一种酶促聚合制备微凝胶的方法
一种酶促聚合制备微凝胶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能高分子材料技术领域，涉及一种酶促聚合制备微凝胶的方法。
【背景技术】
[0002] 微凝胶是一种具有分子内交联、典型三维网络结构的聚合物微粒。微凝胶是纳米 或微米级的粒子，容易在其表面进行改性，因此，微凝胶可分为不具有反应活性的微凝胶和 具有反应活性的反应性微凝胶。在反应性微凝胶的表面引入的功能基团后，可以进行很多 的后续反应，可以说是万能的粒子聚合体。
[0003] 目前，微凝胶由于具有优异的吸水性、保水性、表面易功能化等特点，其已受到科 研工作人员的广泛关注。而微凝胶的制备方法较多，反应大多为自由基聚合，应用较广泛的 是反相乳液聚合，这是由于反相乳液聚合不但具有高效、高产的特点，又能很好地排除宏观 凝胶的形成。
[0004] 然而，制备微凝胶（也为高分子聚合物）的重要环节就是选择合适的引发剂，自由 基聚合的引发体系可分为以下几类：氧化还原引发体系、偶氮类引发体系、复合引发体系、 二硫化物引发剂、双官能度和多官能度引发剂等。现今，采用上述常见的引发体系的研宄较 多，例如，申请号为201210445460. 6的中国发明专利公布了一种高强度微凝胶复合水凝胶 的制备方法，采用丙烯酰胺和2-丙烯酰胺基-二甲基丙磺酸作为主要单体，用N-羟甲基丙 烯酰胺作为功能单体，首先利用反相乳液聚合得到含有羟甲基的反应性微凝胶，再将这种 微凝胶粒子分散到丙烯酰胺和2-丙烯酰胺基-二甲基丙磺酸的水溶液中并进行自由基聚 合得到微凝胶复合聚合物，最后将这种微凝胶复合聚合物或先部分脱水的微凝胶复合聚合 物再加热发生交联，就可以得到微凝胶复合水凝胶。该专利公布的技术方案采用偶氮类引 发剂V-50,并采用纳米粘土作为交联剂，制得的复合水凝胶具有更高的机械强度及高吸水 率。
[0005] 上述专利中提及的反相乳液聚合是指以非极性介质（如烃类溶剂）作为连续相， 将水溶性单体溶于水，再借助乳化剂分散于油相中，形成油包水型（W/0)乳液而进行的聚 合反应。
[0006] 目前，采用酶催化聚合来制备微凝胶的研宄甚少。众所周知，酶催化聚合是近年发 展起来的新型绿色聚合方法，能够在温和条件下高选择性地、高效专一地合成聚合物，可能 的残留也不会有毒副作用，具有环境友好等优点，这是其他引发体系不可比拟的。酶促聚合 不仅可以在单相溶剂中进行反应，在胶束体系中也能反应。在生物催化聚合方面，以辣根过 氧化物酶（HRP)最为常见。而将辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合与反相乳液聚合相结合， 利用反相乳液聚合体系不容易破坏水相中酶的催化活性，并且乳化剂产生的巨大油水界面 能够使得酶高度分散，从而可以使酶保持高催化效率。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种将反相乳液聚 合与辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合相结合制备微凝胶的方法。
[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0009] -种酶促聚合制备微凝胶的方法，该方法具体包括以下步骤：
[0010] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0011] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0012] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0013] (4)向步骤⑶制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0014] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0015] 步骤⑴所述的正辛烷与乙酰丙酮按质量比为（130-135) :1进行混合，并且所述 的正辛烷与乳化剂的质量比为（4-5) :1。
[0016] 步骤（1)乳化剂包括吐温20或司班80中的一种或两种。
[0017] 步骤（1)所述的乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂。
[0018] 步骤（2)所述的水相溶液中N, N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的7_8wt%。
[0019] 步骤⑵所述的水相溶液中N, N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的 0. 15-0. 24wt%。
[0020] 步骤（2)所述的水相溶液中辣根过氧化物酶的浓度为0. 05-0. 06mmol/L。
[0021] 步骤（3)所述的反相乳液中油相与水相的质量比为（5-7) :1。
[0022] 步骤⑷滴加的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15-16mmol/L。
[0023] 步骤（4)所述的聚合反应的时间为5-6h，反应温度为25-30°C。
[0024] 本发明利用温和的辣根过氧化物酶（HRP)酶促引发体系，以N，N-二甲基丙烯酰 胺（DMM)为单体，以N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA)为交联剂，在正辛烷中进行反相乳液聚 合，制备一系列N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA)含量不同的微凝胶，同时将辣根过氧化物酶 (HRP)进行固定化，具体反应原理如下：
[0025；
[0026] 本发明采用反相乳液聚合与辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合相结合的思路，通过 温和的HRP酶促引发体系，水溶性单体、交联剂在反相胶束中进行聚合反应，利用反相乳液 聚合体系不容易破坏水相中辣根过氧化物酶的催化活性，并且乳化剂产生的巨大油水界面 能够使得辣根过氧化物酶高度分散，使辣根过氧化物酶保持高催化效率，同时将HRP进行 固定化，能够快速高效地制备得到球形规整、表面光滑、粒径分布窄的微凝胶。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0028] 1)本发明采用辣根过氧化物酶（HRP)酶促引发体系，条件温和，可能的残留也不 会有毒副作用，具有环境友好等优点，且制备工艺相对简单、产物处理方便，适合于中等规 模工业生产；
[0029] 2)本发明通过改变N，N-亚甲基双丙烯酰胺的浓度，能够调节以微凝胶固定的辣 根过氧化物酶（HRP)的催化活性，在酶催化等生物领域具有广阔的应用前景；
[0030] 3)本发明将适用于宏观水凝胶的辣根过氧化物酶（HRP)酶促引发体系应用于微 凝胶的制备，首次将反相乳液聚合与辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合相结合，制备得到球 形规整、表面光滑、粒径分布窄的微凝胶，这种制备上的创新可以为其他体系或相关领域的 应用提供科学依据。
【附图说明】
[0031] 图1为实施例1制备所得微凝胶的扫描电子显微镜图；
[0032] 图2为实施例1制备所得微凝胶的激光衍射粒度分布谱图；
[0033] 图3为不同N，N-亚甲基双丙烯酰胺含量的微凝胶在PBS缓冲液（50mM、pH = 7. 0) 中的酶催化活性曲线。
[0034] 其中，PBS缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钾配制而成的磷酸缓冲液。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0036] 实施例1 :
[0037] 室温下（25°C )，准确称取I. 2g吐温20和2. 4g司班80于IOOmL三口烧瓶中，并 加入16. 4g正辛烷、130 yL乙酰丙酮以及搅拌子，控制一定的搅拌速率使其混合均匀，组成 油相，并开始通氩气以去除装置中的氧气。
[0038] 在小样品管中加入31(^1^单体0嫩4、7.211^交联剂]\^、3.371^去离子水，超声一 段时间，再加入9mg辣根过氧化物酶HRP，混合均匀后，用针筒吸取上述混合液逐滴注射到 油相中，磁力搅拌30min。
[0039] 然后，用微量注射器向油水混合物中缓慢加入320 μ L双氧水溶液（0. 2M)，继续搅 拌、持续通气。
[0040] 反应6h后，加入过量乙醇破乳，离心，取沉淀再用乙醇洗涤2次、水洗1次，以除去 乳化剂、正辛烷、未反应单体、交联剂等杂质，即得半透明黄棕色胶状物。
[0041] 图1所示为制备所得微凝胶的扫描电子显微镜图（SEM)，图2所示为制备所得微凝 胶的激光衍射粒度分布图，由图1及图2分析可知，本实施例制备所得的微凝胶具有良好的 单分散性，粒径分布较窄，其水合粒径约为30 μ m，比SEM结果（约15 μ m)略大，说明微凝胶 在水中具有较强的吸水膨胀能力，即在水中发生了溶胀。
[0042] 实施例2 :
[0043] 以辣根过氧化物酶HRP催化过氧化氢和邻苯二胺（OPD)生成2, 3-二氨基吩嗪作 为模型反应进行酶催化动力学研宄。
[0044] 首先，用磷酸氢二钠与磷酸二氢钾配制50mM、pH = 7. 0的磷酸缓冲液（以下简称 PBS缓冲液，即水相）。
[0045] 然后，在室温下准确称取一定量微凝胶胶状物，溶于一定量PBS缓冲液中，振荡， 形成均匀、稀的悬浊液。取一定量悬浊液于石英比色皿中，再加入PBS缓冲液、(PD溶液，组 成I. 99mL的混合液。
[0046] 最后，用微量注射器注射10微升30%双氧水，用针头搅拌约7秒后，采用紫外可见 分光光度仪的动力学模式，每隔6秒测量450nm(最大吸收波长）处的吸光度，共测60秒， 即得动力学曲线。
[0047] 需要说明的是，在上述2mL混合液中，H2O2浓度固定为50mM，以微凝胶固定的酶HRP 的浓度为 〇· 2mg/L，OTO 浓度分别为 L 0、1· 5、2· 0、3· 0、6· 0 和 10.0 mM。
[0048] 图3即为不同MBA含量的微凝胶在PBS缓冲液中的酶催化活性。当MBA含量从 0. 15wt%增大至0. 90wt%时，聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMM)微凝胶在水相中的催化常数 Kcat先增大后逐渐减小。当MBA含量为0. 18wt% 时，Keat达到最大值148.48^1,即此时固定 化酶的催化速率达到最大，因此，通过改变MBA浓度能够调节以微凝胶固定的酶HRP的催化 活性。
[0049] 实施例3 :
[0050] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0051] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0052] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0053] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0054] (4)向步骤⑶制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0055] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0056] 其中，步骤⑴正辛烷与乙酰丙酮按质量比为130:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为4 :1，乳化剂为吐温20 ;步骤⑵水相溶液中N，N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量 的7wt %，N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的0. 24wt %，辣根过氧化物酶的浓度 为0. 05mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水相的质量比为5 :1 ;步骤（4)滴加的过氧化 氢在反相乳液水相中的浓度为16mmol/L，并且聚合反应的时间控制为6h，反应温度控制为 25。。。
[0057] 实施例4 :
[0058] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0059] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0060] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0061] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0062] (4)向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0063] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0064] 其中，步骤（1)正辛烷与乙酰丙酮按质量比为135:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为4. 2 :1，乳化剂为司班80 ;步骤⑵水相溶液中N，N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质 量的7. 6wt %，N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的0. 2wt %，辣根过氧化物酶的浓 度为0. 056mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水相的质量比为6 :1 ;步骤⑷滴加的过氧 化氢在反相乳液水相中的浓度为15. 2mmol/L，并且聚合反应的时间控制为5h，反应温度控 制为30°C。
[0065] 实施例5 :
[0066] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0067] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0068] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0069] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0070] (4)向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0071] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0072] 其中，步骤（1)正辛烷与乙酰丙酮按质量比为132:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为5 :1，乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂；步骤（2)水相溶液中 N, N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的8wt%，N, N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质 量的0. 15wt%，辣根过氧化物酶的浓度为0. 06mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水相的 质量比为7 :1 ;步骤（4)滴加的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15mmol/L，并且聚合 反应的时间控制为6h，反应温度控制为25°C。
[0073] 实施例6 :
[0074] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMM)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0075] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0076] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0077] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0078] (4)向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0079] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0080] 其中，步骤（1)正辛烷与乙酰丙酮按质量比为134:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为4.8 :1，乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂；步骤（2)水相溶液 中N，N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的7. 7wt %，N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液 总质量的〇. 18wt%，辣根过氧化物酶的浓度为0. 058mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水 相的质量比为6. 5 :1 ;步骤（4)滴加的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15. 2mmol/L， 并且聚合反应的时间控制为5h，反应温度控制为25°C。
【主权项】
1. 一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤： (1) 取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩气以 去除氧气； (2) 取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子水， 超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀，制得 水相溶液； (3) 将步骤（2)制得的水相溶液逐滴加入到步骤（1)的油相中，搅拌均匀，制得反相乳 液； (4) 向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持续通 入氩气，进行聚合反应； (5) 待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗涤2 次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。2. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（1)所述 的正辛烷与乙酰丙酮按质量比为（130-135) :1进行混合，并且所述的正辛烷与乳化剂的质 量比为（4-5) :1。3. 根据权利要求1或2所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（1) 乳化剂包括吐温20或司班80中的一种或两种。4. 根据权利要求3所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（1)所述 的乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂。5. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（2)所述 的水相溶液中N,N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的7-8wt%。6. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（2)所述 的水相溶液中N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的0. 15-0. 24wt%。7. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（2)所述 的水相溶液中辣根过氧化物酶的浓度为〇. 05-0. 06mmol/L。8. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（3)所述 的反相乳液中油相与水相的质量比为（5-7) :1。9. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（4)滴加 的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15-16mmol/L。10. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤⑷所 述的聚合反应的时间为5-6h，反应温度为25-30°C。
【专利摘要】本发明涉及一种酶促聚合制备微凝胶的方法，包括：取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩气以去除氧气；取一定量N,N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子水，超声混合，待N,N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀，制得水相溶液；将水相溶液逐滴加入到油相中，搅拌均匀，制得反相乳液；向反相乳液中，加入过氧化氢，并持续通入氩气，进行聚合反应；待聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，洗涤，即制得半透明黄棕色微凝胶。与现有技术相比，本发明制备条件温和，过程简单，所得微凝胶具有球形规整、表面光滑、粒径分布窄等优点。
【IPC分类】C08F222/38, C08F2/30, C08F220/54, C08J3/075
【公开号】CN104892835
【申请号】CN201510225651
【发明人】包嵩, 王启刚
【申请人】同济大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月6日
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能高分子材料技术领域，涉及一种酶促聚合制备微凝胶的方法。
【背景技术】
[0002] 微凝胶是一种具有分子内交联、典型三维网络结构的聚合物微粒。微凝胶是纳米 或微米级的粒子，容易在其表面进行改性，因此，微凝胶可分为不具有反应活性的微凝胶和 具有反应活性的反应性微凝胶。在反应性微凝胶的表面引入的功能基团后，可以进行很多 的后续反应，可以说是万能的粒子聚合体。
[0003] 目前，微凝胶由于具有优异的吸水性、保水性、表面易功能化等特点，其已受到科 研工作人员的广泛关注。而微凝胶的制备方法较多，反应大多为自由基聚合，应用较广泛的 是反相乳液聚合，这是由于反相乳液聚合不但具有高效、高产的特点，又能很好地排除宏观 凝胶的形成。
[0004] 然而，制备微凝胶（也为高分子聚合物）的重要环节就是选择合适的引发剂，自由 基聚合的引发体系可分为以下几类：氧化还原引发体系、偶氮类引发体系、复合引发体系、 二硫化物引发剂、双官能度和多官能度引发剂等。现今，采用上述常见的引发体系的研宄较 多，例如，申请号为201210445460. 6的中国发明专利公布了一种高强度微凝胶复合水凝胶 的制备方法，采用丙烯酰胺和2-丙烯酰胺基-二甲基丙磺酸作为主要单体，用N-羟甲基丙 烯酰胺作为功能单体，首先利用反相乳液聚合得到含有羟甲基的反应性微凝胶，再将这种 微凝胶粒子分散到丙烯酰胺和2-丙烯酰胺基-二甲基丙磺酸的水溶液中并进行自由基聚 合得到微凝胶复合聚合物，最后将这种微凝胶复合聚合物或先部分脱水的微凝胶复合聚合 物再加热发生交联，就可以得到微凝胶复合水凝胶。该专利公布的技术方案采用偶氮类引 发剂V-50,并采用纳米粘土作为交联剂，制得的复合水凝胶具有更高的机械强度及高吸水 率。
[0005] 上述专利中提及的反相乳液聚合是指以非极性介质（如烃类溶剂）作为连续相， 将水溶性单体溶于水，再借助乳化剂分散于油相中，形成油包水型（W/0)乳液而进行的聚 合反应。
[0006] 目前，采用酶催化聚合来制备微凝胶的研宄甚少。众所周知，酶催化聚合是近年发 展起来的新型绿色聚合方法，能够在温和条件下高选择性地、高效专一地合成聚合物，可能 的残留也不会有毒副作用，具有环境友好等优点，这是其他引发体系不可比拟的。酶促聚合 不仅可以在单相溶剂中进行反应，在胶束体系中也能反应。在生物催化聚合方面，以辣根过 氧化物酶（HRP)最为常见。而将辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合与反相乳液聚合相结合， 利用反相乳液聚合体系不容易破坏水相中酶的催化活性，并且乳化剂产生的巨大油水界面 能够使得酶高度分散，从而可以使酶保持高催化效率。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种将反相乳液聚 合与辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合相结合制备微凝胶的方法。
[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0009] -种酶促聚合制备微凝胶的方法，该方法具体包括以下步骤：
[0010] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0011] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0012] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0013] (4)向步骤⑶制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0014] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0015] 步骤⑴所述的正辛烷与乙酰丙酮按质量比为（130-135) :1进行混合，并且所述 的正辛烷与乳化剂的质量比为（4-5) :1。
[0016] 步骤（1)乳化剂包括吐温20或司班80中的一种或两种。
[0017] 步骤（1)所述的乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂。
[0018] 步骤（2)所述的水相溶液中N, N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的7_8wt%。
[0019] 步骤⑵所述的水相溶液中N, N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的 0. 15-0. 24wt%。
[0020] 步骤（2)所述的水相溶液中辣根过氧化物酶的浓度为0. 05-0. 06mmol/L。
[0021] 步骤（3)所述的反相乳液中油相与水相的质量比为（5-7) :1。
[0022] 步骤⑷滴加的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15-16mmol/L。
[0023] 步骤（4)所述的聚合反应的时间为5-6h，反应温度为25-30°C。
[0024] 本发明利用温和的辣根过氧化物酶（HRP)酶促引发体系，以N，N-二甲基丙烯酰 胺（DMM)为单体，以N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA)为交联剂，在正辛烷中进行反相乳液聚 合，制备一系列N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA)含量不同的微凝胶，同时将辣根过氧化物酶 (HRP)进行固定化，具体反应原理如下：
[0025；
[0026] 本发明采用反相乳液聚合与辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合相结合的思路，通过 温和的HRP酶促引发体系，水溶性单体、交联剂在反相胶束中进行聚合反应，利用反相乳液 聚合体系不容易破坏水相中辣根过氧化物酶的催化活性，并且乳化剂产生的巨大油水界面 能够使得辣根过氧化物酶高度分散，使辣根过氧化物酶保持高催化效率，同时将HRP进行 固定化，能够快速高效地制备得到球形规整、表面光滑、粒径分布窄的微凝胶。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0028] 1)本发明采用辣根过氧化物酶（HRP)酶促引发体系，条件温和，可能的残留也不 会有毒副作用，具有环境友好等优点，且制备工艺相对简单、产物处理方便，适合于中等规 模工业生产；
[0029] 2)本发明通过改变N，N-亚甲基双丙烯酰胺的浓度，能够调节以微凝胶固定的辣 根过氧化物酶（HRP)的催化活性，在酶催化等生物领域具有广阔的应用前景；
[0030] 3)本发明将适用于宏观水凝胶的辣根过氧化物酶（HRP)酶促引发体系应用于微 凝胶的制备，首次将反相乳液聚合与辣根过氧化物酶（HRP)酶促聚合相结合，制备得到球 形规整、表面光滑、粒径分布窄的微凝胶，这种制备上的创新可以为其他体系或相关领域的 应用提供科学依据。
【附图说明】
[0031] 图1为实施例1制备所得微凝胶的扫描电子显微镜图；
[0032] 图2为实施例1制备所得微凝胶的激光衍射粒度分布谱图；
[0033] 图3为不同N，N-亚甲基双丙烯酰胺含量的微凝胶在PBS缓冲液（50mM、pH = 7. 0) 中的酶催化活性曲线。
[0034] 其中，PBS缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钾配制而成的磷酸缓冲液。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0036] 实施例1 :
[0037] 室温下（25°C )，准确称取I. 2g吐温20和2. 4g司班80于IOOmL三口烧瓶中，并 加入16. 4g正辛烷、130 yL乙酰丙酮以及搅拌子，控制一定的搅拌速率使其混合均匀，组成 油相，并开始通氩气以去除装置中的氧气。
[0038] 在小样品管中加入31(^1^单体0嫩4、7.211^交联剂]\^、3.371^去离子水，超声一 段时间，再加入9mg辣根过氧化物酶HRP，混合均匀后，用针筒吸取上述混合液逐滴注射到 油相中，磁力搅拌30min。
[0039] 然后，用微量注射器向油水混合物中缓慢加入320 μ L双氧水溶液（0. 2M)，继续搅 拌、持续通气。
[0040] 反应6h后，加入过量乙醇破乳，离心，取沉淀再用乙醇洗涤2次、水洗1次，以除去 乳化剂、正辛烷、未反应单体、交联剂等杂质，即得半透明黄棕色胶状物。
[0041] 图1所示为制备所得微凝胶的扫描电子显微镜图（SEM)，图2所示为制备所得微凝 胶的激光衍射粒度分布图，由图1及图2分析可知，本实施例制备所得的微凝胶具有良好的 单分散性，粒径分布较窄，其水合粒径约为30 μ m，比SEM结果（约15 μ m)略大，说明微凝胶 在水中具有较强的吸水膨胀能力，即在水中发生了溶胀。
[0042] 实施例2 :
[0043] 以辣根过氧化物酶HRP催化过氧化氢和邻苯二胺（OPD)生成2, 3-二氨基吩嗪作 为模型反应进行酶催化动力学研宄。
[0044] 首先，用磷酸氢二钠与磷酸二氢钾配制50mM、pH = 7. 0的磷酸缓冲液（以下简称 PBS缓冲液，即水相）。
[0045] 然后，在室温下准确称取一定量微凝胶胶状物，溶于一定量PBS缓冲液中，振荡， 形成均匀、稀的悬浊液。取一定量悬浊液于石英比色皿中，再加入PBS缓冲液、(PD溶液，组 成I. 99mL的混合液。
[0046] 最后，用微量注射器注射10微升30%双氧水，用针头搅拌约7秒后，采用紫外可见 分光光度仪的动力学模式，每隔6秒测量450nm(最大吸收波长）处的吸光度，共测60秒， 即得动力学曲线。
[0047] 需要说明的是，在上述2mL混合液中，H2O2浓度固定为50mM，以微凝胶固定的酶HRP 的浓度为 〇· 2mg/L，OTO 浓度分别为 L 0、1· 5、2· 0、3· 0、6· 0 和 10.0 mM。
[0048] 图3即为不同MBA含量的微凝胶在PBS缓冲液中的酶催化活性。当MBA含量从 0. 15wt%增大至0. 90wt%时，聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMM)微凝胶在水相中的催化常数 Kcat先增大后逐渐减小。当MBA含量为0. 18wt% 时，Keat达到最大值148.48^1,即此时固定 化酶的催化速率达到最大，因此，通过改变MBA浓度能够调节以微凝胶固定的酶HRP的催化 活性。
[0049] 实施例3 :
[0050] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0051] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0052] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0053] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0054] (4)向步骤⑶制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0055] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0056] 其中，步骤⑴正辛烷与乙酰丙酮按质量比为130:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为4 :1，乳化剂为吐温20 ;步骤⑵水相溶液中N，N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量 的7wt %，N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的0. 24wt %，辣根过氧化物酶的浓度 为0. 05mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水相的质量比为5 :1 ;步骤（4)滴加的过氧化 氢在反相乳液水相中的浓度为16mmol/L，并且聚合反应的时间控制为6h，反应温度控制为 25。。。
[0057] 实施例4 :
[0058] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0059] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0060] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0061] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0062] (4)向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0063] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0064] 其中，步骤（1)正辛烷与乙酰丙酮按质量比为135:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为4. 2 :1，乳化剂为司班80 ;步骤⑵水相溶液中N，N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质 量的7. 6wt %，N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的0. 2wt %，辣根过氧化物酶的浓 度为0. 056mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水相的质量比为6 :1 ;步骤⑷滴加的过氧 化氢在反相乳液水相中的浓度为15. 2mmol/L，并且聚合反应的时间控制为5h，反应温度控 制为30°C。
[0065] 实施例5 :
[0066] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0067] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0068] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0069] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0070] (4)向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0071] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0072] 其中，步骤（1)正辛烷与乙酰丙酮按质量比为132:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为5 :1，乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂；步骤（2)水相溶液中 N, N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的8wt%，N, N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质 量的0. 15wt%，辣根过氧化物酶的浓度为0. 06mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水相的 质量比为7 :1 ;步骤（4)滴加的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15mmol/L，并且聚合 反应的时间控制为6h，反应温度控制为25°C。
[0073] 实施例6 :
[0074] 本实施例制备聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMM)微凝胶，具体包括以下步骤：
[0075] (1)取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩 气以去除氧气；
[0076] (2)取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子 水，超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀， 制得水相溶液；
[0077] (3)将步骤⑵制得的水相溶液逐滴加入到步骤⑴的油相中，搅拌均勾，制得反 相乳液；
[0078] (4)向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持 续通入氩气，进行聚合反应；
[0079] (5)待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗 涤2次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。
[0080] 其中，步骤（1)正辛烷与乙酰丙酮按质量比为134:1，并且正辛烷与乳化剂的质量 比为4.8 :1，乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂；步骤（2)水相溶液 中N，N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的7. 7wt %，N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液 总质量的〇. 18wt%，辣根过氧化物酶的浓度为0. 058mmol/L ;步骤（3)反相乳液中油相与水 相的质量比为6. 5 :1 ;步骤（4)滴加的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15. 2mmol/L， 并且聚合反应的时间控制为5h，反应温度控制为25°C。
【主权项】
1. 一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤： (1) 取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩气以 去除氧气； (2) 取一定量N，N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子水， 超声混合，待N，N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀，制得 水相溶液； (3) 将步骤（2)制得的水相溶液逐滴加入到步骤（1)的油相中，搅拌均匀，制得反相乳 液； (4) 向步骤（3)制得的反相乳液中，边搅拌边逐滴加入过氧化氢，继续搅拌，并持续通 入氩气，进行聚合反应； (5) 待步骤（4)聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，乙醇洗涤2 次，水洗1次，即制得半透明黄棕色微凝胶。2. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（1)所述 的正辛烷与乙酰丙酮按质量比为（130-135) :1进行混合，并且所述的正辛烷与乳化剂的质 量比为（4-5) :1。3. 根据权利要求1或2所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（1) 乳化剂包括吐温20或司班80中的一种或两种。4. 根据权利要求3所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（1)所述 的乳化剂为吐温20与司班80按质量比为1:2的混合乳化剂。5. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（2)所述 的水相溶液中N,N-二甲基丙烯酰胺占水相溶液总质量的7-8wt%。6. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（2)所述 的水相溶液中N，N-亚甲基双丙烯酰胺占水相溶液总质量的0. 15-0. 24wt%。7. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（2)所述 的水相溶液中辣根过氧化物酶的浓度为〇. 05-0. 06mmol/L。8. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（3)所述 的反相乳液中油相与水相的质量比为（5-7) :1。9. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤（4)滴加 的过氧化氢在反相乳液水相中的浓度为15-16mmol/L。10. 根据权利要求1所述的一种酶促聚合制备微凝胶的方法，其特征在于，步骤⑷所 述的聚合反应的时间为5-6h，反应温度为25-30°C。
【专利摘要】本发明涉及一种酶促聚合制备微凝胶的方法，包括：取正辛烷、乙酰丙酮混合均匀后，加入乳化剂，充分混合，制成油相，并通入氩气以去除氧气；取一定量N,N-二甲基丙烯酰胺，并依次加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺及去离子水，超声混合，待N,N-亚甲基双丙烯酰胺完全溶解后，再加入辣根过氧化物酶，搅拌均匀，制得水相溶液；将水相溶液逐滴加入到油相中，搅拌均匀，制得反相乳液；向反相乳液中，加入过氧化氢，并持续通入氩气，进行聚合反应；待聚合反应结束后，加入过量乙醇破乳，离心，取底部沉淀物，洗涤，即制得半透明黄棕色微凝胶。与现有技术相比，本发明制备条件温和，过程简单，所得微凝胶具有球形规整、表面光滑、粒径分布窄等优点。
【IPC分类】C08F222/38, C08F2/30, C08F220/54, C08J3/075
【公开号】CN104892835
【申请号】CN201510225651
【发明人】包嵩, 王启刚
【申请人】同济大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月6日
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