分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法
分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于分子印迹技术的食品安全控制与分析的方法。
【背景技术】
[0002] 食品安全是当今世界备受人们关注的焦点问题之一。我国经济持续发展的同时， 食品安全问题也频频发生，人们由过去的吃的饱转向关注吃的健康、科学、营养。总体来说， 我国的食品安全现状不容乐观，从2008年的三鹿奶粉事件到后来的苏丹红、瘦肉精、地沟 油，这些都严重影响了人们的身体健康和生命安全，同时也给经济和社会的可持续发展带 来了不利的影响。加强食品安全管理，改善食品安全现状，减少食品安全相关事故已经成为 了消费者的迫切需求和政府工作的重心之一。国务院印发的《2015年食品安全重点工作安 排》立足于找问题，抓改革，出实招，切实打造食品安全新常态。
[0003] 邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)是一类常见的增塑剂，能够起到软化聚合物，改善 透明度，增强塑料制品耐用度的效果，因而被广泛应用于塑料制品的生产。由于成本低廉， 近年来一些厂家将其滥用在食品、医疗器械、玩具等包装中。然而，DEHP本身具有较强的脂 溶性，容易从塑料制品中迀移出来，从而污染被包装物品。并且通过呼吸、饮食和皮肤接触 进入人体内，对人体健康带来了危害。大量的动物毒理学试验证明，DEHP及其代谢产物具 有一定的致畸性、致癌性、生殖发育毒性。由于它的潜在毒性，欧盟限制其应用于0~3岁 儿童相关产品的生产中。FDA规定的成人每日最大摄入量为3. 5 μ g/mL，新生儿与婴儿为 〇·3 μ g/mL〇
[0004] 分子印迹技术（MIT)是一项具有特异识别功能的新兴技术，结合了高分子化学、 材料化学、化学工程以及生物化学等学科的知识，广泛应用于固相萃取、色谱分离、传感器 制造等领域。它利用分子印迹聚合物（MIPs)模拟酶-底物或抗体-抗原之间的相互作用， 对印迹分子进行专一性的识别。该项技术应用成功的关键是MIPs的制备过程，包括功能单 体、交联剂、溶剂、引发剂等的选择及用量，引发聚合的条件及制备方法等。MIT以其高亲和 性、高特异性、高准确性和稳定性等独特优点，迅速吸引了各国研宄人员的关注，其应用方 法也日趋成熟。
[0005] 目前现有的采用分子印迹技术（MIT)吸附邻苯二甲酸二乙基己酯残留的方法为： 2012年Shaikh等人用甲基丙烯酸（MAA)制备分子印迹膜富集河水中的DEHP，气相色谱法 测定残留量。
[0006] 目前现有的米用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography\ HPLC)测定邻苯二甲酸二乙基己醋残留的方法为：2009年Chaudhary等人建立了 HPLC测定 DEHP的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种分子印迹技术与HPLC联用测定邻苯二甲酸 二乙基己酯残留的方法以及所用的烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物；采用本发明的方 法能从复杂化合物中分离与富集DEHP。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种烯丙基-β_环糊精分子印迹聚 合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)、烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体的制备，依次进行以下步骤：
[0010] ①、准确称取20克氢氧化钠（NaOH)，20g β -环糊精，然后加入20mL水，50~70°C 水浴1. 5~2. 5h (较佳为60°C水浴2h)，不断搅拌从而实现均匀混合；
[0011] ②、在氮气保护下，在步骤①所得物中加入4mmol烯丙基溴，于50~70°C继续搅拌 1. 5~2. 5h (较佳为60°C继续搅拌2h);
[0012] ③、将上述步骤②所得混合物50~70 °C水浴25~35min (较佳为60 °C水浴 30min)，然后将其转移至鼓风干燥箱中，干燥至恒重（约60°C干燥2~3天），得固体混合 物；
[0013] ④、将步骤③所得的固体混合物研磨成粉末（过200目筛），得烯丙基-β-环糊精 (allyl-β-Ο))单体（粉末状）；
[0014] 2)、烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物的制备，依次进行以下步骤：
[0015] ①、称取2. 80g步骤1)所得稀丙基-β -环糊精（allyl-β -⑶）单体，加入无水乙 醇洗涤；
[0016] 备注说明：重复洗涤5次，每次持续5分钟；加入无水乙醇洗涤的目的是为了去除 烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体可能存在的试剂残留；
[0017] 然后先加入40mL的N，N-二甲基甲酰胺搅拌25~35min (较佳为30min)，再 加入2mmol邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)，在氮气的保护下，于45~60 °C磁力搅拌 (600rpm) 1. 5 ~2. 5h (较佳为 2h);
[0018] ②、取上述步骤①所得到1/3体积的溶液，加入12mmol功能单体于45~60°C磁力 搅拌（600rpm)，充分反应Ih ;
[0019] ③、在步骤②所得反应产物中加入40mg偶氮二异丁腈（AIBN)作为引物，然后加入 60mmol乙稀乙二醇二甲基丙稀酸（EGDMA)，45~60°C磁力搅拌（600rpm)反应30min ;
[0020] ④、将上述步骤③所得的固体产物50~70°C水浴22~24h(较佳为60°C水浴 24h)，然后放入鼓风干燥箱里，干燥至恒重（约60°C干燥2~3天）；
[0021] ⑤、将上述步骤④所得的固体，研磨后过400目筛，用50~70°C的热水洗涤（目的 是去除反应试剂），获得印迹孔穴模板；
[0022] ⑥、利用甲醇：=乙酸9:l(v/v)体积比的混合液对印迹孔穴模板内部进行索氏抽 提（一般为于65~75°C抽提46~50h，较佳为70°C抽提48h)，直至用紫外可见分光光度 法检测不到邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)，然后用甲醇洗涤除去残留的乙酸，可获得烯丙 基-β -环糊精分子印迹聚合物。
[0023] 作为本发明的烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物的制备方法的改进：
[0024] 所述步骤2)中：
[0025] 步骤②的功能单体为：甲基丙烯酸（MA)、甲基丙烯酸甲酯（MMA)或丙烯腈（AN);
[0026] 对应的步骤⑤所得的印迹孔穴模板为：甲基丙烯酸-烯丙基-β -环糊精分子印 迹聚合物（M-MA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物（M-MM)，丙烯 腈一烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-AN)。
[0027] 本发明还同时提供了利用上述烯丙基-β_环糊精分子印迹聚合物进行的分子印 迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，包括如下步骤：
[0028] 1)、制备样品待测液和作为标品的邻苯二甲酸二乙基己酯溶液；
[0029] 2)、将烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物用甲醇和水依次洗涤，然后风干至恒 重；接着分别加入至步骤1)所得的样品待测液和邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中，直至烯丙 基-β -环糊精分子印迹聚合物的浓度为100~400ng/ml ;
[0030] 烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物例如可选用：甲基丙烯酸-烯丙基-β -环 糊精分子印迹聚合物（M-MAA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物 (M-MMA)，丙烯腈一烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物（M-AN);
[0031] 3)、在步骤2)所得液中加入50%甲醇，所述50%甲醇与步骤2)所得液的体积比 为1~3 :1 ;
[0032] 上述50 %甲醇是指体积浓度为50 %的甲醇水溶液；
[0033] 4)、利用甲醇：乙酸=9:1(v/v)体积比的混合液对步骤3)所得物进行洗脱；洗脱 25~35min(较佳为30min)后将所得的残留物用氮气吹干，然后加入甲醇（Img氮气吹干所 得物配用ImL甲醇）充分溶解，220nm膜过滤后HPLC进行分析；
[0034] 5)、HPLC 条件
[0035] Agilentl200高效液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司
[0036] 色谱柱：Kinetex XB-C18 (IOOmmX 4. 60mm, 1. 8 μ m)
[0037] 流动相：甲醇：异丙醇：水=250 :100 :50的体积比；
[0038] 流速：1mT,/mi η
[0039] 进样量：10 μ L
[0040] 检测波长：225nm
[0041] 运行时间：6min ;
[0042] 6)、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度（邻苯二甲酸二乙基己 酯的浓度）之间的关系建立HPLC标准曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入上述HPLC 标准曲线中，从而获得样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。
[0043] 作为本发明的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法的改进：
[0044] 步骤2)中：烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物为丙烯腈一烯丙基-β-环糊精 分子印迹聚合物（M-AN)。最佳浓度为300ng/ml~400ng/ml。
[0045] 本发明采用两步法制备分子印迹聚合物。本发明首次用HPLC结合分子印迹法去 测定DEHP的残留量；即，本发明首先制备功能性的烯丙基- β -环糊精分子印迹聚合物，接 着再结合待检测样品制备成相应的分子印迹聚合物。
[0046] 采用本发明的方法测定邻苯二甲酸二乙基己酯残留，具有如下技术优势：
[0047] 首次将分子印迹技术与HPLC相结合测定DEHP的残留。该分析方法所需的分析样 品用量少，操作简单、方便、快速（仅需大约2. 5小时），成本低，灵敏度高。
【具体实施方式】
[0048] 实施例1、烯丙基- β -环糊精分子印迹聚合物的制备方法，依次进行以下步骤：
[0049] 1)、烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体的制备，依次进行以下步骤：
[0050] ①、准确称取20克氢氧化钠（NaOH)，20g β -环糊精，然后加入20mL水，60°C水浴 2h，不断搅拌从而实现均匀混合；
[0051] ②、在氮气保护下，在步骤①所得物中加入4mmol烯丙基溴，于60°C继续搅拌2h ;
[0052] ③、将上述步骤②所得混合物60°C水浴30min，然后将其转移至鼓风干燥箱中，干 燥至恒重（约60°C干燥2~3天），得固体混合物；
[0053] ④、将步骤③所得的固体混合物研磨成粉末（过200目筛），得烯丙基-β-环糊精 (allyl-β-Ο))单体（粉末状）；
[0054] 2)、烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物的制备，依次进行以下步骤：
[0055] ①、称取2. 80g步骤1)所得稀丙基-β -环糊精（allyl-β-CD)单体，加入无水乙 醇洗涤；
[0056] 备注说明：重复洗涤5次，每次持续5分钟；加入无水乙醇洗涤的目的是为了去除 烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体可能存在的试剂残留；
[0057] 然后先加入40mL的N，N-二甲基甲酰胺搅拌30min，再加入2mmol邻苯二甲酸二 乙基己醋（DEHP)，在氮气的保护下，于45~60°C磁力搅拌（600rpm)2h ;
[0058] ②、取上述步骤①所得到1/3体积的溶液，加入12mmol功能单体于45~60°C磁力 搅拌（600rpm)，充分反应Ih ;
[0059] ③、在步骤②所得反应产物中加入40mg偶氮二异丁腈（AIBN)作为引物，然后加入 60mmol乙稀乙二醇二甲基丙稀酸（EGDMA)，45~60°C磁力搅拌（600rpm)反应30min ;
[0060] ④、将上述步骤③所得的固体产物60°C水浴24h，然后放入鼓风干燥箱里，干燥至 恒重（约60°C干燥2~3天）；
[0061] ⑤、将上述步骤④所得的固体，研磨后过400目筛，用50~70°C的热水洗绦（目的 是去除反应试剂），获得印迹孔穴模板；
[0062] ⑥、利用甲醇：=乙酸9:l(v/v)体积比的混合液对印迹孔穴模板内部进行索氏抽 提（70°C抽提48h)，直至用紫外可见分光光度法检测不到邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)， 然后用甲醇洗涤除去残留的乙酸，获得烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物。
[0063] 步骤②的功能单体分别为：甲基丙烯酸（MA)、甲基丙烯酸甲酯（MMA)或丙烯腈 (AN);对应的步骤⑤所得的印迹孔穴模板为：甲基丙烯酸-烯丙基-β-环糊精分子印迹聚 合物（M-MA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-MM)，丙烯腈一烯 丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-AN)。
[0064] 实施例2、利用烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物进行的分子印迹技术吸附邻苯 二甲酸二乙基己酯的方法，依次进行如下步骤：
[0065] 1 )、制备样品待测液：
[0066] 准确称取Ig婴儿配方奶粉（作为样品），加入IOmL甲醇，涡流式搅拌器搅拌 15min，使其混合均勾。加入0. 5g NaCl，用祸流式搅拌器搅拌15min后超声处理IOmin (目 的是为了增加样品的溶解度）。取出混合物，3500rpm离心10min，收集上层清液，作为样品 待测液。
[0067] 备注说明：共得到上层清液IOml左右。
[0068] 2)、将烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物用甲醇和水依次洗涤（备注说明：lmg 烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物配用3mL的甲醇和3mL的水）；然后风干至恒重；然后 加入至步骤1)所得的样品待测液中，直至烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物的浓度如表 1所示（即，分别为100、200、300、400ng/mL)。目的是为了特异性吸附DEHP。
[0069] 备注说明：烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物分别选用甲基丙烯酸-烯丙 基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-MA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β -环糊精分子印迹聚 合物（M-MMA)，丙烯腈一烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-AN)。
[0070] 3)、在步骤2)的所得物中加入1~1.2体积倍的50%甲醇（目的是为了吸附溶 液）。
[0071] 备注说明：上述50 %甲醇是指体积浓度为50 %的甲醇水溶液；
[0072] 4)、利用甲醇：乙酸=9:1 (v/v)体积比的混合液对步骤3)所得物（全部）进行洗 脱；为流动洗涤，流速为0. 5mL/min左右；洗涤30min后将残留物用氮气吹干，然后加入甲 醇（按照Img氮气吹干所得物配用ImL甲醇的用量比）充分溶解，220nm膜过滤后HPLC进 行分析。
[0073] 备注说明：220nm膜过滤，得到0. 8ml滤液；
[0074] 5)、HPLC 条件
[0075] Agilentl200高效液相色谱仪安捷伦科技（中国）有限公司
[0076] 色谱柱：Kinetex XB-C18 (IOOmmX 4. 60mm, 1. 8 μ m)
[0077] 流动相：甲醇：异丙醇：水（250 :100 :50)
[0078] 流速：1mT,/mi η
[0079] 进样量：10 μ L
[0080] 检测波长：225nm
[0081] 运行时间：6min ;
[0082] 备注说明：用标品（邻苯二甲酸二乙基己酯）替代上述步骤1)中的样品，直接 HPLC处理；即，其余内容同上述步骤。
[0083] 6)、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度之间的关系建立HPLC 标准曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入上述HPLC标准曲线中，从而获得样品待测液 中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。
[0084] 所得的DEHP的平均回收率如表1所示。
[0085] 表、IDEHP的平均回收率
[0086]
[0087] 从表1中可以看出，M-AN的回收率比其他两种高，平均回收率在93. 59-97. 98%。
[0088] 标准曲线的建立：
[0089] 用 DEHP 的标准品（0· 0025, 0· 005, 0· 1，0· 2, 0· 4, 0· 6, 0· 8, 1 μ g ml/1)建立 HPLC 标 准曲线，
[0090] y = 9. 154x+l. 923, R2= 0. 998。
[0091] 检出限：0.045 μ g ι?ΙΛ电子信噪比3:1
[0092] 定量限：0. 139 μ g ι?ΙΛ电子信噪比10:1
[0093] 根据"Agilentl200高效液相色谱仪"得出待测样品的数据，结合标准曲线进行分 析即可得到待测物品中的DEHP含量。
[0094] HPLC检测所得值为Y，从而最终得出样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓 度；即，所得的X经过百分比的换算后得知样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。具 体如表2所示。
[0095] 表 2
[0096]
[0098] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 烯丙基-e-环糊精分子印迹聚合物的制备方法，其特征是包括以下步骤： 1) 、烯丙基-e-环糊精单体的制备，依次进行以下步骤： ① 、准确称取20克氢氧化钠，20g0 -环糊精，然后加入20mL水，50~70°C水浴1. 5~ 2. 5h，不断搅拌从而实现均匀混合； ② 、在氮气保护下，在步骤①所得物中加入4mmol稀丙基溴，于50~70°C继续搅拌 1. 5 ~2. 5h; ③ 、将上述步骤②所得混合物50~70°C水浴25~35min，然后将其转移至鼓风干燥箱 中，干燥至恒重，得固体混合物； ④ 、将步骤③所得的固体混合物研磨成粉末，得烯丙基-e-环糊精单体； 2) 、烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物的制备，依次进行以下步骤： ① 、称取2. 80g步骤1)所得烯丙基-0 -环糊精单体，加入无水乙醇洗涤； 然后先加入40mL的N，N_二甲基甲酰胺搅拌25~35min，再加入2mmol邻苯二甲酸二 乙基己醋，在氮气的保护下，于45~60°C磁力搅拌1. 5~2. 5h; ② 、取上述步骤①所得到1/3体积的溶液，加入12mmol功能单体于45~60°C磁力搅 拌，充分反应Ih; ③ 、在步骤②所得反应产物中加入40mg偶氮二异丁腈作为引物，然后加入60mmol乙稀 乙二醇二甲基丙稀酸，45~60°C磁力搅拌反应30min; ④ 、将上述步骤③所得的固体产物50~70°C水浴22~24h，然后放入鼓风干燥箱里， 干燥至恒重； ⑤ 、将上述步骤④所得的固体，研磨后过400目筛，用50~70°C的热水洗涤，获得印迹 孔穴模板； ⑥ 、利用甲醇：=乙酸9:1体积比的混合液对印迹孔穴模板内部进行索氏抽提，直至用 紫外可见分光光度法检测不到邻苯二甲酸二乙基己酯，然后用甲醇洗涤除去残留的乙酸， 获得烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物。2. 根据权利要求1所述的烯丙基_ 0 -环糊精分子印迹聚合物的制备方法，其特征是： 所述步骤2)中： 步骤②的功能单体为：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈； 对应的步骤⑤所得的印迹孔穴模板为：甲基丙烯酸-烯丙基-e_环糊精分子印迹聚合 物，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-e-环糊精分子印迹聚合物，丙烯腈--烯丙基-e-环糊精 分子印迹聚合物。3. 利用权利要求1或2所述的烯丙基-e-环糊精分子印迹聚合物进行的分子印迹技 术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征是包括如下步骤： 1) 、制备样品待测液和作为标品的邻苯二甲酸二乙基己酯溶液； 2) 、将烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物用甲醇和水依次洗涤，然后风干至恒重； 接着分别加入至步骤1)所得的样品待测液和邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中，直至烯丙 基-13 -环糊精分子印迹聚合物的浓度为100~400ng/ml; 3) 、在步骤2)所得液中加入50%甲醇，所述50%甲醇与步骤2)所得液的体积比为1~ 3:1; 上述50 %甲醇是指体积浓度为50 %的甲醇水溶液； 4) 、利用甲醇：乙酸=9:1体积比的混合液对步骤3)所得物进行洗脱；洗脱25~35min 后将所得的残留物用氮气吹干，然后加入甲醇充分溶解，220nm膜过滤后HPLC进行分析， 5)、HPLC条件 Agilent1200高效液相色谱仪 色谱柱：KinetexXB_C18(100mmX4. 60mm,I. 8ym) 流动相：甲醇：异丙醇：水=250 :100 :50的体积比； 流速：lmL/min进样量：10yL 检测波长：225nm 运行时间：6min; 6) 、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度之间的关系建立HPLC标准 曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入上述HPLC标准曲线中，从而获得样品待测液中邻 苯二甲酸二乙基己酯的浓度。4. 根据权利要求3所述的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征 是： 所述步骤2)中：烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物为丙烯腈一烯丙基-0 -环糊精 分子印迹聚合物。5. 根据权利要求4所述的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征是 HPLC标准曲线为：y= 9. 154x+l. 923,R2= 0? 998。6. 根据权利要求5所述的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征 是：邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中，邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度分别为0. 0025, 0. 005, 0 .1, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8,IygmL1O
【专利摘要】本发明公开了一种利用烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物进行的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，包括如下步骤：1)、制备样品待测液和作为标品的邻苯二甲酸二乙基己酯溶液；2)、将烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物分别加入至步骤1)所得的样品待测液和邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中；3)、在步骤2)所得液中加入50％甲醇；4)、步骤3)所得物经洗涤、溶解、膜过滤后进行HPLC分析；5)、设定HPLC条件；6)、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度之间的关系建立HPLC标准曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入HPLC标准曲线中，从而获得样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。
【IPC分类】B01J20/30, B01J20/26, C08J9/28, C08F220/14, C08F220/44, C08F251/00, C08F220/06
【公开号】CN104892841
【申请号】CN201510257481
【发明人】沈生荣, 索维查, 于海宁
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于分子印迹技术的食品安全控制与分析的方法。
【背景技术】
[0002] 食品安全是当今世界备受人们关注的焦点问题之一。我国经济持续发展的同时， 食品安全问题也频频发生，人们由过去的吃的饱转向关注吃的健康、科学、营养。总体来说， 我国的食品安全现状不容乐观，从2008年的三鹿奶粉事件到后来的苏丹红、瘦肉精、地沟 油，这些都严重影响了人们的身体健康和生命安全，同时也给经济和社会的可持续发展带 来了不利的影响。加强食品安全管理，改善食品安全现状，减少食品安全相关事故已经成为 了消费者的迫切需求和政府工作的重心之一。国务院印发的《2015年食品安全重点工作安 排》立足于找问题，抓改革，出实招，切实打造食品安全新常态。
[0003] 邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)是一类常见的增塑剂，能够起到软化聚合物，改善 透明度，增强塑料制品耐用度的效果，因而被广泛应用于塑料制品的生产。由于成本低廉， 近年来一些厂家将其滥用在食品、医疗器械、玩具等包装中。然而，DEHP本身具有较强的脂 溶性，容易从塑料制品中迀移出来，从而污染被包装物品。并且通过呼吸、饮食和皮肤接触 进入人体内，对人体健康带来了危害。大量的动物毒理学试验证明，DEHP及其代谢产物具 有一定的致畸性、致癌性、生殖发育毒性。由于它的潜在毒性，欧盟限制其应用于0~3岁 儿童相关产品的生产中。FDA规定的成人每日最大摄入量为3. 5 μ g/mL，新生儿与婴儿为 〇·3 μ g/mL〇
[0004] 分子印迹技术（MIT)是一项具有特异识别功能的新兴技术，结合了高分子化学、 材料化学、化学工程以及生物化学等学科的知识，广泛应用于固相萃取、色谱分离、传感器 制造等领域。它利用分子印迹聚合物（MIPs)模拟酶-底物或抗体-抗原之间的相互作用， 对印迹分子进行专一性的识别。该项技术应用成功的关键是MIPs的制备过程，包括功能单 体、交联剂、溶剂、引发剂等的选择及用量，引发聚合的条件及制备方法等。MIT以其高亲和 性、高特异性、高准确性和稳定性等独特优点，迅速吸引了各国研宄人员的关注，其应用方 法也日趋成熟。
[0005] 目前现有的采用分子印迹技术（MIT)吸附邻苯二甲酸二乙基己酯残留的方法为： 2012年Shaikh等人用甲基丙烯酸（MAA)制备分子印迹膜富集河水中的DEHP，气相色谱法 测定残留量。
[0006] 目前现有的米用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography\ HPLC)测定邻苯二甲酸二乙基己醋残留的方法为：2009年Chaudhary等人建立了 HPLC测定 DEHP的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种分子印迹技术与HPLC联用测定邻苯二甲酸 二乙基己酯残留的方法以及所用的烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物；采用本发明的方 法能从复杂化合物中分离与富集DEHP。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种烯丙基-β_环糊精分子印迹聚 合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)、烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体的制备，依次进行以下步骤：
[0010] ①、准确称取20克氢氧化钠（NaOH)，20g β -环糊精，然后加入20mL水，50~70°C 水浴1. 5~2. 5h (较佳为60°C水浴2h)，不断搅拌从而实现均匀混合；
[0011] ②、在氮气保护下，在步骤①所得物中加入4mmol烯丙基溴，于50~70°C继续搅拌 1. 5~2. 5h (较佳为60°C继续搅拌2h);
[0012] ③、将上述步骤②所得混合物50~70 °C水浴25~35min (较佳为60 °C水浴 30min)，然后将其转移至鼓风干燥箱中，干燥至恒重（约60°C干燥2~3天），得固体混合 物；
[0013] ④、将步骤③所得的固体混合物研磨成粉末（过200目筛），得烯丙基-β-环糊精 (allyl-β-Ο))单体（粉末状）；
[0014] 2)、烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物的制备，依次进行以下步骤：
[0015] ①、称取2. 80g步骤1)所得稀丙基-β -环糊精（allyl-β -⑶）单体，加入无水乙 醇洗涤；
[0016] 备注说明：重复洗涤5次，每次持续5分钟；加入无水乙醇洗涤的目的是为了去除 烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体可能存在的试剂残留；
[0017] 然后先加入40mL的N，N-二甲基甲酰胺搅拌25~35min (较佳为30min)，再 加入2mmol邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)，在氮气的保护下，于45~60 °C磁力搅拌 (600rpm) 1. 5 ~2. 5h (较佳为 2h);
[0018] ②、取上述步骤①所得到1/3体积的溶液，加入12mmol功能单体于45~60°C磁力 搅拌（600rpm)，充分反应Ih ;
[0019] ③、在步骤②所得反应产物中加入40mg偶氮二异丁腈（AIBN)作为引物，然后加入 60mmol乙稀乙二醇二甲基丙稀酸（EGDMA)，45~60°C磁力搅拌（600rpm)反应30min ;
[0020] ④、将上述步骤③所得的固体产物50~70°C水浴22~24h(较佳为60°C水浴 24h)，然后放入鼓风干燥箱里，干燥至恒重（约60°C干燥2~3天）；
[0021] ⑤、将上述步骤④所得的固体，研磨后过400目筛，用50~70°C的热水洗涤（目的 是去除反应试剂），获得印迹孔穴模板；
[0022] ⑥、利用甲醇：=乙酸9:l(v/v)体积比的混合液对印迹孔穴模板内部进行索氏抽 提（一般为于65~75°C抽提46~50h，较佳为70°C抽提48h)，直至用紫外可见分光光度 法检测不到邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)，然后用甲醇洗涤除去残留的乙酸，可获得烯丙 基-β -环糊精分子印迹聚合物。
[0023] 作为本发明的烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物的制备方法的改进：
[0024] 所述步骤2)中：
[0025] 步骤②的功能单体为：甲基丙烯酸（MA)、甲基丙烯酸甲酯（MMA)或丙烯腈（AN);
[0026] 对应的步骤⑤所得的印迹孔穴模板为：甲基丙烯酸-烯丙基-β -环糊精分子印 迹聚合物（M-MA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物（M-MM)，丙烯 腈一烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-AN)。
[0027] 本发明还同时提供了利用上述烯丙基-β_环糊精分子印迹聚合物进行的分子印 迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，包括如下步骤：
[0028] 1)、制备样品待测液和作为标品的邻苯二甲酸二乙基己酯溶液；
[0029] 2)、将烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物用甲醇和水依次洗涤，然后风干至恒 重；接着分别加入至步骤1)所得的样品待测液和邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中，直至烯丙 基-β -环糊精分子印迹聚合物的浓度为100~400ng/ml ;
[0030] 烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物例如可选用：甲基丙烯酸-烯丙基-β -环 糊精分子印迹聚合物（M-MAA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物 (M-MMA)，丙烯腈一烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物（M-AN);
[0031] 3)、在步骤2)所得液中加入50%甲醇，所述50%甲醇与步骤2)所得液的体积比 为1~3 :1 ;
[0032] 上述50 %甲醇是指体积浓度为50 %的甲醇水溶液；
[0033] 4)、利用甲醇：乙酸=9:1(v/v)体积比的混合液对步骤3)所得物进行洗脱；洗脱 25~35min(较佳为30min)后将所得的残留物用氮气吹干，然后加入甲醇（Img氮气吹干所 得物配用ImL甲醇）充分溶解，220nm膜过滤后HPLC进行分析；
[0034] 5)、HPLC 条件
[0035] Agilentl200高效液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司
[0036] 色谱柱：Kinetex XB-C18 (IOOmmX 4. 60mm, 1. 8 μ m)
[0037] 流动相：甲醇：异丙醇：水=250 :100 :50的体积比；
[0038] 流速：1mT,/mi η
[0039] 进样量：10 μ L
[0040] 检测波长：225nm
[0041] 运行时间：6min ;
[0042] 6)、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度（邻苯二甲酸二乙基己 酯的浓度）之间的关系建立HPLC标准曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入上述HPLC 标准曲线中，从而获得样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。
[0043] 作为本发明的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法的改进：
[0044] 步骤2)中：烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物为丙烯腈一烯丙基-β-环糊精 分子印迹聚合物（M-AN)。最佳浓度为300ng/ml~400ng/ml。
[0045] 本发明采用两步法制备分子印迹聚合物。本发明首次用HPLC结合分子印迹法去 测定DEHP的残留量；即，本发明首先制备功能性的烯丙基- β -环糊精分子印迹聚合物，接 着再结合待检测样品制备成相应的分子印迹聚合物。
[0046] 采用本发明的方法测定邻苯二甲酸二乙基己酯残留，具有如下技术优势：
[0047] 首次将分子印迹技术与HPLC相结合测定DEHP的残留。该分析方法所需的分析样 品用量少，操作简单、方便、快速（仅需大约2. 5小时），成本低，灵敏度高。
【具体实施方式】
[0048] 实施例1、烯丙基- β -环糊精分子印迹聚合物的制备方法，依次进行以下步骤：
[0049] 1)、烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体的制备，依次进行以下步骤：
[0050] ①、准确称取20克氢氧化钠（NaOH)，20g β -环糊精，然后加入20mL水，60°C水浴 2h，不断搅拌从而实现均匀混合；
[0051] ②、在氮气保护下，在步骤①所得物中加入4mmol烯丙基溴，于60°C继续搅拌2h ;
[0052] ③、将上述步骤②所得混合物60°C水浴30min，然后将其转移至鼓风干燥箱中，干 燥至恒重（约60°C干燥2~3天），得固体混合物；
[0053] ④、将步骤③所得的固体混合物研磨成粉末（过200目筛），得烯丙基-β-环糊精 (allyl-β-Ο))单体（粉末状）；
[0054] 2)、烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物的制备，依次进行以下步骤：
[0055] ①、称取2. 80g步骤1)所得稀丙基-β -环糊精（allyl-β-CD)单体，加入无水乙 醇洗涤；
[0056] 备注说明：重复洗涤5次，每次持续5分钟；加入无水乙醇洗涤的目的是为了去除 烯丙基-β-环糊精（allyl-β-⑶）单体可能存在的试剂残留；
[0057] 然后先加入40mL的N，N-二甲基甲酰胺搅拌30min，再加入2mmol邻苯二甲酸二 乙基己醋（DEHP)，在氮气的保护下，于45~60°C磁力搅拌（600rpm)2h ;
[0058] ②、取上述步骤①所得到1/3体积的溶液，加入12mmol功能单体于45~60°C磁力 搅拌（600rpm)，充分反应Ih ;
[0059] ③、在步骤②所得反应产物中加入40mg偶氮二异丁腈（AIBN)作为引物，然后加入 60mmol乙稀乙二醇二甲基丙稀酸（EGDMA)，45~60°C磁力搅拌（600rpm)反应30min ;
[0060] ④、将上述步骤③所得的固体产物60°C水浴24h，然后放入鼓风干燥箱里，干燥至 恒重（约60°C干燥2~3天）；
[0061] ⑤、将上述步骤④所得的固体，研磨后过400目筛，用50~70°C的热水洗绦（目的 是去除反应试剂），获得印迹孔穴模板；
[0062] ⑥、利用甲醇：=乙酸9:l(v/v)体积比的混合液对印迹孔穴模板内部进行索氏抽 提（70°C抽提48h)，直至用紫外可见分光光度法检测不到邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)， 然后用甲醇洗涤除去残留的乙酸，获得烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物。
[0063] 步骤②的功能单体分别为：甲基丙烯酸（MA)、甲基丙烯酸甲酯（MMA)或丙烯腈 (AN);对应的步骤⑤所得的印迹孔穴模板为：甲基丙烯酸-烯丙基-β-环糊精分子印迹聚 合物（M-MA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-MM)，丙烯腈一烯 丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-AN)。
[0064] 实施例2、利用烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物进行的分子印迹技术吸附邻苯 二甲酸二乙基己酯的方法，依次进行如下步骤：
[0065] 1 )、制备样品待测液：
[0066] 准确称取Ig婴儿配方奶粉（作为样品），加入IOmL甲醇，涡流式搅拌器搅拌 15min，使其混合均勾。加入0. 5g NaCl，用祸流式搅拌器搅拌15min后超声处理IOmin (目 的是为了增加样品的溶解度）。取出混合物，3500rpm离心10min，收集上层清液，作为样品 待测液。
[0067] 备注说明：共得到上层清液IOml左右。
[0068] 2)、将烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物用甲醇和水依次洗涤（备注说明：lmg 烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物配用3mL的甲醇和3mL的水）；然后风干至恒重；然后 加入至步骤1)所得的样品待测液中，直至烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物的浓度如表 1所示（即，分别为100、200、300、400ng/mL)。目的是为了特异性吸附DEHP。
[0069] 备注说明：烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物分别选用甲基丙烯酸-烯丙 基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-MA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β -环糊精分子印迹聚 合物（M-MMA)，丙烯腈一烯丙基-β -环糊精分子印迹聚合物（M-AN)。
[0070] 3)、在步骤2)的所得物中加入1~1.2体积倍的50%甲醇（目的是为了吸附溶 液）。
[0071] 备注说明：上述50 %甲醇是指体积浓度为50 %的甲醇水溶液；
[0072] 4)、利用甲醇：乙酸=9:1 (v/v)体积比的混合液对步骤3)所得物（全部）进行洗 脱；为流动洗涤，流速为0. 5mL/min左右；洗涤30min后将残留物用氮气吹干，然后加入甲 醇（按照Img氮气吹干所得物配用ImL甲醇的用量比）充分溶解，220nm膜过滤后HPLC进 行分析。
[0073] 备注说明：220nm膜过滤，得到0. 8ml滤液；
[0074] 5)、HPLC 条件
[0075] Agilentl200高效液相色谱仪安捷伦科技（中国）有限公司
[0076] 色谱柱：Kinetex XB-C18 (IOOmmX 4. 60mm, 1. 8 μ m)
[0077] 流动相：甲醇：异丙醇：水（250 :100 :50)
[0078] 流速：1mT,/mi η
[0079] 进样量：10 μ L
[0080] 检测波长：225nm
[0081] 运行时间：6min ;
[0082] 备注说明：用标品（邻苯二甲酸二乙基己酯）替代上述步骤1)中的样品，直接 HPLC处理；即，其余内容同上述步骤。
[0083] 6)、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度之间的关系建立HPLC 标准曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入上述HPLC标准曲线中，从而获得样品待测液 中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。
[0084] 所得的DEHP的平均回收率如表1所示。
[0085] 表、IDEHP的平均回收率
[0086]
[0087] 从表1中可以看出，M-AN的回收率比其他两种高，平均回收率在93. 59-97. 98%。
[0088] 标准曲线的建立：
[0089] 用 DEHP 的标准品（0· 0025, 0· 005, 0· 1，0· 2, 0· 4, 0· 6, 0· 8, 1 μ g ml/1)建立 HPLC 标 准曲线，
[0090] y = 9. 154x+l. 923, R2= 0. 998。
[0091] 检出限：0.045 μ g ι?ΙΛ电子信噪比3:1
[0092] 定量限：0. 139 μ g ι?ΙΛ电子信噪比10:1
[0093] 根据"Agilentl200高效液相色谱仪"得出待测样品的数据，结合标准曲线进行分 析即可得到待测物品中的DEHP含量。
[0094] HPLC检测所得值为Y，从而最终得出样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓 度；即，所得的X经过百分比的换算后得知样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。具 体如表2所示。
[0095] 表 2
[0096]
[0098] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 烯丙基-e-环糊精分子印迹聚合物的制备方法，其特征是包括以下步骤： 1) 、烯丙基-e-环糊精单体的制备，依次进行以下步骤： ① 、准确称取20克氢氧化钠，20g0 -环糊精，然后加入20mL水，50~70°C水浴1. 5~ 2. 5h，不断搅拌从而实现均匀混合； ② 、在氮气保护下，在步骤①所得物中加入4mmol稀丙基溴，于50~70°C继续搅拌 1. 5 ~2. 5h; ③ 、将上述步骤②所得混合物50~70°C水浴25~35min，然后将其转移至鼓风干燥箱 中，干燥至恒重，得固体混合物； ④ 、将步骤③所得的固体混合物研磨成粉末，得烯丙基-e-环糊精单体； 2) 、烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物的制备，依次进行以下步骤： ① 、称取2. 80g步骤1)所得烯丙基-0 -环糊精单体，加入无水乙醇洗涤； 然后先加入40mL的N，N_二甲基甲酰胺搅拌25~35min，再加入2mmol邻苯二甲酸二 乙基己醋，在氮气的保护下，于45~60°C磁力搅拌1. 5~2. 5h; ② 、取上述步骤①所得到1/3体积的溶液，加入12mmol功能单体于45~60°C磁力搅 拌，充分反应Ih; ③ 、在步骤②所得反应产物中加入40mg偶氮二异丁腈作为引物，然后加入60mmol乙稀 乙二醇二甲基丙稀酸，45~60°C磁力搅拌反应30min; ④ 、将上述步骤③所得的固体产物50~70°C水浴22~24h，然后放入鼓风干燥箱里， 干燥至恒重； ⑤ 、将上述步骤④所得的固体，研磨后过400目筛，用50~70°C的热水洗涤，获得印迹 孔穴模板； ⑥ 、利用甲醇：=乙酸9:1体积比的混合液对印迹孔穴模板内部进行索氏抽提，直至用 紫外可见分光光度法检测不到邻苯二甲酸二乙基己酯，然后用甲醇洗涤除去残留的乙酸， 获得烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物。2. 根据权利要求1所述的烯丙基_ 0 -环糊精分子印迹聚合物的制备方法，其特征是： 所述步骤2)中： 步骤②的功能单体为：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈； 对应的步骤⑤所得的印迹孔穴模板为：甲基丙烯酸-烯丙基-e_环糊精分子印迹聚合 物，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-e-环糊精分子印迹聚合物，丙烯腈--烯丙基-e-环糊精 分子印迹聚合物。3. 利用权利要求1或2所述的烯丙基-e-环糊精分子印迹聚合物进行的分子印迹技 术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征是包括如下步骤： 1) 、制备样品待测液和作为标品的邻苯二甲酸二乙基己酯溶液； 2) 、将烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物用甲醇和水依次洗涤，然后风干至恒重； 接着分别加入至步骤1)所得的样品待测液和邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中，直至烯丙 基-13 -环糊精分子印迹聚合物的浓度为100~400ng/ml; 3) 、在步骤2)所得液中加入50%甲醇，所述50%甲醇与步骤2)所得液的体积比为1~ 3:1; 上述50 %甲醇是指体积浓度为50 %的甲醇水溶液； 4) 、利用甲醇：乙酸=9:1体积比的混合液对步骤3)所得物进行洗脱；洗脱25~35min 后将所得的残留物用氮气吹干，然后加入甲醇充分溶解，220nm膜过滤后HPLC进行分析， 5)、HPLC条件 Agilent1200高效液相色谱仪 色谱柱：KinetexXB_C18(100mmX4. 60mm,I. 8ym) 流动相：甲醇：异丙醇：水=250 :100 :50的体积比； 流速：lmL/min进样量：10yL 检测波长：225nm 运行时间：6min; 6) 、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度之间的关系建立HPLC标准 曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入上述HPLC标准曲线中，从而获得样品待测液中邻 苯二甲酸二乙基己酯的浓度。4. 根据权利要求3所述的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征 是： 所述步骤2)中：烯丙基-0 -环糊精分子印迹聚合物为丙烯腈一烯丙基-0 -环糊精 分子印迹聚合物。5. 根据权利要求4所述的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征是 HPLC标准曲线为：y= 9. 154x+l. 923,R2= 0? 998。6. 根据权利要求5所述的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，其特征 是：邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中，邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度分别为0. 0025, 0. 005, 0 .1, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8,IygmL1O
【专利摘要】本发明公开了一种利用烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物进行的分子印迹技术吸附邻苯二甲酸二乙基己酯的方法，包括如下步骤：1)、制备样品待测液和作为标品的邻苯二甲酸二乙基己酯溶液；2)、将烯丙基-β-环糊精分子印迹聚合物分别加入至步骤1)所得的样品待测液和邻苯二甲酸二乙基己酯溶液中；3)、在步骤2)所得液中加入50％甲醇；4)、步骤3)所得物经洗涤、溶解、膜过滤后进行HPLC分析；5)、设定HPLC条件；6)、用邻苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC检测结果和浓度之间的关系建立HPLC标准曲线；将样品待测液的HPLC检测结果代入HPLC标准曲线中，从而获得样品待测液中邻苯二甲酸二乙基己酯的浓度。
【IPC分类】B01J20/30, B01J20/26, C08J9/28, C08F220/14, C08F220/44, C08F251/00, C08F220/06
【公开号】CN104892841
【申请号】CN201510257481
【发明人】沈生荣, 索维查, 于海宁
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
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