一种荧光探针及其制备方法和应用
一种荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于Cy7的荧光探针及其在检测半胱氨酸（Cys)中的应用。
【背景技术】
[0002] L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯 一具有还原性基团疏基（-SH)的氨基酸。含疏基的半胱氨酸（Cysteine, Cys)与高半胱氨 酸（Homocysteine, Hey)是同时表达在真核细胞内的含疏基的氨基酸，分子结构只有一个 亚甲基的区别，功能差异则非常明显。Cys作为人体必须的氨基酸之一，是参与蛋白质合成 的20中氨基酸中的一种，同时也是构建重要的谷胱甘肽的三个氨基酸之一，而Hey为甲硫 氨酸代谢的中间产物，本身不参与蛋白质的合成，体内高半胱氨酸含量的大小与许多疾病 相关联。现代医学研宄表明，细胞内Hey的高表达与心血管疾病及阿尔茨海默与进行性老 年痴呆有直接关联。因此，研制高选择性地识别半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光探针具有十 分重要的意义。
[0003] 正是因为半胱氨酸具有如此重要的生理和病理学意义，对存在于生物系统中的半 胱氨酸检测引起了人们的广泛重视。荧光探针是有效检测生命体内半胱氨酸的手段之一。 一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性 好、合成简单等优点。近年来，能够应用于检测活细胞中半胱氨酸的荧光探针如雨后春笋般 涌现了。在可见光区更长区段（对生物组织伤害更小）的检测半胱氨酸的荧光探针仍具有 重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可用于选择性检测半胱氨酸的荧光探针。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：一种荧光探针，所述的荧光探针的结构式如（I )所 示：
[0006]
[0007] 上述的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0008] 1)中间体1的合成：在N2保护下，将Cy7荧光染料、无水乙腈和甲胺水溶液混合 后，于常温下反应，TLC跟踪反应终点，将反应物过硅胶柱（200-300目的硅胶柱），干燥，得 中间体1 ;中间体1的结构如（Π )所示：
[0009]
[0010] 优选的，Cy7荧光染料与甲氨的摩尔比为1:1-1. 5 ;
[0011] TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=2-4:1。
[0012] 2)中间体2的合成：在队保护下，于冰水浴中，将硫代乙酸和2-碘乙醇混合，缓慢 滴加1，8-二氮杂二环^^一碳-7-烯（DBU)，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，TLC追 踪反应终点，反应物过硅胶柱，得中间体2 ;中间体2的结构如（III)所示：
[0013]
[0014] 优选的，硫代乙酸、DBU和2-碘乙醇的摩尔比为1-1.5:1-1.5:1 ;
[0015] TLC跟踪反应终点的展开剂为二氯甲烷。
[0016] 3)中间体3的合成：在N2保护下，于冰水浴中，将中间体1、无水二氯甲烷和三乙 胺混合，缓慢滴加三光气【双（三氯甲基）碳酸酯】的甲苯溶液，滴加完成后，将混合液置于 室温下搅拌反应，TLC追踪反应终点，至反应液由蓝色变为绿色，将反应液在真空状态下旋 干，无水乙醚洗绦，收集滤饼，得中间体3冲间体3的结构如（IV)所示：
[0017]
[0018] 优选的，中间体1、三乙胺与三光气的摩尔比为1:15-25:5-7 ;
[0019] TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10:1。
[0020] 4)荧光探针的合成：在N2保护下，将中间体2、中间体3和三乙胺混合，于30-40°C 下反应，TLC追踪反应终点，得到目标产物荧光探针；其结构式如（I)所示。
[0021] 优选的，三乙胺、中间体2和中间体3的摩尔比为1-1.5:2-2. 5:1-1. 5。TLC跟踪 反应终点的展开剂为乙酸乙酯：甲醇=10 :1。
[0022] 本发明的荧光探针，采用Cy7作为荧光母体，在Cy7母体上引入硫酯类结构，使得 探针能够测定半胱氨酸，与半胱氨酸发生反应，指示半胱氨酸的存在或定量测定半胱氨酸 的浓度。
[0023] 本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定性检测。应用于定性检测半胱氨酸时，其是与 半胱氨酸作用后，从而导致荧光改变；此过程可用于定性检测半胱氨酸。
[0024] 本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定量检测。将浓度呈梯度变化的半胱氨酸的PB 缓冲液分别加入荧光探针的PB缓冲液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧光强度， 然后以半胱氨酸的浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧光强 度从图中读出待测溶液中半胱氨酸的含量。此过程可用于定量检测半胱氨酸。
[0025] 本发明的荧光探针，荧光探针本身在750nm处没有荧光，与半胱氨酸作用后750nm 处荧光发生增强，且荧光强度正比于半胱氨酸浓度，从而指示半胱氨酸的存在或定量测定 半胱氨酸的浓度。因此，本发明的荧光探针，可用于定性和/或定量检测半胱氨酸。
[0026] 上述的应用，方法如下：分别将上述的荧光探针和待测物溶于PH = 5-9的磷酸 盐缓冲溶液中，分别取两种溶液，然后加入体积比为1:1的PH = 5-9磷酸盐缓冲溶液和二 甲基亚砜（DMSO)的混合液，混合均勾，得工作液，测量该工作液在Aex = 650nm，Aem = 750nm下的焚光发射光谱。
[0027] 本发明的有益效果：本发明的荧光探针，在半胱氨酸存在下荧光发生显著增强，可 用于高选择性、高灵敏性地定性及定量检测半胱氨酸。这对于深入研宄半胱氨酸在生物体 内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
【附图说明】
[0028] 图1是实施例1合成的荧光探针的1H NMR。
[0029] 图2是实施例1合成的荧光探针的13CNMR。
[0030] 图3是实施例2中荧光探针与半胱氨酸响应后的紫外可见吸收光谱；
[0031] 其中，图3a :空白；图3b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图3c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 3d :半胱氨酸终浓度40uM ;图3e :半胱氨酸终浓度60uM ;图3f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 3g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0032] 图4是实施例2中荧光探针与半胱氨酸响应后的荧光发射光谱；
[0033] 其中，图4a :空白；图4b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图4c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 4d :半胱氨酸终浓度40uM ;图4e :半胱氨酸终浓度60uM ;图4f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 4g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0034] 图5是荧光探针与不同浓度下半胱氨酸反应速率的动力学示意图；
[0035] 其中，图5a :空白；图5b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图5c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 5d :半胱氨酸终浓度40uM ;图5e :半胱氨酸终浓度60uM ;图5f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 5g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0036] 图6是本发明荧光探针对半胱氨酸的选择性示意图；
[0037] 其中，图6a :空白；图6b :抗坏血酸；图6c :甘氨酸；图6d :组氨酸；图6e :半胱氨 酸；图6f :二硫苏糖醇；图6g :色氨酸；图6h :谷胱甘肽；图6i :谷氨酸；图6j :过氧化氢。
[0038] 图7是本发明焚光探针在不同pH下的焚光强度不意图。
[0039] 图8是本发明荧光探针对半胱氨酸的定量检测示意图。
[0040]图9是本发明荧光探针对半胱氨酸的检出限示意图。
【具体实施方式】
[0041] 以下实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
[0042] 实施例1 一种焚光探针的合成
[0043] 1)中间体1的合成：在队保护下，将Cy7-Cl (七甲川花菁）1.28g(2.0mm〇l)置于 IOOmL三口瓶中，加入50mL无水乙腈和甲胺水溶液（将0. 061g (2. Ommol)甲胺溶于20ml水 中），常温反应3小时。TLC追踪反应终点（展开剂为乙酸乙酯：甲醇=3:l(v/v))，反应 后，将反应产物过硅胶柱（硅胶的颗粒大小为200-300目的），收集流出液，真空状态下用旋 转蒸发仪旋干，得到蓝色粉末状产物lg，即中间体1，产率为79%。
[0044] 2)中间体2的合成：在队保护下，将0. 874g(ll. 5mmol)硫代乙酸置于IOOmL三口 瓶中，将三口瓶置于冰浴中，加入1.72g(10.0mmol)2-碘乙醇，再将 1.749g(11.5mmol)DBU 缓慢滴加于反应液中，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，TLC追踪反应终点（用纯二 氯甲烷作为展开剂），反应后，将反应产物过硅胶柱（硅胶的颗粒大小为200-300目的），收 集滤液，得到黄色油状液体〇. 5g，即中间体2,产率为42 %。
[0045] 3)中间体3的合成：在队保护下，将0. 127g(0. 2mmol)中间体1置于50mL三口 瓶中，加入50mL无水二氯甲烧中（必须保证绝对无水），加入0. 404g(4mmol)三乙胺，将三 口瓶置于冰浴中，将〇. 386g(l. 3mmol)固体三光气溶于2mL甲苯中，用恒压滴液漏斗缓慢的 滴加到反应液中，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，搅拌约3小时，TLC追踪反应终点 (展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至反应液由蓝色变为绿色。将反应物在 真空状态下旋干，无水乙醚60mLX 3进行洗涤，将滤饼收集，得到0. 03g绿色固体，即中间体 3,产率为22%。
[0046] 4)荧光探针的合成：在N2保护下，将0. 109g(0. 14mmol)中间体3置于IOOmL三 口瓶中，将〇. 〇34g(0. 28mmol)中间体2加入到反应瓶中，加入0. 014g(0. 14mmol)三乙胺， 35°C反应，TLC追踪反应终点（展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至中间体3 完全反应完毕，过滤，干燥，得到0. 005g绿色的固体粉末，即为荧光探针，产率为5%。荧光 探针的结构式如（I)所示。
[0047]
[0048] 将获得的荧光探针做核磁共振氢谱图，结果如图1 :? NMR (400MHz，⑶Cl3) δ (ppm) : 7. 56-7. 48 (d，2H)，7. 43-7. 38 (t，2H)，7. 37-7. 33 (d，2H)，7. 26-7. 22 (t， 4H)，7. 19-7. 14 (d，2H)，6. 37-6. 28 (d，2H)，5. 32-5. 29 (s，2H)，4. 35-4. 29 (m， 3H)，4. 16-4. 06 (t，2H)，3. 37-3. 33 (s，2H)，3. 31-3. 04 (t，2H)，2. 89-2. 77 (m， 2H)，2. 77-2. 66 (m，2H)，2. 00-1. 96 (s，3H)，I. 67-1. 64 (s，6H)，I. 50-1. 44 (t， 6H)，I. 27-1. 24 (s，4H)，I. 00-0· 96 (t，2H)。
[0049] 将获得的荧光探针做 核磁共振碳谱图，结果如图2 :13CNMR(100MHZ，DMS0，ppm): 171. 717,170. 367,168. 469,167. 825,153.012,141.813,141.349,141.058,132.073， 130. 908,128. 758,128. 366,125. 533,122. 508,110. 694,101. 930,65· 573,63· 554,62· 641， 53. 793,49. 228,40. 358,38. 459,31. 919,30. 608,29. 621,29. 337,29. 116,29. 110,28. 557, 28. 205,27. 238,25. 354,22. 689,20. 829,20. 526,19. 202,14. 105,13. 688,12. 611。
[0050] 实施例2荧光探针与半胱氨酸响应后的性能研宄
[0051] 将荧光探针溶于0. 1Μ，pH = 7. 40的PB缓冲液（磷酸盐缓冲溶液）中，配制成浓 度为2000uM的荧光探针溶液，作为荧光探针储备液。
[0052] 将半胱氨酸溶于0. 1M，pH = 7. 40的PB缓冲液中，分别配制成浓度为100uM、 200uM、400uM、600uM、800uM、1000 uM的半胱氨酸溶液，作为半胱氨酸储备液。
[0053] (一）紫外吸收与焚光发射
[0054] 取20uL浓度为2000uM的荧光探针溶液和20uL不同浓度的半胱氨酸溶液，加入到 全波长扫描式多功能读数仪中的96孔酶标板中，同时每孔酶标板中另加入160uL体积比为 1:1的PB缓冲液（pH = 7. 40,浓度为0. 1M)和DMSO的混合液，混合均匀，得工作液，测量该 工作液的紫外可见吸收光谱和发射光谱，同时做空白（空白中只是不加荧光探针，其它相 同），结果如图3和图4所示。
[0055] 由图3和图4可见，随着半胱氨酸浓度的增大，750nm处的荧光强度在增加。探针 的最大吸收在800nm处，最大发射波长在750nm处。结果显示探针响应后的最大激发波长 为650nm、最大发射波长为750nm。
[0056] (二）荧光探针的动力学试验
[0057] 在96孔酶标板中分别加入160uL体积比为1:1的PB缓冲液（0· 1M，pH = 7. 40)和 DMSO的混合液，然后分别加入20uL的2000uM的荧光探针溶液，再分别加入20uL的100uM、 200uM、400uM、600uM、800uM和1000 uM的半胱氨酸溶液，混合均匀，得工作液。在全波长扫描 式多功能读数仪下测量该工作液的荧光发射光谱，X ex = 650nm，光栅宽度为5nm，Aem = 750nm，监测其荧光强度变化情况，同时做空白（空白中只是不加荧光探针，其它相同）。结 果如图5所示。
[0058] 由图5可见，在空白组中，探针的荧光强度几乎没有变化，随着半胱氨酸浓度的逐 渐增加探针荧光强度不断变化。可知，探针可以稳定的响应半胱氨酸。且随着时间的增长， 荧光强度在增大。
[0059] (三）荧光探针的选择性试验
[0060] 分别将组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、抗坏血酸、二硫苏糖醇、色氨酸、谷胱甘肽、谷氨 酸和过氧化氢溶于PB缓冲溶液（0. 1M，PH = 7. 4)中，分别得到浓度为20mM组氨酸溶液； 20mM甘氨酸溶液；1000 uM半胱氨酸溶液；20mM抗坏血酸溶液；200uM二硫苏糖醇溶液；20mM 色氨酸溶液；200uM谷胱甘肽溶液；20mM谷氨酸溶液；20mM过氧化氢溶液。
[0061] 在160ul体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1M，PH = 7. 4)和DMSO的混合液中，加20ul 荧光探针溶液（2000uM)，然后分别加入20ul的20mM组氨酸溶液；20mM甘氨酸溶液；1000 uM 半胱氨酸溶液；20mM抗坏血酸溶液；200uM二硫苏糖醇溶液；20mM色氨酸溶液；200uM谷胱 甘肽溶液；20mM谷氨酸溶液和20mM过氧化氢溶液，混合均匀，分别得到工作液。使用全波 长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。分别测量不同工作液的荧光发射光谱，光 栅宽度为 5nm，λ em = 750nm。
[0062] 荧光探针对半胱氨酸的选择性实验结果如图6所示。图6中，纵坐标表示荧光强 度，横坐标表示时间的变化。由图6可见，荧光探针对半胱氨酸具有很好的选择性，对体系 荧光显著增强。测定条件下，相比于半胱氨酸，其他物质导致的荧光增强可以忽略。
[0063] (四）不同的PH对荧光探针荧光强度的影响
[0064] 在96孔酶标板中分别加入160uL体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1M)和DMSO的混合 液，加入20uL的1000 uM半胱氨酸溶液，加入20uL的2000uM的荧光探针液。其中PB (0. 1M) 的PH分别为I. 5、2. 5、3. 5、4. 5、5. 5、6. 5、7. 5、8. 5、9. 5、10. 5。利用全波长扫描式多功能读 数仪分别对该十个不同PH条件下的反应液在相同的时间点进行单点扫描，以不同的十个 PH作为横坐标，以不同的荧光强度作为纵坐标进行绘图，结果如图7所示。
[0065] 由图7可见，在pH为1. 5到10. 5的pH条件下，荧光探针的荧光在半胱氨酸作用 下可以显著增强，pH对该探针有影响，且在PH = 7. 4左右的生理PH下荧光强度最强。PH =7. 4与生物的生理条件下的酸碱度是接近的，这也说明该荧光探针较适合应用于生物体 内从而进行生物检测。
[0066] 实施例3荧光探针对半胱氨酸的定量检测
[0067] ( -）定量检测
[0068] 将荧光探针溶于0· 1M，pH = 7. 40的PB缓冲液（磷酸盐缓冲溶液）中，配置成浓 度为2000uM的荧光探针溶液，作为标准溶液。
[0069] 将半胱氨酸溶于0. 1M，pH = 7. 40的PB缓冲液中，分别配制成浓度为100uM、 200uM、400uM、600uM、800uM和1000 uM的半胱氨酸溶液，作为标准溶液。
[0070] 取160ul体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1M、PH = 7. 4)和DMSO的混合溶液，加入 20uL浓度为2000uM的标准荧光探针溶液和20uL不同浓度（OuM-1000 uM)的标准半胱氨酸 溶液，混合均匀，作为标准工作溶液。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行 测量。测量该标准工作液的荧光发射光谱，λ ex = 650nm，光栅宽度为5nm，λ em = 750nm， 以荧光强度为纵坐标，半胱氨酸浓度为横坐标，做标准曲线，结果如图8所示。由图8可见， 当半胱氨酸的浓度在IOOuM以下时，荧光探针的荧光强度与半胱氨酸的浓度呈现很好的线 性关系。相应的线性回归方程为F 75tlnm= 0. 1763 XC半+2. 9428,其线性相关系数为R = 0. 9873,其中，F为荧光强度，Ciwius为半胱氨酸的浓度。
[0071] (二）荧光探针对半胱氨酸的检出限
[0072] 于160ul体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1Μ、PH = 7. 4)和DMSO的混合溶液中，加 20uL荧光探针溶液（2000uM)以及20uL不同浓度（OuM-1000 uM)的半胱氨酸溶液。使用全 波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，λ ex = 650nm，光栅宽度为5nm，λ em = 750nm。将750nm处的荧光强度F、最小荧光强度Fmin和最 大荧光强度Fmax数据，利用归一化公式：(F-F minV(Fmax-Fmin)计算得到的数据作为纵坐标，对 半胱氨酸的浓度（uM)取对数Log[半胱氨酸]，作为横坐标。做一条线性回归曲线。该曲线 与横坐标的交点即是荧光探针对半胱氨酸的检出限。结果如图9所示，由图9可见，该探针 的检出限是1. 388Χ10-5Μ。
【主权项】
1. 一种荧光探针，其特征在于所述的荧光探针的结构式如（I )所示：2. -种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 中间体1的合成：在N2保护下，将Cy7荧光染料、无水乙腈和甲胺水溶液混合后，于 常温下反应，TLC跟踪反应终点，将反应物过硅胶柱，干燥，得中间体1 ; 2) 中间体2的合成：在N2保护下，于冰水浴中，将硫代乙酸和2-碘乙醇混合，缓慢滴加 1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯，然后将混合液于室温下反应，TLC追踪反应终点，将反应物 过硅胶柱，得中间体2 ; 3) 中间体3的合成：在N2保护下，于冰水浴中，将中间体1、无水二氯甲烷和三乙胺混 合，缓慢滴加三光气的甲苯溶液，然后将混合液于室温下搅拌反应，TLC追踪反应终点，至反 应液由蓝色变为绿色，将反应液在真空状态下旋干，无水乙醚洗涤，收集滤饼，得中间体3 ; 4) 荧光探针的合成：在N2保护下，将中间体2、中间体3和三乙胺混合，于30-40°C下反 应，TLC追踪反应终点，得到目标产物荧光探针。3. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)中，Cy7荧光染 料与甲胺的摩尔比为1:1-1. 5 ;TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇= 2-4:1〇4. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2)中，硫代乙酸、 1，8-二氮杂二环^^一碳-7-烯和2-碘乙醇的摩尔比为1-1. 5:1-1. 5:1 ;TLC跟踪反应终点 的展开剂为二氯甲烷。5. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤3)中，中间体1、三 乙胺与三光气的摩尔比为1:15-25:5-7 ;TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙 酯：甲醇=10:1。6. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤4)中，三乙胺、中间 体2和中间体3的摩尔比为1-1.5:2-2.5:1-1.5 ;TLC跟踪反应终点的展开剂为乙酸乙酯： 甲醇=10 :1。7. 权利要求1所述的荧光探针在半胱氨酸的定性和/或定量检测中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于方法如下：分别将权利要求1所述的荧光 探针和待测物溶于PH = 5-9的磷酸盐缓冲溶液中，分别取两种溶液，然后加入体积比为1:1 的PH = 5-9磷酸盐缓冲溶液和二甲基亚砜的混合液，混合均匀，得工作液，测量该工作液在 λ ex = 650nm，λ em = 750nm下的焚光发射光谱。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲溶液的PH = 7. 4。
【专利摘要】本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。所述的荧光探针具有如(I)所示的结构式，这类化合物用作检测半胱氨酸的荧光探针，其本身在750nm处没有荧光，与半胱氨酸作用后750nm处的荧光发生增强，且荧光强度正比于半胱氨酸浓度，从而指示半胱氨酸的存在或定量测定半胱氨酸的浓度。
【IPC分类】G01N21/64, C09K11/06, C07D209/14
【公开号】CN104893710
【申请号】CN201510168610
【发明人】夏立新, 张爱霞, 宋朋
【申请人】辽宁大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月8日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于Cy7的荧光探针及其在检测半胱氨酸（Cys)中的应用。
【背景技术】
[0002] L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯 一具有还原性基团疏基（-SH)的氨基酸。含疏基的半胱氨酸（Cysteine, Cys)与高半胱氨 酸（Homocysteine, Hey)是同时表达在真核细胞内的含疏基的氨基酸，分子结构只有一个 亚甲基的区别，功能差异则非常明显。Cys作为人体必须的氨基酸之一，是参与蛋白质合成 的20中氨基酸中的一种，同时也是构建重要的谷胱甘肽的三个氨基酸之一，而Hey为甲硫 氨酸代谢的中间产物，本身不参与蛋白质的合成，体内高半胱氨酸含量的大小与许多疾病 相关联。现代医学研宄表明，细胞内Hey的高表达与心血管疾病及阿尔茨海默与进行性老 年痴呆有直接关联。因此，研制高选择性地识别半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光探针具有十 分重要的意义。
[0003] 正是因为半胱氨酸具有如此重要的生理和病理学意义，对存在于生物系统中的半 胱氨酸检测引起了人们的广泛重视。荧光探针是有效检测生命体内半胱氨酸的手段之一。 一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性 好、合成简单等优点。近年来，能够应用于检测活细胞中半胱氨酸的荧光探针如雨后春笋般 涌现了。在可见光区更长区段（对生物组织伤害更小）的检测半胱氨酸的荧光探针仍具有 重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可用于选择性检测半胱氨酸的荧光探针。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：一种荧光探针，所述的荧光探针的结构式如（I )所 示：
[0006]
[0007] 上述的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0008] 1)中间体1的合成：在N2保护下，将Cy7荧光染料、无水乙腈和甲胺水溶液混合 后，于常温下反应，TLC跟踪反应终点，将反应物过硅胶柱（200-300目的硅胶柱），干燥，得 中间体1 ;中间体1的结构如（Π )所示：
[0009]
[0010] 优选的，Cy7荧光染料与甲氨的摩尔比为1:1-1. 5 ;
[0011] TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=2-4:1。
[0012] 2)中间体2的合成：在队保护下，于冰水浴中，将硫代乙酸和2-碘乙醇混合，缓慢 滴加1，8-二氮杂二环^^一碳-7-烯（DBU)，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，TLC追 踪反应终点，反应物过硅胶柱，得中间体2 ;中间体2的结构如（III)所示：
[0013]
[0014] 优选的，硫代乙酸、DBU和2-碘乙醇的摩尔比为1-1.5:1-1.5:1 ;
[0015] TLC跟踪反应终点的展开剂为二氯甲烷。
[0016] 3)中间体3的合成：在N2保护下，于冰水浴中，将中间体1、无水二氯甲烷和三乙 胺混合，缓慢滴加三光气【双（三氯甲基）碳酸酯】的甲苯溶液，滴加完成后，将混合液置于 室温下搅拌反应，TLC追踪反应终点，至反应液由蓝色变为绿色，将反应液在真空状态下旋 干，无水乙醚洗绦，收集滤饼，得中间体3冲间体3的结构如（IV)所示：
[0017]
[0018] 优选的，中间体1、三乙胺与三光气的摩尔比为1:15-25:5-7 ;
[0019] TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10:1。
[0020] 4)荧光探针的合成：在N2保护下，将中间体2、中间体3和三乙胺混合，于30-40°C 下反应，TLC追踪反应终点，得到目标产物荧光探针；其结构式如（I)所示。
[0021] 优选的，三乙胺、中间体2和中间体3的摩尔比为1-1.5:2-2. 5:1-1. 5。TLC跟踪 反应终点的展开剂为乙酸乙酯：甲醇=10 :1。
[0022] 本发明的荧光探针，采用Cy7作为荧光母体，在Cy7母体上引入硫酯类结构，使得 探针能够测定半胱氨酸，与半胱氨酸发生反应，指示半胱氨酸的存在或定量测定半胱氨酸 的浓度。
[0023] 本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定性检测。应用于定性检测半胱氨酸时，其是与 半胱氨酸作用后，从而导致荧光改变；此过程可用于定性检测半胱氨酸。
[0024] 本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定量检测。将浓度呈梯度变化的半胱氨酸的PB 缓冲液分别加入荧光探针的PB缓冲液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧光强度， 然后以半胱氨酸的浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧光强 度从图中读出待测溶液中半胱氨酸的含量。此过程可用于定量检测半胱氨酸。
[0025] 本发明的荧光探针，荧光探针本身在750nm处没有荧光，与半胱氨酸作用后750nm 处荧光发生增强，且荧光强度正比于半胱氨酸浓度，从而指示半胱氨酸的存在或定量测定 半胱氨酸的浓度。因此，本发明的荧光探针，可用于定性和/或定量检测半胱氨酸。
[0026] 上述的应用，方法如下：分别将上述的荧光探针和待测物溶于PH = 5-9的磷酸 盐缓冲溶液中，分别取两种溶液，然后加入体积比为1:1的PH = 5-9磷酸盐缓冲溶液和二 甲基亚砜（DMSO)的混合液，混合均勾，得工作液，测量该工作液在Aex = 650nm，Aem = 750nm下的焚光发射光谱。
[0027] 本发明的有益效果：本发明的荧光探针，在半胱氨酸存在下荧光发生显著增强，可 用于高选择性、高灵敏性地定性及定量检测半胱氨酸。这对于深入研宄半胱氨酸在生物体 内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
【附图说明】
[0028] 图1是实施例1合成的荧光探针的1H NMR。
[0029] 图2是实施例1合成的荧光探针的13CNMR。
[0030] 图3是实施例2中荧光探针与半胱氨酸响应后的紫外可见吸收光谱；
[0031] 其中，图3a :空白；图3b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图3c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 3d :半胱氨酸终浓度40uM ;图3e :半胱氨酸终浓度60uM ;图3f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 3g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0032] 图4是实施例2中荧光探针与半胱氨酸响应后的荧光发射光谱；
[0033] 其中，图4a :空白；图4b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图4c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 4d :半胱氨酸终浓度40uM ;图4e :半胱氨酸终浓度60uM ;图4f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 4g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0034] 图5是荧光探针与不同浓度下半胱氨酸反应速率的动力学示意图；
[0035] 其中，图5a :空白；图5b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图5c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 5d :半胱氨酸终浓度40uM ;图5e :半胱氨酸终浓度60uM ;图5f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 5g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0036] 图6是本发明荧光探针对半胱氨酸的选择性示意图；
[0037] 其中，图6a :空白；图6b :抗坏血酸；图6c :甘氨酸；图6d :组氨酸；图6e :半胱氨 酸；图6f :二硫苏糖醇；图6g :色氨酸；图6h :谷胱甘肽；图6i :谷氨酸；图6j :过氧化氢。
[0038] 图7是本发明焚光探针在不同pH下的焚光强度不意图。
[0039] 图8是本发明荧光探针对半胱氨酸的定量检测示意图。
[0040]图9是本发明荧光探针对半胱氨酸的检出限示意图。
【具体实施方式】
[0041] 以下实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
[0042] 实施例1 一种焚光探针的合成
[0043] 1)中间体1的合成：在队保护下，将Cy7-Cl (七甲川花菁）1.28g(2.0mm〇l)置于 IOOmL三口瓶中，加入50mL无水乙腈和甲胺水溶液（将0. 061g (2. Ommol)甲胺溶于20ml水 中），常温反应3小时。TLC追踪反应终点（展开剂为乙酸乙酯：甲醇=3:l(v/v))，反应 后，将反应产物过硅胶柱（硅胶的颗粒大小为200-300目的），收集流出液，真空状态下用旋 转蒸发仪旋干，得到蓝色粉末状产物lg，即中间体1，产率为79%。
[0044] 2)中间体2的合成：在队保护下，将0. 874g(ll. 5mmol)硫代乙酸置于IOOmL三口 瓶中，将三口瓶置于冰浴中，加入1.72g(10.0mmol)2-碘乙醇，再将 1.749g(11.5mmol)DBU 缓慢滴加于反应液中，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，TLC追踪反应终点（用纯二 氯甲烷作为展开剂），反应后，将反应产物过硅胶柱（硅胶的颗粒大小为200-300目的），收 集滤液，得到黄色油状液体〇. 5g，即中间体2,产率为42 %。
[0045] 3)中间体3的合成：在队保护下，将0. 127g(0. 2mmol)中间体1置于50mL三口 瓶中，加入50mL无水二氯甲烧中（必须保证绝对无水），加入0. 404g(4mmol)三乙胺，将三 口瓶置于冰浴中，将〇. 386g(l. 3mmol)固体三光气溶于2mL甲苯中，用恒压滴液漏斗缓慢的 滴加到反应液中，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，搅拌约3小时，TLC追踪反应终点 (展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至反应液由蓝色变为绿色。将反应物在 真空状态下旋干，无水乙醚60mLX 3进行洗涤，将滤饼收集，得到0. 03g绿色固体，即中间体 3,产率为22%。
[0046] 4)荧光探针的合成：在N2保护下，将0. 109g(0. 14mmol)中间体3置于IOOmL三 口瓶中，将〇. 〇34g(0. 28mmol)中间体2加入到反应瓶中，加入0. 014g(0. 14mmol)三乙胺， 35°C反应，TLC追踪反应终点（展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至中间体3 完全反应完毕，过滤，干燥，得到0. 005g绿色的固体粉末，即为荧光探针，产率为5%。荧光 探针的结构式如（I)所示。
[0047]
[0048] 将获得的荧光探针做核磁共振氢谱图，结果如图1 :? NMR (400MHz，⑶Cl3) δ (ppm) : 7. 56-7. 48 (d，2H)，7. 43-7. 38 (t，2H)，7. 37-7. 33 (d，2H)，7. 26-7. 22 (t， 4H)，7. 19-7. 14 (d，2H)，6. 37-6. 28 (d，2H)，5. 32-5. 29 (s，2H)，4. 35-4. 29 (m， 3H)，4. 16-4. 06 (t，2H)，3. 37-3. 33 (s，2H)，3. 31-3. 04 (t，2H)，2. 89-2. 77 (m， 2H)，2. 77-2. 66 (m，2H)，2. 00-1. 96 (s，3H)，I. 67-1. 64 (s，6H)，I. 50-1. 44 (t， 6H)，I. 27-1. 24 (s，4H)，I. 00-0· 96 (t，2H)。
[0049] 将获得的荧光探针做 核磁共振碳谱图，结果如图2 :13CNMR(100MHZ，DMS0，ppm): 171. 717,170. 367,168. 469,167. 825,153.012,141.813,141.349,141.058,132.073， 130. 908,128. 758,128. 366,125. 533,122. 508,110. 694,101. 930,65· 573,63· 554,62· 641， 53. 793,49. 228,40. 358,38. 459,31. 919,30. 608,29. 621,29. 337,29. 116,29. 110,28. 557, 28. 205,27. 238,25. 354,22. 689,20. 829,20. 526,19. 202,14. 105,13. 688,12. 611。
[0050] 实施例2荧光探针与半胱氨酸响应后的性能研宄
[0051] 将荧光探针溶于0. 1Μ，pH = 7. 40的PB缓冲液（磷酸盐缓冲溶液）中，配制成浓 度为2000uM的荧光探针溶液，作为荧光探针储备液。
[0052] 将半胱氨酸溶于0. 1M，pH = 7. 40的PB缓冲液中，分别配制成浓度为100uM、 200uM、400uM、600uM、800uM、1000 uM的半胱氨酸溶液，作为半胱氨酸储备液。
[0053] (一）紫外吸收与焚光发射
[0054] 取20uL浓度为2000uM的荧光探针溶液和20uL不同浓度的半胱氨酸溶液，加入到 全波长扫描式多功能读数仪中的96孔酶标板中，同时每孔酶标板中另加入160uL体积比为 1:1的PB缓冲液（pH = 7. 40,浓度为0. 1M)和DMSO的混合液，混合均匀，得工作液，测量该 工作液的紫外可见吸收光谱和发射光谱，同时做空白（空白中只是不加荧光探针，其它相 同），结果如图3和图4所示。
[0055] 由图3和图4可见，随着半胱氨酸浓度的增大，750nm处的荧光强度在增加。探针 的最大吸收在800nm处，最大发射波长在750nm处。结果显示探针响应后的最大激发波长 为650nm、最大发射波长为750nm。
[0056] (二）荧光探针的动力学试验
[0057] 在96孔酶标板中分别加入160uL体积比为1:1的PB缓冲液（0· 1M，pH = 7. 40)和 DMSO的混合液，然后分别加入20uL的2000uM的荧光探针溶液，再分别加入20uL的100uM、 200uM、400uM、600uM、800uM和1000 uM的半胱氨酸溶液，混合均匀，得工作液。在全波长扫描 式多功能读数仪下测量该工作液的荧光发射光谱，X ex = 650nm，光栅宽度为5nm，Aem = 750nm，监测其荧光强度变化情况，同时做空白（空白中只是不加荧光探针，其它相同）。结 果如图5所示。
[0058] 由图5可见，在空白组中，探针的荧光强度几乎没有变化，随着半胱氨酸浓度的逐 渐增加探针荧光强度不断变化。可知，探针可以稳定的响应半胱氨酸。且随着时间的增长， 荧光强度在增大。
[0059] (三）荧光探针的选择性试验
[0060] 分别将组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、抗坏血酸、二硫苏糖醇、色氨酸、谷胱甘肽、谷氨 酸和过氧化氢溶于PB缓冲溶液（0. 1M，PH = 7. 4)中，分别得到浓度为20mM组氨酸溶液； 20mM甘氨酸溶液；1000 uM半胱氨酸溶液；20mM抗坏血酸溶液；200uM二硫苏糖醇溶液；20mM 色氨酸溶液；200uM谷胱甘肽溶液；20mM谷氨酸溶液；20mM过氧化氢溶液。
[0061] 在160ul体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1M，PH = 7. 4)和DMSO的混合液中，加20ul 荧光探针溶液（2000uM)，然后分别加入20ul的20mM组氨酸溶液；20mM甘氨酸溶液；1000 uM 半胱氨酸溶液；20mM抗坏血酸溶液；200uM二硫苏糖醇溶液；20mM色氨酸溶液；200uM谷胱 甘肽溶液；20mM谷氨酸溶液和20mM过氧化氢溶液，混合均匀，分别得到工作液。使用全波 长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。分别测量不同工作液的荧光发射光谱，光 栅宽度为 5nm，λ em = 750nm。
[0062] 荧光探针对半胱氨酸的选择性实验结果如图6所示。图6中，纵坐标表示荧光强 度，横坐标表示时间的变化。由图6可见，荧光探针对半胱氨酸具有很好的选择性，对体系 荧光显著增强。测定条件下，相比于半胱氨酸，其他物质导致的荧光增强可以忽略。
[0063] (四）不同的PH对荧光探针荧光强度的影响
[0064] 在96孔酶标板中分别加入160uL体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1M)和DMSO的混合 液，加入20uL的1000 uM半胱氨酸溶液，加入20uL的2000uM的荧光探针液。其中PB (0. 1M) 的PH分别为I. 5、2. 5、3. 5、4. 5、5. 5、6. 5、7. 5、8. 5、9. 5、10. 5。利用全波长扫描式多功能读 数仪分别对该十个不同PH条件下的反应液在相同的时间点进行单点扫描，以不同的十个 PH作为横坐标，以不同的荧光强度作为纵坐标进行绘图，结果如图7所示。
[0065] 由图7可见，在pH为1. 5到10. 5的pH条件下，荧光探针的荧光在半胱氨酸作用 下可以显著增强，pH对该探针有影响，且在PH = 7. 4左右的生理PH下荧光强度最强。PH =7. 4与生物的生理条件下的酸碱度是接近的，这也说明该荧光探针较适合应用于生物体 内从而进行生物检测。
[0066] 实施例3荧光探针对半胱氨酸的定量检测
[0067] ( -）定量检测
[0068] 将荧光探针溶于0· 1M，pH = 7. 40的PB缓冲液（磷酸盐缓冲溶液）中，配置成浓 度为2000uM的荧光探针溶液，作为标准溶液。
[0069] 将半胱氨酸溶于0. 1M，pH = 7. 40的PB缓冲液中，分别配制成浓度为100uM、 200uM、400uM、600uM、800uM和1000 uM的半胱氨酸溶液，作为标准溶液。
[0070] 取160ul体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1M、PH = 7. 4)和DMSO的混合溶液，加入 20uL浓度为2000uM的标准荧光探针溶液和20uL不同浓度（OuM-1000 uM)的标准半胱氨酸 溶液，混合均匀，作为标准工作溶液。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行 测量。测量该标准工作液的荧光发射光谱，λ ex = 650nm，光栅宽度为5nm，λ em = 750nm， 以荧光强度为纵坐标，半胱氨酸浓度为横坐标，做标准曲线，结果如图8所示。由图8可见， 当半胱氨酸的浓度在IOOuM以下时，荧光探针的荧光强度与半胱氨酸的浓度呈现很好的线 性关系。相应的线性回归方程为F 75tlnm= 0. 1763 XC半+2. 9428,其线性相关系数为R = 0. 9873,其中，F为荧光强度，Ciwius为半胱氨酸的浓度。
[0071] (二）荧光探针对半胱氨酸的检出限
[0072] 于160ul体积比为1:1的PB缓冲液（0. 1Μ、PH = 7. 4)和DMSO的混合溶液中，加 20uL荧光探针溶液（2000uM)以及20uL不同浓度（OuM-1000 uM)的半胱氨酸溶液。使用全 波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，λ ex = 650nm，光栅宽度为5nm，λ em = 750nm。将750nm处的荧光强度F、最小荧光强度Fmin和最 大荧光强度Fmax数据，利用归一化公式：(F-F minV(Fmax-Fmin)计算得到的数据作为纵坐标，对 半胱氨酸的浓度（uM)取对数Log[半胱氨酸]，作为横坐标。做一条线性回归曲线。该曲线 与横坐标的交点即是荧光探针对半胱氨酸的检出限。结果如图9所示，由图9可见，该探针 的检出限是1. 388Χ10-5Μ。
【主权项】
1. 一种荧光探针，其特征在于所述的荧光探针的结构式如（I )所示：2. -种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 中间体1的合成：在N2保护下，将Cy7荧光染料、无水乙腈和甲胺水溶液混合后，于 常温下反应，TLC跟踪反应终点，将反应物过硅胶柱，干燥，得中间体1 ; 2) 中间体2的合成：在N2保护下，于冰水浴中，将硫代乙酸和2-碘乙醇混合，缓慢滴加 1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯，然后将混合液于室温下反应，TLC追踪反应终点，将反应物 过硅胶柱，得中间体2 ; 3) 中间体3的合成：在N2保护下，于冰水浴中，将中间体1、无水二氯甲烷和三乙胺混 合，缓慢滴加三光气的甲苯溶液，然后将混合液于室温下搅拌反应，TLC追踪反应终点，至反 应液由蓝色变为绿色，将反应液在真空状态下旋干，无水乙醚洗涤，收集滤饼，得中间体3 ; 4) 荧光探针的合成：在N2保护下，将中间体2、中间体3和三乙胺混合，于30-40°C下反 应，TLC追踪反应终点，得到目标产物荧光探针。3. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)中，Cy7荧光染 料与甲胺的摩尔比为1:1-1. 5 ;TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇= 2-4:1〇4. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2)中，硫代乙酸、 1，8-二氮杂二环^^一碳-7-烯和2-碘乙醇的摩尔比为1-1. 5:1-1. 5:1 ;TLC跟踪反应终点 的展开剂为二氯甲烷。5. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤3)中，中间体1、三 乙胺与三光气的摩尔比为1:15-25:5-7 ;TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙 酯：甲醇=10:1。6. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤4)中，三乙胺、中间 体2和中间体3的摩尔比为1-1.5:2-2.5:1-1.5 ;TLC跟踪反应终点的展开剂为乙酸乙酯： 甲醇=10 :1。7. 权利要求1所述的荧光探针在半胱氨酸的定性和/或定量检测中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于方法如下：分别将权利要求1所述的荧光 探针和待测物溶于PH = 5-9的磷酸盐缓冲溶液中，分别取两种溶液，然后加入体积比为1:1 的PH = 5-9磷酸盐缓冲溶液和二甲基亚砜的混合液，混合均匀，得工作液，测量该工作液在 λ ex = 650nm，λ em = 750nm下的焚光发射光谱。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲溶液的PH = 7. 4。
【专利摘要】本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。所述的荧光探针具有如(I)所示的结构式，这类化合物用作检测半胱氨酸的荧光探针，其本身在750nm处没有荧光，与半胱氨酸作用后750nm处的荧光发生增强，且荧光强度正比于半胱氨酸浓度，从而指示半胱氨酸的存在或定量测定半胱氨酸的浓度。
【IPC分类】G01N21/64, C09K11/06, C07D209/14
【公开号】CN104893710
【申请号】CN201510168610
【发明人】夏立新, 张爱霞, 宋朋
【申请人】辽宁大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月8日
最新回复(0)