磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物及制备方法、脂质体造影剂和治疗肿瘤脂质体诊疗药物的制作方法
磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物及制备方法、脂质体造影剂和治疗肿瘤脂质体诊疗药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂质体技术领域，尤其涉及一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物 及其制备方法、脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
【背景技术】
[0002] 癌症是危害人类健康的主要疾病之一，仅在我国每年大约有300万左右的新增癌 症病人，其中绝大多数在确诊的时候，已经进入了癌症的中晚期。因此对肿瘤、病变组织的 早期检测及诊断，是早期发现癌症并及时治疗的必要条件，早期诊断和治疗癌症既能够提 高对疾病的治疗效果，又能够为患者减轻痛苦、减少经济负担。
[0003] 自1976年后，核磁共振成像（MRI)技术被广泛的应用于现代医学诊断中，成为了 现代医学影像学的重要组成部分。与X射线计算机断层扫描（CT)等传统的影像检查相比， MRI具有非常明显的优势，如较高的空间分辨率、对软组织的良好对比度、无电离辐射伤害 等。然而MRI也有不足之处，如它的空间分辨率不及CT，带有心脏起搏器的患者或有某些金 属异物的部位不能作核磁共振的检查等。
[0004] CT是用计算机控制X射线源和探测器，使之环绕人体某一部位，利用人体组织密 度的差异而显现出的图像。虽然CT只能辨别出有密度差异的组织，对软组织的分辨率不 高，但是CT成像技术也有着自身的优势：首先，CT对平片检查较难显示的部分，例如同心、 大血管重叠病变的显示，更具有优越性；其次，CT对胸部疾病的诊断，随着高分辨率CT设备 的应用，日益显示出它的优越性；最后，随着科技的发展CT对心脏方面和血管方面的检查 具有重要意义。
[0005] 当人体内的某些组织、器官缺乏自然对比度时，为了提高这些组织和器官分辨率， 以便进一步显示某些较小的病变，可以通过人为的方法将一些物质引入器官内、组织内，使 疑难的病变得到及时的确诊。这些被引入的物质也就是我们通常所用的对比剂，也称造影 剂。理想的造影剂应具备如下条件：（1)有优良的显影效果；（2)水溶性好，渗透压和粘度应 当与血浆相近；（3)体内稳定性好，易于排除体外，不在体内积累；(4)无细胞毒性；(5)靶 向性好，能特异地被肿瘤细胞内化或结合在其细胞表面。目前所使用的CT和MRI的造影剂 由于化合物分子本身体积小，而缺少对肿瘤组织的靶向性，难以用于肿瘤的早期检测和诊 断；另外，这些造影剂还存在给药量大、显影时间短、对血管和中枢神经系统有毒副作用等 缺陷。
[0006] 脂质体是由无毒、可生物降解的类脂物质构成的双层囊泡或微球，其粒径范围在 几十到几百纳米，它能够聚集、担载各种药物，并改善所担载药物的溶解性和亲脂性能，降 低药物毒性，还有助于药物的靶向输送。以纳米脂质体作为载体的造影剂可以实现降低造 影剂用量、减少造影剂对人体的毒性、大大增加显影时间的优点，能够在肿瘤的治疗过程 中，对肿瘤组织的定期监测，了解其大小、形态变化，有助于为医生采取及时有效的治疗方 案提供科学依据。
[0007] 现有技术提供的脂质体一般为末端为甲氧基基团的聚乙二醇高分子，抗体对甲氧 基基团的亲和性较高，尤其是对含有多甲氧基的聚乙二醇修饰物，因此抗体对末端为甲氧 基基团的聚乙二醇脂质体的清除速度较快，导致这种含有甲氧基基团的脂质体在进入体内 后，在血液中的白蛋白等各种因素作用下，脂质体有引起不良免疫反应和被快速清除的风 险。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物及其 制备方法、脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟 基聚乙二醇衍生物末端为羟基，能够避免在体内被快速清除，在体内的生物保留时间较长。
[0009] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式11-1、式 II-2或式II-3所示的结构：
[0012] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200 ; i为0或1。
[0013] 优选的，所述R为式101或式102中的一种：
[0014]
[0015] 式101中，&和R 2独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的條径基；
[0016] 式102中，馬和R 4独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的烯烃基。
[0017] 优选的，所述R为式201~式211中的一种：
[0018]
[0019]
[0020] 优选的，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的结构为式I-a或式IIA-1-a 中的一种：
[0021]
[0022] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0023] 在缩合剂的作用下，将α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物进行活化，得到羟基聚 乙二醇活化酯；
[0024] 将所述羟基聚乙二醇活化酯和磷脂酰乙醇胺进行偶合反应，得到磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物；所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式IIA-I~式 ΙΙΑ-3所示的结构：
[0025]
[0026] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200 ;
[0027] 所述α-羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物具有式IIIA-I~式IIIA-3所示的结构：
[0029]其中，η 为 20 ~200 ;m 为 1 ~10。
[0030] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0031] 将α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应，得到磷脂酰乙醇 胺羟基聚乙二醇；
[0032] 在还原剂的作用下，将所述磷脂酰乙醇胺羟基聚乙二醇进行还原反应，得到具有 式I或式IIB-I~ΙΙΒ-3所示结构的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物：
[0035] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200 ;
[0036] 所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV或式IIIB-I~IIIB-3所示的 结构： L0038」 具中，m为1~10 ;η为20~200。
[0039] 优选的，所述磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油脂酰基磷酰乙醇 胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、 1，3-二棕榈酰-甘油-2-磷酸乙醇胺、1，3-二油脂酰-甘油-2-磷酸乙醇胺、二植烷酰基 磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二亚麻酰基磷脂酰乙醇胺或1-棕榈酰-2-油酰基 磷脂酰乙醇胺。
[0040] 本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物及提供的方法制备得到的磷 脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物中含有末端为羟基的聚乙二醇，这种磷脂酰乙醇胺-羟 基聚乙二醇衍生物作为脂质体具有较低的免疫原性，进入体内能够避免被快速清除，在体 内的生物保留时间较长。
[0041] 此外，本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法所用原料价 格低廉、反应条件温和，易于操作，适合大批量生产。
[0042] 本发明提供了一种脂质体造影剂，以脂质体为载体，所述脂质体包括上述技术方 案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或上述技术方案所述的方法制备得到的磷 脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。
[0043] 本发明提供的脂质体造影剂中脂质体包括上述技术方案所述的磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物，这种脂质体造影剂可以避免在体内快速被免疫系统清除，具有 较长的生物保留时间。此外，本发明提供的脂质体造影剂以脂质体为载体，其安全性更高， 具有较好的肿瘤及器官的靶向性。另外，本发明提供的脂质体造影剂中可以负载成像原理 不同的造影试剂，能够扩大影像学检查范围，提高诊断水平。实验结果表明，采用本发明提 供的脂质体造影剂对小鼠肿瘤部位进行成像，在24小时~48小时之间均有较好的成像效 果。
[0044] 本发明提供了一种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以脂质体为载体，所述脂质体包 括上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或上述技术方案所述的方法 制备得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。
[0045] 优选的，所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物包括抗肿瘤药物和脂质体造影剂；所述 脂质体造影剂为上述技术方案所述的脂质体造影剂。
[0046] 本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物以上述技术方案所述的含有磷脂酰乙 醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的脂质体为载体，这种脂质体载体具有较低的免疫原性，在体 内的保留时间较长，使本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物具有较好的治疗效果。实 验结果表明，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在磷酸盐缓冲液环境中150小时 的释放量为70%~80% ;在含有血清白蛋白的磷酸盐缓冲液环境中150小时的释放量为 80%~90%。
【附图说明】
[0047] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图获得其他的附图。
[0048] 图1为本发明实施例1制备磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的合成路线图；
[0049] 图2为本发明实施例2制备磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的合成路线图；
[0050] 图3为本发明实施例3和实施例7制备得到的脂质体造影剂的尺寸稳定性测试结 果；
[0051] 图4为本发明实施例8制备得到的脂质体造影剂的动态光散射（DLS)测试结果；
[0052] 图5为本发明实施例9制备得到的脂质体造影剂的透射电子显微镜图片；
[0053] 图6为本发明实施例9制备得到的脂质体造影剂造影小鼠体内肿瘤细胞的成像图 片；
[0054] 图7为本发明实施例12制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放曲 线；
[0055] 图8为本发明实施例13制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放曲线。
【具体实施方式】
[0056] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0057] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式11-1、式 II-2或式II-3所示的结构：
[0058]
[0059] 其中，R为酰基；η为20~200 ;m为1~10 ;i为0或1。
[0060] 在本发明的实施例中，所述R为式101或式102中的一种：
[0061]
[0062] 式101中，RdP R 2独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的條径基；
[0063] 式102中，&和R 4独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的烯烃基。
[0064] 在其他的实施例中，所述R为式201~式211中的一种：
[0065]
[0066]
[0067] 在本发明的实施例中，所述η为50~150, m为1~10 ;在其他的实施例中，所述 η为80~120, m为1~10。在本发明的实施例中，所述m为1或2。
[0068] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式I_a或式 IIA-1-a所示的结构：
[0069]
[0070] 在本发明的优选实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物为二臂分支 型磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，这种分支型的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生 物相比于线型的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有更好的尺寸稳定性，作为脂 质体 使用在体内的保留时间更长。
[0071] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0072] 在缩合剂的作用下，将α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物进行活化，得到羟基聚 乙二醇活化酯；
[0073] 将所述羟基聚乙二醇活化酯和磷脂酰乙醇胺进行偶合反应，得到磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物；所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式ΙΙΑ-1、式 ΙΙΑ-2或式ΙΙΑ-3所示的结构：
[0074]
[0075] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200。
[0076] 在本发明中，所述α -羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物具有式IIIA-I~IIIA-3所
示的结构：
[0077]
[0078] 其中，η 为 20 ~200 ;m 为 1 ~10。
[0079] 在本发明的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式ΠΙΑ-1-a
所示的结构：
[0080]
[0081] 在本发明的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二醇的分子 量为 1000 Da ~20000Da ;优选为 2000Da ~1000 ODa ;更优选为 2000Da、4000Da、6000Da 或 8000Da〇
[0082] 在本发明的实施例中，式IIIA-I~式IIIA-3中的η为20~200 ;在其他的实施例 中，式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3中的η为50~150 ;在另外的实施例中，式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3 中的η为80~120。在本发明的优选实施例中，式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3中的m为1、2、3或 4〇
[0083] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（DPPE)、 二油脂酰基磷酰乙醇胺（DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE)、二月桂酰基磷脂酰乙 醇胺（DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺（DMPE)、1，3-二棕榈酰-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-DPPE)、1，3-二油脂酰-甘油-2-磷酸乙醇胺（1，3-D0PE)、二植烧酰基磷脂酰乙醇 胺（DPyPE)、二芥酰基磷脂酰乙醇胺（DEPE)、二亚麻酰基磷脂酰乙醇胺（DLoPE)或1-棕榈 酰-2-油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPPE);优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰基磷脂 酰乙醇胺。
[0084] 在本发明的实施例中，所述缩合剂为N，N-二环己基碳二亚胺（DCC)和N-羟基琥 珀酰亚胺（NHS) ;1_乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳化二胺基盐酸盐（EDC)和N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS) ;N，N-二环己基碳二亚胺（DCC)和1-羟基苯并三氮唑（HOBT);或1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳化二胺基盐酸盐（EDC)和2- (7-偶氮苯并三氮唑）-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基 脲六氟磷酸酯（HATU)。在本发明的优选实施例中，所述缩合剂为N，N-二环己基碳二亚胺和 N-羟基琥珀酰亚胺。
[0085] 在本发明的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物、磷脂酰乙醇胺和 缩合剂的摩尔比为I: (1~1. 5) : (1~2);在其他的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚 乙二醇衍生物、磷脂酰乙醇胺和缩合剂的摩尔比为I: (I. 1~1. 3) : (1. 2~1. 5)。
[0086] 在本发明的实施例中，所述偶合反应的温度为20°C~30°C;在其他的实施例中，所 述偶合反应的温度为25°C。在本发明的是实例中，所述偶合反应的时间为18小时~24小 时；在其他的实施例中，所述偶合反应的时间为20小时。
[0087] 在本发明的实施例中，可以在溶剂中进行所述偶合反应。在本发明的实施例中，所 述溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺；优选为四氢呋喃或二氯 甲烷。
[0088] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0089] 将α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应，得到磷脂酰乙醇 胺羟基聚乙二醇；
[0090] 在还原剂的作用下，将所述磷脂酰乙醇胺羟基聚乙二醇进行还原反应，得到具有 式I或式IIB-I~ΙΙΒ-3所示结构的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物：
[0091]
[0092] 其中，R为酰基；η为20~200 ;m为1~10。
[0093] 在本发明中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV或式IIIB-I~ ΙΙΙΒ-3所示的结构：
[0094]
[0095]
[0096] 其中，η 为 20 ~200 ;m 为 1 ~10。
[0097] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV-a所示 的结构：
[0098]
[0099] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二醇的分子 量为 1000 Da ~20000Da ;优选为 2000Da ~1000 ODa ;更优选为 2000Da、4000Da、6000Da 或 8000Da〇
[0100] 在本发明的实施例中，式IV和IIIB-I~IIIB-3中的η为20~200 ;在其他的实施 例中，式IV和IIIB-I~ΙΙΙΒ-3中的η为50~150 ;在另外的实施例中，式IV和IIIB-I~ ΙΙΙΒ-3中的η为80~120。在本发明的优选实施例中，式IV和IIIB-I~ΙΙΙΒ-3中的m 为2、3或4。
[0101] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺的种类和上述技术方案所述磷脂酰乙醇胺的种类 一致，在此不再赘述。
[0102] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺的 摩尔比为1:(1~1.5);在其他的实施例中，所述α-醛基-ε-羟基聚乙二醇衍生物和磷 脂酰乙醇胺的摩尔比为1:1. 2。
[0103] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反 应的pH值为5~7. 4 ;优选为5。在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍 生物和磷脂酰乙醇胺反应的温度为20°C~30°C;在其他的实施例中，所述α -醛基-ε -羟 基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反应的温度为25°C。在本发明的实施例中，所述α-醛 基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反应的时间为2小时~20小时；在其他的实 施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反应的时间为6小时~10 小时。
[0104] 在本发明的实施例中，所述还原剂为氰基硼氢化钠或硼氢化钠；优选为氰基硼氢 化钠。在本发明的实施例中，所述还原反应的时间为5小时~20小时；优选为5小时~8 小时。
[0105] 本发明提供了一种脂质体造影剂，以脂质体为载体，所述脂质体包括上述技术方 案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或上述技术方案所述的方法制备得到的磷 脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂由上述技术 方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试剂、中性磷脂和胆固醇制备得到。
[0106] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物与上述技术方案所述磷脂 酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物一致，在此不再赘述。
[0107] 在本发明的实施例中，所述造影试剂为CT造影试剂、MRI造影试剂和FMT造影试 剂中的一种或几种；优选为CT造影试剂、MRI造影试剂和FMT造影试剂中的几种。本发明 优选含有上述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的脂质体来担载成像原理不同的造影 试剂，以扩展影像学检测的范围，提高诊断水平，如同时担载CT造影试剂和MRI造影试剂， CT用来扫描大体的体内结构，例如脑、胸、腹部、盆腔、四肢（骨头和软组织）、颈部等，而MRI 则用来分析软组织，例如某些特定疾病的脑组织、脊柱（脊髓）、四肢关节（主要看关节软组 织）、体内脏器的肿瘤；综合CT和MRI增强扫描的结果能够为医生对复杂病情的诊断提供 更加准确的科学依据，有利于实现对病变的早发现，早治疗的目的。
[0108] 在本发明中，所述CT造影试剂为X射线计算机断层扫描成像造影试剂；所述MRI 造影试剂为磁共振成像造影试剂；所述FMT造影试剂为荧光分子断层扫描成像造影试剂。
[0109] 在本发明的实施例中，所述CT造影试剂为非离子型碘盐类造影试剂，如碘帕醇、 碘海醇、碘普罗胺、碘佛醇和碘克沙醇中的一种或几种；优选为碘海醇、碘普罗胺、碘佛醇和 碘克沙醇中的一种或几种。
[0110] 在本发明的实施例中，所述MRI造影试剂可以为钆双胺（Gd-DTPA-BM)、钆贝葡胺 (Gd-BOPTA)、钆喷酸葡胺（Gd-DTPA)、钆特酸葡甲胺（Gd-DOTA)、钆特醇（Gd-HP-D03A)、钆塞 酸二钠盐（Gd-EOB-DTPA)、钆磷维塞三钠和钆布醇等一种或多种；优选为钆喷酸葡胺和钆 特醇中的一种或两种。
[0111] 在本发明的实施例中，所述FMT造影试剂选自磺酰罗丹明B、吲哚菁绿、异硫氰酸 荧光素、花氰染料5、碘化丙啶（PI)、SYT016、花菁类Cy3和花菁类Cy5中的一种或几种。
[0112] 在本发明的实施例中，所述中性磷脂包括1，2-二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC)和 1，2-二棕榈酰基磷脂酰胆碱（DPPC)中的一种或两种。
[0113] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆 固醇的质量比为（4~20) : (50~70) : (15~25)。在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二醇的分子量为2000Da时，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙 二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇的质量比为（15~20) : (50~70) : (15~25)。在本发明 的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇中聚乙二醇衍生物的分子量为4000Da时， 所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇的质量比为（7~14) : (50~ 70) : (15~25)。在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二 醇的分子量为6000Da时，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇的 质量比为（4~10) : (50~70) : (15~25)。在本发明的实施例中，所述中性磷脂和胆固醇 的用量配比为（2~4) :1。
[0114] 在本发明的实施例中，所述造影试剂在所述脂质体造影剂中的质量含量为 0. 02mg/mL~100mg/mL。在本发明的实施例中，当所述造影试剂为CT造影试剂时，所述造影 试剂在所述脂质体造影剂中的质量含量为30mg/mL~100mg/mL，优选为50mg/mL~75mg/ mL。在本发明的实施例中，当所述造影试剂为MRI造影试剂时，所述造影试剂在所述脂质体 造影剂中的质量含量为lmg/mL~10mg/mL，优选为2mg/mL~6mg/mL。在本发明的实施例 中，当所述造影试剂为FMT造影试剂时，所述造影试剂在所述脂质体造影剂中的质量含量 为 0· 02mg/mL ~8mg/mL，优选为 0· lmg/mL ~3mg/mL。
[0115] 在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂的粒径为50nm~200nm ;优选为60nm、 80nm 或 lOOnm。
[0116] 在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂的制备方法为：
[0117] 将上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇 在醇类化合物中溶解，得到溶解液；
[0118] 将造影试剂和所述溶解液混合，得到脂质体囊泡；
[0119] 将所述脂质体囊泡进行挤出造粒，得到造影剂。
[0120] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂、胆固醇和造影 试剂的种类和用量与上述技术方案所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂、 胆 固醇和造影试剂的种类和用量一致，在此不再赘述。
[0121] 在本发明的实施例中，所述醇类化合物为碳原子数为1~5的醇类化合物；优选为 乙醇。在本发明的实施例中，所述造影试剂既可以为造影试剂的水溶液也可以为固体造影 试剂。在本发明的实施例中，可以向所述溶解液中加入造影试剂的水溶液进行混合，得到脂 质体囊泡。在本发明的实施例中，可以在超声的作用下将造影试剂和所述溶解液进行混合。 在本发明的实施例中，所述超声的时间可以为〇. 5小时~3小时；优选为1小时。
[0122] 在本发明的实施例中，所述挤出造粒的设备可以为高压膜挤出机。在本发明的实 施例中，所述挤出造粒过程中采用的聚酯膜的孔径为80nm~200nm ;在其他的实施例中， 所述挤出造粒过程中采用的聚酯膜的孔径为IOOnm~150nm。本发明实施提供的方法制备 得到的脂质体造影剂的粒度与上述技术方案所述的脂质体造影剂的粒度一致，在此不再赘 述。
[0123] 在本发明的实施例中，得到脂质体造影剂后可以将所述脂质体造影剂反复进行浓 缩，以去除脂质体造影剂中游离的造影试剂，得到所需浓度的脂质体造影剂后保存备用。在 本发明的实施例中，所述浓缩采用的超滤膜的截留分子量为100000。在本发明的实施例中， 所述浓缩采用的浓缩液为磷酸盐缓冲液。在本发明的实施例中，所述浓缩的次数为5次~ 20次，优选为10次。在本发明的实施例中，所述造影剂的保存温度为2°C~8°C。
[0124] 本发明实施例提供的脂质体造影剂的制备方法操作方便，所需的制备时间远小于 单一薄膜挤出法制备造影剂，适用于大规模连续生产。
[0125] 本发明可以采用含有磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的脂质体直接负载抗 肿瘤药物，制备得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物；这种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在体内 的保存时间长、治疗效果好；在本发明的优选实施例中，可以在制备肿瘤的脂质体诊疗药物 中同时负载抗肿瘤药物和造影剂，这种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物可以同时对肿瘤进行诊 断和治疗。
[0126] 本发明提供了一种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以脂质体为载体，所述脂质体包 括上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，或上述技术方案所述的方法 制备得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。在本发明的实施例中，所述治疗肿瘤的 脂质体诊疗药物由上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、脂质和抗肿 瘤药物制备得到；所述脂质优选为阳离子脂质。在本发明的优选实施例中，所述治疗肿瘤的 脂质体诊疗药物可以由上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试 剂、中性磷脂、胆固醇、阳离子脂质和抗肿瘤药物制备得到。本发明提供的治疗肿瘤的脂质 体诊疗药物优选同时含有脂质体造影剂和抗肿瘤药物，这种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物能 够实现造影动态跟踪和治疗肿瘤的双重效果。
[0127] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试剂和中性磷脂与 上述技术方案所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试剂和中性磷脂一致，在此 不再赘述。
[0128] 在本发明的实施例中，所述阳离子脂质可以为氯化三甲基_2, 3-二油酰氧基丙基 铵（DOTAP)、氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA)、三氟乙酸二甲基-2, 3-二油烯 氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基）乙基按（DOSPA)、溴化二甲基_2_轻乙基-2, 3-二油酰 氧基丙基铵（DORI)、溴化二甲基-2-羟乙基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DORIE)、溴化二甲 基_3_轻丙基_2, 3_二油條氧基丙基按（DORIE-HP)、漠化二甲基_4_轻丁基_2, 3_二油條 氧基丙基铵（DORIE-HB)、溴化二甲基-5-羟戊基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DORIE-HPc)、溴 化二甲基-2-羟乙基-2, 3-双十六烷氧基丙基铵（DPRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2, 3-双 十八烷氧基丙基铵（DSRIE)或溴化二甲基-2-羟乙基-2, 3-双十四烷氧基丙基铵（DMRIE); 优选为氯化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP)或氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基 铵（DOTMA)〇
[0129] 在本发明的实施例中，所述抗肿瘤药物包括水溶性抗肿瘤药物和脂溶性抗肿瘤药 物中的一种或几种。在本发明的实施例中，所述水溶性抗肿瘤药物包括盐酸多柔比星、长春 新碱、顺铂、卡铂、柔红霉素、丝裂霉素 C和博莱霉素 A5等的一种或几种。在本发明的实施 例中，所述脂溶性抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、依托泊苷、索拉非尼和甲苯磺酸索 拉非尼中的一种或几种。
[0130] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物和阳离子脂质的 质量比为（4~20) : (5~12)。在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇 衍生物、中性磷脂、胆固醇和阳离子脂质的质量比为（4~20) : (50~70) : (15~25) : (5~ 12) 〇
[0131] 在本发明中的实施例中，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中的质量 含量为lmg/mL~80mg/L。在本发明的实施例中，当所述抗肿瘤药物为水溶性抗肿瘤药物 时，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤药物种类的质量含量为lmg/mL~25mg/L ;在其他的实施例 中，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中的质量含量为2mg/mL~10mg/L。在本 发明的实施例中，当所述抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物时，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物中的质量含量为2mg/mL~80mg/L ;在其他的实施例中，所述抗肿瘤药物 在治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中的质量含量为4mg/mL~25mg/L。
[0132] 本发明对所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的制备方法没有特殊的限制，采用本领 域技术人员熟知的制备治疗肿瘤的药物的技术方案制备得到即可。在本发明的实施例中， 当所述抗肿瘤药物为水溶性抗肿瘤药物时，所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的制备方法 为：
[0133] 将中性磷脂、阳离子脂质、磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物和胆固醇在醇类 化合物中溶解，得到溶解溶液；
[0134] 将水性抗肿瘤药物和造影试剂混合，得到混合药剂；
[0135] 将所述溶解溶液和混合药剂混合，得到中间产物；
[0136] 将所述中间产物进行挤出造粒，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
[0137] 在本发明的实施例中，所述中性磷脂、阳离子脂质、羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 衍生物、胆固醇和水溶性抗肿瘤药物的质量比为（45~60) : (5~12) : (4~20) : (15~ 25) : (3 ~19) 〇
[0138] 在本发明中，所述醇类化合物与上述技术方案所述的醇类化合物一致，在此不再 赘述。在本发明的实施例中，所述醇类化合物在所述溶解溶液中的质量含量为5%~20%。 在本发明的实施例中，中性磷脂、阳离子脂质、羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺衍生物和胆固 醇在醇类化合物中溶解的温度为65°C~75°C ;在其他的实施例中，中性磷脂、阳离子脂质、 羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺衍生物和胆固醇在醇类化合物中溶解的温度为70°C。在本发 明的实施例中，中性磷脂、阳离子脂质、羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺衍生物和胆固醇在醇 类化合物中溶解的设备为涡流振动仪。
[0139] 在本发明的实施例中，所述造影试剂为碘普罗胺和钆喷酸葡胺。在本发明的实施 例中，所述碘普罗胺和钆喷酸葡胺的体积比为（3. 5~4. 5) :1 ;在其他的实施例中，所述碘 普罗胺和钆喷酸葡胺的体积比为4:1。在本发明的实施例中，水性抗肿瘤药物和造影试剂 混合的温度为45°C~55°C ;在其他的实施例中，水性抗肿瘤药物和造影试剂混合的温度为 50°C。在本发明的实施例中，水性抗肿瘤药物和造影试剂混合的设备为涡流振动仪。
[0140] 在本发明的实施例中，所述混合药剂和溶解溶液混合的温度为65°C~75°C ;在其 他的实施例中，所述混合药剂和溶解溶液混合的温度为70°C。在本发明的实施例中，所述混 合药剂和溶解溶液混合的设备为涡流振动仪。
[0141] 在本发明中，所述挤出造粒的方法与上述技术方案所述的挤出造粒的方法一致， 在此不再赘述。
[0142] 在本发明的实施例中，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物后，可以将治疗肿瘤的脂 质体诊疗药物反复浓缩，以去除其中残留的造影试剂和抗肿瘤药物，得到所需浓度的治疗 肿瘤的脂质体诊疗药物；将所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在2°C~8°C下保存。在本发明 中，所述浓缩的方法与上述技术方案所述浓缩的方法一致，在此不再赘述。
[0143] 在本发明的实施例中，当所述抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物时，所述治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物的制备方法为：
[0144] 将脂溶性抗肿瘤药物、磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂、阳离子脂 质和胆固醇溶解于有机溶剂中，得到混合液；
[0145] 将所述混合液进行蒸发处理，去除其中的有机溶剂，得到薄膜；
[0146] 将所述薄膜和造影试剂混合后挤出造粒，得到治疗肿瘤的药物。
[0147] 在本发明的实施例中，所述脂溶性抗肿瘤药物、磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二 醇衍生物、中性磷脂、阳离子脂质和胆固醇的质量比为（5~20): (45~60): (5~ 12) :(4-20): (15~25)。在本发明的实施例中，所述有机溶剂为三氯甲烷和甲醇。在本发 明的实施例中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为（1~4) : 1。在本发明的实施例中，所述混 合液的浓度为lmg/mL~10mg/mL。
[0148] 在本发明的实施例中，将所述混和液进行蒸发处理之前，可以将所述混合液置于 30°C~50°C的恒温水浴中。在本发明的实施例中，所述蒸发处理的方法为真空旋转蒸发。 在本发明的实施例中，得到薄膜后可以将所述薄膜进行干燥，进一步去除所述薄膜中的有 机溶剂。在本发明的实施例中，所述干燥的设备为真空干燥箱。在本发明的实施例中，所述 干燥的温度为20°C~30°C。在本发明的实施例中，所述干燥的时间为20小时~30小时。
[0149] 在本发明中，所述造影试剂与上述技术方案所述水性抗肿瘤药物中采用的造影试 剂一致，在此不再赘述。在本发明的实施例中，所述薄膜和造影试剂混合的温度为45°C~ 55°C ;在其他的实施例中，所述薄膜和造影试剂混合的温度为50°C。在本发明的实施例中， 所述薄膜和造影试剂混合的设备为涡轮振动仪。
[0150] 在本发明的实施例中，将所述薄膜和造影试剂混合后得到的物质进行挤出造粒的 设备为高压膜挤出仪。在本发明的实施例中，可以将所述薄膜和造影试剂混合后得到的物 质在挤出造粒的过程中先通过5次的200nm的聚酯膜，再通过5次的SOnm的聚酯膜进行挤 出造粒。在本发明的实施例中，制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的粒度为SOnm~ IOOnm0
[0151] 在本发明的实施例中，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物后，可以将所述治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物依次进行纯化、超滤和浓缩，得到所需浓度和体积的治疗肿瘤的脂质体 诊疗药物。在本发明的实施例中，所述纯化的柱子为葡聚糖G-25或葡聚糖G-50。在本发明 的实施例中，所述超滤的设备可以为超滤膜。在本发明的实施例中，所述浓缩的设备可以为 浓缩柱。
[0152] 在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中还包括 赋形剂，如山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖或海藻糖，将加入赋形剂的脂质体造影剂和治疗肿 瘤的脂质体诊疗药物经过冷冻干燥后可将所述脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药 物制备成粉针剂。在本发明的实施例中，所述粉针剂型的脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质 体诊疗药物可在4°C~8°C下长时间保存，可溶解于用于药物注射的药剂中，如5%的葡萄 糖溶液、生理盐水等。
[0153] 将本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物进行核磁共振检测，检测结 果为，本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式I或式Π -1~II-3所示 的结构。
[0154] 将本发明提供的脂质体造影剂用于 小鼠肿瘤部位的成像，具体为：
[0155] 将本发明提供的脂质体造影剂通过小鼠尾部静脉注射的方法注射到已有肿瘤的 小鼠体内；然后分别在〇小时、24小时、48小时对小鼠的肿瘤部位同时进行成像检测，检测 结果为，本发明提供的脂质体造影剂在注射完成后24~48小时之间，肿瘤部位仍然有很强 的成像信号，且显示出来非常好的肿瘤靶向性；由此可知，本发明提供的脂质体造影剂的免 疫原性较低，在体内的生物保留时间较长。
[0156] 将本发明提供的抗肿瘤的脂质体诊疗药物放入透析袋（5000MwC0)中封好，再把 透析袋放到IOOmL的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4,浓度0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气 摇床上，50r/min ;按照时间点，每次取样，同时补加 PBS ;取出的样品经过过滤后，用HPLC测 定样品中的抗肿瘤药物的浓度；测试本发明的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放量； 测试结果为，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在磷酸盐缓冲液环境中150小时的 释放量为70%~80% ;由此可知，本发明提供的治疗肿瘤的药物具有较好的尺寸稳定性以 及良好的缓释控制性能。
[0157] 将本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物放入透析袋（5000MwC0)中封好， 再把透析袋放到IOOmL的含有10 %的牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4,浓度 0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气摇床上，50r/min ;按照时间点，每次取样，同时补加 PBS，取出的样品经过过滤后，用二氯甲烷萃取3次，除去二氯甲烷后，用乙醇溶解；用HPLC 测定样品中的抗肿瘤药物的浓度，测试本发明提供的治疗肿瘤的药物的体外释放量；测试 结果为，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在含有血清白蛋白的磷酸盐缓冲液环境 中150小时的释放量为80%~90% ;由此可知，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物 具有较低的免疫原性，不会被血清白蛋白快速清除；同时还具有较好的尺寸稳定性以及良 好的缓释控制性能。
[0158] 本发明以下实施例所用到的原料均为市售商品。
[0159] 实施例1二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的合成
[0160] 按照图1所示的合成路线图制备二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生 物：
[0161] 在200mL的圆底烧瓶中加入10. 4g的线型的α -丙醛-ε -羟基聚乙二醇 (HO-(CH2CH2O) 44-(CH2) 2CH0)和4. 43g的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，然后加入IOOmUpH值为 5. 4的磷酸盐缓冲溶液（PBS)，在搅拌的条件下进行6小时的反应；
[0162] 所述反应结束后，向得到的反应产物中加入2g的氰基硼氢化钠，在25°C下进行7 小时的反应；
[0163] 所述反应结果后，向得到的反应溶液中加入饱和的氯化铵溶液，然后用二氯甲烷 萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸镁干燥，再过滤，浓缩滤液，再将浓缩后的滤液滴加到 IOOmL的乙醚中，得到13. 2g的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，将所述二 硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物真空干燥后在_20°C中保存待用；二硬脂酰 基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的产率为93%。
[0164] 将本发明实施例1制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物进 行核磁共振检测，检测结果为：
[0165] 1H NMR (400MHz，CDCl3) ( δ ppm):
[0166] 5· 18 (CH2-CH-CH2)，4· 05 (O-CH-CH2-O)，3· 86-3. 25 (PEG, OP-OCH2, -NHCH2CH2CH2)，3· 11-2. 95 (OP-OCH2, OP-OCH2CH2NH)，2· 85 (-NHCH2CH2CH2)，L 75 (-NHCH2CH2CH2)，2· 30 ((CH2-CO) 2 ),L 58 (-CH2-CH2-CO-), 1. 35-1. 19 (((CH2) 14) 2), 0. 9 (CH3-)
[0167] 由以上检测结果可知，本发明实施例1制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟 基聚乙二醇衍生物具有式I-a所示的结构：
[0168]
[0169] 式 I-a 中，η 为 44。
[0170] 实施例2二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物的合成
[0171] 按照图2所示的合成路线图制备二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍 生物：
[0172] 在200mL的圆底烧瓶内加入27. 4g的双臂羟基聚乙二醇（(HO-PEG2k)2-COOH)，然后 加入50mL的四氢呋喃并搅拌直到双臂羟基聚乙二醇完全溶解；分别称取I. 37g的N，N-二 环己基碳二亚胺和0. 77g的氮羟基琥珀酰亚胺（NHS)，并先后加入到圆底烧瓶内，在25°C下 反应18小时，得到反应溶液；过滤除去所述反应溶液中的沉淀后，将得到的滤液浓缩，除去 其中的四氢呋喃；再将浓缩后的产物滴加到IOOmL的乙醚中，得到30. 2g的双臂聚乙二醇羧 酸活化酯（(HO-PEG2k)2-NHS)，将所述双臂聚乙二醇羧酸活化酯真空干燥，并在-20度中保 存待用；所述双臂聚乙二醇羧酸活化酯产率为93%。
[0173] 在IOOmL的圆底烧瓶内，将I. 77g的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺加入其中，同时加 入50mL的二氯甲烷将其溶解，将IOg的上述双臂聚乙二醇羧酸活化酯加入到烧瓶内，并在 25°C下反应6小时；将得到的反应溶液浓缩至10mL，然后倒入IOOmL的乙醚中，得到8. 9g 的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物，将所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物真空干燥并在-20度下保存；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物的产率为76%。
[0174] 将本发明实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生 物进行核磁共振检测，检测结果为：
[0175] 1H NMR (400MHz，CDCl3) ( δ ppm):
[0176] 5· 18 (CH2-CH-CH2)，4· 05 (O-CH-CH2-O)，3· 86-3. 25 (PEG, O-CH2-CH2-N, N-CH2-CO, OP -OCH2)，3· 11 (OP-OCH2)，2· 81 (O-CH2-CH2-N)，2· 30 ((CH2-CO)2)，I. 58 (-CH2-CH2-CO-)，I. 35-1 ? 19 (((CH2)J2), 0.9 (CH3-)
[0177] 由以上检测结果可知，本发明实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双 臂羟基聚乙二醇衍生物具有式ΠΑ-1-a所示的结构：
[0178]
[0179] 式 IIA-1-a 中，η 为 44。
[0180] 实施例3~实施例6
[0181] 按照表1中的原料用量制备得到脂质体造影剂，表1为本发明实施例3~实施例 6制备脂质体造影剂的原料用量：
[0182] 将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC)、胆固醇和实施例1制备得到的二硬脂酰基磷脂酰 乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物（DSPE-(PEG 2k-OH))溶于15mL的乙醇的中搅拌，直到以上原 料均匀分散，得到混合溶液；
[0183] 将碘普罗胺和钆喷酸葡胺溶解在IOmL的注射用水中，然后加入到上述混合溶液 中，得到混合物；
[0184] 将所述混合物和甲醇溶液混合后用400W功率下的探头超声90次，超声过程中工 作5s，间歇5s，得到中间产物；
[0185] 将所述中间产物通过高压膜挤出仪反复通过孔径为SOnm的聚酯膜进行挤压，循 环5次，得到粒度为IOOnm粗产物；
[0186] 将所述粗产物在截留分子量为lOOOOOMwCO的超滤膜内浓缩后用PBS缓冲液稀释 至原体积，如此反复操作10次，去除其中游离的碘普罗胺及钆喷酸葡胺，得到脂质体造影 剂。
[0187] 表1本发明实施例3~实施例6制备脂质体造影剂的原料用量
[0188]
[0189] 实施例7~实施例10
[0190] 按照表2中的原料用量制备得到脂质体造影剂，表2为本发明实施例7~实施例 10制备脂质体造影剂的原料用量：
[0191] 将DPPC、胆固醇、实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二 醇（DSPE-(PEG 2k-OH)2)溶于15mL的乙醇中搅拌，直到以上原料均匀分散，得到混合溶液；
[0192] 将碘普罗胺和钆喷酸葡胺溶解在IOmL的注射用水中，然后加入到上述混合溶液 中，得到混合物；
[0193] 将所述混合物和甲醇溶液混合后用400W功率下探头超声90次，超声过程中工作 5s，间歇5s，得到中间产物；
[0194] 将所述中间产物通过高压膜挤出仪反复通过孔径为SOnm的聚酯膜进行挤压，循 环5次，得到直径为IOOnm粗产物；
[0195] 将所述粗产物在截留分子量为100000MWC0的超滤膜内浓缩后用PBS缓冲液稀释 至原体积，如此反复操作10次，去除未包裹的碘普罗胺及钆喷酸葡胺，得到脂质体造影剂。
[0196] 表2本发明实施例7~实施例10制备脂质体造影剂的原料用量
[0197]
[0198] 将本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂采用PBS溶液稀释30 倍，用动态激光散射仪器（DLS)测定造影剂的平均粒径、粒径稳定性和表面电荷，取造影剂 5mL，然后放置在25°C下保存；每隔一定时间取部分造影剂，然用DLS法测脂质体造影剂的 粒径，每种脂质体造影剂测3次，然后取平均值作为结果；测试结果如表3和图3~图5所 示，表3为本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂的物理参数；图3为本发 明实施例3和本发明实施例7制备得到的脂质体造影剂的尺寸稳定性测试结果；图4为本 发明实施例8制备得到的脂质体造影剂的动态光散射（DLS)测试结果；图5为本发明实施 例9制备的脂质体造影剂的透射电子显微镜图片。
[0199] 测试本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂中造影试剂的载药量 和包封率，钆喷酸葡胺包封率的测定方法为：
[0200] 取ImL的造影剂溶液，上样于Sephadex G-50凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，接收造 影剂的洗脱组分，再用蒸馏水定容至IOmL ;然后取ImL样品，用ICP法分析含量；
[0201] 碘普罗胺包封率的测定方法为：
[0202] 取ImL造影剂溶液，采用UPLC方法分析游离碘普罗胺的含量；
[0203] 碘普罗胺和钆喷酸葡胺的包封率和载药量可分别用下述公式计算：
[0204] 包封率=(W0-W游离）/W。X 100 % ;
[0205] 其中，Wci为起始脂质体造影剂质量;W _为透析液中脂质体造影剂质量；
[0206] 载药量=加入造影试剂的质量X包封率/[(加入造影剂的质量X包封率）+造 影剂质量]Xioo% ;
[0207] 测试结果如表3所示。
[0208] 表3本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂的物理参数
[0209]
[0210] 将实施例9制备得到的脂质体造影剂用于小鼠肿瘤部位的CT和MRI成像，具体 为：
[0211] 将本发明实施例9制备得到的脂质体造影剂通过小鼠尾部静脉注射的方法，按照 300mg (碘普罗胺）/kg (小鼠）、60mg (钆喷酸葡胺）/kg (小鼠）的剂量，将IOmL实施例9制 备得到的脂质体造影剂注射到已有肿瘤的小鼠体内；然后分别在〇小时、24小时、48小时对 小鼠的肿瘤部位同时进行CT和MRI成像检测，检测结果如图6所示，图6为本发明实施例9 制备得到的脂质体造影剂造影小鼠体内肿瘤细胞的成像图片，本发明实施例9提供的脂质 体造影剂在注射完成后24~48小时之间，肿瘤部位仍然有很强的CT和MRI信号，且显示 出来非 常好的肿瘤靶向性，而现有技术中的CT和MRI造影剂在小鼠体内的最佳成像的时间 不超过30分钟；由此可知，本发明实施例9提供的脂质体造影剂的免疫原性较低，在体内的 生物保留时间较长。
[0212] 实施例11
[0213] 将227mg的DPPC、82mg的胆固醇、42mg的实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰 乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物（DSPE-(PEG 2k-OH)2)溶于15mL的乙醇的中，搅拌直到完 全溶解，得到混合溶液；
[0214] 将230mg的碘普罗胺和3mg的吲哚菁绿溶解在IOmL的注射用水中，然后加入到上 述混合溶液中，得到混合物；
[0215] 将所述混合物在50°C下用400W功率下探头超声90次，超声的过程中工作5s，间 歇5s，得到中间产物；
[0216] 将所述中间产物加入到高压膜挤出仪经过5次的SOnm的聚酯膜循环挤压，得到 IOOnm的粗产物；
[0217] 将所述粗产物在截留分子量为100000MWC0的超滤膜内浓缩并用PBS缓冲液稀释 至原体积，如此反复操作10次，去除未包裹的碘普罗胺及吲哚菁绿，得到脂质体造影剂。
[0218] 实施例12
[0219] 将57. Img的DPPC、9. 9mg的氯化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵（DOTPA)、 12mg的实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物 (DSPE-(PEG 2k-OH)2和21mg的胆固醇溶解在20mL的乙醇中，直到全部溶解，得到混合溶液；
[0220] 将IOmg的盐酸多柔比星、23mg的碘普罗胺和5mg的钆喷酸葡胺分别溶解在IOmL 的注射水中混合；将得到的混合物质置于50°C的恒温水浴中，用涡轮振动仪振动至其充分 混合，得到混合物；
[0221] 将所述混合物转移至装有上述混合溶液的烧瓶内，将烧瓶浸入温度为70°C的恒温 水浴中，用涡轮振动仪振动烧瓶中的物质直到形成分散均匀的溶液，得到分散物；
[0222] 将所述分散物通过挤出仪，依次用孔径为200nm和SOnm的聚酯膜过滤各5次，得 到粒度为90nm的粗产物；
[0223] 将所述粗产物用截留分子量为100000MWC0的超滤膜进行浓缩后加入PBS稀释至 其起始浓度后再浓缩，如此反复10次，去除未包裹的盐酸多柔比星和碘普罗胺及钆喷酸葡 胺，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
[0224] 取ImL质量浓度为2mg/mL的本发明实施例12制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗 药物，用无水乙醇稀释至20mL后过滤，取上清液；以注射用水为对照，用紫外分光光度计测 定上清液在480nm波长处的紫外吸收值，计算上清液中的盐酸多柔比星的浓度，得出本发 明实施例12制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中包含抗肿瘤药物的含量，在与总的 加入的抗肿瘤药物量相比，得出抗肿瘤药物的包封率；计算结果为，本发明实施例12制备 得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中盐酸多柔比星的包封率为92. 5±0. 3%。
[0225] 取2mL质量浓度为2mg/mL的本发明实施例12制备得到的抗肿瘤的脂质体诊疗药 物，放入透析袋（5000MwC0)中封好，再把透析袋放到IOOmL的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4， 浓度0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气摇床上，50r/min ;按照时间点，每次取样2mL，同 时补加2mL的PBS ;取出的样品经过过滤后，用HPLC测定样品中的盐酸多柔比星的浓度；得 到的盐酸多柔比星体外释放曲线如图7所示，图7为本发明实施例12制备得到的治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物的体外释放曲线；从图中可以看出，本发明实施例12制备得到的治疗肿 瘤的脂质体诊疗药物具有较好的尺寸稳定性以及良好的缓释控制性能。
[0226] 实施例13
[0227] 将IOmg的多西紫杉醇、55mg的DPPC、9. 3mg的D0TPA、9. 5mg的实施例2制备得到 的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物DSPE-(PEG2K-〇H)jP 19mg的胆固 醇溶解在15mL的三氯甲烷和5mL甲醇组成的有机溶剂中，并搅拌2小时，使之溶解，得到溶 解溶液；
[0228] 将所述溶解溶液转移至与旋转蒸发器连接的烧瓶内，将烧瓶浸入温度为30°C的恒 温水浴中，然后抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，至烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；
[0229] 将形成有薄膜的烧瓶放入真空干燥箱中，在25°C下干燥24小时，进一步除去残留 的有机溶剂；
[0230] 将23mg的碘普罗胺和5mg的钆喷酸葡胺分别溶解在8mL和2mL的注射水中，然后 将得到的混合液加入上述形成有薄膜的烧瓶中；将所述烧瓶置于50°C的恒温水浴中，用涡 轮振动仪振动烧瓶中的物质至其充分混合，得到混合物；
[0231] 将所述混合物通过挤出仪，依次用孔径为200nm和SOnm的聚酯膜各过滤5次，得 到粒径为95nm的粗产物；
[0232] 将所述粗产物通过葡聚糖G-50柱子纯化，上样量控制在2 %的柱体积，以注射用 水为流动相，收集脂质体的组分，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
[0233] 取ImL本发明实施例13制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物置 于SepharoseG-50柱（30mmX 150mm)，以注射用水洗脱，收集含有治疗肿瘤脂质体 诊疗药物的组分，然后加入无水乙醇至体积为20mL;色谱检测条件为：Diamonsil C18(250mmX4. 6mm, 5 μπι)，流动相为甲醇-乙腈-水（体积比35 :40 :25)，流速为lmL/min， 紫外检查波长为230nm，进样量为20 μ L ;通过进样分析，计算已包封的多西紫杉醇量；计算 结果为，本发明实施例13制备得到的抗肿瘤的脂质体诊疗药物中多西紫杉醇的包封率为 90. 5±2· 1%〇
[0234] 取2mL的质量浓度为2mg/mL的本发明实施例13制备得到的治疗肿瘤的脂质体 诊疗药物，放入透析袋（5000MwC0)中封好，再把透析袋放到IOOmL的含有10%的牛血清白 蛋白的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4,浓度0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气摇床上，50r/ min ;按照时间点，每次取样2mL，同时补加2mL的PBS，取出的样品经过过滤后，用二氯甲烷 (2mL)萃取3次，除去二氯甲烷后，用乙醇（ImL)溶解；用HPLC测定样品中的多西紫杉醇的 浓度，得到的多西紫杉醇体外释放曲线如图8所示，图8为本发明实施例13制备得到的治 疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放曲线；由图可知，本发明实施例13制备得到的治疗肿 瘤的脂质体诊疗药物具有较低的免疫原性，不会被血清白蛋白快速清除；同时还具有较好 的尺寸稳定性以及良好的缓释控制性能。
[0235] 由以上实施例可知，本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具 有式I、式11-1、式II-2或式II-3所示的结构，其中，R为酰基；η为20~200 ;m为1~ 10 ;i为0或1。本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括： 将α-羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物进行活化后与磷脂酰乙醇胺进行偶合；或将α-醛 基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应后再还原。本发明提供了一种脂质 体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以上述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物为脂 质体载体的成分。本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物中含有羟基聚乙二 醇，这种末端为羟基的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有较低的免疫原性，能够避 免在体内被快速清除，在体内的生物保留时间较长。
【主权项】
1. 一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式π-l、式II-2或式II-3所 示的结构：其中，R为酰基； η 为 20 ~200 ; m为1~10 ; i为0或1。2. 根据权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，其特征在于，所述R为 式101或式102中的一种：式101中，&和1?2独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25的烯 径基； 式102中，馬和R 4独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25的烯 烃基。3.根据权利要求2所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，其特征在于，所述R为 式201~式211中的一种：4.根据权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，其特征在于，所述磷脂 酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的结构为式I-a或式IIA-1-a中的一种：5. -种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括： 在缩合剂的作用下，将α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物进行活化，得到羟基聚乙二 醇活化酯； 将所述羟基聚乙二醇活化酯和磷脂酰乙醇胺进行偶合反应，得到磷脂酰乙醇胺-羟基 聚乙二醇衍生物；所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的结构为式IIA-I~式ΙΙΑ-3 中的一种：其中，R为酰基； m为1~10 ; η 为 20 ~200 ; 所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3所示的结构：其中，m为1~10 ;η为20~200。6. -种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括： 将α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应，得到磷脂酰乙醇胺羟 基聚乙二醇； 在还原剂的作用下，将所述磷脂酰乙醇胺羟基聚乙二醇进行还原反应，得到具有式I 或IIB-I~式IIB-3所示结构的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物：其中，R为酰基； m为1~10 ; η 为 20 ~200 ; 所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV或IIIB-I~式ΙΙΙΒ-3所示的结 构：其中，η为20~200, m为1~10。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰基 磷脂酰乙醇胺、二油脂酰基磷酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇 胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、1，3-二棕榈酰-甘油-2-磷酸乙醇胺、1，3-二油脂酰-甘 油-2-磷酸乙醇胺、二植烷酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二亚麻酰基磷脂酰 乙醇胺或1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰乙醇胺。8. -种脂质体造影剂，以脂质体为载体，所述脂质体包括权利要求1~4中任意一项所 述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或权利要求5~7中任意一项所述的方法制备 得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。9. 一种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以脂质体为载体，所述脂质体包括为权利要求 1~4中任意一项所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或权利要求5~7中任意 一项所述的方法制备得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。10. 根据权利要求9所述的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，其特征在于，所述治疗肿瘤的 脂质体诊疗药物包括抗肿瘤药物和脂质体造影剂；所述脂质体造影剂为权利要求8所述的 脂质体造影剂。
【专利摘要】本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式II-1、式II-2或式II-3所示的结构。本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：将α-羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物进行活化后与磷脂酰乙醇胺进行偶合；或将α-醛基-ε-羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应后再还原。本发明提供了一种以磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物为成分的脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物末端为羟基，与磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇相比，这种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有较低的免疫原性，在体内的生物保留时间较长。式I式II-1式II-2式II-3。
【IPC分类】A61P35/00, C08G65/48, A61K47/34, C08G65/327, A61K9/127, C08G65/00, A61K49/00
【公开号】CN104892918
【申请号】CN201510288430
【发明人】吕常海
【申请人】吕常海
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂质体技术领域，尤其涉及一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物 及其制备方法、脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
【背景技术】
[0002] 癌症是危害人类健康的主要疾病之一，仅在我国每年大约有300万左右的新增癌 症病人，其中绝大多数在确诊的时候，已经进入了癌症的中晚期。因此对肿瘤、病变组织的 早期检测及诊断，是早期发现癌症并及时治疗的必要条件，早期诊断和治疗癌症既能够提 高对疾病的治疗效果，又能够为患者减轻痛苦、减少经济负担。
[0003] 自1976年后，核磁共振成像（MRI)技术被广泛的应用于现代医学诊断中，成为了 现代医学影像学的重要组成部分。与X射线计算机断层扫描（CT)等传统的影像检查相比， MRI具有非常明显的优势，如较高的空间分辨率、对软组织的良好对比度、无电离辐射伤害 等。然而MRI也有不足之处，如它的空间分辨率不及CT，带有心脏起搏器的患者或有某些金 属异物的部位不能作核磁共振的检查等。
[0004] CT是用计算机控制X射线源和探测器，使之环绕人体某一部位，利用人体组织密 度的差异而显现出的图像。虽然CT只能辨别出有密度差异的组织，对软组织的分辨率不 高，但是CT成像技术也有着自身的优势：首先，CT对平片检查较难显示的部分，例如同心、 大血管重叠病变的显示，更具有优越性；其次，CT对胸部疾病的诊断，随着高分辨率CT设备 的应用，日益显示出它的优越性；最后，随着科技的发展CT对心脏方面和血管方面的检查 具有重要意义。
[0005] 当人体内的某些组织、器官缺乏自然对比度时，为了提高这些组织和器官分辨率， 以便进一步显示某些较小的病变，可以通过人为的方法将一些物质引入器官内、组织内，使 疑难的病变得到及时的确诊。这些被引入的物质也就是我们通常所用的对比剂，也称造影 剂。理想的造影剂应具备如下条件：（1)有优良的显影效果；（2)水溶性好，渗透压和粘度应 当与血浆相近；（3)体内稳定性好，易于排除体外，不在体内积累；(4)无细胞毒性；(5)靶 向性好，能特异地被肿瘤细胞内化或结合在其细胞表面。目前所使用的CT和MRI的造影剂 由于化合物分子本身体积小，而缺少对肿瘤组织的靶向性，难以用于肿瘤的早期检测和诊 断；另外，这些造影剂还存在给药量大、显影时间短、对血管和中枢神经系统有毒副作用等 缺陷。
[0006] 脂质体是由无毒、可生物降解的类脂物质构成的双层囊泡或微球，其粒径范围在 几十到几百纳米，它能够聚集、担载各种药物，并改善所担载药物的溶解性和亲脂性能，降 低药物毒性，还有助于药物的靶向输送。以纳米脂质体作为载体的造影剂可以实现降低造 影剂用量、减少造影剂对人体的毒性、大大增加显影时间的优点，能够在肿瘤的治疗过程 中，对肿瘤组织的定期监测，了解其大小、形态变化，有助于为医生采取及时有效的治疗方 案提供科学依据。
[0007] 现有技术提供的脂质体一般为末端为甲氧基基团的聚乙二醇高分子，抗体对甲氧 基基团的亲和性较高，尤其是对含有多甲氧基的聚乙二醇修饰物，因此抗体对末端为甲氧 基基团的聚乙二醇脂质体的清除速度较快，导致这种含有甲氧基基团的脂质体在进入体内 后，在血液中的白蛋白等各种因素作用下，脂质体有引起不良免疫反应和被快速清除的风 险。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物及其 制备方法、脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟 基聚乙二醇衍生物末端为羟基，能够避免在体内被快速清除，在体内的生物保留时间较长。
[0009] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式11-1、式 II-2或式II-3所示的结构：
[0012] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200 ; i为0或1。
[0013] 优选的，所述R为式101或式102中的一种：
[0014]
[0015] 式101中，&和R 2独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的條径基；
[0016] 式102中，馬和R 4独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的烯烃基。
[0017] 优选的，所述R为式201~式211中的一种：
[0018]
[0019]
[0020] 优选的，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的结构为式I-a或式IIA-1-a 中的一种：
[0021]
[0022] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0023] 在缩合剂的作用下，将α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物进行活化，得到羟基聚 乙二醇活化酯；
[0024] 将所述羟基聚乙二醇活化酯和磷脂酰乙醇胺进行偶合反应，得到磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物；所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式IIA-I~式 ΙΙΑ-3所示的结构：
[0025]
[0026] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200 ;
[0027] 所述α-羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物具有式IIIA-I~式IIIA-3所示的结构：
[0029]其中，η 为 20 ~200 ;m 为 1 ~10。
[0030] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0031] 将α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应，得到磷脂酰乙醇 胺羟基聚乙二醇；
[0032] 在还原剂的作用下，将所述磷脂酰乙醇胺羟基聚乙二醇进行还原反应，得到具有 式I或式IIB-I~ΙΙΒ-3所示结构的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物：
[0035] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200 ;
[0036] 所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV或式IIIB-I~IIIB-3所示的 结构： L0038」 具中，m为1~10 ;η为20~200。
[0039] 优选的，所述磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油脂酰基磷酰乙醇 胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、 1，3-二棕榈酰-甘油-2-磷酸乙醇胺、1，3-二油脂酰-甘油-2-磷酸乙醇胺、二植烷酰基 磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二亚麻酰基磷脂酰乙醇胺或1-棕榈酰-2-油酰基 磷脂酰乙醇胺。
[0040] 本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物及提供的方法制备得到的磷 脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物中含有末端为羟基的聚乙二醇，这种磷脂酰乙醇胺-羟 基聚乙二醇衍生物作为脂质体具有较低的免疫原性，进入体内能够避免被快速清除，在体 内的生物保留时间较长。
[0041] 此外，本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法所用原料价 格低廉、反应条件温和，易于操作，适合大批量生产。
[0042] 本发明提供了一种脂质体造影剂，以脂质体为载体，所述脂质体包括上述技术方 案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或上述技术方案所述的方法制备得到的磷 脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。
[0043] 本发明提供的脂质体造影剂中脂质体包括上述技术方案所述的磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物，这种脂质体造影剂可以避免在体内快速被免疫系统清除，具有 较长的生物保留时间。此外，本发明提供的脂质体造影剂以脂质体为载体，其安全性更高， 具有较好的肿瘤及器官的靶向性。另外，本发明提供的脂质体造影剂中可以负载成像原理 不同的造影试剂，能够扩大影像学检查范围，提高诊断水平。实验结果表明，采用本发明提 供的脂质体造影剂对小鼠肿瘤部位进行成像，在24小时~48小时之间均有较好的成像效 果。
[0044] 本发明提供了一种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以脂质体为载体，所述脂质体包 括上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或上述技术方案所述的方法 制备得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。
[0045] 优选的，所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物包括抗肿瘤药物和脂质体造影剂；所述 脂质体造影剂为上述技术方案所述的脂质体造影剂。
[0046] 本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物以上述技术方案所述的含有磷脂酰乙 醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的脂质体为载体，这种脂质体载体具有较低的免疫原性，在体 内的保留时间较长，使本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物具有较好的治疗效果。实 验结果表明，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在磷酸盐缓冲液环境中150小时 的释放量为70%~80% ;在含有血清白蛋白的磷酸盐缓冲液环境中150小时的释放量为 80%~90%。
【附图说明】
[0047] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图获得其他的附图。
[0048] 图1为本发明实施例1制备磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的合成路线图；
[0049] 图2为本发明实施例2制备磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的合成路线图；
[0050] 图3为本发明实施例3和实施例7制备得到的脂质体造影剂的尺寸稳定性测试结 果；
[0051] 图4为本发明实施例8制备得到的脂质体造影剂的动态光散射（DLS)测试结果；
[0052] 图5为本发明实施例9制备得到的脂质体造影剂的透射电子显微镜图片；
[0053] 图6为本发明实施例9制备得到的脂质体造影剂造影小鼠体内肿瘤细胞的成像图 片；
[0054] 图7为本发明实施例12制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放曲 线；
[0055] 图8为本发明实施例13制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放曲线。
【具体实施方式】
[0056] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0057] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式11-1、式 II-2或式II-3所示的结构：
[0058]
[0059] 其中，R为酰基；η为20~200 ;m为1~10 ;i为0或1。
[0060] 在本发明的实施例中，所述R为式101或式102中的一种：
[0061]
[0062] 式101中，RdP R 2独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的條径基；
[0063] 式102中，&和R 4独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25 的烯烃基。
[0064] 在其他的实施例中，所述R为式201~式211中的一种：
[0065]
[0066]
[0067] 在本发明的实施例中，所述η为50~150, m为1~10 ;在其他的实施例中，所述 η为80~120, m为1~10。在本发明的实施例中，所述m为1或2。
[0068] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式I_a或式 IIA-1-a所示的结构：
[0069]
[0070] 在本发明的优选实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物为二臂分支 型磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，这种分支型的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生 物相比于线型的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有更好的尺寸稳定性，作为脂 质体 使用在体内的保留时间更长。
[0071] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0072] 在缩合剂的作用下，将α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物进行活化，得到羟基聚 乙二醇活化酯；
[0073] 将所述羟基聚乙二醇活化酯和磷脂酰乙醇胺进行偶合反应，得到磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物；所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式ΙΙΑ-1、式 ΙΙΑ-2或式ΙΙΑ-3所示的结构：
[0074]
[0075] 其中，R为酰基；m为1~10 ;n为20~200。
[0076] 在本发明中，所述α -羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物具有式IIIA-I~IIIA-3所
示的结构：
[0077]
[0078] 其中，η 为 20 ~200 ;m 为 1 ~10。
[0079] 在本发明的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式ΠΙΑ-1-a
所示的结构：
[0080]
[0081] 在本发明的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二醇的分子 量为 1000 Da ~20000Da ;优选为 2000Da ~1000 ODa ;更优选为 2000Da、4000Da、6000Da 或 8000Da〇
[0082] 在本发明的实施例中，式IIIA-I~式IIIA-3中的η为20~200 ;在其他的实施例 中，式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3中的η为50~150 ;在另外的实施例中，式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3 中的η为80~120。在本发明的优选实施例中，式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3中的m为1、2、3或 4〇
[0083] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（DPPE)、 二油脂酰基磷酰乙醇胺（DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE)、二月桂酰基磷脂酰乙 醇胺（DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺（DMPE)、1，3-二棕榈酰-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-DPPE)、1，3-二油脂酰-甘油-2-磷酸乙醇胺（1，3-D0PE)、二植烧酰基磷脂酰乙醇 胺（DPyPE)、二芥酰基磷脂酰乙醇胺（DEPE)、二亚麻酰基磷脂酰乙醇胺（DLoPE)或1-棕榈 酰-2-油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPPE);优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰基磷脂 酰乙醇胺。
[0084] 在本发明的实施例中，所述缩合剂为N，N-二环己基碳二亚胺（DCC)和N-羟基琥 珀酰亚胺（NHS) ;1_乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳化二胺基盐酸盐（EDC)和N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS) ;N，N-二环己基碳二亚胺（DCC)和1-羟基苯并三氮唑（HOBT);或1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳化二胺基盐酸盐（EDC)和2- (7-偶氮苯并三氮唑）-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基 脲六氟磷酸酯（HATU)。在本发明的优选实施例中，所述缩合剂为N，N-二环己基碳二亚胺和 N-羟基琥珀酰亚胺。
[0085] 在本发明的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物、磷脂酰乙醇胺和 缩合剂的摩尔比为I: (1~1. 5) : (1~2);在其他的实施例中，所述α -羧基-ε -羟基聚 乙二醇衍生物、磷脂酰乙醇胺和缩合剂的摩尔比为I: (I. 1~1. 3) : (1. 2~1. 5)。
[0086] 在本发明的实施例中，所述偶合反应的温度为20°C~30°C;在其他的实施例中，所 述偶合反应的温度为25°C。在本发明的是实例中，所述偶合反应的时间为18小时~24小 时；在其他的实施例中，所述偶合反应的时间为20小时。
[0087] 在本发明的实施例中，可以在溶剂中进行所述偶合反应。在本发明的实施例中，所 述溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺；优选为四氢呋喃或二氯 甲烷。
[0088] 本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：
[0089] 将α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应，得到磷脂酰乙醇 胺羟基聚乙二醇；
[0090] 在还原剂的作用下，将所述磷脂酰乙醇胺羟基聚乙二醇进行还原反应，得到具有 式I或式IIB-I~ΙΙΒ-3所示结构的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物：
[0091]
[0092] 其中，R为酰基；η为20~200 ;m为1~10。
[0093] 在本发明中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV或式IIIB-I~ ΙΙΙΒ-3所示的结构：
[0094]
[0095]
[0096] 其中，η 为 20 ~200 ;m 为 1 ~10。
[0097] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV-a所示 的结构：
[0098]
[0099] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二醇的分子 量为 1000 Da ~20000Da ;优选为 2000Da ~1000 ODa ;更优选为 2000Da、4000Da、6000Da 或 8000Da〇
[0100] 在本发明的实施例中，式IV和IIIB-I~IIIB-3中的η为20~200 ;在其他的实施 例中，式IV和IIIB-I~ΙΙΙΒ-3中的η为50~150 ;在另外的实施例中，式IV和IIIB-I~ ΙΙΙΒ-3中的η为80~120。在本发明的优选实施例中，式IV和IIIB-I~ΙΙΙΒ-3中的m 为2、3或4。
[0101] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺的种类和上述技术方案所述磷脂酰乙醇胺的种类 一致，在此不再赘述。
[0102] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺的 摩尔比为1:(1~1.5);在其他的实施例中，所述α-醛基-ε-羟基聚乙二醇衍生物和磷 脂酰乙醇胺的摩尔比为1:1. 2。
[0103] 在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反 应的pH值为5~7. 4 ;优选为5。在本发明的实施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍 生物和磷脂酰乙醇胺反应的温度为20°C~30°C;在其他的实施例中，所述α -醛基-ε -羟 基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反应的温度为25°C。在本发明的实施例中，所述α-醛 基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反应的时间为2小时~20小时；在其他的实 施例中，所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺反应的时间为6小时~10 小时。
[0104] 在本发明的实施例中，所述还原剂为氰基硼氢化钠或硼氢化钠；优选为氰基硼氢 化钠。在本发明的实施例中，所述还原反应的时间为5小时~20小时；优选为5小时~8 小时。
[0105] 本发明提供了一种脂质体造影剂，以脂质体为载体，所述脂质体包括上述技术方 案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或上述技术方案所述的方法制备得到的磷 脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂由上述技术 方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试剂、中性磷脂和胆固醇制备得到。
[0106] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物与上述技术方案所述磷脂 酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物一致，在此不再赘述。
[0107] 在本发明的实施例中，所述造影试剂为CT造影试剂、MRI造影试剂和FMT造影试 剂中的一种或几种；优选为CT造影试剂、MRI造影试剂和FMT造影试剂中的几种。本发明 优选含有上述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的脂质体来担载成像原理不同的造影 试剂，以扩展影像学检测的范围，提高诊断水平，如同时担载CT造影试剂和MRI造影试剂， CT用来扫描大体的体内结构，例如脑、胸、腹部、盆腔、四肢（骨头和软组织）、颈部等，而MRI 则用来分析软组织，例如某些特定疾病的脑组织、脊柱（脊髓）、四肢关节（主要看关节软组 织）、体内脏器的肿瘤；综合CT和MRI增强扫描的结果能够为医生对复杂病情的诊断提供 更加准确的科学依据，有利于实现对病变的早发现，早治疗的目的。
[0108] 在本发明中，所述CT造影试剂为X射线计算机断层扫描成像造影试剂；所述MRI 造影试剂为磁共振成像造影试剂；所述FMT造影试剂为荧光分子断层扫描成像造影试剂。
[0109] 在本发明的实施例中，所述CT造影试剂为非离子型碘盐类造影试剂，如碘帕醇、 碘海醇、碘普罗胺、碘佛醇和碘克沙醇中的一种或几种；优选为碘海醇、碘普罗胺、碘佛醇和 碘克沙醇中的一种或几种。
[0110] 在本发明的实施例中，所述MRI造影试剂可以为钆双胺（Gd-DTPA-BM)、钆贝葡胺 (Gd-BOPTA)、钆喷酸葡胺（Gd-DTPA)、钆特酸葡甲胺（Gd-DOTA)、钆特醇（Gd-HP-D03A)、钆塞 酸二钠盐（Gd-EOB-DTPA)、钆磷维塞三钠和钆布醇等一种或多种；优选为钆喷酸葡胺和钆 特醇中的一种或两种。
[0111] 在本发明的实施例中，所述FMT造影试剂选自磺酰罗丹明B、吲哚菁绿、异硫氰酸 荧光素、花氰染料5、碘化丙啶（PI)、SYT016、花菁类Cy3和花菁类Cy5中的一种或几种。
[0112] 在本发明的实施例中，所述中性磷脂包括1，2-二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC)和 1，2-二棕榈酰基磷脂酰胆碱（DPPC)中的一种或两种。
[0113] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆 固醇的质量比为（4~20) : (50~70) : (15~25)。在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇 胺-羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二醇的分子量为2000Da时，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙 二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇的质量比为（15~20) : (50~70) : (15~25)。在本发明 的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇中聚乙二醇衍生物的分子量为4000Da时， 所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇的质量比为（7~14) : (50~ 70) : (15~25)。在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物中聚乙二 醇的分子量为6000Da时，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇的 质量比为（4~10) : (50~70) : (15~25)。在本发明的实施例中，所述中性磷脂和胆固醇 的用量配比为（2~4) :1。
[0114] 在本发明的实施例中，所述造影试剂在所述脂质体造影剂中的质量含量为 0. 02mg/mL~100mg/mL。在本发明的实施例中，当所述造影试剂为CT造影试剂时，所述造影 试剂在所述脂质体造影剂中的质量含量为30mg/mL~100mg/mL，优选为50mg/mL~75mg/ mL。在本发明的实施例中，当所述造影试剂为MRI造影试剂时，所述造影试剂在所述脂质体 造影剂中的质量含量为lmg/mL~10mg/mL，优选为2mg/mL~6mg/mL。在本发明的实施例 中，当所述造影试剂为FMT造影试剂时，所述造影试剂在所述脂质体造影剂中的质量含量 为 0· 02mg/mL ~8mg/mL，优选为 0· lmg/mL ~3mg/mL。
[0115] 在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂的粒径为50nm~200nm ;优选为60nm、 80nm 或 lOOnm。
[0116] 在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂的制备方法为：
[0117] 将上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂和胆固醇 在醇类化合物中溶解，得到溶解液；
[0118] 将造影试剂和所述溶解液混合，得到脂质体囊泡；
[0119] 将所述脂质体囊泡进行挤出造粒，得到造影剂。
[0120] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂、胆固醇和造影 试剂的种类和用量与上述技术方案所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂、 胆 固醇和造影试剂的种类和用量一致，在此不再赘述。
[0121] 在本发明的实施例中，所述醇类化合物为碳原子数为1~5的醇类化合物；优选为 乙醇。在本发明的实施例中，所述造影试剂既可以为造影试剂的水溶液也可以为固体造影 试剂。在本发明的实施例中，可以向所述溶解液中加入造影试剂的水溶液进行混合，得到脂 质体囊泡。在本发明的实施例中，可以在超声的作用下将造影试剂和所述溶解液进行混合。 在本发明的实施例中，所述超声的时间可以为〇. 5小时~3小时；优选为1小时。
[0122] 在本发明的实施例中，所述挤出造粒的设备可以为高压膜挤出机。在本发明的实 施例中，所述挤出造粒过程中采用的聚酯膜的孔径为80nm~200nm ;在其他的实施例中， 所述挤出造粒过程中采用的聚酯膜的孔径为IOOnm~150nm。本发明实施提供的方法制备 得到的脂质体造影剂的粒度与上述技术方案所述的脂质体造影剂的粒度一致，在此不再赘 述。
[0123] 在本发明的实施例中，得到脂质体造影剂后可以将所述脂质体造影剂反复进行浓 缩，以去除脂质体造影剂中游离的造影试剂，得到所需浓度的脂质体造影剂后保存备用。在 本发明的实施例中，所述浓缩采用的超滤膜的截留分子量为100000。在本发明的实施例中， 所述浓缩采用的浓缩液为磷酸盐缓冲液。在本发明的实施例中，所述浓缩的次数为5次~ 20次，优选为10次。在本发明的实施例中，所述造影剂的保存温度为2°C~8°C。
[0124] 本发明实施例提供的脂质体造影剂的制备方法操作方便，所需的制备时间远小于 单一薄膜挤出法制备造影剂，适用于大规模连续生产。
[0125] 本发明可以采用含有磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的脂质体直接负载抗 肿瘤药物，制备得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物；这种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在体内 的保存时间长、治疗效果好；在本发明的优选实施例中，可以在制备肿瘤的脂质体诊疗药物 中同时负载抗肿瘤药物和造影剂，这种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物可以同时对肿瘤进行诊 断和治疗。
[0126] 本发明提供了一种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以脂质体为载体，所述脂质体包 括上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，或上述技术方案所述的方法 制备得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。在本发明的实施例中，所述治疗肿瘤的 脂质体诊疗药物由上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、脂质和抗肿 瘤药物制备得到；所述脂质优选为阳离子脂质。在本发明的优选实施例中，所述治疗肿瘤的 脂质体诊疗药物可以由上述技术方案所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试 剂、中性磷脂、胆固醇、阳离子脂质和抗肿瘤药物制备得到。本发明提供的治疗肿瘤的脂质 体诊疗药物优选同时含有脂质体造影剂和抗肿瘤药物，这种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物能 够实现造影动态跟踪和治疗肿瘤的双重效果。
[0127] 在本发明中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试剂和中性磷脂与 上述技术方案所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、造影试剂和中性磷脂一致，在此 不再赘述。
[0128] 在本发明的实施例中，所述阳离子脂质可以为氯化三甲基_2, 3-二油酰氧基丙基 铵（DOTAP)、氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA)、三氟乙酸二甲基-2, 3-二油烯 氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基）乙基按（DOSPA)、溴化二甲基_2_轻乙基-2, 3-二油酰 氧基丙基铵（DORI)、溴化二甲基-2-羟乙基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DORIE)、溴化二甲 基_3_轻丙基_2, 3_二油條氧基丙基按（DORIE-HP)、漠化二甲基_4_轻丁基_2, 3_二油條 氧基丙基铵（DORIE-HB)、溴化二甲基-5-羟戊基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DORIE-HPc)、溴 化二甲基-2-羟乙基-2, 3-双十六烷氧基丙基铵（DPRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2, 3-双 十八烷氧基丙基铵（DSRIE)或溴化二甲基-2-羟乙基-2, 3-双十四烷氧基丙基铵（DMRIE); 优选为氯化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP)或氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基 铵（DOTMA)〇
[0129] 在本发明的实施例中，所述抗肿瘤药物包括水溶性抗肿瘤药物和脂溶性抗肿瘤药 物中的一种或几种。在本发明的实施例中，所述水溶性抗肿瘤药物包括盐酸多柔比星、长春 新碱、顺铂、卡铂、柔红霉素、丝裂霉素 C和博莱霉素 A5等的一种或几种。在本发明的实施 例中，所述脂溶性抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、依托泊苷、索拉非尼和甲苯磺酸索 拉非尼中的一种或几种。
[0130] 在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物和阳离子脂质的 质量比为（4~20) : (5~12)。在本发明的实施例中，所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇 衍生物、中性磷脂、胆固醇和阳离子脂质的质量比为（4~20) : (50~70) : (15~25) : (5~ 12) 〇
[0131] 在本发明中的实施例中，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中的质量 含量为lmg/mL~80mg/L。在本发明的实施例中，当所述抗肿瘤药物为水溶性抗肿瘤药物 时，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤药物种类的质量含量为lmg/mL~25mg/L ;在其他的实施例 中，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中的质量含量为2mg/mL~10mg/L。在本 发明的实施例中，当所述抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物时，所述抗肿瘤药物在治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物中的质量含量为2mg/mL~80mg/L ;在其他的实施例中，所述抗肿瘤药物 在治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中的质量含量为4mg/mL~25mg/L。
[0132] 本发明对所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的制备方法没有特殊的限制，采用本领 域技术人员熟知的制备治疗肿瘤的药物的技术方案制备得到即可。在本发明的实施例中， 当所述抗肿瘤药物为水溶性抗肿瘤药物时，所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的制备方法 为：
[0133] 将中性磷脂、阳离子脂质、磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物和胆固醇在醇类 化合物中溶解，得到溶解溶液；
[0134] 将水性抗肿瘤药物和造影试剂混合，得到混合药剂；
[0135] 将所述溶解溶液和混合药剂混合，得到中间产物；
[0136] 将所述中间产物进行挤出造粒，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
[0137] 在本发明的实施例中，所述中性磷脂、阳离子脂质、羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 衍生物、胆固醇和水溶性抗肿瘤药物的质量比为（45~60) : (5~12) : (4~20) : (15~ 25) : (3 ~19) 〇
[0138] 在本发明中，所述醇类化合物与上述技术方案所述的醇类化合物一致，在此不再 赘述。在本发明的实施例中，所述醇类化合物在所述溶解溶液中的质量含量为5%~20%。 在本发明的实施例中，中性磷脂、阳离子脂质、羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺衍生物和胆固 醇在醇类化合物中溶解的温度为65°C~75°C ;在其他的实施例中，中性磷脂、阳离子脂质、 羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺衍生物和胆固醇在醇类化合物中溶解的温度为70°C。在本发 明的实施例中，中性磷脂、阳离子脂质、羟基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺衍生物和胆固醇在醇 类化合物中溶解的设备为涡流振动仪。
[0139] 在本发明的实施例中，所述造影试剂为碘普罗胺和钆喷酸葡胺。在本发明的实施 例中，所述碘普罗胺和钆喷酸葡胺的体积比为（3. 5~4. 5) :1 ;在其他的实施例中，所述碘 普罗胺和钆喷酸葡胺的体积比为4:1。在本发明的实施例中，水性抗肿瘤药物和造影试剂 混合的温度为45°C~55°C ;在其他的实施例中，水性抗肿瘤药物和造影试剂混合的温度为 50°C。在本发明的实施例中，水性抗肿瘤药物和造影试剂混合的设备为涡流振动仪。
[0140] 在本发明的实施例中，所述混合药剂和溶解溶液混合的温度为65°C~75°C ;在其 他的实施例中，所述混合药剂和溶解溶液混合的温度为70°C。在本发明的实施例中，所述混 合药剂和溶解溶液混合的设备为涡流振动仪。
[0141] 在本发明中，所述挤出造粒的方法与上述技术方案所述的挤出造粒的方法一致， 在此不再赘述。
[0142] 在本发明的实施例中，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物后，可以将治疗肿瘤的脂 质体诊疗药物反复浓缩，以去除其中残留的造影试剂和抗肿瘤药物，得到所需浓度的治疗 肿瘤的脂质体诊疗药物；将所述治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在2°C~8°C下保存。在本发明 中，所述浓缩的方法与上述技术方案所述浓缩的方法一致，在此不再赘述。
[0143] 在本发明的实施例中，当所述抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物时，所述治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物的制备方法为：
[0144] 将脂溶性抗肿瘤药物、磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物、中性磷脂、阳离子脂 质和胆固醇溶解于有机溶剂中，得到混合液；
[0145] 将所述混合液进行蒸发处理，去除其中的有机溶剂，得到薄膜；
[0146] 将所述薄膜和造影试剂混合后挤出造粒，得到治疗肿瘤的药物。
[0147] 在本发明的实施例中，所述脂溶性抗肿瘤药物、磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二 醇衍生物、中性磷脂、阳离子脂质和胆固醇的质量比为（5~20): (45~60): (5~ 12) :(4-20): (15~25)。在本发明的实施例中，所述有机溶剂为三氯甲烷和甲醇。在本发 明的实施例中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为（1~4) : 1。在本发明的实施例中，所述混 合液的浓度为lmg/mL~10mg/mL。
[0148] 在本发明的实施例中，将所述混和液进行蒸发处理之前，可以将所述混合液置于 30°C~50°C的恒温水浴中。在本发明的实施例中，所述蒸发处理的方法为真空旋转蒸发。 在本发明的实施例中，得到薄膜后可以将所述薄膜进行干燥，进一步去除所述薄膜中的有 机溶剂。在本发明的实施例中，所述干燥的设备为真空干燥箱。在本发明的实施例中，所述 干燥的温度为20°C~30°C。在本发明的实施例中，所述干燥的时间为20小时~30小时。
[0149] 在本发明中，所述造影试剂与上述技术方案所述水性抗肿瘤药物中采用的造影试 剂一致，在此不再赘述。在本发明的实施例中，所述薄膜和造影试剂混合的温度为45°C~ 55°C ;在其他的实施例中，所述薄膜和造影试剂混合的温度为50°C。在本发明的实施例中， 所述薄膜和造影试剂混合的设备为涡轮振动仪。
[0150] 在本发明的实施例中，将所述薄膜和造影试剂混合后得到的物质进行挤出造粒的 设备为高压膜挤出仪。在本发明的实施例中，可以将所述薄膜和造影试剂混合后得到的物 质在挤出造粒的过程中先通过5次的200nm的聚酯膜，再通过5次的SOnm的聚酯膜进行挤 出造粒。在本发明的实施例中，制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的粒度为SOnm~ IOOnm0
[0151] 在本发明的实施例中，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物后，可以将所述治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物依次进行纯化、超滤和浓缩，得到所需浓度和体积的治疗肿瘤的脂质体 诊疗药物。在本发明的实施例中，所述纯化的柱子为葡聚糖G-25或葡聚糖G-50。在本发明 的实施例中，所述超滤的设备可以为超滤膜。在本发明的实施例中，所述浓缩的设备可以为 浓缩柱。
[0152] 在本发明的实施例中，所述脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中还包括 赋形剂，如山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖或海藻糖，将加入赋形剂的脂质体造影剂和治疗肿 瘤的脂质体诊疗药物经过冷冻干燥后可将所述脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药 物制备成粉针剂。在本发明的实施例中，所述粉针剂型的脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质 体诊疗药物可在4°C~8°C下长时间保存，可溶解于用于药物注射的药剂中，如5%的葡萄 糖溶液、生理盐水等。
[0153] 将本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物进行核磁共振检测，检测结 果为，本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有式I或式Π -1~II-3所示 的结构。
[0154] 将本发明提供的脂质体造影剂用于 小鼠肿瘤部位的成像，具体为：
[0155] 将本发明提供的脂质体造影剂通过小鼠尾部静脉注射的方法注射到已有肿瘤的 小鼠体内；然后分别在〇小时、24小时、48小时对小鼠的肿瘤部位同时进行成像检测，检测 结果为，本发明提供的脂质体造影剂在注射完成后24~48小时之间，肿瘤部位仍然有很强 的成像信号，且显示出来非常好的肿瘤靶向性；由此可知，本发明提供的脂质体造影剂的免 疫原性较低，在体内的生物保留时间较长。
[0156] 将本发明提供的抗肿瘤的脂质体诊疗药物放入透析袋（5000MwC0)中封好，再把 透析袋放到IOOmL的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4,浓度0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气 摇床上，50r/min ;按照时间点，每次取样，同时补加 PBS ;取出的样品经过过滤后，用HPLC测 定样品中的抗肿瘤药物的浓度；测试本发明的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放量； 测试结果为，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在磷酸盐缓冲液环境中150小时的 释放量为70%~80% ;由此可知，本发明提供的治疗肿瘤的药物具有较好的尺寸稳定性以 及良好的缓释控制性能。
[0157] 将本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物放入透析袋（5000MwC0)中封好， 再把透析袋放到IOOmL的含有10 %的牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4,浓度 0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气摇床上，50r/min ;按照时间点，每次取样，同时补加 PBS，取出的样品经过过滤后，用二氯甲烷萃取3次，除去二氯甲烷后，用乙醇溶解；用HPLC 测定样品中的抗肿瘤药物的浓度，测试本发明提供的治疗肿瘤的药物的体外释放量；测试 结果为，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物在含有血清白蛋白的磷酸盐缓冲液环境 中150小时的释放量为80%~90% ;由此可知，本发明提供的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物 具有较低的免疫原性，不会被血清白蛋白快速清除；同时还具有较好的尺寸稳定性以及良 好的缓释控制性能。
[0158] 本发明以下实施例所用到的原料均为市售商品。
[0159] 实施例1二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的合成
[0160] 按照图1所示的合成路线图制备二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生 物：
[0161] 在200mL的圆底烧瓶中加入10. 4g的线型的α -丙醛-ε -羟基聚乙二醇 (HO-(CH2CH2O) 44-(CH2) 2CH0)和4. 43g的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，然后加入IOOmUpH值为 5. 4的磷酸盐缓冲溶液（PBS)，在搅拌的条件下进行6小时的反应；
[0162] 所述反应结束后，向得到的反应产物中加入2g的氰基硼氢化钠，在25°C下进行7 小时的反应；
[0163] 所述反应结果后，向得到的反应溶液中加入饱和的氯化铵溶液，然后用二氯甲烷 萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸镁干燥，再过滤，浓缩滤液，再将浓缩后的滤液滴加到 IOOmL的乙醚中，得到13. 2g的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，将所述二 硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物真空干燥后在_20°C中保存待用；二硬脂酰 基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的产率为93%。
[0164] 将本发明实施例1制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物进 行核磁共振检测，检测结果为：
[0165] 1H NMR (400MHz，CDCl3) ( δ ppm):
[0166] 5· 18 (CH2-CH-CH2)，4· 05 (O-CH-CH2-O)，3· 86-3. 25 (PEG, OP-OCH2, -NHCH2CH2CH2)，3· 11-2. 95 (OP-OCH2, OP-OCH2CH2NH)，2· 85 (-NHCH2CH2CH2)，L 75 (-NHCH2CH2CH2)，2· 30 ((CH2-CO) 2 ),L 58 (-CH2-CH2-CO-), 1. 35-1. 19 (((CH2) 14) 2), 0. 9 (CH3-)
[0167] 由以上检测结果可知，本发明实施例1制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羟 基聚乙二醇衍生物具有式I-a所示的结构：
[0168]
[0169] 式 I-a 中，η 为 44。
[0170] 实施例2二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物的合成
[0171] 按照图2所示的合成路线图制备二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍 生物：
[0172] 在200mL的圆底烧瓶内加入27. 4g的双臂羟基聚乙二醇（(HO-PEG2k)2-COOH)，然后 加入50mL的四氢呋喃并搅拌直到双臂羟基聚乙二醇完全溶解；分别称取I. 37g的N，N-二 环己基碳二亚胺和0. 77g的氮羟基琥珀酰亚胺（NHS)，并先后加入到圆底烧瓶内，在25°C下 反应18小时，得到反应溶液；过滤除去所述反应溶液中的沉淀后，将得到的滤液浓缩，除去 其中的四氢呋喃；再将浓缩后的产物滴加到IOOmL的乙醚中，得到30. 2g的双臂聚乙二醇羧 酸活化酯（(HO-PEG2k)2-NHS)，将所述双臂聚乙二醇羧酸活化酯真空干燥，并在-20度中保 存待用；所述双臂聚乙二醇羧酸活化酯产率为93%。
[0173] 在IOOmL的圆底烧瓶内，将I. 77g的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺加入其中，同时加 入50mL的二氯甲烷将其溶解，将IOg的上述双臂聚乙二醇羧酸活化酯加入到烧瓶内，并在 25°C下反应6小时；将得到的反应溶液浓缩至10mL，然后倒入IOOmL的乙醚中，得到8. 9g 的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物，将所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物真空干燥并在-20度下保存；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物的产率为76%。
[0174] 将本发明实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生 物进行核磁共振检测，检测结果为：
[0175] 1H NMR (400MHz，CDCl3) ( δ ppm):
[0176] 5· 18 (CH2-CH-CH2)，4· 05 (O-CH-CH2-O)，3· 86-3. 25 (PEG, O-CH2-CH2-N, N-CH2-CO, OP -OCH2)，3· 11 (OP-OCH2)，2· 81 (O-CH2-CH2-N)，2· 30 ((CH2-CO)2)，I. 58 (-CH2-CH2-CO-)，I. 35-1 ? 19 (((CH2)J2), 0.9 (CH3-)
[0177] 由以上检测结果可知，本发明实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双 臂羟基聚乙二醇衍生物具有式ΠΑ-1-a所示的结构：
[0178]
[0179] 式 IIA-1-a 中，η 为 44。
[0180] 实施例3~实施例6
[0181] 按照表1中的原料用量制备得到脂质体造影剂，表1为本发明实施例3~实施例 6制备脂质体造影剂的原料用量：
[0182] 将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC)、胆固醇和实施例1制备得到的二硬脂酰基磷脂酰 乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物（DSPE-(PEG 2k-OH))溶于15mL的乙醇的中搅拌，直到以上原 料均匀分散，得到混合溶液；
[0183] 将碘普罗胺和钆喷酸葡胺溶解在IOmL的注射用水中，然后加入到上述混合溶液 中，得到混合物；
[0184] 将所述混合物和甲醇溶液混合后用400W功率下的探头超声90次，超声过程中工 作5s，间歇5s，得到中间产物；
[0185] 将所述中间产物通过高压膜挤出仪反复通过孔径为SOnm的聚酯膜进行挤压，循 环5次，得到粒度为IOOnm粗产物；
[0186] 将所述粗产物在截留分子量为lOOOOOMwCO的超滤膜内浓缩后用PBS缓冲液稀释 至原体积，如此反复操作10次，去除其中游离的碘普罗胺及钆喷酸葡胺，得到脂质体造影 剂。
[0187] 表1本发明实施例3~实施例6制备脂质体造影剂的原料用量
[0188]
[0189] 实施例7~实施例10
[0190] 按照表2中的原料用量制备得到脂质体造影剂，表2为本发明实施例7~实施例 10制备脂质体造影剂的原料用量：
[0191] 将DPPC、胆固醇、实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二 醇（DSPE-(PEG 2k-OH)2)溶于15mL的乙醇中搅拌，直到以上原料均匀分散，得到混合溶液；
[0192] 将碘普罗胺和钆喷酸葡胺溶解在IOmL的注射用水中，然后加入到上述混合溶液 中，得到混合物；
[0193] 将所述混合物和甲醇溶液混合后用400W功率下探头超声90次，超声过程中工作 5s，间歇5s，得到中间产物；
[0194] 将所述中间产物通过高压膜挤出仪反复通过孔径为SOnm的聚酯膜进行挤压，循 环5次，得到直径为IOOnm粗产物；
[0195] 将所述粗产物在截留分子量为100000MWC0的超滤膜内浓缩后用PBS缓冲液稀释 至原体积，如此反复操作10次，去除未包裹的碘普罗胺及钆喷酸葡胺，得到脂质体造影剂。
[0196] 表2本发明实施例7~实施例10制备脂质体造影剂的原料用量
[0197]
[0198] 将本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂采用PBS溶液稀释30 倍，用动态激光散射仪器（DLS)测定造影剂的平均粒径、粒径稳定性和表面电荷，取造影剂 5mL，然后放置在25°C下保存；每隔一定时间取部分造影剂，然用DLS法测脂质体造影剂的 粒径，每种脂质体造影剂测3次，然后取平均值作为结果；测试结果如表3和图3~图5所 示，表3为本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂的物理参数；图3为本发 明实施例3和本发明实施例7制备得到的脂质体造影剂的尺寸稳定性测试结果；图4为本 发明实施例8制备得到的脂质体造影剂的动态光散射（DLS)测试结果；图5为本发明实施 例9制备的脂质体造影剂的透射电子显微镜图片。
[0199] 测试本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂中造影试剂的载药量 和包封率，钆喷酸葡胺包封率的测定方法为：
[0200] 取ImL的造影剂溶液，上样于Sephadex G-50凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，接收造 影剂的洗脱组分，再用蒸馏水定容至IOmL ;然后取ImL样品，用ICP法分析含量；
[0201] 碘普罗胺包封率的测定方法为：
[0202] 取ImL造影剂溶液，采用UPLC方法分析游离碘普罗胺的含量；
[0203] 碘普罗胺和钆喷酸葡胺的包封率和载药量可分别用下述公式计算：
[0204] 包封率=(W0-W游离）/W。X 100 % ;
[0205] 其中，Wci为起始脂质体造影剂质量;W _为透析液中脂质体造影剂质量；
[0206] 载药量=加入造影试剂的质量X包封率/[(加入造影剂的质量X包封率）+造 影剂质量]Xioo% ;
[0207] 测试结果如表3所示。
[0208] 表3本发明实施例3~实施例10制备得到的脂质体造影剂的物理参数
[0209]
[0210] 将实施例9制备得到的脂质体造影剂用于小鼠肿瘤部位的CT和MRI成像，具体 为：
[0211] 将本发明实施例9制备得到的脂质体造影剂通过小鼠尾部静脉注射的方法，按照 300mg (碘普罗胺）/kg (小鼠）、60mg (钆喷酸葡胺）/kg (小鼠）的剂量，将IOmL实施例9制 备得到的脂质体造影剂注射到已有肿瘤的小鼠体内；然后分别在〇小时、24小时、48小时对 小鼠的肿瘤部位同时进行CT和MRI成像检测，检测结果如图6所示，图6为本发明实施例9 制备得到的脂质体造影剂造影小鼠体内肿瘤细胞的成像图片，本发明实施例9提供的脂质 体造影剂在注射完成后24~48小时之间，肿瘤部位仍然有很强的CT和MRI信号，且显示 出来非 常好的肿瘤靶向性，而现有技术中的CT和MRI造影剂在小鼠体内的最佳成像的时间 不超过30分钟；由此可知，本发明实施例9提供的脂质体造影剂的免疫原性较低，在体内的 生物保留时间较长。
[0212] 实施例11
[0213] 将227mg的DPPC、82mg的胆固醇、42mg的实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰 乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物（DSPE-(PEG 2k-OH)2)溶于15mL的乙醇的中，搅拌直到完 全溶解，得到混合溶液；
[0214] 将230mg的碘普罗胺和3mg的吲哚菁绿溶解在IOmL的注射用水中，然后加入到上 述混合溶液中，得到混合物；
[0215] 将所述混合物在50°C下用400W功率下探头超声90次，超声的过程中工作5s，间 歇5s，得到中间产物；
[0216] 将所述中间产物加入到高压膜挤出仪经过5次的SOnm的聚酯膜循环挤压，得到 IOOnm的粗产物；
[0217] 将所述粗产物在截留分子量为100000MWC0的超滤膜内浓缩并用PBS缓冲液稀释 至原体积，如此反复操作10次，去除未包裹的碘普罗胺及吲哚菁绿，得到脂质体造影剂。
[0218] 实施例12
[0219] 将57. Img的DPPC、9. 9mg的氯化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵（DOTPA)、 12mg的实施例2制备得到的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物 (DSPE-(PEG 2k-OH)2和21mg的胆固醇溶解在20mL的乙醇中，直到全部溶解，得到混合溶液；
[0220] 将IOmg的盐酸多柔比星、23mg的碘普罗胺和5mg的钆喷酸葡胺分别溶解在IOmL 的注射水中混合；将得到的混合物质置于50°C的恒温水浴中，用涡轮振动仪振动至其充分 混合，得到混合物；
[0221] 将所述混合物转移至装有上述混合溶液的烧瓶内，将烧瓶浸入温度为70°C的恒温 水浴中，用涡轮振动仪振动烧瓶中的物质直到形成分散均匀的溶液，得到分散物；
[0222] 将所述分散物通过挤出仪，依次用孔径为200nm和SOnm的聚酯膜过滤各5次，得 到粒度为90nm的粗产物；
[0223] 将所述粗产物用截留分子量为100000MWC0的超滤膜进行浓缩后加入PBS稀释至 其起始浓度后再浓缩，如此反复10次，去除未包裹的盐酸多柔比星和碘普罗胺及钆喷酸葡 胺，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
[0224] 取ImL质量浓度为2mg/mL的本发明实施例12制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗 药物，用无水乙醇稀释至20mL后过滤，取上清液；以注射用水为对照，用紫外分光光度计测 定上清液在480nm波长处的紫外吸收值，计算上清液中的盐酸多柔比星的浓度，得出本发 明实施例12制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中包含抗肿瘤药物的含量，在与总的 加入的抗肿瘤药物量相比，得出抗肿瘤药物的包封率；计算结果为，本发明实施例12制备 得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物中盐酸多柔比星的包封率为92. 5±0. 3%。
[0225] 取2mL质量浓度为2mg/mL的本发明实施例12制备得到的抗肿瘤的脂质体诊疗药 物，放入透析袋（5000MwC0)中封好，再把透析袋放到IOOmL的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4， 浓度0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气摇床上，50r/min ;按照时间点，每次取样2mL，同 时补加2mL的PBS ;取出的样品经过过滤后，用HPLC测定样品中的盐酸多柔比星的浓度；得 到的盐酸多柔比星体外释放曲线如图7所示，图7为本发明实施例12制备得到的治疗肿瘤 的脂质体诊疗药物的体外释放曲线；从图中可以看出，本发明实施例12制备得到的治疗肿 瘤的脂质体诊疗药物具有较好的尺寸稳定性以及良好的缓释控制性能。
[0226] 实施例13
[0227] 将IOmg的多西紫杉醇、55mg的DPPC、9. 3mg的D0TPA、9. 5mg的实施例2制备得到 的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双臂羟基聚乙二醇衍生物DSPE-(PEG2K-〇H)jP 19mg的胆固 醇溶解在15mL的三氯甲烷和5mL甲醇组成的有机溶剂中，并搅拌2小时，使之溶解，得到溶 解溶液；
[0228] 将所述溶解溶液转移至与旋转蒸发器连接的烧瓶内，将烧瓶浸入温度为30°C的恒 温水浴中，然后抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，至烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；
[0229] 将形成有薄膜的烧瓶放入真空干燥箱中，在25°C下干燥24小时，进一步除去残留 的有机溶剂；
[0230] 将23mg的碘普罗胺和5mg的钆喷酸葡胺分别溶解在8mL和2mL的注射水中，然后 将得到的混合液加入上述形成有薄膜的烧瓶中；将所述烧瓶置于50°C的恒温水浴中，用涡 轮振动仪振动烧瓶中的物质至其充分混合，得到混合物；
[0231] 将所述混合物通过挤出仪，依次用孔径为200nm和SOnm的聚酯膜各过滤5次，得 到粒径为95nm的粗产物；
[0232] 将所述粗产物通过葡聚糖G-50柱子纯化，上样量控制在2 %的柱体积，以注射用 水为流动相，收集脂质体的组分，得到治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。
[0233] 取ImL本发明实施例13制备得到的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物置 于SepharoseG-50柱（30mmX 150mm)，以注射用水洗脱，收集含有治疗肿瘤脂质体 诊疗药物的组分，然后加入无水乙醇至体积为20mL;色谱检测条件为：Diamonsil C18(250mmX4. 6mm, 5 μπι)，流动相为甲醇-乙腈-水（体积比35 :40 :25)，流速为lmL/min， 紫外检查波长为230nm，进样量为20 μ L ;通过进样分析，计算已包封的多西紫杉醇量；计算 结果为，本发明实施例13制备得到的抗肿瘤的脂质体诊疗药物中多西紫杉醇的包封率为 90. 5±2· 1%〇
[0234] 取2mL的质量浓度为2mg/mL的本发明实施例13制备得到的治疗肿瘤的脂质体 诊疗药物，放入透析袋（5000MwC0)中封好，再把透析袋放到IOOmL的含有10%的牛血清白 蛋白的PBS缓冲溶液中（pH值7. 4,浓度0. 05mol/L)，然后放入到37°C的空气摇床上，50r/ min ;按照时间点，每次取样2mL，同时补加2mL的PBS，取出的样品经过过滤后，用二氯甲烷 (2mL)萃取3次，除去二氯甲烷后，用乙醇（ImL)溶解；用HPLC测定样品中的多西紫杉醇的 浓度，得到的多西紫杉醇体外释放曲线如图8所示，图8为本发明实施例13制备得到的治 疗肿瘤的脂质体诊疗药物的体外释放曲线；由图可知，本发明实施例13制备得到的治疗肿 瘤的脂质体诊疗药物具有较低的免疫原性，不会被血清白蛋白快速清除；同时还具有较好 的尺寸稳定性以及良好的缓释控制性能。
[0235] 由以上实施例可知，本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具 有式I、式11-1、式II-2或式II-3所示的结构，其中，R为酰基；η为20~200 ;m为1~ 10 ;i为0或1。本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括： 将α-羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物进行活化后与磷脂酰乙醇胺进行偶合；或将α-醛 基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应后再还原。本发明提供了一种脂质 体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以上述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物为脂 质体载体的成分。本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物中含有羟基聚乙二 醇，这种末端为羟基的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有较低的免疫原性，能够避 免在体内被快速清除，在体内的生物保留时间较长。
【主权项】
1. 一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式π-l、式II-2或式II-3所 示的结构：其中，R为酰基； η 为 20 ~200 ; m为1~10 ; i为0或1。2. 根据权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，其特征在于，所述R为 式101或式102中的一种：式101中，&和1?2独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25的烯 径基； 式102中，馬和R 4独立地选自碳原子数为10~20的烷基或碳原子数为15~25的烯 烃基。3.根据权利要求2所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，其特征在于，所述R为 式201~式211中的一种：4.根据权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，其特征在于，所述磷脂 酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的结构为式I-a或式IIA-1-a中的一种：5. -种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括： 在缩合剂的作用下，将α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物进行活化，得到羟基聚乙二 醇活化酯； 将所述羟基聚乙二醇活化酯和磷脂酰乙醇胺进行偶合反应，得到磷脂酰乙醇胺-羟基 聚乙二醇衍生物；所述磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的结构为式IIA-I~式ΙΙΑ-3 中的一种：其中，R为酰基； m为1~10 ; η 为 20 ~200 ; 所述α -羧基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IIIA-I~式ΙΙΙΑ-3所示的结构：其中，m为1~10 ;η为20~200。6. -种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括： 将α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应，得到磷脂酰乙醇胺羟 基聚乙二醇； 在还原剂的作用下，将所述磷脂酰乙醇胺羟基聚乙二醇进行还原反应，得到具有式I 或IIB-I~式IIB-3所示结构的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物：其中，R为酰基； m为1~10 ; η 为 20 ~200 ; 所述α -醛基-ε -羟基聚乙二醇衍生物具有式IV或IIIB-I~式ΙΙΙΒ-3所示的结 构：其中，η为20~200, m为1~10。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰基 磷脂酰乙醇胺、二油脂酰基磷酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇 胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、1，3-二棕榈酰-甘油-2-磷酸乙醇胺、1，3-二油脂酰-甘 油-2-磷酸乙醇胺、二植烷酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二亚麻酰基磷脂酰 乙醇胺或1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰乙醇胺。8. -种脂质体造影剂，以脂质体为载体，所述脂质体包括权利要求1~4中任意一项所 述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或权利要求5~7中任意一项所述的方法制备 得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。9. 一种治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，以脂质体为载体，所述脂质体包括为权利要求 1~4中任意一项所述的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物；或权利要求5~7中任意 一项所述的方法制备得到的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物。10. 根据权利要求9所述的治疗肿瘤的脂质体诊疗药物，其特征在于，所述治疗肿瘤的 脂质体诊疗药物包括抗肿瘤药物和脂质体造影剂；所述脂质体造影剂为权利要求8所述的 脂质体造影剂。
【专利摘要】本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物，具有式I、式II-1、式II-2或式II-3所示的结构。本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物的制备方法，包括：将α-羧基-ε-羟基聚乙二醇衍生物进行活化后与磷脂酰乙醇胺进行偶合；或将α-醛基-ε-羟基聚乙二醇衍生物和磷脂酰乙醇胺进行反应后再还原。本发明提供了一种以磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物为成分的脂质体造影剂和治疗肿瘤的脂质体诊疗药物。本发明提供的磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物末端为羟基，与磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇相比，这种磷脂酰乙醇胺-羟基聚乙二醇衍生物具有较低的免疫原性，在体内的生物保留时间较长。式I式II-1式II-2式II-3。
【IPC分类】A61P35/00, C08G65/48, A61K47/34, C08G65/327, A61K9/127, C08G65/00, A61K49/00
【公开号】CN104892918
【申请号】CN201510288430
【发明人】吕常海
【申请人】吕常海
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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