蜻蜓肠道菌土曲霉qt122及其代谢产物和应用
蜻蜓肠道菌土曲霉qt122及其代谢产物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术农业生产领域，涉及蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株及其代谢产物和应用。
【背景技术】
[0002] 昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物，与昆虫共生的特境微生物具有丰 富的多样性。据已有的研宄报道我们可以知道昆虫共生菌不仅种类繁多，而且在生态、代谢 特征、生理活性等方面均有一定的特殊性，因此其可能是抗菌、除草剂等新型药源分子的广 泛来源。但与昆虫种类相比，目前人们对昆虫共生菌研宄较少，对其代谢产物研宄更少，因 此，研宄昆虫共生菌及其次生代谢产物对开拓发现新型活性物质具有重要意义。
[0003] 稗草（Echinochloa crusgalli)是世界性十大恶性杂草之一，是稻田、麦田地等最 重要的草害。近年来已经上升为水稻产区第一恶性杂草，严重影响水稻产量及品质。反枝 苋（Amaranthus retroflexus)是入侵种中发生频率最多、分布最广、危害最严重的杂草， 是菜园、果园及棉花和玉米等旱作物地中的常见杂草，并且该植物可富集硝酸盐，家畜过量 食用后会引起中毒，造成大量经济损失。目前治理稗草和反枝苋危害的主要措施是化学防 治。随着化学除草剂的广泛应用，其弊端日趋突出，化学除草剂造成环境污染，农药残留以 及杂草抗药性的问题已经引起农药科技工作者的高度关注，开发研制高效安全、无污染的 新型除草剂迫在眉睫。微生物源除草剂以其资源丰富、毒性小、不破坏生态环境、残留少、选 择性强、对非靶标生物和哺乳动物安全、环境兼容性好等优点，正逐步引起人们的重视，是 新型除草剂的重要研宄方向。已有研宄表明昆虫肠道菌可能合成植物毒素，这类毒素能杀 死植物以利于昆虫消化摄入的植物，如Zhang等分离筛选出具有除草活性的棉蝗肠道真菌 HC02(Phoma sp.)和负幢肠道真菌FHOl (Curvularia sp.)，并从其代谢产物中分离到同样 具有较好除草活性的单体化合物。因此，昆虫肠道共生菌可能是新型除草剂的重要来源。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株及其及其代谢产物和用途。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供土曲霉QT122,为Aspergillus terreus QT122,其保藏编号为：CCTCC M 2015240。
[0006] 土曲霉QT122,保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC);保藏名称为： Aspergillus terreus QT122 ;保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年4月17日； 保藏号：CCTCC NO :M 2015240。
[0007] 本发明还同时提供了土曲霉QT122发酵液的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)、活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)接入麦芽液体培养基中，于 27. 5~28. 5°C (较佳为28°C )、160~180rpm/min (较佳为170rpm/min)的条件下培养2~ 3d (较佳为3d)作为种子液；
[0009] 备注说明：活化为经麦芽固体培养基的活化；即，具体为：从保藏菌种的MEA试管 斜面中取带菌的菌丝体块（约1~2g)于新鲜的麦芽固体培养基（MEA)上，然后于28°C恒 温箱中倒置培养，得到活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)。
[0010] -般而言，将活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的菌丝体块（约2~ 3g)接种到装有150mL麦芽液体培养基（ME培养基）中于上述条件下进行培养；就能得到 种子液；
[0011] 2)、将种子液按照1%~2%体积比的接种量接入麦芽液体培养基中，于27. 5~ 28. 5°C (较佳为28°C )、160~180rpm/min (较佳为170rpm/min)的条件下培养6~8d (较 佳为7d)，得土曲霉QT122发酵液。
[0012] 本发明还同时提供了利用上述土曲霉QT122发酵液制备土曲霉QT122代谢产物的 方法，包括以下步骤：
[0013] 1)、将土曲霉QT122发酵液利用纱布（例如为4层纱布）进行过滤，得滤液（为对 反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制作用的发酵滤液）；
[0014] 将滤液经乙酸乙酯萃取后，真空减压浓缩干燥（于0. 1个负压的真空度，45°C干燥 30~40分钟），得土曲霉QT122发酵液粗提物（为褐色）；
[0015] 2)、将土曲霉QT122发酵液粗提物用硅胶柱层析进行粗分，采用二氯甲烷/甲醇进 行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：1〇〇:〇, 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100 :16, 100:32 ;进而相应得到7个馏分：F1~F7 ;
[0016] 3)、将Fl和F2分别进行如下操作：浓缩后用甲醇重结晶；总共得到4个土曲霉 QT122代谢产物。
[0017] 备注说明：Fl对应得到的是化合物1和化合物2, F2对应得到的是化合物3和化 合物4。
[0018] 本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的4种土曲霉QT122代谢产物，分别 具有如下结构式：
[0019]
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[0020] 本发明还同时提供了上述土曲霉QT122的用途：用于抑制反枝苋或稗草幼根的生 长。
[0021] 作为本发明的土曲霉QT122的用途的改进：土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发 酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物均能用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。
[0022] 本发明还同时提供了一类对反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制活性的生物农药， 该生物农药中含有以下任意一种：土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲 霉QT122代谢产物。
[0023] 麦芽固体培养基（MEA培养基）为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，琼脂20g，蒸 馏水1L。
[0024] 麦芽液体培养基（ME培养基）为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，蒸馏水1L。
[0025] 在本发明中，土曲霉QT122代谢产物的用法和用量可参照2, 4-D的用法和用量。
[0026] 即，本发明的第一个目的是提供一种蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergi I Ius terreus QT122)菌株及其用途；本发明的第二个目的是提供上述的蜻蜓肠道共生土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的培养物；本发明的第三个目的是提供上述培养物的 制备方法；本发明的第四个目的是提供上述培养物的用途；本发明的第五个目的是提供具 有抑制反枝苋、稗草等杂草的幼根生长作用的微生物源农药。
[0027] 综上所述，本发明的蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株，该 菌发酵液及其代谢产物具有抑制反枝苋和稗草幼根生长的活性，因此对开发新型微生物源 除草剂具有重要的价值。本发明提供的菌株具有较好的除草活性可应用于制备微生物源除 草剂。
【附图说明】
[0028] 图1为蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株的培养特征图；
[0029] 图2蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株的孢子形态特征 图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施案例对本发明做进一步的解释。
[0031] 实施例1、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的分离、纯化与鉴 定：
[0032] 供试蜻蜓采自浙江师范大学附近郊区。将捕捉回来的蜻蜓饥饿处理24h，于无菌条 件下用75% (体积％ )酒精进行表面消毒2min，再用无菌水漂洗3次后用无菌镊子解剖。 取出肠道置于无菌研钵中，加少量无菌水进行研磨，再用无菌水将其稀释成1〇'1〇_ 2、1〇_3 三个浓度梯度。分别取各浓度梯度稀释液〇.2mL涂布于麦芽固体培养基（MEA培养基）上， 于28°C恒温箱中倒置培养。待菌落长出后，从菌落边缘挑取少量菌丝，转接到新的MEA培养 基上，如此反复转接得到单菌落，并将该单菌落QT122保存至MEA试管斜面备用。
[0033] 按照BioTeke新型快速基因组DNA提取试剂盒说明书，提取上述所得的共生 菌 QT122 基因组 DNA，采用 ITS 通用引物 ITSl (5, -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 正向）和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）扩增 rDNA ITS 区基因序列并纯化。
[0034] 测序结果通过BLAST程序进行相似度比较；分析结果表明，共生真菌QT122与 Aspergillus terreus (KM 924436)具有较高相似度，相似度为99%。结合该菌形态学特征， 鉴定该菌为A. terreus。
[0035] 上述MEA培养基配方为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，琼脂20g，蒸馏水lL，pH 7.0, 并于I. 1个大气压，121°C下灭菌20min (为常规灭菌）。
[0036] 将上述土曲霉（Aspergillus terreus)转接至MEA试管斜面保存备用。
[0037] 对上述土曲霉（Aspergillus terreus)进行了菌种保藏，保藏单位：中国典型培 养物保藏中心（CCTCC);保藏名称为：Aspergi Ilus terreus QT122 ;保藏地址：中国武汉武 汉大学；保藏日期：2015年4月17日；保藏号：CCTCC NO :M 2015240。
[0038] 实施例2、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的液体发酵：
[0039] 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的活化：从保藏菌种的MEA试管斜面中取 带菌的菌丝体块（约1~2g)于新鲜的麦芽固体培养基（MEA)上，于28°C恒温箱中倒置培 养，得到活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)。
[0040] 将活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的菌丝体块（约2~3g)接种 到装有150mL麦芽液体培养基（ME培养基）的250mL三角瓶中，于28°C，170rpm/min的条 件下培养3d作为种子液；共接种6~7瓶。
[0041] 然后按照1 %体积比的接种量，将5ml的种子液转接入装有500mL麦芽液体培养基 (ME培养基）的1000 mL三角瓶中，于28°C，170rpm/min的条件下培养7d ;得土曲霉QT122 发酵液（简称发酵液）。
[0042] 麦芽液体培养基（ME培养基）为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，蒸馏水1L，pH 7.0, 并于I. 1个大气压，121°C下灭菌20min (为常规灭菌）。
[0043] 实施例3、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)代谢产物的分离纯 化：
[0044] 将按照实施例2所述方法制备而得的40L发酵液经4层纱布过滤，所得滤液用等 体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取3次，将萃取液经真空浓缩干燥（于0. 1个负压的真空 度，45°C干燥30~40分钟），得到褐色的发酵液粗提物（26. 23g)。
[0045] 将所得的发酵液粗提物（26. 23g)用硅胶柱层析（200~300目的硅胶，约260g)进 行粗分，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：1〇〇:〇， 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100:16, 100:32 ;每种洗脱液的用量分别约为 5100ml、4500ml、 3750ml、3000ml、2250ml、1500ml、1500ml，流速为lOml/min。不同的梯度洗脱所得分别进行 收集。
[0046] 将所得的第1种洗脱部分Fl进行浓缩（于0. 1个负压的真空度，45°C干燥30~ 40分钟）后于甲醇中进行重结晶，能分别得到化合物1(橙色针状结晶，约5. Ig)和化合物 2 (橙色粉末，约6. 9g)。对所得的第2种洗脱部分F2进行同样的处理（即，浓缩后于甲醇中 进行重结晶），得到化合物3 (白色针状结晶，约12. Ig)和化合物4 (黄色粉末，约15. 9g)。 共得到上述4个单一代谢产物。最后结合多种波谱技术对所述4个化合物进行结构鉴定。
[0047] 上述4个化合物的波谱数据为：
[0048] 化合物 1 :橙色针状结晶。ESI-MS:m/ z calcd. for 270. 0528 (C15HltlO5). 1H NMR(600MHz, Acetone) δ 12. 22(d, J = 10. 6Hz, 1H), 12. 10 (d, J = 11. 4Hz, 1H), 7. 58 (d, J =I. 0Hz, 1H), 7. 27 (d, J = 2. 4Hz, 1H), 7. 16 (d, J = 0. 7Hz, 1H), 6. 68 (d, J = 2. 4Hz, 1H), 2. 49 (s, 4H).
[0049] 13C NMR(151MHz, Acetone) δ 190. 92, 182. 99, 182. 72, 181. 30, 165. 51, 148. 72, 124 .09, 120. 62, 108. 77, 107. 98, 80. 50, 25. 33, 13. 70.
[0050] 化合物 2 :橙色粉末。ESI-MS:m/z calcd. for 284. 0685 (C16H12O5). 1H NMR (600MHz, DMS0) 5l3.24(s,lH),7.43(d,J = l.lHz,lH),7.21(d,J = 2. 3Hz, 1H), 7. 13 (s, 1H), 6. 85 (d, J = 2. 3Hz, 1H), 3. 91 (s, 2H), 2. 40 (s, 2H). 13C NMR(151MHz, DMS0) δ 186. 79, 182. 76, 164. 92, 163. 91, 162. 17, 147. 07, 137. 27, 132. 50, 124 .63, 119. 57, 114. 85, 113. 12, 107. 42, 105. 44, 56. 79, 21. 84.
[0051] 化合物 3 :白色针状结晶。ESI-MS:m/z calcd. for 154. 0630 (C8HltlO3). 1H NMR (600MHz, MeOD) δ 6. 86 (dq, J = 15. 7, 6. 9Hz, 1H), 6. 41 (m, 1H), 6. 03 (s, 1H), 4. 70 (d, J = 2. 6Hz, 1H),4. ll(d, J = 2. 7Hz, 1H), 1.96(dd, J = 6.9, I. 6Hz, 3H). 13C NMR(151MHz, MeOD) δ 205. 49, 170. 71, 141. 75, 126. 31, 125. 81, 82. 29, 77. 98, 49. 33, 49. 18, 49. 04, 48. 90, 48. 7 6, 48. 62, 48. 47, 19. 39.
[0052] 化合物 4 :黄色粉末。ESI-MS:m/z calcd for 384. 9882 (C16H11Cl2O7). 1H MMR(600MHz，DMS0)Sll.78(s，lH)，10.16(s，lH)，6.95(d，J = 2.1Hz，lH)，6.73(d，J = 2. 0Hz，1H)，3. 67(d，J = 8. 3Hz，3H)，3. 45(s，9H)，2. 45(s，1H). 13C NMR(151MHz，DMS0) δ 199 .84, 170. 39, 165. 19, 158. 19, 156. 15, 154. 68, 141. 29, 127. 47, 124. 91, 111. 80, HO. 83, 107 .00, 103. 15, 99. 08, 55. 60, 51. 83, 18. 39.
[0053] 上述4个化合物的结构式为：
[0054]
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[0055] 实施例4、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的发酵液对反枝苋 和稗草幼根生长的抑制作用：
[0056] 吸取5mL发酵液（土曲霉QT122发酵液）于铺有滤纸的培养皿使滤纸饱和。同时 将阳性对照2, 4-D用丙酮配置成100 μ g/mL，吸取5mL于铺有滤纸的培养皿中使滤纸饱和， 溶剂挥发后加入5mL的无菌水。选取催芽的反枝苋和稗草种子（每皿10粒）放在滤纸上， 每个处理3个重复。然后放在28°C、70%相对湿度、定时光照（12h光照，12h黑暗）条件的 人工气候培养箱培养。2d后测量种子根长，以平均根生长抑制率表示结果。计算公式为： 平均根生长抑制率（％)=[(对照平均根长一处理平均根长）/对照平均根长]X100%。
[0057] 表1 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)发酵液对反枝苋和稗草幼根的抑制效 果
[0058]
[0059] 备注说明：表1中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照；供试浓度为100 μ g/mL。
[0060] 实验结果见表1 ;表1中的结果表明，土曲霉（Aspergillus terreus QT122)发 酵液对反枝苋和稗草幼根的生长抑制率分别为78. 5%和68. 5%，其结果稍弱于阳性对照 对反枝苋和稗草幼根的生长抑制率。因此本发明提供的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株具有被开发为微生物源除草剂的潜力。
[0061] 实施例5、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的代谢产物对反枝 苋和稗草幼根生长的抑制作用：
[0062] 将发酵液粗提物和代谢产物分别用丙酮配制成lOOug/mL的溶液，分别吸取5mL于 铺有滤纸的培养皿中使滤纸饱和，溶剂挥发后加入5mL的无菌水，阳性对照用丙酮做同样 的处理。选取催芽的反枝苋和稗草种子（每皿10粒）放在滤纸上，每个处理3个重复。然 后放在28°C、70%相对湿度、定时光照（12h光照，12h黑暗）条件的人工气候培养箱培养。 2d后测量种子根长，以平均根生长抑制率表示结果。计算公式为：平均根生长抑制率（％ ) =[(对照平均根长一处理平均根长）/对照平均根长]X 100%。
[0063] 所得结果如下表2和表3所示。
[0064] 表2 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)发酵液粗提物对反枝苋和稗草幼根的 抑制效果
[0065]
[0067] 备注说明：表2中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照；供试浓度为100 μ g/mL。
[0068] 根据表2中结果表明，土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株发酵液的粗 提物对稗草幼根的生长抑制率大于79%，与阳性对照基本相当；而与阳性对照的结果相比 较，其对反枝苋幼根的生长同样有着很好的抑制作用，抑制率大于68%。
[0069] 表3 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)代谢产物对反枝苋和稗草幼根的抑制 效果
[0070]
[0071] 备注说明：表3中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照；供试浓度为100 μ g/mL。
[0072] 实验结果见表3。表中结果表明，与阳性对照实验结果相比较，土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的代谢产物对反枝苋和稗草幼根生长的抑制作用以化 合物3的效果最佳，抑制率高达80%以上；而化合物4对反枝苋和稗草幼根的生长也有着 较好的抑制作用，抑制率均大于60% ;化合物1和2对反枝苋和稗草幼根的生长都有着中 等强度的抑制活性。
[0073] 对比例1 :将如下所述的现有的土曲霉按照实施例2进行液体发酵，所得的发酵液 按照实施例4所述进行实验，所得结果如下表4所示；
[0074] 土曲霉A :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的海绵共附生土曲 霉 PF26(CGMCC NO. 5208);
[0075] 土曲霉B :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的土曲霉 ZRV2011P5(CGMCC NO. 8746)；
[0076] 土曲霉C :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的土曲霉 SNGB9003(CGMCC N0.0 569)；
[0077] 土曲霉D :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的土曲霉 ZSOl (CGMCC NO. 6413)。
[0078] 表4、各种发酵液对反枝苋和稗草幼根的抑制效果
[0079]
[0080] 备注说明：表4中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照，且供试浓度为100 μ g/Ml。
[0081] 对比例实验结果见表4。表中结果表明，在同等实验条件的情况下，各种现有的 土曲霉发酵液对反枝苋和稗草幼根生长的抑制活性与阳性对照相比，只有本发明的土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的发酵液效果显著，均与阳性对照相当；而土曲霉A、B、 C、D的发酵液对反枝苋和稗草幼根生长的抑制活性较弱，抑制率均小于40%。
[0082] 综合实施例4、实施例5以及对比例1的实验结果表明，蜻蜓肠道共生土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的发酵液和代谢产物具有很好的除草活性，因此对开 发新型微生物源除草剂具有重要的价值和潜力。
[0083] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
L 土曲霉QT122,其特征是：为Aspergillus terreus QT122,其保藏编号为：CCTCC M2015240。
2. 土曲霉QT122发酵液的制备方法，其特征是包括以下步骤： 1) 、活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)接入麦芽液体培养基中，于 27. 5~28. 5°C、160~180rpm/min的条件下培养2~3d，得种子液； 2) 、将种子液按照1 %~2%体积比的接种量接入麦芽液体培养基中，于27. 5~ 28. 5°C、160~180rpm/min的条件下培养6~8d，得土曲霉QT122发酵液。
3. 利用土曲霉QT122发酵液制备土曲霉QT122代谢产物的方法，其特征是包括以下步 骤： 1) 、将土曲霉QT122发酵液利用纱布进行过滤，得滤液； 将滤液经乙酸乙酯萃取后，真空减压浓缩干燥，得土曲霉QT122发酵液粗提物； 2) 、将土曲霉QT122发酵液粗提物用硅胶柱层析进行粗分，采用二氯甲烷/甲醇进行梯 度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：1〇〇:〇, 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100:16， 100:32 ;进而相应得到7个馏分：F1~F7 ; 3) 、将Fl和F2分别进行如下操作：浓缩后用甲醇重结晶；总共得到4个土曲霉QT122 代谢产物。
4. 依据权利要求3所述方法制备而得的4种土曲霉QT122代谢产物，其特征是分别具 有如下结构式：
5. 土曲霉QT122的用途，其特征是：用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。
6. 根据权利要求5所述的土曲霉QT122的用途，其特征是：土曲霉QT122发酵液、土曲 霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物均能用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。
7. 对反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制活性的生物农药，其特征是：该生物农药中含 有以下任意一种：土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产 物。
【专利摘要】本发明公开了一种土曲霉QT122，为Aspergillus terreus QT122，其保藏编号为：CCTCC M 2015240。本发明还同时公开了土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物的制备方法。本发明还同时公开了土曲霉QT122的用途，土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物均能用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物可用于制备对反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制活性的生物农药。CCTCC NO： M 201524020150417
【IPC分类】C12R1/66, C07C49/597, C12N1/14, A01N63/04, A01N45/02, A01N35/06, C07C69/92, C07C50/18, A01N37/10
【公开号】CN104893986
【申请号】CN201510261549
【发明人】张应烙, 卢贻会
【申请人】浙江师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月21日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术农业生产领域，涉及蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株及其代谢产物和应用。
【背景技术】
[0002] 昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物，与昆虫共生的特境微生物具有丰 富的多样性。据已有的研宄报道我们可以知道昆虫共生菌不仅种类繁多，而且在生态、代谢 特征、生理活性等方面均有一定的特殊性，因此其可能是抗菌、除草剂等新型药源分子的广 泛来源。但与昆虫种类相比，目前人们对昆虫共生菌研宄较少，对其代谢产物研宄更少，因 此，研宄昆虫共生菌及其次生代谢产物对开拓发现新型活性物质具有重要意义。
[0003] 稗草（Echinochloa crusgalli)是世界性十大恶性杂草之一，是稻田、麦田地等最 重要的草害。近年来已经上升为水稻产区第一恶性杂草，严重影响水稻产量及品质。反枝 苋（Amaranthus retroflexus)是入侵种中发生频率最多、分布最广、危害最严重的杂草， 是菜园、果园及棉花和玉米等旱作物地中的常见杂草，并且该植物可富集硝酸盐，家畜过量 食用后会引起中毒，造成大量经济损失。目前治理稗草和反枝苋危害的主要措施是化学防 治。随着化学除草剂的广泛应用，其弊端日趋突出，化学除草剂造成环境污染，农药残留以 及杂草抗药性的问题已经引起农药科技工作者的高度关注，开发研制高效安全、无污染的 新型除草剂迫在眉睫。微生物源除草剂以其资源丰富、毒性小、不破坏生态环境、残留少、选 择性强、对非靶标生物和哺乳动物安全、环境兼容性好等优点，正逐步引起人们的重视，是 新型除草剂的重要研宄方向。已有研宄表明昆虫肠道菌可能合成植物毒素，这类毒素能杀 死植物以利于昆虫消化摄入的植物，如Zhang等分离筛选出具有除草活性的棉蝗肠道真菌 HC02(Phoma sp.)和负幢肠道真菌FHOl (Curvularia sp.)，并从其代谢产物中分离到同样 具有较好除草活性的单体化合物。因此，昆虫肠道共生菌可能是新型除草剂的重要来源。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株及其及其代谢产物和用途。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供土曲霉QT122,为Aspergillus terreus QT122,其保藏编号为：CCTCC M 2015240。
[0006] 土曲霉QT122,保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC);保藏名称为： Aspergillus terreus QT122 ;保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年4月17日； 保藏号：CCTCC NO :M 2015240。
[0007] 本发明还同时提供了土曲霉QT122发酵液的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)、活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)接入麦芽液体培养基中，于 27. 5~28. 5°C (较佳为28°C )、160~180rpm/min (较佳为170rpm/min)的条件下培养2~ 3d (较佳为3d)作为种子液；
[0009] 备注说明：活化为经麦芽固体培养基的活化；即，具体为：从保藏菌种的MEA试管 斜面中取带菌的菌丝体块（约1~2g)于新鲜的麦芽固体培养基（MEA)上，然后于28°C恒 温箱中倒置培养，得到活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)。
[0010] -般而言，将活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的菌丝体块（约2~ 3g)接种到装有150mL麦芽液体培养基（ME培养基）中于上述条件下进行培养；就能得到 种子液；
[0011] 2)、将种子液按照1%~2%体积比的接种量接入麦芽液体培养基中，于27. 5~ 28. 5°C (较佳为28°C )、160~180rpm/min (较佳为170rpm/min)的条件下培养6~8d (较 佳为7d)，得土曲霉QT122发酵液。
[0012] 本发明还同时提供了利用上述土曲霉QT122发酵液制备土曲霉QT122代谢产物的 方法，包括以下步骤：
[0013] 1)、将土曲霉QT122发酵液利用纱布（例如为4层纱布）进行过滤，得滤液（为对 反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制作用的发酵滤液）；
[0014] 将滤液经乙酸乙酯萃取后，真空减压浓缩干燥（于0. 1个负压的真空度，45°C干燥 30~40分钟），得土曲霉QT122发酵液粗提物（为褐色）；
[0015] 2)、将土曲霉QT122发酵液粗提物用硅胶柱层析进行粗分，采用二氯甲烷/甲醇进 行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：1〇〇:〇, 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100 :16, 100:32 ;进而相应得到7个馏分：F1~F7 ;
[0016] 3)、将Fl和F2分别进行如下操作：浓缩后用甲醇重结晶；总共得到4个土曲霉 QT122代谢产物。
[0017] 备注说明：Fl对应得到的是化合物1和化合物2, F2对应得到的是化合物3和化 合物4。
[0018] 本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的4种土曲霉QT122代谢产物，分别 具有如下结构式：
[0019]
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[0020] 本发明还同时提供了上述土曲霉QT122的用途：用于抑制反枝苋或稗草幼根的生 长。
[0021] 作为本发明的土曲霉QT122的用途的改进：土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发 酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物均能用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。
[0022] 本发明还同时提供了一类对反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制活性的生物农药， 该生物农药中含有以下任意一种：土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲 霉QT122代谢产物。
[0023] 麦芽固体培养基（MEA培养基）为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，琼脂20g，蒸 馏水1L。
[0024] 麦芽液体培养基（ME培养基）为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，蒸馏水1L。
[0025] 在本发明中，土曲霉QT122代谢产物的用法和用量可参照2, 4-D的用法和用量。
[0026] 即，本发明的第一个目的是提供一种蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergi I Ius terreus QT122)菌株及其用途；本发明的第二个目的是提供上述的蜻蜓肠道共生土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的培养物；本发明的第三个目的是提供上述培养物的 制备方法；本发明的第四个目的是提供上述培养物的用途；本发明的第五个目的是提供具 有抑制反枝苋、稗草等杂草的幼根生长作用的微生物源农药。
[0027] 综上所述，本发明的蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株，该 菌发酵液及其代谢产物具有抑制反枝苋和稗草幼根生长的活性，因此对开发新型微生物源 除草剂具有重要的价值。本发明提供的菌株具有较好的除草活性可应用于制备微生物源除 草剂。
【附图说明】
[0028] 图1为蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株的培养特征图；
[0029] 图2蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株的孢子形态特征 图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施案例对本发明做进一步的解释。
[0031] 实施例1、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的分离、纯化与鉴 定：
[0032] 供试蜻蜓采自浙江师范大学附近郊区。将捕捉回来的蜻蜓饥饿处理24h，于无菌条 件下用75% (体积％ )酒精进行表面消毒2min，再用无菌水漂洗3次后用无菌镊子解剖。 取出肠道置于无菌研钵中，加少量无菌水进行研磨，再用无菌水将其稀释成1〇'1〇_ 2、1〇_3 三个浓度梯度。分别取各浓度梯度稀释液〇.2mL涂布于麦芽固体培养基（MEA培养基）上， 于28°C恒温箱中倒置培养。待菌落长出后，从菌落边缘挑取少量菌丝，转接到新的MEA培养 基上，如此反复转接得到单菌落，并将该单菌落QT122保存至MEA试管斜面备用。
[0033] 按照BioTeke新型快速基因组DNA提取试剂盒说明书，提取上述所得的共生 菌 QT122 基因组 DNA，采用 ITS 通用引物 ITSl (5, -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 正向）和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）扩增 rDNA ITS 区基因序列并纯化。
[0034] 测序结果通过BLAST程序进行相似度比较；分析结果表明，共生真菌QT122与 Aspergillus terreus (KM 924436)具有较高相似度，相似度为99%。结合该菌形态学特征， 鉴定该菌为A. terreus。
[0035] 上述MEA培养基配方为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，琼脂20g，蒸馏水lL，pH 7.0, 并于I. 1个大气压，121°C下灭菌20min (为常规灭菌）。
[0036] 将上述土曲霉（Aspergillus terreus)转接至MEA试管斜面保存备用。
[0037] 对上述土曲霉（Aspergillus terreus)进行了菌种保藏，保藏单位：中国典型培 养物保藏中心（CCTCC);保藏名称为：Aspergi Ilus terreus QT122 ;保藏地址：中国武汉武 汉大学；保藏日期：2015年4月17日；保藏号：CCTCC NO :M 2015240。
[0038] 实施例2、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的液体发酵：
[0039] 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的活化：从保藏菌种的MEA试管斜面中取 带菌的菌丝体块（约1~2g)于新鲜的麦芽固体培养基（MEA)上，于28°C恒温箱中倒置培 养，得到活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)。
[0040] 将活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的菌丝体块（约2~3g)接种 到装有150mL麦芽液体培养基（ME培养基）的250mL三角瓶中，于28°C，170rpm/min的条 件下培养3d作为种子液；共接种6~7瓶。
[0041] 然后按照1 %体积比的接种量，将5ml的种子液转接入装有500mL麦芽液体培养基 (ME培养基）的1000 mL三角瓶中，于28°C，170rpm/min的条件下培养7d ;得土曲霉QT122 发酵液（简称发酵液）。
[0042] 麦芽液体培养基（ME培养基）为：生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，蒸馏水1L，pH 7.0, 并于I. 1个大气压，121°C下灭菌20min (为常规灭菌）。
[0043] 实施例3、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)代谢产物的分离纯 化：
[0044] 将按照实施例2所述方法制备而得的40L发酵液经4层纱布过滤，所得滤液用等 体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取3次，将萃取液经真空浓缩干燥（于0. 1个负压的真空 度，45°C干燥30~40分钟），得到褐色的发酵液粗提物（26. 23g)。
[0045] 将所得的发酵液粗提物（26. 23g)用硅胶柱层析（200~300目的硅胶，约260g)进 行粗分，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：1〇〇:〇， 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100:16, 100:32 ;每种洗脱液的用量分别约为 5100ml、4500ml、 3750ml、3000ml、2250ml、1500ml、1500ml，流速为lOml/min。不同的梯度洗脱所得分别进行 收集。
[0046] 将所得的第1种洗脱部分Fl进行浓缩（于0. 1个负压的真空度，45°C干燥30~ 40分钟）后于甲醇中进行重结晶，能分别得到化合物1(橙色针状结晶，约5. Ig)和化合物 2 (橙色粉末，约6. 9g)。对所得的第2种洗脱部分F2进行同样的处理（即，浓缩后于甲醇中 进行重结晶），得到化合物3 (白色针状结晶，约12. Ig)和化合物4 (黄色粉末，约15. 9g)。 共得到上述4个单一代谢产物。最后结合多种波谱技术对所述4个化合物进行结构鉴定。
[0047] 上述4个化合物的波谱数据为：
[0048] 化合物 1 :橙色针状结晶。ESI-MS:m/ z calcd. for 270. 0528 (C15HltlO5). 1H NMR(600MHz, Acetone) δ 12. 22(d, J = 10. 6Hz, 1H), 12. 10 (d, J = 11. 4Hz, 1H), 7. 58 (d, J =I. 0Hz, 1H), 7. 27 (d, J = 2. 4Hz, 1H), 7. 16 (d, J = 0. 7Hz, 1H), 6. 68 (d, J = 2. 4Hz, 1H), 2. 49 (s, 4H).
[0049] 13C NMR(151MHz, Acetone) δ 190. 92, 182. 99, 182. 72, 181. 30, 165. 51, 148. 72, 124 .09, 120. 62, 108. 77, 107. 98, 80. 50, 25. 33, 13. 70.
[0050] 化合物 2 :橙色粉末。ESI-MS:m/z calcd. for 284. 0685 (C16H12O5). 1H NMR (600MHz, DMS0) 5l3.24(s,lH),7.43(d,J = l.lHz,lH),7.21(d,J = 2. 3Hz, 1H), 7. 13 (s, 1H), 6. 85 (d, J = 2. 3Hz, 1H), 3. 91 (s, 2H), 2. 40 (s, 2H). 13C NMR(151MHz, DMS0) δ 186. 79, 182. 76, 164. 92, 163. 91, 162. 17, 147. 07, 137. 27, 132. 50, 124 .63, 119. 57, 114. 85, 113. 12, 107. 42, 105. 44, 56. 79, 21. 84.
[0051] 化合物 3 :白色针状结晶。ESI-MS:m/z calcd. for 154. 0630 (C8HltlO3). 1H NMR (600MHz, MeOD) δ 6. 86 (dq, J = 15. 7, 6. 9Hz, 1H), 6. 41 (m, 1H), 6. 03 (s, 1H), 4. 70 (d, J = 2. 6Hz, 1H),4. ll(d, J = 2. 7Hz, 1H), 1.96(dd, J = 6.9, I. 6Hz, 3H). 13C NMR(151MHz, MeOD) δ 205. 49, 170. 71, 141. 75, 126. 31, 125. 81, 82. 29, 77. 98, 49. 33, 49. 18, 49. 04, 48. 90, 48. 7 6, 48. 62, 48. 47, 19. 39.
[0052] 化合物 4 :黄色粉末。ESI-MS:m/z calcd for 384. 9882 (C16H11Cl2O7). 1H MMR(600MHz，DMS0)Sll.78(s，lH)，10.16(s，lH)，6.95(d，J = 2.1Hz，lH)，6.73(d，J = 2. 0Hz，1H)，3. 67(d，J = 8. 3Hz，3H)，3. 45(s，9H)，2. 45(s，1H). 13C NMR(151MHz，DMS0) δ 199 .84, 170. 39, 165. 19, 158. 19, 156. 15, 154. 68, 141. 29, 127. 47, 124. 91, 111. 80, HO. 83, 107 .00, 103. 15, 99. 08, 55. 60, 51. 83, 18. 39.
[0053] 上述4个化合物的结构式为：
[0054]
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[0055] 实施例4、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的发酵液对反枝苋 和稗草幼根生长的抑制作用：
[0056] 吸取5mL发酵液（土曲霉QT122发酵液）于铺有滤纸的培养皿使滤纸饱和。同时 将阳性对照2, 4-D用丙酮配置成100 μ g/mL，吸取5mL于铺有滤纸的培养皿中使滤纸饱和， 溶剂挥发后加入5mL的无菌水。选取催芽的反枝苋和稗草种子（每皿10粒）放在滤纸上， 每个处理3个重复。然后放在28°C、70%相对湿度、定时光照（12h光照，12h黑暗）条件的 人工气候培养箱培养。2d后测量种子根长，以平均根生长抑制率表示结果。计算公式为： 平均根生长抑制率（％)=[(对照平均根长一处理平均根长）/对照平均根长]X100%。
[0057] 表1 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)发酵液对反枝苋和稗草幼根的抑制效 果
[0058]
[0059] 备注说明：表1中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照；供试浓度为100 μ g/mL。
[0060] 实验结果见表1 ;表1中的结果表明，土曲霉（Aspergillus terreus QT122)发 酵液对反枝苋和稗草幼根的生长抑制率分别为78. 5%和68. 5%，其结果稍弱于阳性对照 对反枝苋和稗草幼根的生长抑制率。因此本发明提供的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株具有被开发为微生物源除草剂的潜力。
[0061] 实施例5、蜻蜓肠道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的代谢产物对反枝 苋和稗草幼根生长的抑制作用：
[0062] 将发酵液粗提物和代谢产物分别用丙酮配制成lOOug/mL的溶液，分别吸取5mL于 铺有滤纸的培养皿中使滤纸饱和，溶剂挥发后加入5mL的无菌水，阳性对照用丙酮做同样 的处理。选取催芽的反枝苋和稗草种子（每皿10粒）放在滤纸上，每个处理3个重复。然 后放在28°C、70%相对湿度、定时光照（12h光照，12h黑暗）条件的人工气候培养箱培养。 2d后测量种子根长，以平均根生长抑制率表示结果。计算公式为：平均根生长抑制率（％ ) =[(对照平均根长一处理平均根长）/对照平均根长]X 100%。
[0063] 所得结果如下表2和表3所示。
[0064] 表2 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)发酵液粗提物对反枝苋和稗草幼根的 抑制效果
[0065]
[0067] 备注说明：表2中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照；供试浓度为100 μ g/mL。
[0068] 根据表2中结果表明，土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株发酵液的粗 提物对稗草幼根的生长抑制率大于79%，与阳性对照基本相当；而与阳性对照的结果相比 较，其对反枝苋幼根的生长同样有着很好的抑制作用，抑制率大于68%。
[0069] 表3 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)代谢产物对反枝苋和稗草幼根的抑制 效果
[0070]
[0071] 备注说明：表3中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照；供试浓度为100 μ g/mL。
[0072] 实验结果见表3。表中结果表明，与阳性对照实验结果相比较，土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的代谢产物对反枝苋和稗草幼根生长的抑制作用以化 合物3的效果最佳，抑制率高达80%以上；而化合物4对反枝苋和稗草幼根的生长也有着 较好的抑制作用，抑制率均大于60% ;化合物1和2对反枝苋和稗草幼根的生长都有着中 等强度的抑制活性。
[0073] 对比例1 :将如下所述的现有的土曲霉按照实施例2进行液体发酵，所得的发酵液 按照实施例4所述进行实验，所得结果如下表4所示；
[0074] 土曲霉A :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的海绵共附生土曲 霉 PF26(CGMCC NO. 5208);
[0075] 土曲霉B :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的土曲霉 ZRV2011P5(CGMCC NO. 8746)；
[0076] 土曲霉C :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的土曲霉 SNGB9003(CGMCC N0.0 569)；
[0077] 土曲霉D :为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的土曲霉 ZSOl (CGMCC NO. 6413)。
[0078] 表4、各种发酵液对反枝苋和稗草幼根的抑制效果
[0079]
[0080] 备注说明：表4中CK为空白对照；2, 4-D为阳性对照，且供试浓度为100 μ g/Ml。
[0081] 对比例实验结果见表4。表中结果表明，在同等实验条件的情况下，各种现有的 土曲霉发酵液对反枝苋和稗草幼根生长的抑制活性与阳性对照相比，只有本发明的土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的发酵液效果显著，均与阳性对照相当；而土曲霉A、B、 C、D的发酵液对反枝苋和稗草幼根生长的抑制活性较弱，抑制率均小于40%。
[0082] 综合实施例4、实施例5以及对比例1的实验结果表明，蜻蜓肠道共生土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的发酵液和代谢产物具有很好的除草活性，因此对开 发新型微生物源除草剂具有重要的价值和潜力。
[0083] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
L 土曲霉QT122,其特征是：为Aspergillus terreus QT122,其保藏编号为：CCTCC M2015240。
2. 土曲霉QT122发酵液的制备方法，其特征是包括以下步骤： 1) 、活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)接入麦芽液体培养基中，于 27. 5~28. 5°C、160~180rpm/min的条件下培养2~3d，得种子液； 2) 、将种子液按照1 %~2%体积比的接种量接入麦芽液体培养基中，于27. 5~ 28. 5°C、160~180rpm/min的条件下培养6~8d，得土曲霉QT122发酵液。
3. 利用土曲霉QT122发酵液制备土曲霉QT122代谢产物的方法，其特征是包括以下步 骤： 1) 、将土曲霉QT122发酵液利用纱布进行过滤，得滤液； 将滤液经乙酸乙酯萃取后，真空减压浓缩干燥，得土曲霉QT122发酵液粗提物； 2) 、将土曲霉QT122发酵液粗提物用硅胶柱层析进行粗分，采用二氯甲烷/甲醇进行梯 度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：1〇〇:〇, 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100:16， 100:32 ;进而相应得到7个馏分：F1~F7 ; 3) 、将Fl和F2分别进行如下操作：浓缩后用甲醇重结晶；总共得到4个土曲霉QT122 代谢产物。
4. 依据权利要求3所述方法制备而得的4种土曲霉QT122代谢产物，其特征是分别具 有如下结构式：
5. 土曲霉QT122的用途，其特征是：用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。
6. 根据权利要求5所述的土曲霉QT122的用途，其特征是：土曲霉QT122发酵液、土曲 霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物均能用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。
7. 对反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制活性的生物农药，其特征是：该生物农药中含 有以下任意一种：土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产 物。
【专利摘要】本发明公开了一种土曲霉QT122，为Aspergillus terreus QT122，其保藏编号为：CCTCC M 2015240。本发明还同时公开了土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物的制备方法。本发明还同时公开了土曲霉QT122的用途，土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物均能用于抑制反枝苋或稗草幼根的生长。土曲霉QT122发酵液、土曲霉QT122发酵液粗提物、土曲霉QT122代谢产物可用于制备对反枝苋和稗草的幼根生长具有抑制活性的生物农药。CCTCC NO： M 201524020150417
【IPC分类】C12R1/66, C07C49/597, C12N1/14, A01N63/04, A01N45/02, A01N35/06, C07C69/92, C07C50/18, A01N37/10
【公开号】CN104893986
【申请号】CN201510261549
【发明人】张应烙, 卢贻会
【申请人】浙江师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月21日
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