检测过氧化亚硝基的荧光探针及制备和应用
检测过氧化亚硝基的荧光探针及制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物检测领域，涉及一类检测过氧化亚硝基的荧光探针及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 过氧化亚硝基是活性氮家族的一员，是生物体内硝化应激反应的产物之一，在体 内由一氧化氮自由基及超氧阴离子合成。由于其强氧化性及强亲核性，过氧化亚硝基可以 与体内众多的生物分子，包括蛋白质、金属酶、脂质、核酸等反应，引起机体氧化损伤最终导 致细胞凋亡。事实上，目前过氧化亚硝基被广泛认为是一氧化氮自由基及超氧阴离子产生 细胞毒性的罪魁祸首，并参与心血管疾病、神经退行性疾病等疾病的发生发展。而另一方 面，过氧化亚硝基也被报导可作为信号分子或细胞毒效应子清除体内入侵病原体，从而发 挥积极的机体保护作用。近期研宄表明，过氧化亚硝基可通过硝化蛋白质酪氨酸残基而参 与到酪氨酸磷酸化信号通路中。目前，人们对过氧化亚硝基在生物体内的生理及病理角色 仍充满争议。因此，发展能对生物体内的过氧化亚硝基进行实时追踪检测的方法，可极大推 动过氧化亚硝基相关的生理病理学研宄。
[0003] 传统的检测过氧化亚硝基的方法基本依赖于其下游反应产物一一3-硝基酪氨酸 的检测。这种检测方法存在特异性差、不能适用于活体检测等两方面的问题。荧光探针检 测法是近几年来发展起来的新方法。该方法利用过氧化亚硝基的氧化性或亲核性，设计可 与过氧化亚硝基特异性反应的荧光探针，这些荧光探针本身无荧光，与过氧化亚硝基反应 后可生成具有强荧光的产物，因而可用于过氧化亚硝基的灵敏检测。由于小分子荧光探针 具有体积小、生物膜通透性良好的优点，因而荧光探针法除适用于检测血浆、组织匀浆中的 过氧化亚硝基，还适用于活细胞甚至是动物组织中过氧化亚硝基的检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一类新型的特异性检测过氧化亚硝基的小分子荧光探 针，具有式Ia或Ib所示的结构通式：
其中： X为硫或氧原子； Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2为氢，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等； 馬为氢或烷氧基； R4为氢、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等； 本发明的又一个目的是提供式Ia及Ib所示化合物的制备方法，通过以下两种制备方 法实现： (1)式Ia化合物的制备方法： R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与RpR2取代的苯甲醛在甲醇溶液 中室温搅拌两个小时，抽滤，即得式la。
[0005] (2)式Ib化合物的制备方法： A. R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与R2取代的邻羟基苯甲醛在甲 醇溶液，双氧水及盐酸共同存在的条件下室温反应得中间体II ; B. 中间体II在二氯甲烷溶液中，吡啶存在的条件下与三氟甲磺酸酐反应，得中间体 III ; C. 中间体III与R3取代的对羟基苯叔丁基二甲基硅醚或者R 3取代的对氨基苯叔丁基 二甲基硅醚在醋酸钯存在下偶联，后经苯胺氮原子甲基化、羟基脱除硅醚保护基，得Ib所 示探针。
其中： X为硫或氧原子； Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2为氢，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等； 馬为氢或烷氧基； R4为氢、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等。
[0007] 本发明的再一个目的是提供式Ia或Ib所示的荧光探针在检测生物过氧化亚硝基 中的应用。本发明以活细胞中的应用为例，可通过以下步骤实现：细胞培养基中加入式Ia 或Ib所示的荧光探针，使其终浓度为5 μ M，37 °C下孵育30分钟，观察记录细胞荧光强度， 本发明提供的荧光探针的特征在于它本身在生理环境中只有微弱的荧光，但可与过氧化亚 硝基特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，实现3倍至600倍的荧光增强，从而实现对 过氧化亚硝基的特异性检测和定量分析。
[0008] 本发明涉及的荧光探针具有以下有益效果：（1)稳定性好，能够长期保存使用； (2)具有较大的吸收发射波长差（>100nm)，能够有效避免激发光的干扰；（3)由于探针本身 无荧光，只有在与过氧化亚硝基反应后才有荧光，因此，检测信噪比高，灵敏度好；（4)具有 优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测过氧化亚硝基；（5)具有良好的生物膜 通透性，因而能用于活细胞中过氧化亚硝基的检测；（6)具有较好的双光子吸收截面，能用 于双光子显微镜下观测。
【附图说明】
[0009] 图1是荧光探针分子Ia-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化。
[0010] 图2.荧光探针分子Ib-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化。
[0011] 图3.荧光探针分子Ib-2与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化。
[0012] 图4是荧光探针分子Ia-I对过氧化亚硝基的选择性。
[0013] 图5是荧光探针分子Ib-I对过氧化亚硝基的选择性。
[0014] 图6是荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基的选择性。
[0015] 图7是荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基浓度依赖性荧光增强。
[0016] 图8是荧光探针分子Ib-I检测活细胞血管内皮细胞中过氧化亚硝基。
[0017] 图9是荧光探针分子Ib-I检测2种活细胞中过氧化亚硝基。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例不是限制本发明的 范围。
[0019] 实施例1 :焚光探针分子Ia-I的制备 Ig邻氨基苯硫酚（8毫摩尔）与邻羟基苯甲醛（8毫摩尔）在SmL甲醇中室温搅拌两 个小时，抽滤，得白色固体2- (2, 3-二氢苯并[d]噻唑-2-基）苯酚。即得la-Ι，收率 50%。1H NMR (500 MHz, DMS0) δ 9. 85 (s，1H)，7. 4 (d，1H)，7. I (t，1H)，6. 95 (d，1H)， 6. 75-6. 85 (m，3H), 6.65 (d，2H), 6.55 (t，lH), 6.45 (s，lH)。
[0021] 实施例2 :焚光探针分子Ib-I的制备 邻氨基苯硫酚（0. 5g，3. 6毫摩尔)与邻羟基苯甲醛（0. 438g，3. 5毫摩尔)溶解在5mL甲 醇溶液中，冰浴下滴加37%的过氧化氢（15. 75毫摩尔)然后再滴加37%盐酸（9. 2毫摩尔)， 室温反应两个小时抽滤，乙醇重结晶，得中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基）苯酚即11-1，收 率70%;中间体II-I (0.5g，2毫摩尔）首先用20毫升无水二氯甲烷搅拌溶解，氮气置换， 冰浴下向反应液中首先滴加吡啶溶液（328μL, 4毫摩尔)，然后再向反应液中匀速缓慢滴加 三氟甲磺酸酐（〇.863g，3毫摩尔），室温搅拌3-4小时。反应完毕用乙酸乙酯萃取，无水硫 酸钠干燥，柱层析纯化，得中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基三氟甲磺酸即III-I ;中间 体III-I (0. 25g，0. 7毫摩尔)与4 -((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯胺（0. 2g，0.8毫摩 尔)、醋酸钯（3%毫摩尔）、BINAP (4. 5%毫摩尔）和碳酸铯（1. 4毫摩尔）溶解在4mL甲苯中， 80摄氏度反应16小时，抽滤，柱层析纯化。得黄色2-(苯并[d]噻唑-2-基）-N-苯基苯 胺类关键中间，收率80%，该中间体经N-甲基化，脱羟基保护基得探针分子Ib-I，收率68%。 1HNMR (500 MHz, DMS0) δ 9. 8 (s, 1H), 5 8.85 (s, 1H), 8. 5 (dd, ^10, 1H), 8.05 (t, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.55 (m, 2H), 6.64 (d，2H), 6.55 (d, 2H), 3.1 (s, 3H)。
[0023] 实施例3 :焚光探针分子Ib-2的制备 中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基）苯基三氟甲磺酸酯（0. 25g，0. 7毫摩尔）与4 -((叔 丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3_甲氧基苯胺（0. 25g，0.8毫摩尔)、醋酸钯（3%毫摩尔)、BINAP (4. 5%毫摩尔）和碳酸铯（1. 4毫摩尔）溶解在4mL甲苯中，80摄氏度反应16小时，抽滤，柱 层析纯化。得黄色2-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-苯基苯胺类关键中间，收率80%;该中间体 经N-甲基化，脱羟基保护基得探针分子lb-2,收率65%。 1HNMR (500 MHz，DMS0) δ 10. 4 (s，lH)，8.15(d，1Η)，8.05 (d，1Η), 7.8 (d，1Η), 7.55 (t, 1Η), 7.45 (t，lH), 7.3 (m, 2H), 7.0 (3, 1H), 6.85 (3, 1H), 6. 7 (d, 1H), 6.5 (dd, 1H) ,3.85 (s, 3H), 3.8 (s, 3H) 〇
[0025] 实施例4 :荧光探针分子Ib-3的制备 中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基)-5-氟苯基三氟甲磺酸酯（0. 50g，1. 4毫摩尔)与4 -((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3_甲氧基苯胺（0.50g，1.6毫摩尔）、醋酸钯（3%毫摩尔)、 BINAP (4. 5%毫摩尔)和碳酸铯（1. 4毫摩尔)溶解在8mL甲苯中，80摄氏度反应16小时，抽 滤，柱层析纯化。得黄色2-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-苯基苯胺类关键中间，收率78% ;该 中间体经N-甲基化，脱羟基保护基得探针分子lb-2,收率70%。1H NMR (500 MHz, DMS0) δ8·52 (dd，lH)，8.45 (s，1H)，8.02 (d，2H), 7.5 (t，lH), 7.40 (t, 1H), 7.34 (t，lH), 7. 2(dd, 2H), 6.62 (d, 1H), 6. 38 (d, 1H), 6. 10(dd, 1H), 3.64 (s, 3H),3. 16(s, 3H)〇
[0027] 实施例5 :荧光探针分子Ia-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化 将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或过氧化亚硝基的PBS溶液，使探 针分子的终浓度为5 μΜ，过氧化亚硝基终浓度为1〇μΜ。反应10min后使用荧光分光光计以 375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的焚光强度，进而确定探针分子与过 氧化亚硝基反应后荧光强度增强，如图1所示。
[0028] 实施例6 :焚光探针分子Ib-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化 将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或过氧化亚硝基的PBS溶液，使探 针分子的终浓度为5 μΜ，过氧化亚硝基终浓度为1〇μΜ。反应10min后使用荧光分光光计以 375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的焚光强度，进而确定探针分子与过 氧化亚硝基反应后荧光强度增强，如图2所示。
[0029] 实施例7 :荧光探针分子Ib-2与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化 将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或过氧化亚硝基的PBS溶液，使探 针分子的终浓度为5 μΜ，过氧化亚硝基终浓度为1〇μΜ。反应10min后使用荧光分光光计以 375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的焚光强度，进而确定探针分子与过 氧化亚硝基反应后荧光强度增强，如图3所示。
[0030] 实施例8 :荧光探针分子Ia-I对过氧化亚硝基的选择性 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶 解的待测样品，使探针分子的终浓度为5 μΜ,而待测样品终浓度为1〇μΜ。反应30min后使 用荧光分光光计以375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而 确定探针分子对过氧化亚硝基的选择性，如图4所示。
[0031] 实施例9 :荧光探针分子Ib-I对过氧化亚硝基的选择性 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶 解的待测样品，使探针分子的终浓度为5 μΜ,而待测样品终浓度为1〇μΜ。反应30min后使 用荧光分光光计以375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而 确定探针分子对过氧化亚硝基的选择性，如图5所示。
[0032] 实施例10 :荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基的选择性 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶 解的待测样品，使探针分子的终浓度为5 μΜ,而待测样品终浓度为1〇μΜ。反应30min后使 用荧光分光光计以375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而 确定探针分子对过氧化亚硝基的选择性，如图6所示。
[0033] 实施例11 :荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基浓度依赖性荧光增强 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入不同浓度的过 氧化亚硝基溶液，使探针分子的终浓度为5 μΜ，反应30min后使用荧光分光光计以375 nm 激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而确定探针分子对过氧化亚 硝基浓度依赖性荧光增强，如图7所示。
[0034] 实施例12 :焚光探针分子Ib-I检测活细胞中过氧化亚硝基 将血管内皮细胞EA. hy926接种于多聚赖氨酸包被过的玻片上，含10%胎牛血清的DMEM 全培养液中培养24小时后，加入ONOCT (60 μΜ)或ONOCT供体SIN-1 (ImM)处理6h。随后 换液，加入含有5 荧光探针Ib_l(5mM，1:1000)的培养液，置于细胞培养箱中37°C孵育 30min。细胞玻片经过4%PFA固定45min后，PBS洗3次，0. l%triton X-100透膜处理5min， 加入50 kg/ml RANase 37°C处理30min排除RNA干扰，随后进行细胞核定位PI染色，封片。 采用激光过聚焦荧光显微镜观察，拍照。其中分别采用405nm和543nm激光波长激发Ib-I 和PI。结果表明，荧光探针分子Ib-I可有效检测到活细胞血管内皮细胞中的过氧亚硝基， 如图8所示。
[0035] 此外，采用糖氧剥夺模型（Oxygen-Glucose deprivation, 0GD)处理血管内皮细 胞EA. hy926和人脑微血管内皮细胞HBMEC，考察荧光探针分子Ib-I是否能有效检测缺血 性病理损伤过程中0N0CT的积聚。细胞经0⑶处理3h后，如上述方法加入荧光探针分子孵 育，并进行固定、透膜、细胞核PI染色、封片、共聚焦显微镜观察、拍照，结果如图9所示。相 较于正常组，0⑶处理组细胞的Ib-I荧光强度明显增强，表明荧光探针分子Ib-I有效监测 细胞病理损伤过程中(^00_的变化。
【主权项】
1. 一类检测过氧化亚硝基的荧光探针，其特征在于，具有式Ia或Ib所示的结构通式： 其中：X为硫或氧原子； Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2为氢，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基； 馬为氢或烷氧基； R4为氢、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基。2. -类式Ia所示化合物的制备方法，其特征在于，通过以下制备方法实现： R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与RpR2取代的苯甲醛在甲醇溶液 中室温搅拌两个小时，抽滤，即得式Ia所示化合物；反应式为：其中取代基X、Yj1、R2、R3、R4的定义同权利要求1。3. -类式Ib所示化合物的制备方法，其特征在于，通过以下制备方法实现： (1) R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与R2取代的邻羟基苯甲醛在 甲醇溶液，双氧水及盐酸共同存在的条件下室温反应得中间体II ; (2) 中间体II在二氯甲烷溶液中，吡啶存在的条件下与三氟甲磺酸酐反应，得中间体 III ; (3) 中间体III与R3取代的对羟基苯叔丁基二甲基硅醚或者R3取代的对氨基苯叔丁基 二甲基硅醚在醋酸钯存在下偶联，后经苯胺氮原子甲基化、羟基脱除硅醚保护基，得Ib所 示化合物；反应式为：其中取代基X、Y、RpR2、R3、R4的定义同权利要求1。4.根据权利要求1所述的一类检测过氧化亚硝基的荧光探针在检测生物过氧化亚硝 基中的应用。
【专利摘要】本发明提供一类检测过氧化亚硝基的荧光探针，具有式Ia或Ib的结构通式，通过（1）R4取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与R1、R2取代的苯甲醛在甲醇溶液中室温搅拌两个小时，得1a；（2）R4取代的邻氨基苯硫酚或者邻氨基苯酚与R2取代的邻羟基苯甲醛进行氧化缩合，得苯并噻唑类或苯并恶唑类中间体；该中间体的酚羟基转化为三氟甲磺酸酯后与R3取代的对羟基苯叔丁基二甲基硅醚或对氨基苯叔丁基二甲基硅醚偶联，经苯胺氮原子甲基化、羟基脱除硅醚保护基，得Ib。本发明提供的荧光探针可与过氧化亚硝基特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，从而实现对过氧化亚硝基的特异性检测。本发明探针的结构通式：。
【IPC分类】C09K11/06, G01N21/64, C07D277/66
【公开号】CN104893711
【申请号】CN201510258766
【发明人】李新, 陶蓉蓉, 韩峰, 胡有洪, 胡永洲, 程娟
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
【技术领域】
[0001] 本发明属生物检测领域，涉及一类检测过氧化亚硝基的荧光探针及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 过氧化亚硝基是活性氮家族的一员，是生物体内硝化应激反应的产物之一，在体 内由一氧化氮自由基及超氧阴离子合成。由于其强氧化性及强亲核性，过氧化亚硝基可以 与体内众多的生物分子，包括蛋白质、金属酶、脂质、核酸等反应，引起机体氧化损伤最终导 致细胞凋亡。事实上，目前过氧化亚硝基被广泛认为是一氧化氮自由基及超氧阴离子产生 细胞毒性的罪魁祸首，并参与心血管疾病、神经退行性疾病等疾病的发生发展。而另一方 面，过氧化亚硝基也被报导可作为信号分子或细胞毒效应子清除体内入侵病原体，从而发 挥积极的机体保护作用。近期研宄表明，过氧化亚硝基可通过硝化蛋白质酪氨酸残基而参 与到酪氨酸磷酸化信号通路中。目前，人们对过氧化亚硝基在生物体内的生理及病理角色 仍充满争议。因此，发展能对生物体内的过氧化亚硝基进行实时追踪检测的方法，可极大推 动过氧化亚硝基相关的生理病理学研宄。
[0003] 传统的检测过氧化亚硝基的方法基本依赖于其下游反应产物一一3-硝基酪氨酸 的检测。这种检测方法存在特异性差、不能适用于活体检测等两方面的问题。荧光探针检 测法是近几年来发展起来的新方法。该方法利用过氧化亚硝基的氧化性或亲核性，设计可 与过氧化亚硝基特异性反应的荧光探针，这些荧光探针本身无荧光，与过氧化亚硝基反应 后可生成具有强荧光的产物，因而可用于过氧化亚硝基的灵敏检测。由于小分子荧光探针 具有体积小、生物膜通透性良好的优点，因而荧光探针法除适用于检测血浆、组织匀浆中的 过氧化亚硝基，还适用于活细胞甚至是动物组织中过氧化亚硝基的检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一类新型的特异性检测过氧化亚硝基的小分子荧光探 针，具有式Ia或Ib所示的结构通式：
其中： X为硫或氧原子； Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2为氢，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等； 馬为氢或烷氧基； R4为氢、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等； 本发明的又一个目的是提供式Ia及Ib所示化合物的制备方法，通过以下两种制备方 法实现： (1)式Ia化合物的制备方法： R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与RpR2取代的苯甲醛在甲醇溶液 中室温搅拌两个小时，抽滤，即得式la。
[0005] (2)式Ib化合物的制备方法： A. R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与R2取代的邻羟基苯甲醛在甲 醇溶液，双氧水及盐酸共同存在的条件下室温反应得中间体II ; B. 中间体II在二氯甲烷溶液中，吡啶存在的条件下与三氟甲磺酸酐反应，得中间体 III ; C. 中间体III与R3取代的对羟基苯叔丁基二甲基硅醚或者R 3取代的对氨基苯叔丁基 二甲基硅醚在醋酸钯存在下偶联，后经苯胺氮原子甲基化、羟基脱除硅醚保护基，得Ib所 示探针。
其中： X为硫或氧原子； Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2为氢，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等； 馬为氢或烷氧基； R4为氢、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等。
[0007] 本发明的再一个目的是提供式Ia或Ib所示的荧光探针在检测生物过氧化亚硝基 中的应用。本发明以活细胞中的应用为例，可通过以下步骤实现：细胞培养基中加入式Ia 或Ib所示的荧光探针，使其终浓度为5 μ M，37 °C下孵育30分钟，观察记录细胞荧光强度， 本发明提供的荧光探针的特征在于它本身在生理环境中只有微弱的荧光，但可与过氧化亚 硝基特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，实现3倍至600倍的荧光增强，从而实现对 过氧化亚硝基的特异性检测和定量分析。
[0008] 本发明涉及的荧光探针具有以下有益效果：（1)稳定性好，能够长期保存使用； (2)具有较大的吸收发射波长差（>100nm)，能够有效避免激发光的干扰；（3)由于探针本身 无荧光，只有在与过氧化亚硝基反应后才有荧光，因此，检测信噪比高，灵敏度好；（4)具有 优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测过氧化亚硝基；（5)具有良好的生物膜 通透性，因而能用于活细胞中过氧化亚硝基的检测；（6)具有较好的双光子吸收截面，能用 于双光子显微镜下观测。
【附图说明】
[0009] 图1是荧光探针分子Ia-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化。
[0010] 图2.荧光探针分子Ib-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化。
[0011] 图3.荧光探针分子Ib-2与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化。
[0012] 图4是荧光探针分子Ia-I对过氧化亚硝基的选择性。
[0013] 图5是荧光探针分子Ib-I对过氧化亚硝基的选择性。
[0014] 图6是荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基的选择性。
[0015] 图7是荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基浓度依赖性荧光增强。
[0016] 图8是荧光探针分子Ib-I检测活细胞血管内皮细胞中过氧化亚硝基。
[0017] 图9是荧光探针分子Ib-I检测2种活细胞中过氧化亚硝基。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例不是限制本发明的 范围。
[0019] 实施例1 :焚光探针分子Ia-I的制备 Ig邻氨基苯硫酚（8毫摩尔）与邻羟基苯甲醛（8毫摩尔）在SmL甲醇中室温搅拌两 个小时，抽滤，得白色固体2- (2, 3-二氢苯并[d]噻唑-2-基）苯酚。即得la-Ι，收率 50%。1H NMR (500 MHz, DMS0) δ 9. 85 (s，1H)，7. 4 (d，1H)，7. I (t，1H)，6. 95 (d，1H)， 6. 75-6. 85 (m，3H), 6.65 (d，2H), 6.55 (t，lH), 6.45 (s，lH)。
[0021] 实施例2 :焚光探针分子Ib-I的制备 邻氨基苯硫酚（0. 5g，3. 6毫摩尔)与邻羟基苯甲醛（0. 438g，3. 5毫摩尔)溶解在5mL甲 醇溶液中，冰浴下滴加37%的过氧化氢（15. 75毫摩尔)然后再滴加37%盐酸（9. 2毫摩尔)， 室温反应两个小时抽滤，乙醇重结晶，得中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基）苯酚即11-1，收 率70%;中间体II-I (0.5g，2毫摩尔）首先用20毫升无水二氯甲烷搅拌溶解，氮气置换， 冰浴下向反应液中首先滴加吡啶溶液（328μL, 4毫摩尔)，然后再向反应液中匀速缓慢滴加 三氟甲磺酸酐（〇.863g，3毫摩尔），室温搅拌3-4小时。反应完毕用乙酸乙酯萃取，无水硫 酸钠干燥，柱层析纯化，得中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基三氟甲磺酸即III-I ;中间 体III-I (0. 25g，0. 7毫摩尔)与4 -((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯胺（0. 2g，0.8毫摩 尔)、醋酸钯（3%毫摩尔）、BINAP (4. 5%毫摩尔）和碳酸铯（1. 4毫摩尔）溶解在4mL甲苯中， 80摄氏度反应16小时，抽滤，柱层析纯化。得黄色2-(苯并[d]噻唑-2-基）-N-苯基苯 胺类关键中间，收率80%，该中间体经N-甲基化，脱羟基保护基得探针分子Ib-I，收率68%。 1HNMR (500 MHz, DMS0) δ 9. 8 (s, 1H), 5 8.85 (s, 1H), 8. 5 (dd, ^10, 1H), 8.05 (t, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.55 (m, 2H), 6.64 (d，2H), 6.55 (d, 2H), 3.1 (s, 3H)。
[0023] 实施例3 :焚光探针分子Ib-2的制备 中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基）苯基三氟甲磺酸酯（0. 25g，0. 7毫摩尔）与4 -((叔 丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3_甲氧基苯胺（0. 25g，0.8毫摩尔)、醋酸钯（3%毫摩尔)、BINAP (4. 5%毫摩尔）和碳酸铯（1. 4毫摩尔）溶解在4mL甲苯中，80摄氏度反应16小时，抽滤，柱 层析纯化。得黄色2-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-苯基苯胺类关键中间，收率80%;该中间体 经N-甲基化，脱羟基保护基得探针分子lb-2,收率65%。 1HNMR (500 MHz，DMS0) δ 10. 4 (s，lH)，8.15(d，1Η)，8.05 (d，1Η), 7.8 (d，1Η), 7.55 (t, 1Η), 7.45 (t，lH), 7.3 (m, 2H), 7.0 (3, 1H), 6.85 (3, 1H), 6. 7 (d, 1H), 6.5 (dd, 1H) ,3.85 (s, 3H), 3.8 (s, 3H) 〇
[0025] 实施例4 :荧光探针分子Ib-3的制备 中间体2-(苯并[d]噻唑-2-基)-5-氟苯基三氟甲磺酸酯（0. 50g，1. 4毫摩尔)与4 -((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3_甲氧基苯胺（0.50g，1.6毫摩尔）、醋酸钯（3%毫摩尔)、 BINAP (4. 5%毫摩尔)和碳酸铯（1. 4毫摩尔)溶解在8mL甲苯中，80摄氏度反应16小时，抽 滤，柱层析纯化。得黄色2-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-苯基苯胺类关键中间，收率78% ;该 中间体经N-甲基化，脱羟基保护基得探针分子lb-2,收率70%。1H NMR (500 MHz, DMS0) δ8·52 (dd，lH)，8.45 (s，1H)，8.02 (d，2H), 7.5 (t，lH), 7.40 (t, 1H), 7.34 (t，lH), 7. 2(dd, 2H), 6.62 (d, 1H), 6. 38 (d, 1H), 6. 10(dd, 1H), 3.64 (s, 3H),3. 16(s, 3H)〇
[0027] 实施例5 :荧光探针分子Ia-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化 将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或过氧化亚硝基的PBS溶液，使探 针分子的终浓度为5 μΜ，过氧化亚硝基终浓度为1〇μΜ。反应10min后使用荧光分光光计以 375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的焚光强度，进而确定探针分子与过 氧化亚硝基反应后荧光强度增强，如图1所示。
[0028] 实施例6 :焚光探针分子Ib-I与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化 将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或过氧化亚硝基的PBS溶液，使探 针分子的终浓度为5 μΜ，过氧化亚硝基终浓度为1〇μΜ。反应10min后使用荧光分光光计以 375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的焚光强度，进而确定探针分子与过 氧化亚硝基反应后荧光强度增强，如图2所示。
[0029] 实施例7 :荧光探针分子Ib-2与过氧化亚硝基反应前后的荧光变化 将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或过氧化亚硝基的PBS溶液，使探 针分子的终浓度为5 μΜ，过氧化亚硝基终浓度为1〇μΜ。反应10min后使用荧光分光光计以 375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的焚光强度，进而确定探针分子与过 氧化亚硝基反应后荧光强度增强，如图3所示。
[0030] 实施例8 :荧光探针分子Ia-I对过氧化亚硝基的选择性 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶 解的待测样品，使探针分子的终浓度为5 μΜ,而待测样品终浓度为1〇μΜ。反应30min后使 用荧光分光光计以375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而 确定探针分子对过氧化亚硝基的选择性，如图4所示。
[0031] 实施例9 :荧光探针分子Ib-I对过氧化亚硝基的选择性 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶 解的待测样品，使探针分子的终浓度为5 μΜ,而待测样品终浓度为1〇μΜ。反应30min后使 用荧光分光光计以375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而 确定探针分子对过氧化亚硝基的选择性，如图5所示。
[0032] 实施例10 :荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基的选择性 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶 解的待测样品，使探针分子的终浓度为5 μΜ,而待测样品终浓度为1〇μΜ。反应30min后使 用荧光分光光计以375 nm激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而 确定探针分子对过氧化亚硝基的选择性，如图6所示。
[0033] 实施例11 :荧光探针分子Ib-2对过氧化亚硝基浓度依赖性荧光增强 将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入不同浓度的过 氧化亚硝基溶液，使探针分子的终浓度为5 μΜ，反应30min后使用荧光分光光计以375 nm 激发，记录溶液在最大发射波长(约470 nm)下的荧光强度，进而确定探针分子对过氧化亚 硝基浓度依赖性荧光增强，如图7所示。
[0034] 实施例12 :焚光探针分子Ib-I检测活细胞中过氧化亚硝基 将血管内皮细胞EA. hy926接种于多聚赖氨酸包被过的玻片上，含10%胎牛血清的DMEM 全培养液中培养24小时后，加入ONOCT (60 μΜ)或ONOCT供体SIN-1 (ImM)处理6h。随后 换液，加入含有5 荧光探针Ib_l(5mM，1:1000)的培养液，置于细胞培养箱中37°C孵育 30min。细胞玻片经过4%PFA固定45min后，PBS洗3次，0. l%triton X-100透膜处理5min， 加入50 kg/ml RANase 37°C处理30min排除RNA干扰，随后进行细胞核定位PI染色，封片。 采用激光过聚焦荧光显微镜观察，拍照。其中分别采用405nm和543nm激光波长激发Ib-I 和PI。结果表明，荧光探针分子Ib-I可有效检测到活细胞血管内皮细胞中的过氧亚硝基， 如图8所示。
[0035] 此外，采用糖氧剥夺模型（Oxygen-Glucose deprivation, 0GD)处理血管内皮细 胞EA. hy926和人脑微血管内皮细胞HBMEC，考察荧光探针分子Ib-I是否能有效检测缺血 性病理损伤过程中0N0CT的积聚。细胞经0⑶处理3h后，如上述方法加入荧光探针分子孵 育，并进行固定、透膜、细胞核PI染色、封片、共聚焦显微镜观察、拍照，结果如图9所示。相 较于正常组，0⑶处理组细胞的Ib-I荧光强度明显增强，表明荧光探针分子Ib-I有效监测 细胞病理损伤过程中(^00_的变化。
【主权项】
1. 一类检测过氧化亚硝基的荧光探针，其特征在于，具有式Ia或Ib所示的结构通式： 其中：X为硫或氧原子； Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2为氢，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基； 馬为氢或烷氧基； R4为氢、C ^C4烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基。2. -类式Ia所示化合物的制备方法，其特征在于，通过以下制备方法实现： R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与RpR2取代的苯甲醛在甲醇溶液 中室温搅拌两个小时，抽滤，即得式Ia所示化合物；反应式为：其中取代基X、Yj1、R2、R3、R4的定义同权利要求1。3. -类式Ib所示化合物的制备方法，其特征在于，通过以下制备方法实现： (1) R4基取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与R2取代的邻羟基苯甲醛在 甲醇溶液，双氧水及盐酸共同存在的条件下室温反应得中间体II ; (2) 中间体II在二氯甲烷溶液中，吡啶存在的条件下与三氟甲磺酸酐反应，得中间体 III ; (3) 中间体III与R3取代的对羟基苯叔丁基二甲基硅醚或者R3取代的对氨基苯叔丁基 二甲基硅醚在醋酸钯存在下偶联，后经苯胺氮原子甲基化、羟基脱除硅醚保护基，得Ib所 示化合物；反应式为：其中取代基X、Y、RpR2、R3、R4的定义同权利要求1。4.根据权利要求1所述的一类检测过氧化亚硝基的荧光探针在检测生物过氧化亚硝 基中的应用。
【专利摘要】本发明提供一类检测过氧化亚硝基的荧光探针，具有式Ia或Ib的结构通式，通过（1）R4取代的邻氨基苯硫酚或者R4取代的邻氨基苯酚与R1、R2取代的苯甲醛在甲醇溶液中室温搅拌两个小时，得1a；（2）R4取代的邻氨基苯硫酚或者邻氨基苯酚与R2取代的邻羟基苯甲醛进行氧化缩合，得苯并噻唑类或苯并恶唑类中间体；该中间体的酚羟基转化为三氟甲磺酸酯后与R3取代的对羟基苯叔丁基二甲基硅醚或对氨基苯叔丁基二甲基硅醚偶联，经苯胺氮原子甲基化、羟基脱除硅醚保护基，得Ib。本发明提供的荧光探针可与过氧化亚硝基特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，从而实现对过氧化亚硝基的特异性检测。本发明探针的结构通式：。
【IPC分类】C09K11/06, G01N21/64, C07D277/66
【公开号】CN104893711
【申请号】CN201510258766
【发明人】李新, 陶蓉蓉, 韩峰, 胡有洪, 胡永洲, 程娟
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
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