一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用
一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料领域，具体涉及一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]组织工程学(tissue engineering),也有人称其为“再生医学”，是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。这个概念由美国国家科学基金委员会在1987年提出，1988年将其正式定义为:应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研宄开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。
[0003]生物医用材料(B1medical Materials)，亦可简称为生物材料(B1materials)，是用于对生物体进行诊断、治疗、修复或替换病变组织、器官或增进其功能的新型高技术材料。而组织工程学的关键技术之一是用生物材料制备具有良好的生物相容性且可被肌体降解吸收的细胞支架。凝胶态是固体和液体的中间状态，水凝胶是指能够在水中发生溶胀并能保持大量水分而又不会溶解的亲水交联三维聚合物网络。水凝胶是一类理想的生物材料，通过简单的改性，可以得到与天然细胞外基质类似、令人满意的物理和化学性质，同时对于氧气、营养物质、细胞代谢物和水溶性金属离子表现出良好的通透性。制备水凝胶的亲水性高分子按来源分为天然高分子和合成高分子。天然水凝胶包括胶原、明胶、纤维蛋白、多糖等，人工合成水凝胶包括合成类多肽、PEG及其衍生物、PMMA及其衍生物、PLGA及其衍生物等。
[0004]透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是糖胺聚糖中的一种，拥有良好的水溶性、生物相容性和降解性能，在促进细胞外基质的分泌和蛋白聚糖形成过程中发挥了重要的作用；然而，脆弱的物理机械性能以及在体内过快的降解速度限制了其应用前景。为了获得具有理想物理机械性能和生物降解速度的天然高分子水凝胶，化学交联的方式被广泛的应用于制备过程中。化学交联反应中经常应用到羧基、羟基、氨基等化学活性较高的官能团，常用的化学交联剂一般含有双官能团，比如二胺、二肼、二醛、二醇等，但这些交联剂通常具有细胞毒性，如果残留将影响水凝胶材料的生物相容性。需要研宄一种新型的化学交联高分子水凝胶，来避免交联反应中添加额外化学物质而带来的细胞毒性。同时，现代医学要求生物材料在使用中能够具有可塑和可控性，实现微创的治疗效果。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明提供了一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶。所述水凝胶物理性质可控，具有良好的细胞相容性和生物降解性能，可用于组织工程原位损伤修复或用于构建可控吸收的三维细胞支架。
[0006]本发明通过以下技术方案来实现:
一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶，以具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物为原料，将原料溶解，然后通过巯基之间氧化反应形成稳定的二硫键，从而构建三维化学交联的智能型水凝胶，通过调节巯基-透明质酸高分子聚合物表面巯基密度、凝胶温度和透明质酸的分子量，利用巯基和二硫键之间的氧化还原转变特性，从而控制凝胶的形成时间、降解时间以及力学特性，构建具有良好三维网络交联结构的可控智能型水凝胶。作为可选方式，所述三维化学交联的反应条件为pH值7.4?8.0。在还原剂作用下，所述水凝胶中的二硫键可发生断裂，凝胶结构迅速崩塌，降解为生物相容性良好的透明质酸单分子物质。
[0007]作为可选方式，具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物是以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到的。
[0008]作为可选方式，所述透明质酸的分子量为:0.1MDa?1.0MDa0
[0009]作为可选方式，所述巯基-透明质酸化合物中的半胱氨接枝率为；10%?60% ； 作为可选方式，所述巯基-透明质酸化合物浓度为1~5% ;进一步的可以为1.0%或2.0%
或 3.0%。
[0010]通过调整透明质酸的分子量(0.1 MDa,0.3 MDaU MDa)、半胱氨的接枝率(11.28%、12.41%、14.69%,29.13%,33.54%,37.47%,51.47%,55.44%,60.56%)、巯基-透明质酸化合物的浓度(1.0 wt %、2.0 wt%或3.0%)、凝胶环境的温度(4°C、37°C )，可以精确控制水凝胶形成的时间(从6分钟到2小时以上)。
[0011]作为可选方式，所述水凝胶中的二硫键可在二硫苏糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH)等还原性小分子存在的条件下，使透明质酸之间的二硫键断开，从而使水凝胶发生还原裂解。进一步的，所述还原性小分子的在体系中的浓度为0.通过调整透明质酸的分子量、半胱氨的接枝率、还原性小分子的浓度，可以控制水凝胶还原裂解的程度(从几分钟到几小时)。
[0012]作为可选方式，所述水凝胶可通过模具成型为特定的形状。
[0013]作为可选方式，所述水凝胶是可注射的，通过控制材料的凝胶时间或环境温度，可使产品在注射前呈流体状态，在注射后形成凝胶状态。所述水凝胶具有可注射、可原位成胶、凝胶过程不产生或残留含有细胞毒性物质等优点。所述水凝胶可以通过注射的方式植入体内，并在组织损伤部位形成水凝胶，实现组织损伤的原位修复。
[0014]本发明提供了一种基于具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物的水凝胶成胶与裂解体系，所述水凝胶成胶与裂解体系包括上述的巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶和还原性小分子。其成胶时间与裂解程度可根据应用需要灵活调整，该体系具有良好的细胞相容性，凝胶过程不产生具有细胞毒性的物质，无外源性物质的引入，有利于细胞的增殖；具有良好的生物降解性能，细胞本身产生的还原性物质也可加快二硫键降解，凝胶降解过程不产生具有细胞毒性的物质，有利于细胞基质的分泌和组织损伤部位的修复。
[0015]本发明还提供了一种上述的二硫键交联的透明质酸水凝胶的制备方法，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物(海绵状固体)，将其溶解，然后通过巯基之间氧化反应形成二硫键，构建具有三维化学交联结构的水凝胶。
[0016]作为可选，可将溶解后的巯基-透明质酸化合物置于相应的模具中进行凝胶反应以获得特定形状的水凝胶；也可以将溶解后的巯基-透明质酸化合物制成注射液，注射后使其在目标区域原位成胶。
[0017]作为可选方式，在上述制备方法中，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物，将其溶解于PH=7.4的PBS缓冲液中，然后调节pH值至7.4?8.0，通过巯基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。
[0018]作为可选，采用加入IM的NaOH溶液的PH值。
[0019]作为可选方式，在上述制备方法中，具体包括以下步骤:
1)透明质酸的半胱氨改性:
半胱氨上的氨基与透明质酸上的羧基在N-琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDOHCl)的催化下进行酰胺反应，制备出原料巯基-透明质酸化合物；
2)化学交联:
将步骤I)中的制备的半胱氨改性透明质酸溶解，然后通过巯基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。
[0020]作为可选方式，在上述制备方法中，具体包括以下步骤:
1)透明质酸的半胱氨改性:
透明质酸钠在N-琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸土卜
ΠΤΤ.(EDC.HCl)的催化下与半胱氨(CSH -HC1)盐酸盐反应，随后加入二硫苏糖醇(DTT)，反应结束后，在去离子水中透析，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸；
2)化学交联:
将步骤I)中的制备的半胱氨改性透明质酸溶解于pH=7.4的PBS缓冲液中，然后通过疏
基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。
[0021 ] 在半胱氨改性透明质酸的制备过程中加入二硫苏糖醇(DTT )可避免制备过程中部分半胱氨改性透明质酸发生二硫键交联导致冷冻干燥后得到部分海绵状产物无法在后续步骤中溶解。透析过程又可除去多余的二硫苏糖醇(DTT)，避免其残留在产物中影响后续步骤的效果。
[0022]作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤I)具体为:
将透明质酸钠溶解于去离子水中，首先加入N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDOHCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入半胱氨(CSH*HC1)盐酸盐溶液，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0023]反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5 ，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0024]作为可选方式，在上述制备方法中，透明质酸钠中羧基:N-琥珀酰亚胺:1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为1:2:2~4:l~4:3~12o通过调整半胱氨、透明质酸、NHS和EDCI的物质的量之比，可以控制半胱氨的取代度。作为可选方式，上述透明质酸的分子量为:0.1MDa?1.0MDa0
[0025]作为可选方式，上述步骤2)中巯基-透明质酸化合物溶液浓度为1.0%-3.0%。
[0026]本发明还提供了一种上述的二硫键交联的透明质酸水凝胶的应用，其特征在于，将其用作三维细胞培养支架或将其制成可注射水凝胶。进一步的，所述三维细胞培养支架可作为组织工程尤其是软骨组织工程；所述可注射水凝胶可用于美容、防止伤口粘连、原位损伤修复、组织工程等。
[0027]本发明还提供了一种三维细胞培养体系，包括上述的二硫键交联的透明质酸水凝胶以及均匀分布于其中的细胞。在该培养体系中细胞可在水凝胶构成整个三维支架中均匀分布，克服了现有三维支架中细胞较难迀移到支架内部的缺陷，所述水凝胶还具有良好的机械性能，且当细胞在支架中增殖到一定规模后，细胞本身产生的还原性物质或外源性地加入的还原性小分子可以使水凝胶中的二硫键断裂，水凝胶发生裂解，裂解产生的透明质酸降解后可形成完全有细胞和细胞外基质组成的类似三维组织的三维立体结构，且降解产物可被机体快速吸收，使培养体系具有良好的生物相容性，可用于多种细胞的三维培养。通过调控透明质酸的分子量、半胱氨的接枝率、还原性小分子的浓度等参数可实现培养体系中水凝胶支架的可控降解。
[0028]本发明还提供了一种三维细胞培养体系的构建方法，包括以下步骤:
(1)将具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物溶解于培养基中，然后加入细胞悬液，混合均匀，形成混合液；
(2)通过巯基之间形成二硫键的反应，使所得混合液中的透明质酸形成三维化学交联的水凝胶并将细胞包裹于其中。
[0029]作为可选方式，在上述三维细胞培养体系的构建方法中，步骤(2)具体为:将步骤(O制得的混合液加入到模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养;
或者，直接将步骤(I)制得的混合液注射到生物体体内，使透明质酸在生物体体内发生三维化学交联形成水凝胶。
[0030]作为可选方式，所述巯基-透明质酸化合物溶于培养基后的浓度为1~3%，优选3%。基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa?1.0MDa，优选为0.3MDa。
[0031]作为可选方式，细胞接种密度为5X 16 cells/mLo所述细胞可以是初生兔软骨细胞(chondrocytes)、初生兔骨间充质干细胞(MSCs )、小鼠成纤维细胞(L929 ce 11 s )等。
[0032]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0033]本发明的有益效果:
本发明所述水凝胶应用的原料透明质酸为天然高分子，具有良好的水溶性、吸水性，所得水凝胶物理性质可控，具有简便的凝胶方式，凝胶过程不产生含有细胞毒性的物质，具有良好的细胞相容性和生物降解性能，可用于组织工程原位损伤修复或用于构建三维细胞支架。
[0034]【附图说明】: 图1为本发明所述水凝胶的制备路线图；
图2为实施例1-9中制备的各个水凝胶材料的力学特性测试结果；
图3为不同浓度的还原剂DTT条件下的降解特性(重量变化)，图中从上到下三个分图的DTT浓度依次为0.1mM, ImM, 1Mm ；
图4为实施例12中所述初生兔软骨细胞(chondrocytes)与本发明所述水凝胶共培养结果(从上到下分别为:3天，7天，14天，21天；从左到右分别为:共聚焦不同倍数条件下观察、TEM观察)；
图5为实施例13中所述初生兔骨间充质干细胞(MSCs)的培养结果(从上到下分别为:3天，7天，14天，21天；从左到右分别为:共聚焦不同倍数条件下观察、TEM观察)；
图6为实施例13中所述MSC细胞的培养结果(从上到下分别为:3天，7天，14天，21天；从左到右分别为:共聚焦不同倍数条件下观察、TEM观察)；
图7为实施例16中包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天(图中左侧)、28天(图中右侧)后激光共聚焦照片；
图8为实施例16中包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天(图中左侧)、28天(图中右侧)后激光共聚焦照片。
[0035]【具体实施方式】:
以下通过实施例的【具体实施方式】再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。
[0036]实施例1
(I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入385mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 11.36mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入10mL46.5mg/ml的二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0037](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0038]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:2:1:3ο
[0039](3)将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0 (该溶液在4°C条件下在2个小时后仍能保持良好的流动性)，然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。37°C条件下的凝胶时间为34分钟。
[0040]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa,半胱氨接枝率为14.69%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为3.3kPa?
[0041]实施例2 (I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入575mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 22.72mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入10mL93.0mg/ml的二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0042](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0043]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:3:2:6ο
[0044](3 )将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，(该溶液在4°C条件下在2个小时后仍能保持良好的流动性)然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。37°C条件下的凝胶时间为28分钟
其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa,半胱氨接枝率为37.47%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为12.4kPa。
[0045]实施例3
(I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入770mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用I M的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 45.44mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入10mL186.0mg/ml的二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0046](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0047]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:4:4:12。
[0048](3 )将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，(该溶液在4°C条件下在2个小时后仍能保持良好的流动性)然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。37°C条件下的凝胶时间为18分钟
其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa,半胱氨接枝率为60.56%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为22.0kPa0
[0049]实施例4
参照实施例1所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为0.3MDa。
[0050]所得巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为12.41%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为7.7kPa?
[0051]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为25分钟。
[0052]实施例5
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为0.3MDa。
[0053]所得巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为16.2kPa。
[0054]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为18分钟。
[0055]实施例6
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为0.3MDa所得巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为35.2kPa。
[0056]制得的产品在形成凝胶前在在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为11分钟。
[0057]实施例7
参照实施例1所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为1.0 MDa。
[0058]所得巯基-透明质酸化合物分子量为1.0MDa,半胱氨接枝率为11.28%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为9.2kPa?
[0059]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为25分钟。
[0060]实施例8
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为1.0 MDa。
[0061]所得巯基-透明质酸化合物分子量为1.0MDa,半胱氨接枝率为29.13%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为17.7kPa?
[0062]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在116分钟内仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为15分钟。
[0063]实施例9
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为1.0 MDa所得巯基-透明质酸化合物分子量为1.0MDa,半胱氨接枝率为51.47%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为42.8kPa。
[0064]制得的产品在形成凝胶前在在4°C条件下在105分钟内仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为6分钟。
[0065]实施例10
(I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入385mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 11.36mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时。
[0066](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0067]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:2:1:3ο
[0068](3)将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。
[0069]所得水凝胶综合性能与实施例1中产品基本一致。只是在步骤(2)中有时会生成部分绵状干燥产物，很难在后续步骤中溶解。
[0070]实施例11
分别取实施例1~9中制得的水凝胶，加入还原性小分子DTT(分别对DTT浓度为0.1mM,ImM, 1Mm条件下水凝胶的降解情况进行检测)，凝胶能够随着时间的延长逐步降解，直到变为溶液状态。
[0071]结果如图3所示:本发明所述水凝胶在还原环境下可加快降解，且降解速率随还原剂浓度增高而加快。
[0072]另外，将上述还原性小分子由DTT换成谷胱甘肽(GSH)也可以达到基本相同的降解效果。
[0073]实施例12
(I)将初生兔软骨细胞(chondrocytes)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0074](2)将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的NaOH溶液调整ρΗ=7.4?8.0，然后加入上述制备的100 μ L chondrocyte细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5 X 16 cells/mL)，将溶液倒入模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入到a -MEM培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养。
[0075]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%。
[0076]包裹chondrocyte细胞的水凝胶培养I天、3天、7天、14天、21天后，分别用光学显微镜，激光共聚焦和扫描轨道电子显微镜观察细胞的生长情况。结果如图4所示:共培养过程中，chondrocyte细胞始终保持圆形形态；共培养7天后，可以明显观察到成对细胞的出现；共培养14天后，可以明显观察到细胞团和基质分泌现象；共培养21天后，可以明显观察到基质的大量分泌和基质包裹的细胞团。观察结果表明chondrocyte细胞可以在共培养体系中进行正常的增殖，并保持分泌基质等正常的生物学功能。
[0077]实施例13
(I)将初生兔骨间充质干细胞(MSCs)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0078](2)将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，然后加入上述制备的100 μ L MSCs细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5X 16 cells/mL)，将溶液倒入模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入到a -MBl培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养。
[0079]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%。
[0080]包裹MSCs 细胞的水凝胶培养I天、3天、7天、14天、21天后，分别用光学显微镜，激光共聚焦和扫描轨道电子显微镜观察细胞的生长情况。结果如图5所示:共培养过程中，L929细胞始终保持圆形形态；共培养7天后，可以明显观察到成对细胞的出现；共培养14天后，可以明显观察到细胞团和基质分泌现象；共培养21天后，可以明显观察到大量的被基质包裹的细胞团。观察结果表明L929细胞可以在共培养体系中进行正常的增殖，并保持分泌基质等正常的生物学功能。
[0081]实施例14
(I)将小鼠成纤维细胞(L929 cells)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0082](2)将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的NaOH溶液调整ρΗ=7.4?8.0，然后加入上述制备的100 μ L L929细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5X 16 cells/mL)，将溶液倒入模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入到a -MBl培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养。
[0083]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%。
[0084]包裹L929细胞的水凝胶培养I天、3天、7天、14天、21天后，分别用光学显微镜，激光共聚焦和扫描轨道电子显微镜观察细胞的生长情况。结果如图6所示:共培养过程中，MSCs细胞始终保持圆形形态，表现出一定的增殖能力。观察结果表明MSCs细胞可以在共培养体系中进行正常的增殖。
[0085]实施例15
I将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的PBS缓冲溶液调整ρΗ=7.4，(水凝胶终浓度为3%)，然后用注射器将0.1mL溶液注射到BALB/C小白鼠皮下。
[0086]2其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%。
[0087]3水凝胶在小白鼠体内培养7天、28天后，取出，观察水凝胶的降解情况，并用激光共聚焦观察细胞的生长情况。
[0088]实验结果发现，该凝胶能够在体内较好保持其凝胶状态，不出现显著性收缩和溶胀。
[0089]实施例16
I将初生兔软骨细胞(chondrocytes)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0090]2将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a-MEM培养基中，首先加入IM的PBS缓冲溶液调整pH=7.4，然后加入上述制备的100 μ L chondrocyte细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5 X 16 cells/mL),用注射器将0.1mL溶液注射到BALB/C小白鼠皮下。
[0091]3其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%。
[0092]4包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天、28天后，取出，用激光共聚焦观察细胞的生长情况(如图7所示)。
[0093]实验结果发现，该在细胞凝胶能够在体内较好保持其凝胶状态，不出现显著性收缩和溶胀。细胞在凝胶内部能够很好的增殖。
[0094]实施例17
I将初生兔软骨细胞(chondrocytes)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10uL浓度为27.5X 107 cells/mL的细胞悬液。
[0095]2将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的PBS缓冲溶液调整ρΗ=7.4，然后加入上述制备的100 μ L chondrocyte细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为2.5 X 17 cells/mL),用注射器将0.1mL溶液注射到BALB/C小白鼠皮下。
[0096]3其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%。
[0097]4包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天、28天后，取出，用激光共聚焦观察细胞的生长情况。(如图8所示)
实验结果发现，该在细胞凝胶能够在体内较好保持其凝胶状态，不出现显著性收缩和溶胀。细胞在凝胶内部能够很好的增殖。
[0098]以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶，其特征在于，以具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物为原料，通过调节其表面巯基密度，凝胶温度和透明质酸的分子量，利用巯基和二硫键之间的氧化还原转变特性，从而控制凝胶的形成时间、降解时间以及力学特性，构建具有良好三维网络交联结构的可控智能型水凝胶。2.根据权利要求1所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的凝胶时间可精确调控。3.根据权利要求1所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，所述水凝胶能够在还原性小分子存在的条件下实现可控降解。4.一种如权利要求1所述的巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物，将其溶解，然后通过巯基之间氧化反应形成二硫键，并形成具有三维化学交联的水凝胶。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物，将其溶解于PH=7.4的PBS缓冲液中，然后加入IM的NaOH溶液调节pH值至7.4?8.0，通过巯基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)透明质酸的半胱氨改性: 透明质酸钠在N-琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)的催化下与半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐反应，随后加入二硫苏糖醇(DTT)，反应结束后，在去离子水中透析，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸； 2)将步骤I)中的制备的半胱氨改性透明质酸溶解于pH=7.4的PBS缓冲液中，然后通过巯基之间氧化作用形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。7.—种权利要求1所述的二硫键交联的透明质酸水凝胶的应用，其特征在于，将其用作三维细胞培养支架或将其制成可注射水凝胶。8.—种三维细胞培养支架体系，其特征在于，包括权利要求1所述的基于巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶以及均匀分布于其中的细胞。9.一种三维细胞培养体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物溶解于培养基中，然后加入细胞悬液，混合均匀，形成混合液； (2)通过巯基之间氧化形成二硫键的反应，使所得混合液中的透明质酸形成三维化学交联的水凝胶并将细胞包裹于其中。10.根据权利要求9所述的三维细胞培养体系的构建方法，其特征在于，步骤(2)具体为:将步骤(I)制得的混合液加入到模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养；或者，直接将步骤(I)制得的混合液注射到生物体体内，使透明质酸在生物体体内发生三维化学交联形成水凝胶。
【专利摘要】本发明公开了一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用，属于生物材料领域。所述水凝胶以具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物为原料，通过调节巯基密度（10%—60%），凝胶温度（4℃，37℃）和透明质酸的分子量（0.1M，0.3M，1M），利用巯基和二硫键之间的氧化还原转变特性，从而控制凝胶的形成时间、降解时间以及力学特性，构建了具有良好三维网络交联结构的可控可注射式智能型水凝胶。同时，该类水凝胶成分组成单一，成胶前后无外源性毒性物质引入，具有良好的生物相容性和降解性能。基于以上研究发现，该类可控自交联高分子聚合物可用于组织工程原位损伤的微创修复以及构建智能可调节的三维细胞培养支架。
【IPC分类】C08L5/08, C08J3/24, A61L27/58, C08J3/075, A61L27/20
【公开号】CN104892962
【申请号】CN201510303980
【发明人】孙勇, 樊渝江, 边少荃, 曹万旭, 张兴栋
【申请人】四川大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月5日
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料领域，具体涉及一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]组织工程学(tissue engineering),也有人称其为“再生医学”，是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。这个概念由美国国家科学基金委员会在1987年提出，1988年将其正式定义为:应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研宄开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。
[0003]生物医用材料(B1medical Materials)，亦可简称为生物材料(B1materials)，是用于对生物体进行诊断、治疗、修复或替换病变组织、器官或增进其功能的新型高技术材料。而组织工程学的关键技术之一是用生物材料制备具有良好的生物相容性且可被肌体降解吸收的细胞支架。凝胶态是固体和液体的中间状态，水凝胶是指能够在水中发生溶胀并能保持大量水分而又不会溶解的亲水交联三维聚合物网络。水凝胶是一类理想的生物材料，通过简单的改性，可以得到与天然细胞外基质类似、令人满意的物理和化学性质，同时对于氧气、营养物质、细胞代谢物和水溶性金属离子表现出良好的通透性。制备水凝胶的亲水性高分子按来源分为天然高分子和合成高分子。天然水凝胶包括胶原、明胶、纤维蛋白、多糖等，人工合成水凝胶包括合成类多肽、PEG及其衍生物、PMMA及其衍生物、PLGA及其衍生物等。
[0004]透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是糖胺聚糖中的一种，拥有良好的水溶性、生物相容性和降解性能，在促进细胞外基质的分泌和蛋白聚糖形成过程中发挥了重要的作用；然而，脆弱的物理机械性能以及在体内过快的降解速度限制了其应用前景。为了获得具有理想物理机械性能和生物降解速度的天然高分子水凝胶，化学交联的方式被广泛的应用于制备过程中。化学交联反应中经常应用到羧基、羟基、氨基等化学活性较高的官能团，常用的化学交联剂一般含有双官能团，比如二胺、二肼、二醛、二醇等，但这些交联剂通常具有细胞毒性，如果残留将影响水凝胶材料的生物相容性。需要研宄一种新型的化学交联高分子水凝胶，来避免交联反应中添加额外化学物质而带来的细胞毒性。同时，现代医学要求生物材料在使用中能够具有可塑和可控性，实现微创的治疗效果。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明提供了一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶。所述水凝胶物理性质可控，具有良好的细胞相容性和生物降解性能，可用于组织工程原位损伤修复或用于构建可控吸收的三维细胞支架。
[0006]本发明通过以下技术方案来实现:
一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶，以具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物为原料，将原料溶解，然后通过巯基之间氧化反应形成稳定的二硫键，从而构建三维化学交联的智能型水凝胶，通过调节巯基-透明质酸高分子聚合物表面巯基密度、凝胶温度和透明质酸的分子量，利用巯基和二硫键之间的氧化还原转变特性，从而控制凝胶的形成时间、降解时间以及力学特性，构建具有良好三维网络交联结构的可控智能型水凝胶。作为可选方式，所述三维化学交联的反应条件为pH值7.4?8.0。在还原剂作用下，所述水凝胶中的二硫键可发生断裂，凝胶结构迅速崩塌，降解为生物相容性良好的透明质酸单分子物质。
[0007]作为可选方式，具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物是以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到的。
[0008]作为可选方式，所述透明质酸的分子量为:0.1MDa?1.0MDa0
[0009]作为可选方式，所述巯基-透明质酸化合物中的半胱氨接枝率为；10%?60% ； 作为可选方式，所述巯基-透明质酸化合物浓度为1~5% ;进一步的可以为1.0%或2.0%
或 3.0%。
[0010]通过调整透明质酸的分子量(0.1 MDa,0.3 MDaU MDa)、半胱氨的接枝率(11.28%、12.41%、14.69%,29.13%,33.54%,37.47%,51.47%,55.44%,60.56%)、巯基-透明质酸化合物的浓度(1.0 wt %、2.0 wt%或3.0%)、凝胶环境的温度(4°C、37°C )，可以精确控制水凝胶形成的时间(从6分钟到2小时以上)。
[0011]作为可选方式，所述水凝胶中的二硫键可在二硫苏糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH)等还原性小分子存在的条件下，使透明质酸之间的二硫键断开，从而使水凝胶发生还原裂解。进一步的，所述还原性小分子的在体系中的浓度为0.通过调整透明质酸的分子量、半胱氨的接枝率、还原性小分子的浓度，可以控制水凝胶还原裂解的程度(从几分钟到几小时)。
[0012]作为可选方式，所述水凝胶可通过模具成型为特定的形状。
[0013]作为可选方式，所述水凝胶是可注射的，通过控制材料的凝胶时间或环境温度，可使产品在注射前呈流体状态，在注射后形成凝胶状态。所述水凝胶具有可注射、可原位成胶、凝胶过程不产生或残留含有细胞毒性物质等优点。所述水凝胶可以通过注射的方式植入体内，并在组织损伤部位形成水凝胶，实现组织损伤的原位修复。
[0014]本发明提供了一种基于具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物的水凝胶成胶与裂解体系，所述水凝胶成胶与裂解体系包括上述的巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶和还原性小分子。其成胶时间与裂解程度可根据应用需要灵活调整，该体系具有良好的细胞相容性，凝胶过程不产生具有细胞毒性的物质，无外源性物质的引入，有利于细胞的增殖；具有良好的生物降解性能，细胞本身产生的还原性物质也可加快二硫键降解，凝胶降解过程不产生具有细胞毒性的物质，有利于细胞基质的分泌和组织损伤部位的修复。
[0015]本发明还提供了一种上述的二硫键交联的透明质酸水凝胶的制备方法，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物(海绵状固体)，将其溶解，然后通过巯基之间氧化反应形成二硫键，构建具有三维化学交联结构的水凝胶。
[0016]作为可选，可将溶解后的巯基-透明质酸化合物置于相应的模具中进行凝胶反应以获得特定形状的水凝胶；也可以将溶解后的巯基-透明质酸化合物制成注射液，注射后使其在目标区域原位成胶。
[0017]作为可选方式，在上述制备方法中，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物，将其溶解于PH=7.4的PBS缓冲液中，然后调节pH值至7.4?8.0，通过巯基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。
[0018]作为可选，采用加入IM的NaOH溶液的PH值。
[0019]作为可选方式，在上述制备方法中，具体包括以下步骤:
1)透明质酸的半胱氨改性:
半胱氨上的氨基与透明质酸上的羧基在N-琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDOHCl)的催化下进行酰胺反应，制备出原料巯基-透明质酸化合物；
2)化学交联:
将步骤I)中的制备的半胱氨改性透明质酸溶解，然后通过巯基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。
[0020]作为可选方式，在上述制备方法中，具体包括以下步骤:
1)透明质酸的半胱氨改性:
透明质酸钠在N-琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸土卜
ΠΤΤ.(EDC.HCl)的催化下与半胱氨(CSH -HC1)盐酸盐反应，随后加入二硫苏糖醇(DTT)，反应结束后，在去离子水中透析，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸；
2)化学交联:
将步骤I)中的制备的半胱氨改性透明质酸溶解于pH=7.4的PBS缓冲液中，然后通过疏
基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。
[0021 ] 在半胱氨改性透明质酸的制备过程中加入二硫苏糖醇(DTT )可避免制备过程中部分半胱氨改性透明质酸发生二硫键交联导致冷冻干燥后得到部分海绵状产物无法在后续步骤中溶解。透析过程又可除去多余的二硫苏糖醇(DTT)，避免其残留在产物中影响后续步骤的效果。
[0022]作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤I)具体为:
将透明质酸钠溶解于去离子水中，首先加入N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDOHCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入半胱氨(CSH*HC1)盐酸盐溶液，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0023]反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5 ，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0024]作为可选方式，在上述制备方法中，透明质酸钠中羧基:N-琥珀酰亚胺:1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为1:2:2~4:l~4:3~12o通过调整半胱氨、透明质酸、NHS和EDCI的物质的量之比，可以控制半胱氨的取代度。作为可选方式，上述透明质酸的分子量为:0.1MDa?1.0MDa0
[0025]作为可选方式，上述步骤2)中巯基-透明质酸化合物溶液浓度为1.0%-3.0%。
[0026]本发明还提供了一种上述的二硫键交联的透明质酸水凝胶的应用，其特征在于，将其用作三维细胞培养支架或将其制成可注射水凝胶。进一步的，所述三维细胞培养支架可作为组织工程尤其是软骨组织工程；所述可注射水凝胶可用于美容、防止伤口粘连、原位损伤修复、组织工程等。
[0027]本发明还提供了一种三维细胞培养体系，包括上述的二硫键交联的透明质酸水凝胶以及均匀分布于其中的细胞。在该培养体系中细胞可在水凝胶构成整个三维支架中均匀分布，克服了现有三维支架中细胞较难迀移到支架内部的缺陷，所述水凝胶还具有良好的机械性能，且当细胞在支架中增殖到一定规模后，细胞本身产生的还原性物质或外源性地加入的还原性小分子可以使水凝胶中的二硫键断裂，水凝胶发生裂解，裂解产生的透明质酸降解后可形成完全有细胞和细胞外基质组成的类似三维组织的三维立体结构，且降解产物可被机体快速吸收，使培养体系具有良好的生物相容性，可用于多种细胞的三维培养。通过调控透明质酸的分子量、半胱氨的接枝率、还原性小分子的浓度等参数可实现培养体系中水凝胶支架的可控降解。
[0028]本发明还提供了一种三维细胞培养体系的构建方法，包括以下步骤:
(1)将具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物溶解于培养基中，然后加入细胞悬液，混合均匀，形成混合液；
(2)通过巯基之间形成二硫键的反应，使所得混合液中的透明质酸形成三维化学交联的水凝胶并将细胞包裹于其中。
[0029]作为可选方式，在上述三维细胞培养体系的构建方法中，步骤(2)具体为:将步骤(O制得的混合液加入到模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养;
或者，直接将步骤(I)制得的混合液注射到生物体体内，使透明质酸在生物体体内发生三维化学交联形成水凝胶。
[0030]作为可选方式，所述巯基-透明质酸化合物溶于培养基后的浓度为1~3%，优选3%。基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa?1.0MDa，优选为0.3MDa。
[0031]作为可选方式，细胞接种密度为5X 16 cells/mLo所述细胞可以是初生兔软骨细胞(chondrocytes)、初生兔骨间充质干细胞(MSCs )、小鼠成纤维细胞(L929 ce 11 s )等。
[0032]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0033]本发明的有益效果:
本发明所述水凝胶应用的原料透明质酸为天然高分子，具有良好的水溶性、吸水性，所得水凝胶物理性质可控，具有简便的凝胶方式，凝胶过程不产生含有细胞毒性的物质，具有良好的细胞相容性和生物降解性能，可用于组织工程原位损伤修复或用于构建三维细胞支架。
[0034]【附图说明】: 图1为本发明所述水凝胶的制备路线图；
图2为实施例1-9中制备的各个水凝胶材料的力学特性测试结果；
图3为不同浓度的还原剂DTT条件下的降解特性(重量变化)，图中从上到下三个分图的DTT浓度依次为0.1mM, ImM, 1Mm ；
图4为实施例12中所述初生兔软骨细胞(chondrocytes)与本发明所述水凝胶共培养结果(从上到下分别为:3天，7天，14天，21天；从左到右分别为:共聚焦不同倍数条件下观察、TEM观察)；
图5为实施例13中所述初生兔骨间充质干细胞(MSCs)的培养结果(从上到下分别为:3天，7天，14天，21天；从左到右分别为:共聚焦不同倍数条件下观察、TEM观察)；
图6为实施例13中所述MSC细胞的培养结果(从上到下分别为:3天，7天，14天，21天；从左到右分别为:共聚焦不同倍数条件下观察、TEM观察)；
图7为实施例16中包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天(图中左侧)、28天(图中右侧)后激光共聚焦照片；
图8为实施例16中包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天(图中左侧)、28天(图中右侧)后激光共聚焦照片。
[0035]【具体实施方式】:
以下通过实施例的【具体实施方式】再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。
[0036]实施例1
(I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入385mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 11.36mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入10mL46.5mg/ml的二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0037](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0038]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:2:1:3ο
[0039](3)将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0 (该溶液在4°C条件下在2个小时后仍能保持良好的流动性)，然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。37°C条件下的凝胶时间为34分钟。
[0040]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa,半胱氨接枝率为14.69%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为3.3kPa?
[0041]实施例2 (I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入575mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 22.72mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入10mL93.0mg/ml的二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0042](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0043]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:3:2:6ο
[0044](3 )将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，(该溶液在4°C条件下在2个小时后仍能保持良好的流动性)然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。37°C条件下的凝胶时间为28分钟
其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa,半胱氨接枝率为37.47%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为12.4kPa。
[0045]实施例3
(I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入770mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用I M的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 45.44mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时；最后用IM的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入10mL186.0mg/ml的二硫苏糖醇(DTT)溶液，反应12个小时。
[0046](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0047]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:4:4:12。
[0048](3 )将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，(该溶液在4°C条件下在2个小时后仍能保持良好的流动性)然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。37°C条件下的凝胶时间为18分钟
其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.1MDa,半胱氨接枝率为60.56%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为22.0kPa0
[0049]实施例4
参照实施例1所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为0.3MDa。
[0050]所得巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为12.41%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为7.7kPa?
[0051]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为25分钟。
[0052]实施例5
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为0.3MDa。
[0053]所得巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为16.2kPa。
[0054]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为18分钟。
[0055]实施例6
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为0.3MDa所得巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为35.2kPa。
[0056]制得的产品在形成凝胶前在在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为11分钟。
[0057]实施例7
参照实施例1所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为1.0 MDa。
[0058]所得巯基-透明质酸化合物分子量为1.0MDa,半胱氨接枝率为11.28%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为9.2kPa?
[0059]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在2个小时后仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为25分钟。
[0060]实施例8
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为1.0 MDa。
[0061]所得巯基-透明质酸化合物分子量为1.0MDa,半胱氨接枝率为29.13%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为17.7kPa?
[0062]制得的产品在形成凝胶前在4°C条件下在116分钟内仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为15分钟。
[0063]实施例9
参照实施例2所述方法，其不同之处仅在于:透明质酸钠分子量为1.0 MDa所得巯基-透明质酸化合物分子量为1.0MDa,半胱氨接枝率为51.47%，巯基-透明质酸化合物溶液浓度3.0%，1%形变量，1Hz频率检测条件下，储能模量为42.8kPa。
[0064]制得的产品在形成凝胶前在在4°C条件下在105分钟内仍保持良好的流动性，37°C条件下的凝胶时间为6分钟。
[0065]实施例10
(I)将400mg透明质酸钠溶解于10mL去离子水中，首先加入230mg N-琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解；然后加入385mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)粉体，用IM的NaOH和IM的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入1mL 11.36mg/mL的半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐，反应24个小时。
[0066](2)反应结束后，用IM的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸。
[0067]其中，透明质酸钠分子量为0.lMDa，透明质酸钠中羧基:N_琥珀酰亚胺:1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐:半胱氨盐酸盐:二硫苏糖醇的物质的量之比为 1:2:2:1:3ο
[0068](3)将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL pH=7.4的PBS缓冲液中，首先在冰水浴条件下加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，然后将溶液倒入直径为8.5mm，高度为3.0mm的圆柱形模具中，最后放置在37°C的保温箱中，通过巯基反应形成二硫键制备水凝胶。
[0069]所得水凝胶综合性能与实施例1中产品基本一致。只是在步骤(2)中有时会生成部分绵状干燥产物，很难在后续步骤中溶解。
[0070]实施例11
分别取实施例1~9中制得的水凝胶，加入还原性小分子DTT(分别对DTT浓度为0.1mM,ImM, 1Mm条件下水凝胶的降解情况进行检测)，凝胶能够随着时间的延长逐步降解，直到变为溶液状态。
[0071]结果如图3所示:本发明所述水凝胶在还原环境下可加快降解，且降解速率随还原剂浓度增高而加快。
[0072]另外，将上述还原性小分子由DTT换成谷胱甘肽(GSH)也可以达到基本相同的降解效果。
[0073]实施例12
(I)将初生兔软骨细胞(chondrocytes)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0074](2)将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的NaOH溶液调整ρΗ=7.4?8.0，然后加入上述制备的100 μ L chondrocyte细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5 X 16 cells/mL)，将溶液倒入模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入到a -MEM培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养。
[0075]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%。
[0076]包裹chondrocyte细胞的水凝胶培养I天、3天、7天、14天、21天后，分别用光学显微镜，激光共聚焦和扫描轨道电子显微镜观察细胞的生长情况。结果如图4所示:共培养过程中，chondrocyte细胞始终保持圆形形态；共培养7天后，可以明显观察到成对细胞的出现；共培养14天后，可以明显观察到细胞团和基质分泌现象；共培养21天后，可以明显观察到基质的大量分泌和基质包裹的细胞团。观察结果表明chondrocyte细胞可以在共培养体系中进行正常的增殖，并保持分泌基质等正常的生物学功能。
[0077]实施例13
(I)将初生兔骨间充质干细胞(MSCs)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0078](2)将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的NaOH溶液调整pH=7.4?8.0，然后加入上述制备的100 μ L MSCs细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5X 16 cells/mL)，将溶液倒入模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入到a -MBl培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养。
[0079]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%。
[0080]包裹MSCs 细胞的水凝胶培养I天、3天、7天、14天、21天后，分别用光学显微镜，激光共聚焦和扫描轨道电子显微镜观察细胞的生长情况。结果如图5所示:共培养过程中，L929细胞始终保持圆形形态；共培养7天后，可以明显观察到成对细胞的出现；共培养14天后，可以明显观察到细胞团和基质分泌现象；共培养21天后，可以明显观察到大量的被基质包裹的细胞团。观察结果表明L929细胞可以在共培养体系中进行正常的增殖，并保持分泌基质等正常的生物学功能。
[0081]实施例14
(I)将小鼠成纤维细胞(L929 cells)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0082](2)将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的NaOH溶液调整ρΗ=7.4?8.0，然后加入上述制备的100 μ L L929细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5X 16 cells/mL)，将溶液倒入模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入到a -MBl培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养。
[0083]其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为55.44%。
[0084]包裹L929细胞的水凝胶培养I天、3天、7天、14天、21天后，分别用光学显微镜，激光共聚焦和扫描轨道电子显微镜观察细胞的生长情况。结果如图6所示:共培养过程中，MSCs细胞始终保持圆形形态，表现出一定的增殖能力。观察结果表明MSCs细胞可以在共培养体系中进行正常的增殖。
[0085]实施例15
I将30mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的PBS缓冲溶液调整ρΗ=7.4，(水凝胶终浓度为3%)，然后用注射器将0.1mL溶液注射到BALB/C小白鼠皮下。
[0086]2其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%。
[0087]3水凝胶在小白鼠体内培养7天、28天后，取出，观察水凝胶的降解情况，并用激光共聚焦观察细胞的生长情况。
[0088]实验结果发现，该凝胶能够在体内较好保持其凝胶状态，不出现显著性收缩和溶胀。
[0089]实施例16
I将初生兔软骨细胞(chondrocytes)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10yL浓度为5.5X107 cells/mL的细胞悬液。
[0090]2将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a-MEM培养基中，首先加入IM的PBS缓冲溶液调整pH=7.4，然后加入上述制备的100 μ L chondrocyte细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为5 X 16 cells/mL),用注射器将0.1mL溶液注射到BALB/C小白鼠皮下。
[0091]3其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%。
[0092]4包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天、28天后，取出，用激光共聚焦观察细胞的生长情况(如图7所示)。
[0093]实验结果发现，该在细胞凝胶能够在体内较好保持其凝胶状态，不出现显著性收缩和溶胀。细胞在凝胶内部能够很好的增殖。
[0094]实施例17
I将初生兔软骨细胞(chondrocytes)均匀分布在培养皿中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中培养。待细胞长满培养皿后，收集细胞，制备成10uL浓度为27.5X 107 cells/mL的细胞悬液。
[0095]2将33mg巯基-透明质酸化合物溶解于ImL a -MEM培养基中，首先加入IM的PBS缓冲溶液调整ρΗ=7.4，然后加入上述制备的100 μ L chondrocyte细胞悬液，混合均匀(水凝胶终浓度为3%，细胞接种密度为2.5 X 17 cells/mL),用注射器将0.1mL溶液注射到BALB/C小白鼠皮下。
[0096]3其中，巯基-透明质酸化合物分子量为0.3MDa，半胱氨接枝率为33.54%。
[0097]4包裹chondrocyte细胞的水凝胶在小白鼠体内培养14天、28天后，取出，用激光共聚焦观察细胞的生长情况。(如图8所示)
实验结果发现，该在细胞凝胶能够在体内较好保持其凝胶状态，不出现显著性收缩和溶胀。细胞在凝胶内部能够很好的增殖。
[0098]以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶，其特征在于，以具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物为原料，通过调节其表面巯基密度，凝胶温度和透明质酸的分子量，利用巯基和二硫键之间的氧化还原转变特性，从而控制凝胶的形成时间、降解时间以及力学特性，构建具有良好三维网络交联结构的可控智能型水凝胶。2.根据权利要求1所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的凝胶时间可精确调控。3.根据权利要求1所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，所述水凝胶能够在还原性小分子存在的条件下实现可控降解。4.一种如权利要求1所述的巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物，将其溶解，然后通过巯基之间氧化反应形成二硫键，并形成具有三维化学交联的水凝胶。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以透明质酸为原料，通过半胱氨改性得到具有自由巯基的巯基-透明质酸高分子聚合物，将其溶解于PH=7.4的PBS缓冲液中，然后加入IM的NaOH溶液调节pH值至7.4?8.0，通过巯基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)透明质酸的半胱氨改性: 透明质酸钠在N-琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)的催化下与半胱氨(CSH.HCl)盐酸盐反应，随后加入二硫苏糖醇(DTT)，反应结束后，在去离子水中透析，冷冻干燥，得到半胱氨改性透明质酸； 2)将步骤I)中的制备的半胱氨改性透明质酸溶解于pH=7.4的PBS缓冲液中，然后通过巯基之间氧化作用形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。7.—种权利要求1所述的二硫键交联的透明质酸水凝胶的应用，其特征在于，将其用作三维细胞培养支架或将其制成可注射水凝胶。8.—种三维细胞培养支架体系，其特征在于，包括权利要求1所述的基于巯基/ 二硫键可控自交联透明质酸水凝胶以及均匀分布于其中的细胞。9.一种三维细胞培养体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物溶解于培养基中，然后加入细胞悬液，混合均匀，形成混合液； (2)通过巯基之间氧化形成二硫键的反应，使所得混合液中的透明质酸形成三维化学交联的水凝胶并将细胞包裹于其中。10.根据权利要求9所述的三维细胞培养体系的构建方法，其特征在于，步骤(2)具体为:将步骤(I)制得的混合液加入到模具中，随后在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入培养基中，在37°C、0.5%C02细胞培养箱中进行培养；或者，直接将步骤(I)制得的混合液注射到生物体体内，使透明质酸在生物体体内发生三维化学交联形成水凝胶。
【专利摘要】本发明公开了一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用，属于生物材料领域。所述水凝胶以具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物为原料，通过调节巯基密度（10%—60%），凝胶温度（4℃，37℃）和透明质酸的分子量（0.1M，0.3M，1M），利用巯基和二硫键之间的氧化还原转变特性，从而控制凝胶的形成时间、降解时间以及力学特性，构建了具有良好三维网络交联结构的可控可注射式智能型水凝胶。同时，该类水凝胶成分组成单一，成胶前后无外源性毒性物质引入，具有良好的生物相容性和降解性能。基于以上研究发现，该类可控自交联高分子聚合物可用于组织工程原位损伤的微创修复以及构建智能可调节的三维细胞培养支架。
【IPC分类】C08L5/08, C08J3/24, A61L27/58, C08J3/075, A61L27/20
【公开号】CN104892962
【申请号】CN201510303980
【发明人】孙勇, 樊渝江, 边少荃, 曹万旭, 张兴栋
【申请人】四川大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月5日
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