一种谷胱甘肽/pH双重刺激响应离子交联型聚合物纳米水凝胶及其制备方法和应用
一种谷胱甘肽/pH双重刺激响应离子交联型聚合物纳米水凝胶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种纳米水凝胶及其制备方法和应用。具体的说是一种具有谷胱甘肽/PH双重刺激响应性的离子交联纳米水凝胶及其制备方法和作为药物载体的应用。
【背景技术】
[0002]根据大量研宄表明，阿霉素是一种有效的抗癌药物，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但是直接注射后通过体液循环到达肿瘤组织的剂量很低，而且会给人体带来严重的副反应。世界上已经有很多研宄来发展目标革E向药物传输体系(drug delivery systems, DDS)来增强药效和降低副反应，这些药物载体包括各种形态的纳米粒子、胶束、微胶囊、纳米水凝胶等。
[0003]在各种药物载体中，聚合物纳米水凝胶是一种理想的药物载体。作为一种通过物理或者化学交联的三维高亲水性的聚合物网络，水凝胶是最接近于人体各种组织细胞的形态，从某种意义上说，人体各种组织都是不同水含量的凝胶。其中，化学交联的纳米水凝胶的高度亲水性和胶体稳定性使得它是一种理想的药物传输载体。
[0004]对于目标药物载体，智能型的纳米水凝胶尤其重要，因为它可以选择性的在目标区域释放药物，而在别的区域保持稳定，一般体现为对于PH值、温度、离子浓度、谷胱甘肽或者它们之间的组合的刺激响应性。其中，最重要的是pH和谷胱甘肽的刺激响应性，因为肿瘤组织(pH弱酸性)和正常细胞(pH中性)间，以及细胞外液(pH中性)和细胞内的内涵体和溶酶体(pH酸性)之间存在着明显的差异，而由肿瘤细胞内液和外液不同浓度的谷胱甘肽浓度产生的环境差异则使得谷胱甘肽刺激响应性也非常重要。针对这些不同组织部位的不同谷胱甘肽/pH设计多重刺激敏感性的药物载体，可以智能化的控制释药和对于肿瘤细胞具有靶向杀伤性。
[0005]对于肿瘤组织，一般为了增强药效，保持药物在目标组织增强渗透滞留效应(EPR，Enhanced enhanced permeability and retent1n effect)，需要药物载体为稳定的高分子量聚合物；但是同时为了在释药结束后可以顺利通过肾脏代谢排出体外，减小药物载体对人体的副作用，一般又要求聚合物分子量小于初次代谢阈值(45 - 50kDa)，为了同时满足这两个矛盾的需求，制备生物可降解的药物载体显得尤为重要。
[0006]基于以上信息，设计制备一种具有可逆交联的、良好的胶体稳定性的、谷胱甘肽/PH双重刺激响应性的、可生物降解的纳米水凝胶药物载体将会是对于药物传递领域的一次很好探索。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种离子交联的具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性的可生物降解的纳米水凝胶及其制备方法；同时，提供一种基于上述纳米水凝胶在制备药物载体中的应用。
[0008]本发明所提供的具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性的纳米水凝胶的制备方法，具体步骤如下:
在单一的乙醇、乙腈、水、四氢呋喃、甲基异丁基酮或甲苯溶剂中，或者为乙腈一乙醇、乙腈一四氢呋喃、乙腈一水、乙腈一甲苯、乙醇一甲苯或甲基异丁基酮一乙腈的混合溶剂中，加入甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、烯酰胺(AM)、N_异丙基丙烯酰胺(NIPAM)或N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)单体；
以二甲基丙烯酸锌(ZDMA)或二甲基丙烯酸钙(CDMA)作为交联剂；在引发剂AIBN或BPO的存在下，进行反应；
加热，反应温度为75~120°C ;用蒸馏沉淀法除去一半溶剂，回流溶剂反应时间为
0.2~4h ;再用离心法除去剩下溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水反复洗涤3~5次；然后在真空烘箱内30~55°C干燥5~24h，即得到纳米水凝胶粒子。
[0009]本发明中，所述混合溶剂的浓度为0.5wt%~20.0wt%。
[0010]本发明中，所述单体在体系中所占质量比为1:20~20:1。
[0011]本发明中，所用的引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)或过氧化二苯甲酰(BPO)。
[0012]上述制备的纳米水凝胶，可以进一步与氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶粒子，具体操作如下:
将上述制得的纳米水凝胶粒子，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，先在溶剂中进行活化反应，再和氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，即得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶。
[0013]所述1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的摩尔比分别为1:1.5和1:1.75。
[0014]本发明所制备的上述纳米水凝胶大小为50~950nm，多分散度为0.04-0.16。
[0015]本发明制得的上述纳米水凝胶可用作药物载体，所载药物可为抗癌药物阿霉素。
[0016]本发明中，降解的测试条件为:在25mL的单口烧瓶里加入5mg的纳米水凝胶粒子，分别加入10 mL的三种缓冲溶液中(磷酸盐缓冲溶液pH=7.4,6.0，醋酸盐缓冲溶液pH=5.0，然后加入10 mM的谷胱甘肽，放入恒温摇床(200rpm摇速，37.5°C)匀速振荡。
[0017]载药的条件为:10mg的纳米水凝胶和6mg盐酸阿霉素，超声分散在20 mL的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，磁力搅拌24h，然后离心移去上清液，用磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)洗涤3次除去表面吸附的阿霉素，即得物理负载阿霉素的纳米水凝胶。
[0018]释药的条件为:将10 mg载药纳米水凝胶粒子分散在10 mL的两种缓冲溶液中(磷酸盐缓冲溶液，PH=7.4 ;醋酸盐缓冲溶液，pH=5.0)，超声分散均匀，然后分为5份，每份2mL,将一份凝胶溶液移入透析袋中(透析分子量Mn=14000)，再放入80 mL的含不同浓度的谷胱甘肽的缓冲溶液中，即刻开始计时释药。在预订时间，从瓶内取出3 mL释药的缓冲溶液进行紫外测量，再补充3 mL纯的缓冲溶液保持体积恒定。
[0019]所制备的纳米水凝胶在还原剂降解后，分子量小于2000且分子量分布均匀(Mn=1200,PDI<l.1)，远小于代谢阈值(45 — 50 kDa)，预计可以很好的代谢排出体外。
[0020]本发明中，所述的纳米水凝胶药物载体，用于装载抗癌药物阿霉素。装载阿霉素药物分子，其包封率和载药率可以方便地用纳米凝胶和阿霉素的不同比例加以控制。在上述方案的基础上，所属抗癌药物阿霉素的载药率的重量百分比最高可为45.4 %。
[0021]阿霉素的释放过程可以通过调节环境的谷胱甘肽浓度和pH值加以控制，在高谷胱甘肽浓度和较低PH值条件下(模拟细胞内环境)展现出较快的释放速度，而在低谷胱甘肽浓度和中性的pH值条件下(模拟细胞外环境)保持稳定，释放量小于20%。
[0022]本发明中，通过将载有药物的上述纳米药物载体和子宫颈瘤细胞一起培养进行细胞实验，纳米水凝胶药物载体体现出了很好的释药行为。通过荧光显微镜进行观察，发现5h后载药纳米水凝胶粒子已经进入细胞，24h后阿霉素药物对于细胞的杀伤作用已经非常明显，细胞存活率大幅降低，剩余的少量细胞也处于皱缩状态，说明所制备的纳米水凝胶是一种较好的药物载体。
[0023]本发明优点在于制备工艺清晰简洁，得到的纳米水凝胶药物载体具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性，谷胱甘肽响应性可以使得纳米水凝胶在肿瘤细胞外低谷胱甘肽浓度的环境中保持稳定，长时间循环，很少泄露药物，而在肿瘤细胞内高 谷胱甘肽浓度的环境中快速降解，变为小分子量的线性链，从而快速释放药物，达到在目标肿瘤细胞内控制释放抗癌药物的效果。PH响应性则使得纳米水凝胶在内涵体，溶酶体等亚细胞器官内更有效的释放出阿霉素，体现出与谷胱甘肽的协同效应。而凝胶粒子的可生物降解性和降解后的小分子量又可以使得药物载体迅速代谢排出体外，进一步减少对人体的副作用。
[0024]以上设计思路基本覆盖了药物传递领域所关心的一些基本问题，因此产品具有良好的全面性。
【附图说明】
[0025]图1:通过控制交联剂的投料量，制备的不同粒径的PMAA纳米水凝胶粒子的透射电镜照片:(a) 15wt%, (b) 20wt%, (c) 25wt%, (d) 30wt%。
【具体实施方式】
[0026]下面将通过实例对于本发明做进一步的详细说明。
[0027]实施例1:锌交联PMAA纳米水凝胶的制备
MAA 单体 400 mg，ZDMA 交联剂 10mg，AIBN 引发剂 16.7 mg，乙腈 40 mL，加热到 95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0028]实施例2:锌交联PAA纳米水凝胶的制备
AA单体400 mg，ZDMA交联剂10mg, 15.3 mg BPO引发剂，40 mL乙腈一乙醇混合溶剂(V乙腈:V乙醇=1:1)，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用丙酮和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0029]实施例3:锌交联PMAA-co-PHPMA纳米水凝胶的制备
MAA 单体 200 mg, HPMA 200mg, ZDMA 交联剂 lOOmg，16.7 mg AIBN 引发剂，40 mL 乙腈一甲苯混合溶剂(V乙腈:V甲苯=4:1)，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用丙酮和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0030]实施例4:锌交联PMAA-co-PHEMA纳米水凝胶的制备
MAA 单体 200 mg, HEMA 200mg, ZDMA 交联剂 100mg，15.4 mg BPO 引发剂，40 mL 乙腈，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0031]实施例5:妈交联PAA纳米水凝胶的制备
AA单体400 mg, CDMA交联剂lOOmg, AIBN引发剂16.7 mg,乙腈40 mL，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0032]实施例6:PMAA修饰聚乙二醇-叶酸的纳米水凝胶的制备步骤1:氨基化聚乙二醇-叶酸的制备
叶酸60mg溶解于20ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 247 mg，N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 230 mg，常温下反应12小时，产物通过加入10ml丙酮/乙醚(3:7)混合溶液沉淀，过滤，真空干燥得到的产物溶于500ml 二甲基亚砜(DMSO)中，加入 tBoc-NH-PEG_NH2200mg 和 N, N-二异丙基乙胺(DIEA)15mg，反应12小时。产物用冰乙醚沉淀，之后重新溶解于氢氧化钠水溶液中，透析48h，冻干后得到产物氨基化聚乙二醇-叶酸。
[0033]步骤2:PMAA纳米水凝胶粒子修饰聚乙二醇-叶酸分子
将PMAA凝胶粒子50 mg，加入20 mL PBS缓冲溶液(pH=5.5)，超声10分钟均匀分散，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 96 mg，室温下搅拌10分钟，然后加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 58 mg，反应2小时，再加入上一步制备的氨基化的聚乙二醇-叶酸25 mg,反应12小时。离心，将粒子用乙醇和去离子水各洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho即可得到修饰叶酸的PMAA纳米水凝胶粒子。
[0034]实施例7:PMAA-co-PHEMA修饰聚乙二醇-叶酸的纳米水凝胶的制备
只需将例6步骤2中PMAA凝胶粒子改成例4中PMAA-co-PHEMA凝胶粒子，其他条件与例6均相同。
[0035]应用例:
取实施例7中制得的纳米水凝胶10 mg，加入6 mg的阿霉素，配成20 mL的溶液，磷酸盐缓冲溶液，常温下搅拌24h，产物用离心分离，冷冻干燥，制成负载有抗癌阿霉素的纳米水凝胶药物载体，载药率的重量比为18.5 - 45.4%。
【主权项】
1.一种谷胱甘肽/pH双重刺激响应离子交联型聚合物纳米水凝胶的制备方法，其特征在于具体步骤如下: 在单一的乙醇、乙腈、水、四氢呋喃、甲基异丁基酮或甲苯溶剂中，或者为乙腈一乙醇、乙腈一四氢呋喃、乙腈一水、乙腈一甲苯、乙醇一甲苯或甲基异丁基酮一乙腈的混合溶剂中，加入甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺或N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺单体； 以二甲基丙烯酸锌或二甲基丙烯酸钙作为交联剂；在引发剂的存在下，进行反应； 加热，反应温度为75~120°C ;用蒸馏沉淀法除去一半溶剂，回流溶剂反应时间为0.2~4h ;再用离心法除去剩下溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水反复洗涤3~5次；然后在真空烘箱内30~55°C干燥5~24h，即得到纳米水凝胶粒子。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶剂的浓度为0.5wt%~20.0wt%D3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单体在体系中所占体积比为1:20-20:1。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应所用的引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于将制得的纳米水凝胶粒子，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，先在溶剂中进行活化反应，再和氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，即得到得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶。6.如权利要求5所述的制备方法得到的纳米水凝胶，其特征在于纳米水凝胶大小为50~950nm,多分散度为 0.04-0.16。7.如权利要求6所述的制备方法得到的纳米水凝胶作为药物载体的应用，所载药物为抗癌药物阿霉素。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体是一种具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性的离子交联纳米水凝胶及其制备方法和作为药物载体的应用。本方法以甲基丙烯酸、丙烯酸、丙烯酰胺等为单体，二甲基丙烯酸锌、二甲基丙烯酸钙为交联剂，通过在乙腈溶剂里回流沉淀，制备高均匀度的低分散度的纳米水凝胶；通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺和氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，可以得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶粒子。得到的纳米水凝胶为形态规整的球形，大小均匀，粒径可调控，具有谷胱甘肽和pH双重刺激响应性，在水中可以长期均匀分散无明显沉淀，有较好的胶体稳定性，良好的分散性，是一种较为理想的药物载体。
【IPC分类】C08F220/58, C08F220/06, C08F222/02, C08G81/02, A61K47/30, C08F220/28, A61K31/704, A61P35/00, C08G65/48
【公开号】CN104892949
【申请号】CN201510243609
【发明人】张子豪, 汪长春
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种纳米水凝胶及其制备方法和应用。具体的说是一种具有谷胱甘肽/PH双重刺激响应性的离子交联纳米水凝胶及其制备方法和作为药物载体的应用。
【背景技术】
[0002]根据大量研宄表明，阿霉素是一种有效的抗癌药物，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但是直接注射后通过体液循环到达肿瘤组织的剂量很低，而且会给人体带来严重的副反应。世界上已经有很多研宄来发展目标革E向药物传输体系(drug delivery systems, DDS)来增强药效和降低副反应，这些药物载体包括各种形态的纳米粒子、胶束、微胶囊、纳米水凝胶等。
[0003]在各种药物载体中，聚合物纳米水凝胶是一种理想的药物载体。作为一种通过物理或者化学交联的三维高亲水性的聚合物网络，水凝胶是最接近于人体各种组织细胞的形态，从某种意义上说，人体各种组织都是不同水含量的凝胶。其中，化学交联的纳米水凝胶的高度亲水性和胶体稳定性使得它是一种理想的药物传输载体。
[0004]对于目标药物载体，智能型的纳米水凝胶尤其重要，因为它可以选择性的在目标区域释放药物，而在别的区域保持稳定，一般体现为对于PH值、温度、离子浓度、谷胱甘肽或者它们之间的组合的刺激响应性。其中，最重要的是pH和谷胱甘肽的刺激响应性，因为肿瘤组织(pH弱酸性)和正常细胞(pH中性)间，以及细胞外液(pH中性)和细胞内的内涵体和溶酶体(pH酸性)之间存在着明显的差异，而由肿瘤细胞内液和外液不同浓度的谷胱甘肽浓度产生的环境差异则使得谷胱甘肽刺激响应性也非常重要。针对这些不同组织部位的不同谷胱甘肽/pH设计多重刺激敏感性的药物载体，可以智能化的控制释药和对于肿瘤细胞具有靶向杀伤性。
[0005]对于肿瘤组织，一般为了增强药效，保持药物在目标组织增强渗透滞留效应(EPR，Enhanced enhanced permeability and retent1n effect)，需要药物载体为稳定的高分子量聚合物；但是同时为了在释药结束后可以顺利通过肾脏代谢排出体外，减小药物载体对人体的副作用，一般又要求聚合物分子量小于初次代谢阈值(45 - 50kDa)，为了同时满足这两个矛盾的需求，制备生物可降解的药物载体显得尤为重要。
[0006]基于以上信息，设计制备一种具有可逆交联的、良好的胶体稳定性的、谷胱甘肽/PH双重刺激响应性的、可生物降解的纳米水凝胶药物载体将会是对于药物传递领域的一次很好探索。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种离子交联的具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性的可生物降解的纳米水凝胶及其制备方法；同时，提供一种基于上述纳米水凝胶在制备药物载体中的应用。
[0008]本发明所提供的具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性的纳米水凝胶的制备方法，具体步骤如下:
在单一的乙醇、乙腈、水、四氢呋喃、甲基异丁基酮或甲苯溶剂中，或者为乙腈一乙醇、乙腈一四氢呋喃、乙腈一水、乙腈一甲苯、乙醇一甲苯或甲基异丁基酮一乙腈的混合溶剂中，加入甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、烯酰胺(AM)、N_异丙基丙烯酰胺(NIPAM)或N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)单体；
以二甲基丙烯酸锌(ZDMA)或二甲基丙烯酸钙(CDMA)作为交联剂；在引发剂AIBN或BPO的存在下，进行反应；
加热，反应温度为75~120°C ;用蒸馏沉淀法除去一半溶剂，回流溶剂反应时间为
0.2~4h ;再用离心法除去剩下溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水反复洗涤3~5次；然后在真空烘箱内30~55°C干燥5~24h，即得到纳米水凝胶粒子。
[0009]本发明中，所述混合溶剂的浓度为0.5wt%~20.0wt%。
[0010]本发明中，所述单体在体系中所占质量比为1:20~20:1。
[0011]本发明中，所用的引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)或过氧化二苯甲酰(BPO)。
[0012]上述制备的纳米水凝胶，可以进一步与氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶粒子，具体操作如下:
将上述制得的纳米水凝胶粒子，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，先在溶剂中进行活化反应，再和氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，即得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶。
[0013]所述1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的摩尔比分别为1:1.5和1:1.75。
[0014]本发明所制备的上述纳米水凝胶大小为50~950nm，多分散度为0.04-0.16。
[0015]本发明制得的上述纳米水凝胶可用作药物载体，所载药物可为抗癌药物阿霉素。
[0016]本发明中，降解的测试条件为:在25mL的单口烧瓶里加入5mg的纳米水凝胶粒子，分别加入10 mL的三种缓冲溶液中(磷酸盐缓冲溶液pH=7.4,6.0，醋酸盐缓冲溶液pH=5.0，然后加入10 mM的谷胱甘肽，放入恒温摇床(200rpm摇速，37.5°C)匀速振荡。
[0017]载药的条件为:10mg的纳米水凝胶和6mg盐酸阿霉素，超声分散在20 mL的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，磁力搅拌24h，然后离心移去上清液，用磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)洗涤3次除去表面吸附的阿霉素，即得物理负载阿霉素的纳米水凝胶。
[0018]释药的条件为:将10 mg载药纳米水凝胶粒子分散在10 mL的两种缓冲溶液中(磷酸盐缓冲溶液，PH=7.4 ;醋酸盐缓冲溶液，pH=5.0)，超声分散均匀，然后分为5份，每份2mL,将一份凝胶溶液移入透析袋中(透析分子量Mn=14000)，再放入80 mL的含不同浓度的谷胱甘肽的缓冲溶液中，即刻开始计时释药。在预订时间，从瓶内取出3 mL释药的缓冲溶液进行紫外测量，再补充3 mL纯的缓冲溶液保持体积恒定。
[0019]所制备的纳米水凝胶在还原剂降解后，分子量小于2000且分子量分布均匀(Mn=1200,PDI<l.1)，远小于代谢阈值(45 — 50 kDa)，预计可以很好的代谢排出体外。
[0020]本发明中，所述的纳米水凝胶药物载体，用于装载抗癌药物阿霉素。装载阿霉素药物分子，其包封率和载药率可以方便地用纳米凝胶和阿霉素的不同比例加以控制。在上述方案的基础上，所属抗癌药物阿霉素的载药率的重量百分比最高可为45.4 %。
[0021]阿霉素的释放过程可以通过调节环境的谷胱甘肽浓度和pH值加以控制，在高谷胱甘肽浓度和较低PH值条件下(模拟细胞内环境)展现出较快的释放速度，而在低谷胱甘肽浓度和中性的pH值条件下(模拟细胞外环境)保持稳定，释放量小于20%。
[0022]本发明中，通过将载有药物的上述纳米药物载体和子宫颈瘤细胞一起培养进行细胞实验，纳米水凝胶药物载体体现出了很好的释药行为。通过荧光显微镜进行观察，发现5h后载药纳米水凝胶粒子已经进入细胞，24h后阿霉素药物对于细胞的杀伤作用已经非常明显，细胞存活率大幅降低，剩余的少量细胞也处于皱缩状态，说明所制备的纳米水凝胶是一种较好的药物载体。
[0023]本发明优点在于制备工艺清晰简洁，得到的纳米水凝胶药物载体具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性，谷胱甘肽响应性可以使得纳米水凝胶在肿瘤细胞外低谷胱甘肽浓度的环境中保持稳定，长时间循环，很少泄露药物，而在肿瘤细胞内高 谷胱甘肽浓度的环境中快速降解，变为小分子量的线性链，从而快速释放药物，达到在目标肿瘤细胞内控制释放抗癌药物的效果。PH响应性则使得纳米水凝胶在内涵体，溶酶体等亚细胞器官内更有效的释放出阿霉素，体现出与谷胱甘肽的协同效应。而凝胶粒子的可生物降解性和降解后的小分子量又可以使得药物载体迅速代谢排出体外，进一步减少对人体的副作用。
[0024]以上设计思路基本覆盖了药物传递领域所关心的一些基本问题，因此产品具有良好的全面性。
【附图说明】
[0025]图1:通过控制交联剂的投料量，制备的不同粒径的PMAA纳米水凝胶粒子的透射电镜照片:(a) 15wt%, (b) 20wt%, (c) 25wt%, (d) 30wt%。
【具体实施方式】
[0026]下面将通过实例对于本发明做进一步的详细说明。
[0027]实施例1:锌交联PMAA纳米水凝胶的制备
MAA 单体 400 mg，ZDMA 交联剂 10mg，AIBN 引发剂 16.7 mg，乙腈 40 mL，加热到 95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0028]实施例2:锌交联PAA纳米水凝胶的制备
AA单体400 mg，ZDMA交联剂10mg, 15.3 mg BPO引发剂，40 mL乙腈一乙醇混合溶剂(V乙腈:V乙醇=1:1)，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用丙酮和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0029]实施例3:锌交联PMAA-co-PHPMA纳米水凝胶的制备
MAA 单体 200 mg, HPMA 200mg, ZDMA 交联剂 lOOmg，16.7 mg AIBN 引发剂，40 mL 乙腈一甲苯混合溶剂(V乙腈:V甲苯=4:1)，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用丙酮和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0030]实施例4:锌交联PMAA-co-PHEMA纳米水凝胶的制备
MAA 单体 200 mg, HEMA 200mg, ZDMA 交联剂 100mg，15.4 mg BPO 引发剂，40 mL 乙腈，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0031]实施例5:妈交联PAA纳米水凝胶的制备
AA单体400 mg, CDMA交联剂lOOmg, AIBN引发剂16.7 mg,乙腈40 mL，加热到95°C，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho
[0032]实施例6:PMAA修饰聚乙二醇-叶酸的纳米水凝胶的制备步骤1:氨基化聚乙二醇-叶酸的制备
叶酸60mg溶解于20ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 247 mg，N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 230 mg，常温下反应12小时，产物通过加入10ml丙酮/乙醚(3:7)混合溶液沉淀，过滤，真空干燥得到的产物溶于500ml 二甲基亚砜(DMSO)中，加入 tBoc-NH-PEG_NH2200mg 和 N, N-二异丙基乙胺(DIEA)15mg，反应12小时。产物用冰乙醚沉淀，之后重新溶解于氢氧化钠水溶液中，透析48h，冻干后得到产物氨基化聚乙二醇-叶酸。
[0033]步骤2:PMAA纳米水凝胶粒子修饰聚乙二醇-叶酸分子
将PMAA凝胶粒子50 mg，加入20 mL PBS缓冲溶液(pH=5.5)，超声10分钟均匀分散，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 96 mg，室温下搅拌10分钟，然后加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 58 mg，反应2小时，再加入上一步制备的氨基化的聚乙二醇-叶酸25 mg,反应12小时。离心，将粒子用乙醇和去离子水各洗涤3次，真空烘箱干燥24 ho即可得到修饰叶酸的PMAA纳米水凝胶粒子。
[0034]实施例7:PMAA-co-PHEMA修饰聚乙二醇-叶酸的纳米水凝胶的制备
只需将例6步骤2中PMAA凝胶粒子改成例4中PMAA-co-PHEMA凝胶粒子，其他条件与例6均相同。
[0035]应用例:
取实施例7中制得的纳米水凝胶10 mg，加入6 mg的阿霉素，配成20 mL的溶液，磷酸盐缓冲溶液，常温下搅拌24h，产物用离心分离，冷冻干燥，制成负载有抗癌阿霉素的纳米水凝胶药物载体，载药率的重量比为18.5 - 45.4%。
【主权项】
1.一种谷胱甘肽/pH双重刺激响应离子交联型聚合物纳米水凝胶的制备方法，其特征在于具体步骤如下: 在单一的乙醇、乙腈、水、四氢呋喃、甲基异丁基酮或甲苯溶剂中，或者为乙腈一乙醇、乙腈一四氢呋喃、乙腈一水、乙腈一甲苯、乙醇一甲苯或甲基异丁基酮一乙腈的混合溶剂中，加入甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺或N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺单体； 以二甲基丙烯酸锌或二甲基丙烯酸钙作为交联剂；在引发剂的存在下，进行反应； 加热，反应温度为75~120°C ;用蒸馏沉淀法除去一半溶剂，回流溶剂反应时间为0.2~4h ;再用离心法除去剩下溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水反复洗涤3~5次；然后在真空烘箱内30~55°C干燥5~24h，即得到纳米水凝胶粒子。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶剂的浓度为0.5wt%~20.0wt%D3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单体在体系中所占体积比为1:20-20:1。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应所用的引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于将制得的纳米水凝胶粒子，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，先在溶剂中进行活化反应，再和氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，即得到得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶。6.如权利要求5所述的制备方法得到的纳米水凝胶，其特征在于纳米水凝胶大小为50~950nm,多分散度为 0.04-0.16。7.如权利要求6所述的制备方法得到的纳米水凝胶作为药物载体的应用，所载药物为抗癌药物阿霉素。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体是一种具有谷胱甘肽/pH双重刺激响应性的离子交联纳米水凝胶及其制备方法和作为药物载体的应用。本方法以甲基丙烯酸、丙烯酸、丙烯酰胺等为单体，二甲基丙烯酸锌、二甲基丙烯酸钙为交联剂，通过在乙腈溶剂里回流沉淀，制备高均匀度的低分散度的纳米水凝胶；通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺和氨基化的聚乙二醇-叶酸分子反应，可以得到叶酸靶向、聚乙二醇修饰的纳米水凝胶粒子。得到的纳米水凝胶为形态规整的球形，大小均匀，粒径可调控，具有谷胱甘肽和pH双重刺激响应性，在水中可以长期均匀分散无明显沉淀，有较好的胶体稳定性，良好的分散性，是一种较为理想的药物载体。
【IPC分类】C08F220/58, C08F220/06, C08F222/02, C08G81/02, A61K47/30, C08F220/28, A61K31/704, A61P35/00, C08G65/48
【公开号】CN104892949
【申请号】CN201510243609
【发明人】张子豪, 汪长春
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
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