液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法及制品的制作方法
液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法及制品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种液态发酵低桔霉素、高色价红曲红 色素的制备方法及其制品。
【背景技术】
[0002] 红曲属曲霉科真菌紫色红曲霉，又称红曲菌，是用红曲菌在大米中培养发酵而成。 传统上，红曲广泛应用在红酒、食醋等食品领域。近代医学研宄报告认为，红曲具有降血压、 降血脂的作用，所含红曲菌素 K可阻止生成胆固醇。红曲色素也是我国的传统产品，其是通 过微生物发酵法生产并得到广泛应用的最为成功的天然色素之一。红曲色素作为目前唯一 的一种来自微生物的天然安全的食用色素在食品、医药、日用品领域得到了广泛的应用。红 曲色素是类聚酮类的醇溶性色素，其中有6种成分：黄色素（红曲素、红曲黄色素）、红色素 (潘红素、红曲红素）、紫色素（潘红胺、红曲红胺），6种成分结构相近，略有差异。但是，在 制备红曲色素的过程中，通常会产生一种有致癌、致畸作用的真菌毒素即桔霉素、其基因毒 性对红曲产品向全球的推广产生严重的负面影响。
[0003] 目前，生产红曲红色素的方法主要有两种，一是通过固体发酵生产红曲米，然后 再提取色素，也可以直接应用；二是通过液体发酵生产色素。然而固体发酵技术所得的红 曲红色素的色价不高而限制其应用。目前采用液体发酵方法生产红曲红色素，产品中色素 含量、及收率、成品色价等均不高，而如何提高发酵液中红曲色素的色价、降低桔霉素含 量、提高产品色价及色素含量，很大程度上受制于菌种、原料配比、发酵过程、生产工艺、设 备等因素的影响、红曲菌产桔霉素的多少，除了和菌种有关外，与发酵工艺条件也有着密 切的关系；然而现有技术中对红曲红色素的制备工艺上的优化研宄并不多见。
[0004] 因此，研发一种液态发酵性能优异的菌种、培育方法及通过液态发酵制备低桔霉 素、高色价红曲红色素的方法，提高红曲红色素的生产效率和品质，就变得较为迫切。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种以东莞市天益生物发酵技术 有限公司开发的红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、紫外诱变、 分离筛选后得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)作为生产高色价、低桔霉素红曲红色 素的菌种。
[0006] 本发明的目的还在于，提供一种以红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)为菌种、通 过优化的液态发酵工艺制备低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法。
[0007] 本发明的目的还在于，提供一种采用上述方法制备得到的液态发酵低桔霉素、高 色价红曲红色素制品。
[0008] 本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：
[0009] 一种红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka),其微牛物保藏编号为CGMCC9707:已于 2014年9月26日保藏在中国微牛物菌种保藏管理委员会普通微牛物中心，该保藏单位位于 北京市朝阳厌北辰西路1号院3号。
[0010] 所述的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)的培育方法，其是由东莞市天益生物发 酵技术有限公司开发的红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、紫 外诱变、分离筛选后得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)。
[0011] 所述的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)其菌种特征为：菌丝：直径3~5um， 一般3um，含有颗粒，培养久后，颗粒变红色，因此菌丝体成深红色；分生抱子：球形，倒梨 形，直径6~9~12um，无色，含颗粒，通常2~3个成链；闭囊壳：球形，直径304~0 (50) um, 30um以下者极少；子囊饱子：椭圆形，无色3 X 2um ;色素：根据Ridgway色谱，其色泽 为红石植红（Grenadine Red);生长温度：最适温度为33~35°C，37°C以上，30°C以下生长 缓慢，40°C以上几乎不生长。
[0012] 红曲红曲菌 YZ301 (Monascus anka Yang YZ301) AS 3. 2636Wa:25°C，7d，菌落直径 22um，落霞红色；25d菌落直径56_，隆起呈疮疤状覆盆子红，菌落中央裂开。
[0013] MEA培养基：25°C，7d，菌落直径8mm，铁棕色；25d菌落直径20mm，褚石色；CYA培 养基：25°C，7d，菌落直径25rnm，浅粉红色。
[0014] 优选地，所述的培养是在麦芽汁琼脂培养基上10~15° Be、温度28~35°C培养 6~8天，菌落生长平坦，在曲汁琼脂上，于33~35°C培养7天成皮膜状菌落，无气生菌丝， 其形状如熔岩流出，石榴水红色，在麦芽汁琼脂上繁殖良好。
[0015] 优选地，所述的紫外诱变及筛选包括:A、紫外诱变：将培养7~9天的红曲菌种， 经高温55~65°C处理2~lOmin、高压0. 04~0. 07Mpa处理5~10小时，放入内装有带 玻璃珠、无菌水30~50ml的三角瓶，置于摇床振荡1~2小时，过滤，取IOml孢子悬浮液， 加到带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射2~lOmin，涂平板，用黑布包扎，于 温度32~35°C下培养6~8天；
[0016] B、分离培养基：可溶性淀粉5%，麦芽糖3%，蛋白胨0. 1%，添加适量乳酸，调节pH 值5~6,琼脂2% ;
[0017] C、分离培养基 PDA :NaN033. 0g，KH2PO4L 0g，MgSOJH2O 0· 5g，FeSOJH2O 0· 01g，蔗 糖30g，自来水1000ml，琼脂15g ;
[0018] D、斜面培养基MEA :麦芽汁20g，葡萄糖20g，蛋白胨l.Og，自来水1000ml，琼脂 20g〇
[0019] 一种采用前述红曲菌液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法，其包括 如下步骤：
[0020] (1)菌种选育：采用通过紫外诱变分离得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka) 作为菌种，其微生物保藏号为CGMCC9707 ;
[0021] (2)种子培养、扩大培养：将步骤⑴选育得到的红曲红曲菌YZ301依次接入装有 种子培养基的一、二级种子罐中分别培养6~9小时，之后接种到发酵罐中扩大培养75~ 85小时，得到液态种子培养液；
[0022] (3)液态发酵生产：
[0023] (31)采用容量为30m3的大容量发酵罐，装入液体发酵培养基；
[0024] (32)接种步骤⑵所得的液态种子培养液，接种量为5~10%，接入二级种子罐 于温度32~35°C下培养6~9小时，制得发酵用液体种子培养液；
[0025] (33)之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，设定发酵条 件后进行液态发酵，即得低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液。
[0026] 其中，所述的步骤（2)中还包括：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的 三角瓶内打碎1~2小时，按5~10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度32~35°C下培养 22~28小时；所述的步骤（2)中的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4~6%、 NaNO3O. 1 ~0· 3%、MgSO4 0· 1 ~0· 3%、KH2PO4O. 1 ~0· 3%、玉米浆 1 ~5%。
[0027] 所述的步骤（31)中还包括首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体积的液体发 酵培养基，在罐温121~125°C、罐压0. 1~0. 15Mpa下灭菌30min，冷却降温至30~35°C; 所述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8~15%、大豆0. 1~ 0. 5%、NaNO3O. 1 %~0. 3%、玉米浆1~5% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为 3. 0 ~4. 5〇
[0028] 所述的步骤（33)发酵条件设定如下：温度为发酵初始0~34h保温在30~ 35°C、发酵持续35~85h调整温度为33~36°C ;通风量为发酵初始0~25h设为300~ 500L · min 、发酵中后期26~85h调整为550~700L · min ;整个发酵过程始终匀速搅拌， 转速为200~400r/min、罐压为0. 04~0. 07Mpa ;连续发酵培养时间共进行75~85h。
[0029] 所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C ;发酵持续35~45小时到达发酵旺盛期后进行补料，补料量占总体积的5~10% ;所 述的补料为米粉10~20%、大豆0. 1~0. 5%，用乳酸调节pH值3. 0~4. 5。
[0030] 前述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其还包括如下步骤：
[0031] (4)提取、纯化：将所述步骤（33)得到的低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液经脱 水后，将留下的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，再二次压滤，将浸提滤液 经膜过滤（即纳滤）、真空浓缩（20~35Be锤度），得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓 缩液；
[0032] (5)喷雾干燥：将步骤⑷所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低 桔霉素、高色价红曲红色素粉末成品。
[0033] 在发酵培养过程中，定期取样分析其理化指标并进行适当补充营养液即补料，可 使发酵水平和产出率均得到提高，补料时间在发酵中期及旺盛期较好。
[0034] 对于前述发酵培养过程中，采用紫外光分光度计检测所述的发酵液、红曲红色素 成品的吸光度，吸收峰波长为495~505nm。
[0035] 在发酵过程中，检测所述红曲红色素成品的桔霉素的含量，其成品中桔霉素的含 量不大于〇· 2mg/kg (以单位色价500u/g计）。
[0036] 采用前述的制备方法制备得到的低桔霉素、高色价红曲红色素，其成品中桔霉素 的含量不大于〇. 2mg/kg (以单位色价500u/g计）、红曲红色素色价为10300~10800u/g。
[0037] 本发明与现有技术相比，具有如下优点：
[0038] 1、本发明提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，其微生物保藏编号为 CGMCC9707,是发明人经过培养、紫外诱变、多次分离筛选后得到优良菌种，其综合生物学性 能优异，最适于液态发酵工艺，繁育性能稳定、高产色素，该菌种在紫外诱变过程中能够耐 高温（35~36. 5 °C )、高压（0. 06~0. 08Mpa)，发酵液培养过程中如增大接种量并保持较低 的PH值、可使发酵水平稳定，且能控制发酵过程中红曲次代谢物桔霉素的含量，提高发酵 液红曲色素的含量（即高色价）及收率，安全性高、稳定性好。
[0039] 2、本发明采用专门培育的菌种、工艺条件及各步骤的合理控制，对选用的红曲菌 诱变株进行液态发酵，得到高含量的红曲红色素发酵液，再经过提取工序处理后所得的红 曲红色素，桔霉素含量很低、安全性高、稳定性好、红曲色素色价高，且本发明将优选的菌种 在种子培养后、液态发酵之前，还采用了逐级扩大培养，从而增加了发酵初期的菌种含量， 提高了发酵期微生物的活性、缩短发酵周期，使大量微生物在发酵期内处于生长旺盛阶段， 保持旺盛的新陈代谢，利于提高色素产量。
[0040] 3、本发明通过提取、纯化工艺，有效地将大分子蛋白、小分子有机酸、糖与天然色 素分离，去除部分桔霉素，使红曲红色素产品的纯度和稳定性显著提高。
[0041] 4、本发明在发酵培养过程中，定期取样分析其理化指标并在发酵旺盛期适当补 料，使发酵水平和产出率均得到提高。
[0042] 5、本发明采用液态发酵技术，原料绿色环保、无污染、安全、配方合理，制备过程容 易控制、工艺合理稳定、效率高，使产品质量稳定、有效成分高、有害成分低，符合食品质量 安全标准，可实现大规模工业化生产。
[0043] 6、本发明的制备方法制得的成品中红曲红色素色价高达10300~10800u/g、桔霉 素含量不大于〇. 2mg/kg (以单位色价500u/g计）。
[0044] 上述是发明技术方案的概述，以下结合【具体实施方式】，对本发明做进一步说明。
【具体实施方式】：
[0045] 实施例1本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，其微生物保藏编号 为CGMCC9707 ;所述的红曲红曲菌YZ301(Monascus anka)l的培育方法，其是由东莞市天益 生物发酵技术有限公司开发的红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培 养、紫外诱变、多次分离筛选后得到的红曲红曲菌，编号YZ301 (Monascus anka)。
[0046] 所述的培养是在麦芽汁琼脂培养基10~15° Be、温度28~35°C培养6~8天， 菌落生长平坦，在曲汁琼脂上，于33~35°C培养7天成皮膜状菌落，无气生菌丝，其形状如 熔岩流出，石榴水红色，在麦芽汁琼脂上繁殖良好；
[0047] 优选地，所述的紫外诱变及筛选包括:A、紫外诱变：将培养7~9天的红曲菌种， 经高温55~65°C处理2~lOmin、高压0. 04~0. 07Mpa处理5~10小时，放入内装有带 玻璃珠、无菌水80~100mL的500ml三角瓶，置于摇床振荡1~2小时，过滤，取IOml孢子 悬浮液，加到带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射2~lOmin，涂平板，用黑布 包扎，于温度32~35 °C下培养6~8天；
[0048] B、分离培养基：可溶性淀粉5%，麦芽糖3%，蛋白胨0. 1%，添加适量乳酸，调节pH 值5~6,琼脂2% ;
[0049] C、分离培养基 PDA :NaN033. 0g，KH2PO4L 0g，MgSOJH2O 0· 5g，FeSOJH2O 0· Olg，蔗 糖30g，自来水1000ml，琼脂15g ;
[0050] D、斜面培养基MEA :麦芽汁20g，葡萄糖20g，蛋白胨l.Og，自来水1000ml，琼脂 20g〇
[0051] 一种采用前述红曲菌液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法，其包括 如下步骤：
[0052] (1)菌种选育：采用通过紫外诱变分离得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka) 作为菌种，其保藏号为CGMCC9707 ;
[0053] (2)种子培养、扩大培养：将步骤⑴选育得到的红曲红曲菌YZ301依次接入装有 种子培养基的一、二级种子罐中分别培养6~9小时，之后接种到发酵罐中扩大培养75~ 85小时，得到液态种子培养液；
[0054] (3)液态发酵生产：
[0055] (31)采用容量为30m3的大容量发酵罐，装入液体发酵培养基；
[0056] (32)接种步骤⑵所得的液态种子培养液，接种量为5~10%，接入二级种子罐 于温度32~35°C下培养6~9小时，制得发酵用液体种子培养液；
[0057] (33)之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，设定发酵条 件后进行液态发酵，即得低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液。
[0058] 其中，所述的步骤（2)中还包括：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的 三角瓶内打碎1~2小时，按5~10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度32~35°C下培养 22~28小时；所述的步骤（2)中的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4~6%、 NaNO3O. 1 ~0· 3%、MgSO4 0· 1 ~0· 3%、KH2PO4O. 1 ~0· 3%、玉米浆 1 ~5%。
[0059] 所述的步骤（31)中还包括首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体积的液体发 酵培养基，在罐温121~125°C、罐压0. 1~0. 15Mpa下灭菌30min，冷却降温至30~35°C; 所述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8~15%、大豆0. 1~ 0. 5%、NaNO3O. 1 %~0. 3%、玉米浆1~5% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为 3. 0 ~4. 5〇
[0060] 所述的步骤（33)发酵条件设定如下：温度为发酵初始0~34h保温在30~ 35°C、发酵持续35~85h调整 温度为33~36°C ;通风量为发酵初始0~25h设为300~ 500L · min、发酵中后期26~85h调整为550~700L · min ;整个发酵过程始终匀速搅拌， 转速为200~400r/min、罐压为0. 04~0. 07Mpa ;连续发酵培养时间共进行75~85h。
[0061] 所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C ;发酵持续35~45小时到达发酵旺盛期后进行补料，补料量占总体积的5~10% ; 所述的补料为米粉10~20%、大豆0. 1~0. 5%、乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0062] 前述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其还包括如下步骤：
[0063] (4)提取、纯化：将所述步骤（33)得到的低桔霉素高色价红曲红色素发酵液经脱 水后，将留下的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，二次压滤，再次浸提滤液 经膜过滤（纳滤）、真空浓缩（20~35Be锤度），得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓缩 液；
[0064] (5)喷雾干燥：将步骤⑷所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低 桔霉素、高色价红曲红色素粉末成品。
[0065] 在发酵培养过程中，定期取样分析其理化指标并进行适当补充营养液即补料，可 使发酵水平和产出率均得到提高，补料时间在发酵中期及旺盛期较好。
[0066] 对于前述发酵培养过程中，采用紫外光分光度计检测所述的发酵液、红曲红色素 成品的吸光度，吸收峰波长为495~505nm。
[0067] 在发酵过程中，检测所述红曲红色素成品的桔霉素的含量，其成品中桔霉素的含 量不大于〇· 2mg/kg (以单位色价500u/g计）。
[0068] 采用前述的制备方法制备得到的低桔霉素、高色价红曲红色素，其成品中桔霉素 的含量不大于〇. 2mg/kg(以单位色价500u/g计）、红曲红色素色价为10300~10800u/g。
[0069] 下面，依据上述实施方案，提供四种具备代表性的具体的实施例。
[0070] 实施例2本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌 液态发酵制备低桔霉素高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1基本相同，其不同之 处在于：
[0071] -种采用红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲 红色素的方法，其具体步骤的不同之处为：
[0072] (2)种子培养、扩大培养：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的三角瓶 内打碎2小时，按10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度35°C下培养28小时，依次接入装 有种子培养基的一、二级种子罐中分别培养6小时，之后接种到发酵罐中扩大培养85小时， 得到液态种子培养液；
[0073] 所述的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4 %、NaNO3O. 2 %、MgSO4 0· 2 %、KH2PO4O. 2 %、玉米浆 1 %。
[0074] (3)液态发酵生产：
[0075] (31)采用容量为30m3的大容量发酵罐，首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体 积的液体发酵培养基，在罐温121°C、罐压0.1 Mpa下灭菌30min，冷却降温至30°C ;
[0076] 所述的液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8%、大豆0.2%、 NaNO3O. 1 %、玉米浆1% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5。
[0077] (32)接种步骤（2)所得的液态种子培养液，接种量为5%，接入二级种子罐于温度 32°C下培养9小时，制得发酵用液体种子培养液；
[0078] (33)之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，得低桔霉 素、高色价红曲红色素发酵液；其中设定的发酵条件为：①温度控制：初始温度30~35°C， 35小时后调整为33~36°C ;②搅拌转速：220~400r/min ;③通风量：初始为350~ 500 (L · min)，35 小时后，然后调整为 550 ~70(V(L · min);④罐压：0· 04 ~0· 07MPa。
[0079] 所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C ;发酵持续35~45小时后进行补料，补料量占总体积的5~10%，经75~85小时发 酵完毕，可得到低桔霉素、高含红曲红色素的发酵液；所述的补料为米粉10~20%、大豆 0· 1~0· 5%、乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0080] (4)提取、纯化：将得到的低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液经脱水后，将留下 的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，经二次压滤，再次浸提滤液经膜过滤 (纳滤）、真空浓缩（20~35Be锤度），得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓缩液；
[0081] (5)喷雾干燥：将所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低桔霉素高 色价红曲红色素粉末成品。
[0082] 在发酵过程，定期检测产品中桔霉素的含量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价 成品中红曲红色素的色价。
[0083] 实施例3本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌液 态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1、2基本相同，其不同之 处在于：
[0084] 制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法中，具体步骤（3)液态发酵生产中：所 述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比调整为：米粉10%、大豆0. 2%、 NaNO3O. 1%、玉米浆3% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5。所述的 步骤（32)中接种步骤（2)所得的液态种子培养液，接种量为6%，接入二级种子罐于温度 32°C下培养6小时。
[0085] 其他步骤同实施例1或2的基本相同。在发酵过程，定期检测产品中桔霉素的含 量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价成品中红曲红色素的色价。
[0086] 实施例4本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌液 态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1、2、3基本相同，其不同 之处在于：
[0087] 制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法中，具体步骤（2)种子培养、扩大培 养：所述的液体种子培养基的原料组成及配比：淀粉4%、NaNO3O. 1%、MgSO4 0. 1%、 KH2PO4O. 1%、玉米浆1%;具体步骤⑶液态发酵生产中，所述的步骤（31)中液体发酵培养 基的原料组成及重量配比调整为：米粉12%、大豆0.2%、NaNO 3O. 1%、玉米浆5% ;还包括 用乳酸调节发酵培养基初始PH值为3.0~4. 5。所述的步骤（32)中接种步骤（2)所得的 液态种子培养液，接种量为8%，接入二级种子罐于温度34°C下培养6小时。所述的步骤 (33)还包括发酵持续35~45小时后进行补料，补料量占总体积的10% ;所述的补料为米 粉10%、大豆0· 1 %、乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0088] 其他步骤同实施例1或2或3的基本相同。在发酵过程，定期检测产品中桔霉素 的含量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价成品中红曲红色素的色价。
[0089] 实施例5本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌 液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1、2、3、4基本相同，其 不同之处在于：
[0090] 制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法中，具体步骤（2)种子培养、扩大培 养：所述的液体种子培养基的原料组成及配比：淀粉4%、NaNO3O. 1%、MgSO4 0. 1%、 KH2PO4O. 1%、玉米浆1%;具体步骤⑶液态发酵生产中，所述的步骤（31)中液体发酵培养 基的原料组成及重量配比调整为：米粉15%、大豆0.3%、NaNO 3O. 1%、玉米浆5% ;还包括 用乳酸调节发 酵培养基初始PH值为3.0~4. 5。所述的步骤（32)中接种步骤（2)所得的 液态种子培养液，接种量为10%，接入二级种子罐于温度35°C下培养8小时。所述的步骤 (33)还包括发酵持续35~45小时后进行补料，补料量占总体积的5%;所述的补料为米粉 10%、大豆0· 5%、用乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0091] 其他步骤同实施例1或2或3或4的基本相同。在发酵过程，定期检测产品中桔 霉素的含量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价成品中红曲红色素的色价。
[0092] 本发明获得的低桔霉素、高色价红曲红色素制品的性能测试结果见表1。
[0093] 表1低桔霉素、高色价红曲红色素的性能测试结果
[0094]
[0096] 本发明并不限于上述实施方式，采用与本发明上述实施例相同或近似的原料、工 艺，而得到的低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法及制品，均在本发明保护范围之内。
【主权项】
1.一种红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，其微生物保藏编号为CGMCC9707。2.根据权利要求1所述的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)的培育方法，其特征在 于，是由红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、紫外诱变、多次分 离筛选后得到的。3. 根据权利要求2所述的红曲红曲菌YZ301(Monascusanka)的培育方法，其特征在 于，所述的培养是在麦芽汁琼脂培养基上10~15°Be、温度28~35°C培养6~8天，菌落 生长平坦，在曲汁琼脂上，于33~35°C培养7天成皮膜状菌落，无气生菌丝，其形状如熔岩 流出，石榴水红色，在麦芽汁琼脂上繁殖良好； 所述的紫外诱变及筛选包括： A、 紫外诱变：将培养7~9天的红曲菌种，经高温55~65°C处理2~lOmin、高压 0. 05~0.IOMpa处理5~10小时，放入内装有带玻璃珠、无菌水80~100mL的500ml三角 瓶，置于摇床振荡1~2小时，过滤，取IOml孢子悬浮液，加到带磁力棒的培养皿内，在磁力 搅拌下进行紫外照射2~lOmin，涂平板，用黑布包扎，于温度32~35°C下培养6~8天； B、 分离培养基：可溶性淀粉5%，麦芽糖3 %，蛋白胨0. 1 %，添加适量乳酸，调节pH值 5~6,琼脂2% ; C、 分离培养基PDA!NaNO3 3. 0g，KH2PO4I. 0g，MgSOJH2O0.5g，FeSOJH2OO.Olg，蔗糖 3〇g，自来水l〇〇〇ml，琼脂15g; D、 斜面培养基MEA:麦芽汁20g，葡萄糖20g，蛋白胨I. 0g，自来水1000ml，琼脂20g。4. 一种采用权利要求1-3之一所述红曲菌液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素 的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)菌种选育：采用通过紫外诱变分离得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)作为 菌种，其微生物保藏号为CGMCC9707 ; (2) 种子培养、扩大培养：将步骤（1)选育得到的红曲红曲菌YZ301依次接入装有种子 培养基的一、二级种子罐中分别培养6~9小时，之后接种到发酵罐中扩大培养75~85小 时，得到液态种子培养液； (3) 液态发酵生产： (31) 采用容量为30m3的大容量发酵罐，装入液体发酵培养基； (32) 接种步骤（2)所得的液态种子培养液，接种量为5~10%，接入二级种子罐于温 度32~35°C下培养6~9小时，制得发酵用液体种子培养液； (33) 之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，设定发酵条件后 进行液态发酵，即得低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液。5. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（2)中还包括：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的三角瓶 内打碎1~2小时，按5~10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度32~35°C下培养22~ 28小时；所述的步骤（2)中的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4~6 %、NaNO3 0? 1 ~0? 3%、MgS04 0? 1 ~0? 3%、KH2P04 0? 1 ~0? 3%、玉米浆 1 ~5%。6. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（31)中还包括首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体积的液体发酵 培养基，在罐温121~125°C、罐压0. 1~0. 15Mpa下灭菌30min，冷却降温至30~35°C; 所述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8~15%、大豆0. 1~ 0. 5%、NaNO3 0. 1 %~0. 3%、玉米浆1~5% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为 3. 0 ~4. 5〇7. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（33)发酵条件设定如下：温度为发酵初始0~34h保温在30~35°C、发 酵持续35~85h调整温度为33~36°C;通风量为发酵初始0~25h设为300~500L.miru 发酵中后期26~85h调整为550~700L^min;整个发酵过程始终匀速搅拌，转速为200~ 400r/min、罐压为0. 04~0. 07Mpa;连续发酵培养时间共进行75~85h。8. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C;发酵持续35~45小时到达发酵旺盛期后进行补料，补料量占总体积的5~10% ;所 述的补料为米粉10~20%、大豆0. 1~0. 5%，用乳酸调节pH值3. 0~4. 5。9. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，还包括如下步骤： (4) 提取、纯化：将所述步骤（33)得到的低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液经脱水 后，将留下的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，再二次压滤，将浸提滤液进行 膜处理（纳滤）、真空浓缩，得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓缩液（20~35Be锤度）； (5) 喷雾干燥：将步骤（4)所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低桔霉 素高色价红曲红色素粉末成品。10. 采用权利要求4-9之一所述的方法制备的低桔霉素、高色价红曲红色素，其特征 在于，其是采用红曲红曲菌YZ301(Monascusanka)作为菌种制得，其微生物保藏编号为 CGMCC9707 ;其成品中桔霉素的含量不大于0. 2mg/kg(以单位色价500u/g计）、红曲红色素 色价为 10300 ~10800u/g。
【专利摘要】本发明公开了一种红曲红曲菌YZ301(Monascus anka Yang YZ301)及其培育方法,其微生物保藏编号为CGMCC9707；还公开了采用该红曲菌液态发酵制备低桔霉素高色价红曲红色素的方法，其包括如下步骤：(1)菌种选育；(2)种子培养、扩大培养；(3)液态发酵生产，还包括提取纯化、喷雾干燥等步骤；其中菌种是由东莞市天益生物发酵技术有限公司开发的红曲红曲菌YZ201(Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、多次紫外诱变、多次分离筛选后所得的红曲红曲菌YZ301(Monascus anka Yang YZ301)，本发明还公开了采用上述制备方法制备得到的高色价、低桔霉素红曲红色素制品。本发明提供的菌种优异、工艺合理稳定，所得成品产量高、品质稳定，成品中桔霉素的含量不大于0.2mg/kg(以单位色价500u/g计)、红曲红色素色价为10300～10800u/g。CGMCC NO.970720140926
【IPC分类】C09B61/00, C12N13/00, C12N15/01, C12N1/14, C12R1/645, C12P1/02
【公开号】CN104893983
【申请号】CN201410829748
【发明人】杨晓暾
【申请人】东莞市天益生物发酵技术有限公司, 杨晓暾
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年12月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种液态发酵低桔霉素、高色价红曲红 色素的制备方法及其制品。
【背景技术】
[0002] 红曲属曲霉科真菌紫色红曲霉，又称红曲菌，是用红曲菌在大米中培养发酵而成。 传统上，红曲广泛应用在红酒、食醋等食品领域。近代医学研宄报告认为，红曲具有降血压、 降血脂的作用，所含红曲菌素 K可阻止生成胆固醇。红曲色素也是我国的传统产品，其是通 过微生物发酵法生产并得到广泛应用的最为成功的天然色素之一。红曲色素作为目前唯一 的一种来自微生物的天然安全的食用色素在食品、医药、日用品领域得到了广泛的应用。红 曲色素是类聚酮类的醇溶性色素，其中有6种成分：黄色素（红曲素、红曲黄色素）、红色素 (潘红素、红曲红素）、紫色素（潘红胺、红曲红胺），6种成分结构相近，略有差异。但是，在 制备红曲色素的过程中，通常会产生一种有致癌、致畸作用的真菌毒素即桔霉素、其基因毒 性对红曲产品向全球的推广产生严重的负面影响。
[0003] 目前，生产红曲红色素的方法主要有两种，一是通过固体发酵生产红曲米，然后 再提取色素，也可以直接应用；二是通过液体发酵生产色素。然而固体发酵技术所得的红 曲红色素的色价不高而限制其应用。目前采用液体发酵方法生产红曲红色素，产品中色素 含量、及收率、成品色价等均不高，而如何提高发酵液中红曲色素的色价、降低桔霉素含 量、提高产品色价及色素含量，很大程度上受制于菌种、原料配比、发酵过程、生产工艺、设 备等因素的影响、红曲菌产桔霉素的多少，除了和菌种有关外，与发酵工艺条件也有着密 切的关系；然而现有技术中对红曲红色素的制备工艺上的优化研宄并不多见。
[0004] 因此，研发一种液态发酵性能优异的菌种、培育方法及通过液态发酵制备低桔霉 素、高色价红曲红色素的方法，提高红曲红色素的生产效率和品质，就变得较为迫切。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种以东莞市天益生物发酵技术 有限公司开发的红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、紫外诱变、 分离筛选后得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)作为生产高色价、低桔霉素红曲红色 素的菌种。
[0006] 本发明的目的还在于，提供一种以红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)为菌种、通 过优化的液态发酵工艺制备低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法。
[0007] 本发明的目的还在于，提供一种采用上述方法制备得到的液态发酵低桔霉素、高 色价红曲红色素制品。
[0008] 本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：
[0009] 一种红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka),其微牛物保藏编号为CGMCC9707:已于 2014年9月26日保藏在中国微牛物菌种保藏管理委员会普通微牛物中心，该保藏单位位于 北京市朝阳厌北辰西路1号院3号。
[0010] 所述的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)的培育方法，其是由东莞市天益生物发 酵技术有限公司开发的红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、紫 外诱变、分离筛选后得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)。
[0011] 所述的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)其菌种特征为：菌丝：直径3~5um， 一般3um，含有颗粒，培养久后，颗粒变红色，因此菌丝体成深红色；分生抱子：球形，倒梨 形，直径6~9~12um，无色，含颗粒，通常2~3个成链；闭囊壳：球形，直径304~0 (50) um, 30um以下者极少；子囊饱子：椭圆形，无色3 X 2um ;色素：根据Ridgway色谱，其色泽 为红石植红（Grenadine Red);生长温度：最适温度为33~35°C，37°C以上，30°C以下生长 缓慢，40°C以上几乎不生长。
[0012] 红曲红曲菌 YZ301 (Monascus anka Yang YZ301) AS 3. 2636Wa:25°C，7d，菌落直径 22um，落霞红色；25d菌落直径56_，隆起呈疮疤状覆盆子红，菌落中央裂开。
[0013] MEA培养基：25°C，7d，菌落直径8mm，铁棕色；25d菌落直径20mm，褚石色；CYA培 养基：25°C，7d，菌落直径25rnm，浅粉红色。
[0014] 优选地，所述的培养是在麦芽汁琼脂培养基上10~15° Be、温度28~35°C培养 6~8天，菌落生长平坦，在曲汁琼脂上，于33~35°C培养7天成皮膜状菌落，无气生菌丝， 其形状如熔岩流出，石榴水红色，在麦芽汁琼脂上繁殖良好。
[0015] 优选地，所述的紫外诱变及筛选包括:A、紫外诱变：将培养7~9天的红曲菌种， 经高温55~65°C处理2~lOmin、高压0. 04~0. 07Mpa处理5~10小时，放入内装有带 玻璃珠、无菌水30~50ml的三角瓶，置于摇床振荡1~2小时，过滤，取IOml孢子悬浮液， 加到带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射2~lOmin，涂平板，用黑布包扎，于 温度32~35°C下培养6~8天；
[0016] B、分离培养基：可溶性淀粉5%，麦芽糖3%，蛋白胨0. 1%，添加适量乳酸，调节pH 值5~6,琼脂2% ;
[0017] C、分离培养基 PDA :NaN033. 0g，KH2PO4L 0g，MgSOJH2O 0· 5g，FeSOJH2O 0· 01g，蔗 糖30g，自来水1000ml，琼脂15g ;
[0018] D、斜面培养基MEA :麦芽汁20g，葡萄糖20g，蛋白胨l.Og，自来水1000ml，琼脂 20g〇
[0019] 一种采用前述红曲菌液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法，其包括 如下步骤：
[0020] (1)菌种选育：采用通过紫外诱变分离得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka) 作为菌种，其微生物保藏号为CGMCC9707 ;
[0021] (2)种子培养、扩大培养：将步骤⑴选育得到的红曲红曲菌YZ301依次接入装有 种子培养基的一、二级种子罐中分别培养6~9小时，之后接种到发酵罐中扩大培养75~ 85小时，得到液态种子培养液；
[0022] (3)液态发酵生产：
[0023] (31)采用容量为30m3的大容量发酵罐，装入液体发酵培养基；
[0024] (32)接种步骤⑵所得的液态种子培养液，接种量为5~10%，接入二级种子罐 于温度32~35°C下培养6~9小时，制得发酵用液体种子培养液；
[0025] (33)之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，设定发酵条 件后进行液态发酵，即得低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液。
[0026] 其中，所述的步骤（2)中还包括：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的 三角瓶内打碎1~2小时，按5~10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度32~35°C下培养 22~28小时；所述的步骤（2)中的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4~6%、 NaNO3O. 1 ~0· 3%、MgSO4 0· 1 ~0· 3%、KH2PO4O. 1 ~0· 3%、玉米浆 1 ~5%。
[0027] 所述的步骤（31)中还包括首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体积的液体发 酵培养基，在罐温121~125°C、罐压0. 1~0. 15Mpa下灭菌30min，冷却降温至30~35°C; 所述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8~15%、大豆0. 1~ 0. 5%、NaNO3O. 1 %~0. 3%、玉米浆1~5% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为 3. 0 ~4. 5〇
[0028] 所述的步骤（33)发酵条件设定如下：温度为发酵初始0~34h保温在30~ 35°C、发酵持续35~85h调整温度为33~36°C ;通风量为发酵初始0~25h设为300~ 500L · min 、发酵中后期26~85h调整为550~700L · min ;整个发酵过程始终匀速搅拌， 转速为200~400r/min、罐压为0. 04~0. 07Mpa ;连续发酵培养时间共进行75~85h。
[0029] 所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C ;发酵持续35~45小时到达发酵旺盛期后进行补料，补料量占总体积的5~10% ;所 述的补料为米粉10~20%、大豆0. 1~0. 5%，用乳酸调节pH值3. 0~4. 5。
[0030] 前述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其还包括如下步骤：
[0031] (4)提取、纯化：将所述步骤（33)得到的低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液经脱 水后，将留下的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，再二次压滤，将浸提滤液 经膜过滤（即纳滤）、真空浓缩（20~35Be锤度），得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓 缩液；
[0032] (5)喷雾干燥：将步骤⑷所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低 桔霉素、高色价红曲红色素粉末成品。
[0033] 在发酵培养过程中，定期取样分析其理化指标并进行适当补充营养液即补料，可 使发酵水平和产出率均得到提高，补料时间在发酵中期及旺盛期较好。
[0034] 对于前述发酵培养过程中，采用紫外光分光度计检测所述的发酵液、红曲红色素 成品的吸光度，吸收峰波长为495~505nm。
[0035] 在发酵过程中，检测所述红曲红色素成品的桔霉素的含量，其成品中桔霉素的含 量不大于〇· 2mg/kg (以单位色价500u/g计）。
[0036] 采用前述的制备方法制备得到的低桔霉素、高色价红曲红色素，其成品中桔霉素 的含量不大于〇. 2mg/kg (以单位色价500u/g计）、红曲红色素色价为10300~10800u/g。
[0037] 本发明与现有技术相比，具有如下优点：
[0038] 1、本发明提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，其微生物保藏编号为 CGMCC9707,是发明人经过培养、紫外诱变、多次分离筛选后得到优良菌种，其综合生物学性 能优异，最适于液态发酵工艺，繁育性能稳定、高产色素，该菌种在紫外诱变过程中能够耐 高温（35~36. 5 °C )、高压（0. 06~0. 08Mpa)，发酵液培养过程中如增大接种量并保持较低 的PH值、可使发酵水平稳定，且能控制发酵过程中红曲次代谢物桔霉素的含量，提高发酵 液红曲色素的含量（即高色价）及收率，安全性高、稳定性好。
[0039] 2、本发明采用专门培育的菌种、工艺条件及各步骤的合理控制，对选用的红曲菌 诱变株进行液态发酵，得到高含量的红曲红色素发酵液，再经过提取工序处理后所得的红 曲红色素，桔霉素含量很低、安全性高、稳定性好、红曲色素色价高，且本发明将优选的菌种 在种子培养后、液态发酵之前，还采用了逐级扩大培养，从而增加了发酵初期的菌种含量， 提高了发酵期微生物的活性、缩短发酵周期，使大量微生物在发酵期内处于生长旺盛阶段， 保持旺盛的新陈代谢，利于提高色素产量。
[0040] 3、本发明通过提取、纯化工艺，有效地将大分子蛋白、小分子有机酸、糖与天然色 素分离，去除部分桔霉素，使红曲红色素产品的纯度和稳定性显著提高。
[0041] 4、本发明在发酵培养过程中，定期取样分析其理化指标并在发酵旺盛期适当补 料，使发酵水平和产出率均得到提高。
[0042] 5、本发明采用液态发酵技术，原料绿色环保、无污染、安全、配方合理，制备过程容 易控制、工艺合理稳定、效率高，使产品质量稳定、有效成分高、有害成分低，符合食品质量 安全标准，可实现大规模工业化生产。
[0043] 6、本发明的制备方法制得的成品中红曲红色素色价高达10300~10800u/g、桔霉 素含量不大于〇. 2mg/kg (以单位色价500u/g计）。
[0044] 上述是发明技术方案的概述，以下结合【具体实施方式】，对本发明做进一步说明。
【具体实施方式】：
[0045] 实施例1本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，其微生物保藏编号 为CGMCC9707 ;所述的红曲红曲菌YZ301(Monascus anka)l的培育方法，其是由东莞市天益 生物发酵技术有限公司开发的红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培 养、紫外诱变、多次分离筛选后得到的红曲红曲菌，编号YZ301 (Monascus anka)。
[0046] 所述的培养是在麦芽汁琼脂培养基10~15° Be、温度28~35°C培养6~8天， 菌落生长平坦，在曲汁琼脂上，于33~35°C培养7天成皮膜状菌落，无气生菌丝，其形状如 熔岩流出，石榴水红色，在麦芽汁琼脂上繁殖良好；
[0047] 优选地，所述的紫外诱变及筛选包括:A、紫外诱变：将培养7~9天的红曲菌种， 经高温55~65°C处理2~lOmin、高压0. 04~0. 07Mpa处理5~10小时，放入内装有带 玻璃珠、无菌水80~100mL的500ml三角瓶，置于摇床振荡1~2小时，过滤，取IOml孢子 悬浮液，加到带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射2~lOmin，涂平板，用黑布 包扎，于温度32~35 °C下培养6~8天；
[0048] B、分离培养基：可溶性淀粉5%，麦芽糖3%，蛋白胨0. 1%，添加适量乳酸，调节pH 值5~6,琼脂2% ;
[0049] C、分离培养基 PDA :NaN033. 0g，KH2PO4L 0g，MgSOJH2O 0· 5g，FeSOJH2O 0· Olg，蔗 糖30g，自来水1000ml，琼脂15g ;
[0050] D、斜面培养基MEA :麦芽汁20g，葡萄糖20g，蛋白胨l.Og，自来水1000ml，琼脂 20g〇
[0051] 一种采用前述红曲菌液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法，其包括 如下步骤：
[0052] (1)菌种选育：采用通过紫外诱变分离得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka) 作为菌种，其保藏号为CGMCC9707 ;
[0053] (2)种子培养、扩大培养：将步骤⑴选育得到的红曲红曲菌YZ301依次接入装有 种子培养基的一、二级种子罐中分别培养6~9小时，之后接种到发酵罐中扩大培养75~ 85小时，得到液态种子培养液；
[0054] (3)液态发酵生产：
[0055] (31)采用容量为30m3的大容量发酵罐，装入液体发酵培养基；
[0056] (32)接种步骤⑵所得的液态种子培养液，接种量为5~10%，接入二级种子罐 于温度32~35°C下培养6~9小时，制得发酵用液体种子培养液；
[0057] (33)之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，设定发酵条 件后进行液态发酵，即得低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液。
[0058] 其中，所述的步骤（2)中还包括：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的 三角瓶内打碎1~2小时，按5~10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度32~35°C下培养 22~28小时；所述的步骤（2)中的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4~6%、 NaNO3O. 1 ~0· 3%、MgSO4 0· 1 ~0· 3%、KH2PO4O. 1 ~0· 3%、玉米浆 1 ~5%。
[0059] 所述的步骤（31)中还包括首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体积的液体发 酵培养基，在罐温121~125°C、罐压0. 1~0. 15Mpa下灭菌30min，冷却降温至30~35°C; 所述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8~15%、大豆0. 1~ 0. 5%、NaNO3O. 1 %~0. 3%、玉米浆1~5% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为 3. 0 ~4. 5〇
[0060] 所述的步骤（33)发酵条件设定如下：温度为发酵初始0~34h保温在30~ 35°C、发酵持续35~85h调整 温度为33~36°C ;通风量为发酵初始0~25h设为300~ 500L · min、发酵中后期26~85h调整为550~700L · min ;整个发酵过程始终匀速搅拌， 转速为200~400r/min、罐压为0. 04~0. 07Mpa ;连续发酵培养时间共进行75~85h。
[0061] 所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C ;发酵持续35~45小时到达发酵旺盛期后进行补料，补料量占总体积的5~10% ; 所述的补料为米粉10~20%、大豆0. 1~0. 5%、乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0062] 前述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其还包括如下步骤：
[0063] (4)提取、纯化：将所述步骤（33)得到的低桔霉素高色价红曲红色素发酵液经脱 水后，将留下的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，二次压滤，再次浸提滤液 经膜过滤（纳滤）、真空浓缩（20~35Be锤度），得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓缩 液；
[0064] (5)喷雾干燥：将步骤⑷所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低 桔霉素、高色价红曲红色素粉末成品。
[0065] 在发酵培养过程中，定期取样分析其理化指标并进行适当补充营养液即补料，可 使发酵水平和产出率均得到提高，补料时间在发酵中期及旺盛期较好。
[0066] 对于前述发酵培养过程中，采用紫外光分光度计检测所述的发酵液、红曲红色素 成品的吸光度，吸收峰波长为495~505nm。
[0067] 在发酵过程中，检测所述红曲红色素成品的桔霉素的含量，其成品中桔霉素的含 量不大于〇· 2mg/kg (以单位色价500u/g计）。
[0068] 采用前述的制备方法制备得到的低桔霉素、高色价红曲红色素，其成品中桔霉素 的含量不大于〇. 2mg/kg(以单位色价500u/g计）、红曲红色素色价为10300~10800u/g。
[0069] 下面，依据上述实施方案，提供四种具备代表性的具体的实施例。
[0070] 实施例2本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌 液态发酵制备低桔霉素高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1基本相同，其不同之 处在于：
[0071] -种采用红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲 红色素的方法，其具体步骤的不同之处为：
[0072] (2)种子培养、扩大培养：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的三角瓶 内打碎2小时，按10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度35°C下培养28小时，依次接入装 有种子培养基的一、二级种子罐中分别培养6小时，之后接种到发酵罐中扩大培养85小时， 得到液态种子培养液；
[0073] 所述的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4 %、NaNO3O. 2 %、MgSO4 0· 2 %、KH2PO4O. 2 %、玉米浆 1 %。
[0074] (3)液态发酵生产：
[0075] (31)采用容量为30m3的大容量发酵罐，首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体 积的液体发酵培养基，在罐温121°C、罐压0.1 Mpa下灭菌30min，冷却降温至30°C ;
[0076] 所述的液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8%、大豆0.2%、 NaNO3O. 1 %、玉米浆1% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5。
[0077] (32)接种步骤（2)所得的液态种子培养液，接种量为5%，接入二级种子罐于温度 32°C下培养9小时，制得发酵用液体种子培养液；
[0078] (33)之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，得低桔霉 素、高色价红曲红色素发酵液；其中设定的发酵条件为：①温度控制：初始温度30~35°C， 35小时后调整为33~36°C ;②搅拌转速：220~400r/min ;③通风量：初始为350~ 500 (L · min)，35 小时后，然后调整为 550 ~70(V(L · min);④罐压：0· 04 ~0· 07MPa。
[0079] 所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C ;发酵持续35~45小时后进行补料，补料量占总体积的5~10%，经75~85小时发 酵完毕，可得到低桔霉素、高含红曲红色素的发酵液；所述的补料为米粉10~20%、大豆 0· 1~0· 5%、乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0080] (4)提取、纯化：将得到的低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液经脱水后，将留下 的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，经二次压滤，再次浸提滤液经膜过滤 (纳滤）、真空浓缩（20~35Be锤度），得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓缩液；
[0081] (5)喷雾干燥：将所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低桔霉素高 色价红曲红色素粉末成品。
[0082] 在发酵过程，定期检测产品中桔霉素的含量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价 成品中红曲红色素的色价。
[0083] 实施例3本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌液 态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1、2基本相同，其不同之 处在于：
[0084] 制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法中，具体步骤（3)液态发酵生产中：所 述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比调整为：米粉10%、大豆0. 2%、 NaNO3O. 1%、玉米浆3% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5。所述的 步骤（32)中接种步骤（2)所得的液态种子培养液，接种量为6%，接入二级种子罐于温度 32°C下培养6小时。
[0085] 其他步骤同实施例1或2的基本相同。在发酵过程，定期检测产品中桔霉素的含 量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价成品中红曲红色素的色价。
[0086] 实施例4本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌液 态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1、2、3基本相同，其不同 之处在于：
[0087] 制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法中，具体步骤（2)种子培养、扩大培 养：所述的液体种子培养基的原料组成及配比：淀粉4%、NaNO3O. 1%、MgSO4 0. 1%、 KH2PO4O. 1%、玉米浆1%;具体步骤⑶液态发酵生产中，所述的步骤（31)中液体发酵培养 基的原料组成及重量配比调整为：米粉12%、大豆0.2%、NaNO 3O. 1%、玉米浆5% ;还包括 用乳酸调节发酵培养基初始PH值为3.0~4. 5。所述的步骤（32)中接种步骤（2)所得的 液态种子培养液，接种量为8%，接入二级种子罐于温度34°C下培养6小时。所述的步骤 (33)还包括发酵持续35~45小时后进行补料，补料量占总体积的10% ;所述的补料为米 粉10%、大豆0· 1 %、乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0088] 其他步骤同实施例1或2或3的基本相同。在发酵过程，定期检测产品中桔霉素 的含量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价成品中红曲红色素的色价。
[0089] 实施例5本实施例提供的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，及采用该红曲菌 液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法及制品，与实施例1、2、3、4基本相同，其 不同之处在于：
[0090] 制备低桔霉素、高色价红曲红色素的方法中，具体步骤（2)种子培养、扩大培 养：所述的液体种子培养基的原料组成及配比：淀粉4%、NaNO3O. 1%、MgSO4 0. 1%、 KH2PO4O. 1%、玉米浆1%;具体步骤⑶液态发酵生产中，所述的步骤（31)中液体发酵培养 基的原料组成及重量配比调整为：米粉15%、大豆0.3%、NaNO 3O. 1%、玉米浆5% ;还包括 用乳酸调节发 酵培养基初始PH值为3.0~4. 5。所述的步骤（32)中接种步骤（2)所得的 液态种子培养液，接种量为10%，接入二级种子罐于温度35°C下培养8小时。所述的步骤 (33)还包括发酵持续35~45小时后进行补料，补料量占总体积的5%;所述的补料为米粉 10%、大豆0· 5%、用乳酸调节pH值为3. 0~4. 5。
[0091] 其他步骤同实施例1或2或3或4的基本相同。在发酵过程，定期检测产品中桔 霉素的含量，用紫外光分光度计检测吸光度，评价成品中红曲红色素的色价。
[0092] 本发明获得的低桔霉素、高色价红曲红色素制品的性能测试结果见表1。
[0093] 表1低桔霉素、高色价红曲红色素的性能测试结果
[0094]
[0096] 本发明并不限于上述实施方式，采用与本发明上述实施例相同或近似的原料、工 艺，而得到的低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法及制品，均在本发明保护范围之内。
【主权项】
1.一种红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)，其微生物保藏编号为CGMCC9707。2.根据权利要求1所述的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)的培育方法，其特征在 于，是由红曲红曲菌YZ201 (Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、紫外诱变、多次分 离筛选后得到的。3. 根据权利要求2所述的红曲红曲菌YZ301(Monascusanka)的培育方法，其特征在 于，所述的培养是在麦芽汁琼脂培养基上10~15°Be、温度28~35°C培养6~8天，菌落 生长平坦，在曲汁琼脂上，于33~35°C培养7天成皮膜状菌落，无气生菌丝，其形状如熔岩 流出，石榴水红色，在麦芽汁琼脂上繁殖良好； 所述的紫外诱变及筛选包括： A、 紫外诱变：将培养7~9天的红曲菌种，经高温55~65°C处理2~lOmin、高压 0. 05~0.IOMpa处理5~10小时，放入内装有带玻璃珠、无菌水80~100mL的500ml三角 瓶，置于摇床振荡1~2小时，过滤，取IOml孢子悬浮液，加到带磁力棒的培养皿内，在磁力 搅拌下进行紫外照射2~lOmin，涂平板，用黑布包扎，于温度32~35°C下培养6~8天； B、 分离培养基：可溶性淀粉5%，麦芽糖3 %，蛋白胨0. 1 %，添加适量乳酸，调节pH值 5~6,琼脂2% ; C、 分离培养基PDA!NaNO3 3. 0g，KH2PO4I. 0g，MgSOJH2O0.5g，FeSOJH2OO.Olg，蔗糖 3〇g，自来水l〇〇〇ml，琼脂15g; D、 斜面培养基MEA:麦芽汁20g，葡萄糖20g，蛋白胨I. 0g，自来水1000ml，琼脂20g。4. 一种采用权利要求1-3之一所述红曲菌液态发酵制备低桔霉素、高色价红曲红色素 的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)菌种选育：采用通过紫外诱变分离得到的红曲红曲菌YZ301 (Monascus anka)作为 菌种，其微生物保藏号为CGMCC9707 ; (2) 种子培养、扩大培养：将步骤（1)选育得到的红曲红曲菌YZ301依次接入装有种子 培养基的一、二级种子罐中分别培养6~9小时，之后接种到发酵罐中扩大培养75~85小 时，得到液态种子培养液； (3) 液态发酵生产： (31) 采用容量为30m3的大容量发酵罐，装入液体发酵培养基； (32) 接种步骤（2)所得的液态种子培养液，接种量为5~10%，接入二级种子罐于温 度32~35°C下培养6~9小时，制得发酵用液体种子培养液； (33) 之后将步骤（32)所得的发酵用液体种子培养液接入发酵罐中，设定发酵条件后 进行液态发酵，即得低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液。5. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（2)中还包括：将红曲红曲菌YZ301置入装有无菌水、玻璃珠的三角瓶 内打碎1~2小时，按5~10%接种量接入三角瓶，经摇瓶于温度32~35°C下培养22~ 28小时；所述的步骤（2)中的种子培养基的原料组成及重量配比为：淀粉4~6 %、NaNO3 0? 1 ~0? 3%、MgS04 0? 1 ~0? 3%、KH2P04 0? 1 ~0? 3%、玉米浆 1 ~5%。6. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（31)中还包括首先在大容量发酵罐中装入占酵罐3/4体积的液体发酵 培养基，在罐温121~125°C、罐压0. 1~0. 15Mpa下灭菌30min，冷却降温至30~35°C; 所述的步骤（31)中液体发酵培养基的原料组成及重量配比为：米粉8~15%、大豆0. 1~ 0. 5%、NaNO3 0. 1 %~0. 3%、玉米浆1~5% ;还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为 3. 0 ~4. 5〇7. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（33)发酵条件设定如下：温度为发酵初始0~34h保温在30~35°C、发 酵持续35~85h调整温度为33~36°C;通风量为发酵初始0~25h设为300~500L.miru 发酵中后期26~85h调整为550~700L^min;整个发酵过程始终匀速搅拌，转速为200~ 400r/min、罐压为0. 04~0. 07Mpa;连续发酵培养时间共进行75~85h。8. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，所述的步骤（33)还包括用乳酸调节发酵培养基初始pH值为3. 0~4. 5,温度32~ 36°C;发酵持续35~45小时到达发酵旺盛期后进行补料，补料量占总体积的5~10% ;所 述的补料为米粉10~20%、大豆0. 1~0. 5%，用乳酸调节pH值3. 0~4. 5。9. 根据权利要求4所述的液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法，其特征 在于，还包括如下步骤： (4) 提取、纯化：将所述步骤（33)得到的低桔霉素、高色价红曲红色素发酵液经脱水 后，将留下的菌丝体用pH为7. 0~9. 0、60~80v/v酒精浸提，再二次压滤，将浸提滤液进行 膜处理（纳滤）、真空浓缩，得到低桔霉素、高色价红曲红色素的浓缩液（20~35Be锤度）； (5) 喷雾干燥：将步骤（4)所得的浓缩液在100~210°C下进行喷雾干燥，制得低桔霉 素高色价红曲红色素粉末成品。10. 采用权利要求4-9之一所述的方法制备的低桔霉素、高色价红曲红色素，其特征 在于，其是采用红曲红曲菌YZ301(Monascusanka)作为菌种制得，其微生物保藏编号为 CGMCC9707 ;其成品中桔霉素的含量不大于0. 2mg/kg(以单位色价500u/g计）、红曲红色素 色价为 10300 ~10800u/g。
【专利摘要】本发明公开了一种红曲红曲菌YZ301(Monascus anka Yang YZ301)及其培育方法,其微生物保藏编号为CGMCC9707；还公开了采用该红曲菌液态发酵制备低桔霉素高色价红曲红色素的方法，其包括如下步骤：(1)菌种选育；(2)种子培养、扩大培养；(3)液态发酵生产，还包括提取纯化、喷雾干燥等步骤；其中菌种是由东莞市天益生物发酵技术有限公司开发的红曲红曲菌YZ201(Monascus anka Nakazawa et Sato)经培养、多次紫外诱变、多次分离筛选后所得的红曲红曲菌YZ301(Monascus anka Yang YZ301)，本发明还公开了采用上述制备方法制备得到的高色价、低桔霉素红曲红色素制品。本发明提供的菌种优异、工艺合理稳定，所得成品产量高、品质稳定，成品中桔霉素的含量不大于0.2mg/kg(以单位色价500u/g计)、红曲红色素色价为10300～10800u/g。CGMCC NO.970720140926
【IPC分类】C09B61/00, C12N13/00, C12N15/01, C12N1/14, C12R1/645, C12P1/02
【公开号】CN104893983
【申请号】CN201410829748
【发明人】杨晓暾
【申请人】东莞市天益生物发酵技术有限公司, 杨晓暾
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年12月25日
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