033] 所述药物，在本发明的一种实施方式中，具体地，为阿霉素或喜树碱。
[0034] 本发明的有益效果：
[0035] (1)本发明的聚合物制备得到的表面糖类修饰聚合物胶束为球形，均匀分布；
[0036] (2)传统胶束载药体系，因其生物相容性较差，且容易造成全身性分布，对正常组 织造成较大毒副作用。而本发明制备的聚合物胶束具有较低的细胞毒性，在实验条件下，聚 合物胶束和人乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育72小时，细胞存活率高于90% ;
[0037] (3)本发明的表面键连糖类的聚合物胶束，能够特异性识别癌细胞表面受体，通过 受体识别作用选择性进入癌细胞，将所载抗癌药物释放，药物进入细胞核后抑制癌细胞生 长；表面无糖类分子修饰的聚合物胶束进入乳腺癌细胞内较少，而表面有糖类分子修饰的 聚合物胶束能够快速进入乳腺癌细胞。
【附图说明】
[0038] 图I !PGMA-Mannose的核磁共振氢谱；
[0039] 图2 :PGMA_Mannose的凝胶渗透色谱图；
[0040] 图3 :PGMA-Mannose空白胶束透射电镜照片（A)和粒径分布图（B);
[0041] 图4 :人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肾上皮HEK293细胞在不同浓度聚合物胶束 PGM-Mannose存在条件下培养72小时后的相对存活率；
[0042] 图5 :荧光共聚焦显微镜照片证明1小时培养后少量载药聚合物胶束被人肾上皮 细胞HEK293摄取；A :DAPI染色的细胞核；B :D0X荧光成像；C :前两种成像的合并图；
[0043] 图6 :荧光共聚焦显微镜照片证明1小时培养后大量载药聚合物胶束被人乳腺癌 细胞MDA-MB-231摄取；A :DAPI染色的细胞核；B :D0X荧光成像；C :前两种成像的合并图。
【具体实施方式】
[ 0044] 缩写：
[0045] PGMA，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；GMA，甲基丙烯酸缩水甘油酯；MBrP，α -溴丙酸 甲酯；CuBr，溴化亚铜；Bpy，联吡啶；THF，四氢呋喃；PGMA-N3，叠氮基取代的聚甲基丙烯酸 缩水甘油酯；PGMA-Mannose，D-甘露糖修饰聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；TMSOTf，三氟甲磺酸 三甲基娃脂；PGMA-Galactose，半乳糖修饰聚甲基丙稀酸缩水甘油醋；PGMA-Glucose，葡萄 糖修饰聚甲基丙烯酸缩水甘油酯。
[0046] 实施例1 :1，2, 3, 4, 6-五-0-乙酰基-D-甘露糖的合成
[0047] 在250mL烧瓶中加入80mL的吡啶溶液，5. 4g的D-甘露糖，以及70mL醋酸酐后，室 温搅拌反应，期间以薄层色谱法（TLC)检测反应，结果显示反应完全后。将烧瓶内溶液转移 至1000 mL分液漏斗，加入IOOmL二氯甲烧溶液进行萃取，以水（3 X IOOmL)，饱和碳酸氢钠 (3 X IOOmL)，以及IM盐酸洗涤后，取二氯甲烷层。以饱和食盐水（2 X IOOmL)，无水硫酸钠进 行干燥，过滤除去无水硫酸钠，并旋转蒸发除去溶剂，真空干燥后得到1，2, 3, 4, 6-六-0-乙 酰基-D-甘露糖。
[0048] 实施例2 :2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-甘露糖的合成
[0049] 将4. 8g化合物2与一定量的预活化分子筛加入250mL烧瓶中，于真空泵上抽真空 3h后，将烧瓶密封，向烧瓶内加入无水二氯甲烧60mL，在整个体系置于冰浴上，搅拌15min 后。在氩气保护条件下，向烧瓶内加入2. 8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf)。加完试剂 后，撤去冰浴，密封氩气保护反应2d。TLC检测反应完毕后，向体系中加入，50mL饱和K 2CO3 终止反应。将烧瓶内混合物转移至500mL分液漏斗中，以饱和K2CO3(50mLX 3)洗涤，饱和 NaCl (50mLX 3)，无水硫酸钠干燥后，过滤除去固体无水硫酸钠后，旋转蒸发浓缩所得液体， 经硅胶柱分离纯化，得白色粉末为2, 3, 4, 6-六-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-甘露糖。
[0050] 实施例3 :炔丙基-a -D-吡喃甘露糖的合成
[0051] 向IOOmL的烧瓶中，加入Ig化合物3,20mL的甲醇，以及催化量甲醇钠。反应30min 后，经TLC检测反应完全。加入氢型阳离子交换树脂中和溶液酸性，过滤除去固体树脂，旋 转蒸发除去剩余溶剂，真空干燥12h后，得到白色粉末即为最终产物炔丙基-a -D-吡喃甘 露糖。
[0052] 实施例4 :1，2, 3, 4, 6-五-O-乙酰基-D-半乳糖的合成
[0053] 在250mL烧瓶中加入80mL的吡啶溶液，5. 4g的D-半乳糖，以及70mL醋酸酐后，室 温搅拌反应，期间以薄层色谱法（TLC)检测反应，结果显示反应完全后。将烧瓶内溶液转移 至1000 mL分液漏斗，加入IOOmL二氯甲烧溶液进行萃取，以水（3 X IOOmL)，饱和碳酸氢钠 (3 X IOOmL)，以及IM盐酸洗涤后，取二氯甲烷层。以饱和食盐水（2 X IOOmL)，无水硫酸钠进 行干燥，过滤除去无水硫酸钠，并旋转蒸发除去溶剂，真空干燥后得到1，2, 3, 4, 6-六-0-乙 酰基-D-半乳糖。
[0054] 实施例5 :2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-半乳糖的合成
[0055] 将4. 8g化合物2与一定量的预活化分子筛加入250mL烧瓶中，于真空泵上抽真空 3h后，将烧瓶密封，向烧瓶内加入无水二氯甲烧60mL，在整个体系置于冰浴上，搅拌15min 后。在氩气保护条件下，向烧瓶内加入2. 8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf)。加完试剂 后，撤去冰浴，密封氩气保护反应2d。TLC检测反应完毕后，向体系中加入，50mL饱和K 2CO3 终止反应。将烧瓶内混合物转移至500mL分液漏斗中，以饱和K2CO3(50mLX 3)洗涤，饱和 NaCl (50mLX 3)，无水硫酸钠干燥后，过滤除去固体无水硫酸钠后，旋转蒸发浓缩所得液体， 经硅胶柱分离纯化，得白色粉末为2, 3, 4, 6-六-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-半乳糖。
[0056] 实施例6 :炔丙基-a -D-吡喃半乳糖的合成
[0057] 向IOOmL的烧瓶中，加入Ig化合物3,20mL的甲醇，以及催化量甲醇钠。反应30min 后，经TLC检测反应完全。加入氢型阳离子交换树脂中和溶液酸性，过滤除去固体树脂，旋 转蒸发除去剩余溶剂，真空干燥12h后，得到白色粉末即为最终产物炔丙基-a -D-吡喃半 乳糖。
[0058] 实施例7 :1，2, 3, 4, 6-五-0-乙酰基-D-葡萄糖的合成
[0059] 在250mL烧瓶中加入80mL的吡啶溶液，5. 4g的D-葡萄糖，以及70mL醋酸酐后，室 温搅拌反应，期间以薄层色谱法（TLC)检测反应，结果显示反应完全后。将烧瓶内溶液转移 至1000 mL分液漏斗，加入IOOmL二氯甲烧溶液进行萃取，以水（3 X IOOmL)，饱和碳酸氢钠 (3 X IOOmL)，以及IM盐酸洗涤后，取二氯甲烷层。以饱和食盐水（2 X IOOmL)，无水硫酸钠进 行干燥，过滤除去无水硫酸钠，并旋转蒸发除去溶剂，真空干燥后得到1，2, 3, 4, 6-六-0-乙 酰基_D_葡萄糖。
[0060] 实施例8 :2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖的合成
[0061 ] 将4. 8g化合物2与一定量的预活化分子筛加入250mL烧瓶中，于真空泵上抽真空 3h后，将烧瓶密封，向烧瓶内加入无水二氯甲烧60mL，在整个体系置于冰浴上，搅拌15min 后。在氩气保护条件下，向烧瓶内加入2. 8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf)。加完试剂 后，撤去冰浴，密封氩气保护反应2d。TLC检测反应完毕后，向体系中加入，50mL饱和K 2CO3 终止反应。将烧瓶内混合物转移至500mL分液漏斗中，以饱和K2CO3(50mLX 3)洗涤，饱和 NaCl (50mLX 3)，无水硫酸钠干燥后，过滤除去固体无水硫酸钠后，旋转蒸发浓缩所得液体， 经硅胶柱分离纯化，得白色粉末为2, 3, 4, 6-六-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖。
[0062] 实施例9 :炔丙基-a -D-吡喃葡萄糖的合成
[0063] 向IOOmL的烧瓶中，加入Ig化合物3,20mL的甲醇，以及催化量甲醇钠。反应30min 后，经TLC检测反应完全。加入氢型阳离子交换树脂中和溶液酸性，过滤除去固体树脂，旋 转蒸发除去剩余溶剂，真空干燥12h后，得到白色粉末即为最终产物炔丙基-a -D-吡喃葡 萄糖。
[0064] 实施例10 :PGMA的合成
[0065] 向50mL烧瓶中加入准确称取的I. 5g的GMA单体（预先通过快速硅胶柱除去阻聚 剂），接着用2. 5mL二甲基亚砜（DMSO)溶解。向烧瓶内通氩气15min，去除体系中氧气。然 后在氩气保护条件下，先后加入64. 4mg的CuBr催化剂和189. 7mg的Bpy配体。最后用微量 进样器向无氧体系中加入81 μ L引发剂MBrP，密封氩气保护条件下，40°C反应2h。反应完成 后，打开密封体系，向烧瓶中加入IOmL THF终止反应。当溶液从棕色变成墨绿色时，将混合 物溶液通过中性氧化铝柱子以除去铜配体，得无色液体，将所得滤液浓缩后，于大体积甲醇 中沉淀，35°C条件下干燥所得沉淀物即可得到白色固体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGM)。 通过控制GMA单体和引发剂MBrP的比例，分别制得不同聚合度的PGMA。
[0066] 实施例11 !PGMA-N3的合成
[0067] 将100.0 mg的PGMA固体，56. Omg的氯化铵粉末，以及68. 5mg的叠氮化钠，加至 50mL烧瓶中，接着继续向烧瓶内加入7mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)液体，将烧瓶密封处理， 50°C油浴反应，12h后，过滤除去反应体系的固体杂质，浓缩所得滤液后，于大体积水中沉 淀，真空干燥所得沉淀物即可得到叠氮基取代的PGM(PGM-N 3)。
[0068] 实施例12 !PGMA-NH2的合成
[0069] 将PGMA固体，钯碳粉末，以及甲醇溶液，加至烧瓶中，置换烧瓶内气体为氢气，添 加氢气球，反应12h后，过滤除去反应体系的固体杂质，浓缩所得滤液后，于大体积水中沉 淀，真空干燥所得沉淀物即可得到氨基取代的PGM(PGM-NH 2)。
[0070] 按类似方法，可制备得到连接键b为巯基（-SH)以及羧基（-COOH)的化合物。
[0071] 实施例 13 :PGMA-Mannose 的合成
[0072] 将60.0 mg的PGMA-队固体置于50mL的烧瓶中，向烧瓶内加入15mL DMF溶液，搅拌 至固体溶解，向烧瓶内通氩气15min以去除体系内氧气。另将125. 2mg的炔丙基-a -D-吡 喃甘露糖粉末和90. 5mg的五水硫酸铜晶体加入5mL蒸馏水中，震荡搅拌使其彻底溶解，向 体系内通氩气15min，以除去烧瓶内氧气，接着在氩气保护条件下，向体系内加入248. Img 的抗坏血酸钠粉末。将上述除尽氧气的DMF溶液体系与水溶液体系混合，密封，氩气保护的 条件下，60°C反应24h。反应完成后，将体系内混合物通过过滤除去不溶物后，浓缩所得滤 液，以双蒸水为透析液透析（MW 2000) 2d后，过滤除去透析产生的固体，冷冻干燥所得滤液 即可得到目标双亲性化合物PGMA-Mannose。核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱证明了所制得 PGM-Mannose的化学结构和相对分子量（如图1和图2)。
[0073] 用PGMA-Mannose制成的聚合物胶束为球形，均匀分布（如图3, A、B)，而且具有较 低的细胞毒性，在实验条件下，聚合物胶束和人乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育72小时， 细胞存活率高于92% (如图4所示）。采用实施例6或9合成的糖分子，也具有类似效果。
[0074] 实施例 14 :PGMA-CONH-Mannose 的合成
[0075] 将60.0 mg的PGMA-NH^体置于50mL的烧瓶中，向烧瓶内加入15mL DMF溶液，搅 拌至固体溶解，向溶液中加入羧基修饰甘露糖，密封，氩气保护的条件下，60°C反应24h。反 应完成后，将体系内混合物通过过滤除去不溶物后，浓缩所得滤液，以双蒸水为透析液透析 (MW 2000) 2d后，过滤除去透析产生的固体，冷冻干燥所得滤液即可得到目标双亲性化合物 PGMA-CONH-Mannose。
[0076] 用PGM-CONH-Mannose制备的糖修饰聚合物胶束：粒径均一；细胞毒性低，与人乳 腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育72小时，细胞存活率高于92% ;与其他表面无糖类分子修 饰的聚合物胶束相比，能够快速进入乳腺癌细胞。采用实施例6或9合成的糖分子，也具有 类似效果。
[0077] 实施例15 !PGM-Mannose胶束包载阿霉素
[0078] 首先称取IOmg PGMA-Mannose样品，加入ImL DMS0,搅拌2h至完全溶解，向其中 加入100 μ L预先配置的阿霉素溶液。搅拌5min后，在剧烈搅拌的条件下，向其中缓慢滴加 ImL双蒸水，透析袋透析除去DMSO溶剂（Mw = 1000, 24h)。过滤透析袋内液体，将所得液体 冷冻干燥，即为包载阿霉素的PGM-Mannose胶束样品。
[0079] 同时，包载阿霉素的PGMA-Mannose胶束，能够特异性选择癌细胞表面受体，通过 受体识别作用选择性进入癌细胞，经过细胞内溶酶体等作用，将所载抗癌药物释放进入细 胞核，达到抑制癌细胞生长的目的。通过激光共聚焦显微镜测试证明了在1小时的培养时 间内，表面无糖类分子修饰的聚合物胶束进入乳腺癌细胞内较少（如图5所示），而表面有 糖类分子修饰的聚合物胶束能够快速进入乳腺癌细胞（如图6所示）。
[0080] 实施例16 !PGMA-Galactose胶束包载阿霉素
[0081] 首先称取IOmg PGMA-Galactose样品，加入ImL DMS0,搅拌2h至完全溶解，向其中 加入100 μ L预先配置的阿霉素溶液。搅拌5min后，在剧烈搅拌的条件下，向其中缓慢滴加 ImL双蒸水，透析袋透析除去DMSO溶剂（Mw = 1000, 24h)。过滤透析袋内液体，将所得液体 冷冻干燥，即为包载阿霉素的PGM-Galactose胶束样品。
[0082] 实施例17 !PGMA-Glucose胶束包载阿霉素
[0083] 首先称取IOmg PGMA-Glucose样品，加入ImL DMS0,搅拌2h至完全溶解，向其中 加入100 μ L预先配置的阿霉素溶液。搅拌5min后，在剧烈搅拌的条件下，向其中缓慢滴加 ImL双蒸水，透析袋透析除去DMSO溶剂（Mw = 1000, 24h)。过滤透析袋内液体，将所得液体 冷冻干燥，即为包载阿霉素的PGM-Gluc0se胶束样品。
[0084] 实施例18 !PGMA-Mannose胶束包载喜树碱
[0085] 用喜树碱代替实施案例15中的阿霉素，其它操作同实施例15。制备得到包载喜树 碱的PGMA-Mannose胶束样品。
[0086] 实施例19 :载药胶束的细胞内吞
[0087] 选取对数期生长的两种细胞分别接种于细胞培养皿内，置培养箱孵育24h使其 贴壁。加入含有载药胶束（40 μ g/mL)的培养液继续培养一定的时间。弃去培养液，用 pH 7. 4的磷酸盐缓冲液（PBS)清洗2次。将细胞用4. 0%甲醛在室温下固定15min。PBS 清洗2次后，用f，6_二脒基-2-苯基吲哚（DAPiayg/mL)染细胞核15min。用激光 共聚焦显微镜观察载药胶束在细胞内部的分布状态，激发波长为405/561nm，发射波长为 417-477/570-1000nm。
[0088] 实施例20 :空白胶束毒性评价
[0089] 采用MTT法考察载药胶束的细胞毒性。将MDA-MB-231或HEK293的细胞悬液种植 于96孔板中，每孔10000个细胞。在培养箱中培养24h后，用pH 7. 4的PBS清洗2次，加 入含载药胶束或原药阿霉素的培养基，使体系中所含的阿霉素的质量浓度为2 μ g/mL。培养 一定的时间后，用pH 7. 4的PBS清洗2次，每孔加入100 μ L MTT溶液（lmg/mL)继续培养 处。弃去孔内培养液，每孔加入10(^1^01^0，振荡101^11，应用酶标仪在49011111处测量各孔 的吸光值（OD)，计算细胞存活率。
[0090] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种糖修饰聚合物，其特征在于，所述糖修饰聚合物具有式1所示的结构： 其中，η为10-300 ;Z为以下任意一个或者多个相同或不同的分子组合得到的化学功能团或功能片段：甘 露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖或含以上分子的糖类； b为以下任意糖类与聚合物的连接键中的一种：酯键、酰胺键、二硫键、醚键、碳氮键或 1，3-三氮唑环2. 根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述式1中的Z为以下任意一种：甘 露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、1，2, 3, 4, 6-五-O-乙酰基-D-甘露糖、2, 3, 4, 6-四-O-乙酰 基-1-炔丙基-a -D-甘露糖、炔丙基-a -D-吡喃甘露糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔 丙基-a -D-半乳糖、1，2, 3, 4, 6_五-〇-乙醜基-D-半乳糖、块丙基-a -D-吡喃半乳糖、 1，2, 3, 4, 6-五-0-乙酰基-D-葡萄糖、2, 3, 4, 6-四-0-乙酰基-1-炔丙基-a -D-葡萄糖、 块丙基_ α _D_吡喃匍萄糖。3. 根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述式1中的b为酯键、酰胺键、二硫键 或1，3_三氮唑环。4. 一种权利要求1-3任一所述聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步 骤： (1) 制备聚合度一定的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯； (2) 将（1)中所得聚合物进行叠氮基或氨基或巯基修饰； (3) 将（2)中所得聚合物进行表面糖类分子修饰。5. -种利用权利要求1-3任一所述聚合物制备得到的表面糖修饰聚合物胶束。6. 根据权利要求5所述的表面糖修饰聚合物胶束，其特征在于，所述胶束的粒径在 10-500nm 之间。7. 根据权利要求5所述的表面糖修饰聚合物胶束，其特征在于，所述聚合物胶束是按 以下方法制备得到的：通过透析和凝胶色谱纯化，通过控制聚合物分子在水溶液中的浓度 高于临界胶束浓度后，超声处理促进胶束形成，即得聚合物胶束溶液。8. 权利要求5所述表面糖修饰聚合物胶束在作为药物载体方面的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为抗癌药物、抗病毒药物、治疗 糖尿病的药物或治疗心脑血管疾病的药物。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为阿霉素或喜树碱。
【专利摘要】本发明公开了一种表面糖修饰聚合物胶束及其制备方法和应用，属于药物和药剂学领域。本发明所述聚合物为双亲性大分子，即以表面修饰糖类为亲水部分，以聚合物碳链为疏水性部分，在水中能够自组装形成胶束同时完成对疏水性药物的包载，同时表面修饰的糖类分子具有选择性识别肿瘤细胞表面受体，达到靶向输送所载药物的特点。本发明的表面糖修饰聚合物胶束不仅低毒性，而且能通过识别癌细胞表面过度表达的糖受体实现靶向药物输送的目的，降低其对正常组织毒副作用，可作为各类抗癌药物的输送载体。
【IPC分类】C08F8/00, A61K31/4745, A61K9/51, C08F8/30, A61P35/00, C08F120/28, A61K31/704
【公开号】CN104892807
【申请号】CN201510295535
【发明人】尹健, 汪舒婷, 张权, 叶舟
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
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