一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉及其应用
一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素 酶的深绿木霉及其应用。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C. 3. I. 1. 73，ferulicacid esterase，FAE)又称肉桂酸醋酶，是 一种新型酶制剂，它主要以阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和木质素阿魏酸酯 为底物，破坏阿魏酸与多糖相连的酯键，从植物细胞壁中释放阿魏酸，让余下的多糖主链易 被降解，有效提高了含有大量木质纤维素和阿魏酸的副产品的营养价值。阿魏酸具有多种 生理功能如清除自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突 变、防癌、增强精子活力以及调节人体免疫等。因此，在食品工业中可利用该酶打断阿魏酸 与细胞壁材料如麸皮、秸杆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，获得功能性食 品基料。阿魏酸酯酶在食品工业中具有广阔的应用前景。
[0003] 在饲料工业中，农作物植物性的纤维原材料经过阿魏酸酯酶处理后，阿魏酸从植 物细胞壁的结构中游离出来，植物材料致密的细胞骨架结构受到破坏，打破了木质素、半纤 维素及纤维素之间的连接，这种疏松的植物性原料更容易被牲畜消化吸收利用，可显著提 高饲料的利用率。
[0004] 纤维素酶是一类能降解纤维素中β -1，4糖苷键的O-糖基化水解酶。在饲料业生 产中，纤维素酶作为一种新型的饲料添加剂，添加剂量一般在〇. 1% -〇. 3%。由于植物细胞 壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的，阻止了动物对植物细胞内营养物质的消化吸收， 纤维素酶能在动物体内分解结构复杂的纤维素，摧毁植物细胞壁并释放营养物质，生成易 于消化的葡萄糖，使饲料的利用率增大，同时增进酸度，激活胃蛋白酶，促进消化吸收；纤维 素酶还能显著减少动物肠道内大肠杆菌的数量并促进有益微生物的生长，改善肠道内菌群 平衡。
[0005] 目前已经筛选到多种分泌阿魏酸酯酶和纤维素酶的微生物菌株，包括真菌、 细菌和酵母。发现的产阿魏酸醋酶微生物主要有黑曲霉（Aaspergillusniger)、链霉 菌（如 Streptomycesavermitilis)、梭菌（如 Clostridiumthermocellum)、杆菌（如 Bacillussp.)、乳酸杆菌（Lactobacilli)、假单胞菌（如 Pseudomonasfluorescens) 等。但绝大多数阿魏酸醋酶从真菌中分离得到，如米曲霉（Aspergi I Iusoryzae)、 黑曲霉（Aspergillusniger)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、尖孢镰刀 菌（Fusariumoxysporum)、嗜热侧抱霉（Sporotrichumthermophile)、黄柄 曲霉（Aspergillusflavipes)、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、塔宾曲霉 (Aspergillustubingensis)、青霉类（Penicillium) 〇
[0006] 目前，阿魏酸酯酶在饲料工业中的需求很大，而应用于工业的阿魏酸酯酶主要来 源于黑曲霉，由于黑曲霉阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，在工业生产使用过 程中，阿魏酸酯酶酶活损失严重，很大程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温 纤维素酶的深绿木霉及其应用，该菌株具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、 发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸 碱稳定性好。
[0008] -种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心CGMCC(地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号： CGMCC No. 8673。
[0009] 本发明所述的深绿木霉菌AWS26的筛选方法包括以下步骤：
[0010] 步骤1，采样及样品处理
[0011] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌的生理盐水的三角瓶中，以160r/min的转速室温振 荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理 20-30min，得土样浑浊液。
[0012] 步骤2,富集培养
[0013] 吸取2-4mL经高温处理后的土样浑浊液，加入至装有30-60mL富集培养基一的三 角瓶中，置于45-50°C、转速160-200r/min下恒温摇床中培养5-7d。然后无菌操作量取 30-50mL富集培养液至离心管中，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，以富集培养基 二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的三角瓶中，再次置于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0014] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠 0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5。121°C 15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0015] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5。121°C 15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0016] 无机盐营养液：NaN03 2. 0g，K2PO4 I. 5g，CaCl2 I. 5g，MgSO4 0· 3g，FeSO4 · 7H20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4) 2S04 5g，去离子水 1000mL。
[0017] 步骤3,初筛
[0018] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培养 箱中继续倒置培养2-4d。
[0019] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基。接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量0.1 %的刚果红染液，染色l-10min，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛平板上接种出来，进一步复筛。
[0020] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C，15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0021] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
[0022] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉1.5g，pH4. 5。121°C，灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐 渐变得不透明，在60-70 °C下倒入平板中。
[0023] 阿魏酸乙酯溶液配制：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离心管中，加入500 yLN、N_二甲 基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0024] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0025] 步骤4,复筛
[0026] 将初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45?恒温培养箱中培养 2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态 一致则认为菌株已纯化。
[0027] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的三角瓶中，在160-180r/min转速 下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10% (v/v)的接种量，将液体种子接 种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发酵 培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活 性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶 活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面培 养基上，4 °C保藏。
[0028] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0029] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0030] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL， (NH4)2S04 lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0031] 经上述筛选方法所得菌株，菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面 疏松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较 厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝 体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或 互生，呈树枝状排列，孢子梗长5. 0-12. 0 μ m，中间宽2. 5-3. 7 μ m，基部宽L 5-3. 0。分生孢 子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》 和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0032] 所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26在饲料原料降解中的应用，具体方法为：将干燥的玉米稻杆粉10g、麸皮 5g、硫酸铵lg、豆柏粉lg、硝酸铵0. 4g、NaClO. 5g、磷酸二氢钾0. 2g和MgSO40.0 5g混合，按 固液质量比1:1.3加入去离子水，再接种菌株（1'1'；[(3110(161'1]^31：1'〇￥；[1^(16)4吧26,26-30°0 培养10天。
[0033] 所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26在发酵麦麸制备阿魏酸中的应用，包括以下步骤：
[0034] 步骤1，将菌株（Trichoderma atroviride)AWS26孢子悬浮液接种到发酵培养基 中，30-35°C培养3-5d，中间翻曲2-3次；
[0035] 步骤2,在步骤1所得麸曲中加入去离子水，搅拌，置于震荡摇床100r/min、50°C浸 提211，过滤，800017 /1^11离心201^11，取上清液用饱和度为80%(见14)2304盐析，4°〇静置过夜， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用pH4. 0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，得到耐高温阿魏 酸酯酶和耐高温纤维素酶混合粗酶；
[0036] 步骤3,将步骤2所得粗酶加入去淀粉麸皮，再加入水，调节pH4. 0,65°C酶解12h， 得阿魏酸。
[0037] 本发明提供的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉，具有营养要求 低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与 纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸碱稳定性好。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明的深绿木霉初筛酶活检测平板图；
[0039] 图2为本发明的深绿木霉复筛酶活检测平板图；
[0040] 图3为实施例3中温度对阿魏酸酯酶与纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0041] 图4为实施例3中pH值对阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0042] 图5为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶酶的热稳定性曲线；
[0043] 图6为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶pH稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
[0046] 步骤1，采样及样品处理：
[0047] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬 液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理20-30min，得土样 浑浊液。
[0048] 步骤2,富集培养：
[0049] 吸取2-4mL步骤1所得土样浑浊液，加至装有30-60mL富集培养基一的容量为 250mL的三角瓶中，于45-50°C、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d，得富集培养液。 无菌操作量取30-50mL富集培养液，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，用富集培养 基二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的250mL三角瓶中，于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0050] 步骤3,初筛：
[0051] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培 养箱中继续倒置培养2-4d。
[0052] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基，接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量〇. 1 %的刚果红染液，染色Ι-lOmin，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛培养基平板上接种出来，进一步复筛。阿魏酸酯酶和纤维素酶初筛平板检测结果分 别如表1和表2所不。
[0053] 步骤4,复筛：
[0054] 将步骤3初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45 °C恒温培养箱中培 养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化，所述 菌株初筛酶活检测平板图如图1所示。
[0055] 步骤5,菌种保藏：
[0056] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/ min转速下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10 % (v/v)的接种量，将液体 种子接种到液体发酵培养中，在160_180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发 酵培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶 活性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高 酶活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面 培养基上，4°C保藏。复筛结果如表3所示，综合考虑阿魏酸酯酶和纤维素酶的酶活情况，选 择菌株AWS26作为目的菌株。复筛所得菌株AWS26阿魏酸酯酶活性检测平板如图2所示，
[0057] 其中，所使用的培养基配方如下：
[0058] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠 0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5 ，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0059] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0060] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C、15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0061] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉I. 5g，pH4. 5,121°C灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐渐 变得不透明，在60-70°C下倒入平板中。其中，阿魏酸乙酯溶液：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离 心管中，加入500 μ L N、N-二甲基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0062] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0063] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0064] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0065] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL， (NH4)2SO4 lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0066] 上述培养基中，无机盐营养液：NaNO3 2. 0g，K2PO4 L 5g，CaCl2 L 5g，MgSO4 (λ 3g， FeSO4 · 7Η20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4)2SO4 5g，去离 子水 1000 mL。
[0067] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。称取200g马铃薯，洗 净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，添加蔗糖20g，补充水至1000mL。
[0068] 表1产阿魏酸酯酶霉菌平板初筛结果
[0069]
[0071] 表2产纤维素酶霉菌平板初筛结果
[0072]
[0073] 表3各菌株粗酶液酶活
[0074]
[0075] 本发明所得菌株AWS26,菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面疏 松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较 厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝 体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或 互生，呈树枝状排列，孢子梗长5. 0-12. 0 μ m，中间宽2. 5-3. 7 μ m，基部宽L 5-3. 0。分生孢 子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》 和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0076] 提取本发明菌株AWS26基因组，依据真菌18SrDNA中最保守的序列设计引物， 扩增采用上游引物：5' -CCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（如SEQ ID NO. 2所示），下游引物： 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（如 SEQ ID NO. 30.所示）。反应条件为：95°C预变性 5min， 94°C变性40S，52°C退火40S，72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。 扩增产物连接 PMD18-T 载体。PCR 反应体系为：10XBuffer2yL，dNTP(2. 5mmol/L)2yL，上 游引物 I UL，下游引物 I yL，templatelO ~50ng，Taq 酶（2. 5U)0. 3μ 1，加水补足 20yL。 经PCR扩增得到其18S rDNA片段712bp。将该扩增片段凝胶回收并测序，提交GenBank进 行核酸同源性分析，测得序列如SEQ ID NO. 1所示，与从NCBI中比对获得的相近霉菌的 18SrDNA序列采用ClustalXl. 83进行多序列比对，然后采用MEGA4. 0生物学软件构建系统 进化树，结果显不菌株AWS26的18SrDNA核苷酸序列与Trichodermaatroviride (JX462604) 的18S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性（maxident)达到99%。综合结合其形态 特征、培养特征观察，将菌株AWS26鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0077] 实施例2产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉应用于饲料原料降 解
[0078] 干燥好的玉米秸杆粉10g，麸皮5g，硫酸铵lg，豆柏粉lg，硝酸铵0. 4g，NaCl 0. 5g， 磷酸二氢钾〇. 2g，MgS04 0. 05g，按固液质量比1:1. 3加入去离子水，将以上饲料置于三角 瓶中，灭菌接种后放入恒温恒湿培养箱，调节温度26-30°C，pH6. 0。接种菌种为本发明的活 化好的菌种AWS26。发酵过程中，每天翻动三角瓶，发酵IOd后，检测纤维素、半纤维素和木 质素的含量变化。检测结果显示，发酵原料中，木质素的降解率为77. 4%，纤维素的降解率 为67. 6%，半纤维素的降解率为47. 9%，还原糖转化率为0. 697g/g秸杆。说明采用本发明 筛选的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶菌株处理玉米秸杆、麸皮等饲料原料，可以 显著地提高不易消化的大分子碳水化合物的降解率，为其应用于饲料工业提供可能性。
[0079] 实施例3产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉应用于发酵麦麸制 备阿魏酸
[0080] 在500mL三角瓶中加入麸皮50g，硫酸铵lg，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0. 2g，硫酸镁 0. 05g，75mL水混匀灭菌。PDA培养基斜面培养接种本发明深绿木霉菌种后，30-35°C培养 3-4d，然后斜面中加无菌水IOml并充分悬浮孢子，灭菌后的培养基中加入2ml孢子悬浮 液，充分混合均匀后，于30-35°C培养3-5d，中间翻曲2-3次。向发酵好的麸曲中加入去离子 水，充分搅拌使麸曲分散，放置于震荡摇床上l〇〇r/min转速下，50°C浸提2h。过滤、8000r/ min离心20min，取上清液用饱和度为80% (NH4)2SO4盐析，4°C静置过夜，8000r/min离心 20min，收集沉淀，pH4. 0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，得到耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤 维素酶混合粗酶。
[0081] 在250mL三角瓶中加入去淀粉麸皮5g，加入本发明深绿木霉发酵自制混合酶5mL， 水115mL，调节pH4. 0,温度为65°C，酶解时间12h。沸水灭酶，离心取上清测定阿魏酸和还 原糖的质量浓度。在此条件下阿魏酸释放量最高为9. 12mg/g麦麸。利用本发明菌株发酵 所产混合酶生产阿魏酸反应温和、容易控制，不会引起褐变，是最佳的提取方法，适用于工 业生产阿魏酸。
[0082] 实施例3耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的酶活及酶学特性测定
[0083] 将筛选得到的深绿木霉AWS26菌株进行发酵，发酵培养基配方为：PDA培养基 80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL，（NH4)2SO4Ig,补充去离子水至lOOmL。 121°C，15min灭菌。发酵条件为：发酵周期2-3d，发酵温度35-40°C，接种量4-8%，摇床转 速 160-200r/min。
[0084] 发酵结束后，将发酵液8000r/min离心20min去除菌体，并用0. 22ym滤除去残余 菌体和不溶物质，收集滤出液。按照硫酸铵饱和度75%，向以上发酵滤出液中添加硫酸铵， 充分溶解后，4°C静置过夜 ，8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲 溶液溶解，上样S印hedex G25分子筛凝胶柱脱盐，层析柱以pH6. 5的磷酸缓冲液平衡后以 相同缓冲溶液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗酶液。所得发酵液阿魏酸酯酶酶 活为：262U/L ;纤维素酶酶活为：915U/mL。
[0085] 酶活性测定方法为：
[0086] 发酵液的阿魏酸酯酶活力测定
[0087] 向2mL离心管中加入0. 5mL经过1-5倍稀释后的酶液，然后再加入0. 5mL阿魏酸 甲酯溶液，充分混匀，65°C保温20min。再加入ImL体积分数为10%的冰乙酸以终止反应。 样品于12000r/min离心10min。保留上清液，稀释2-4倍后，用高效液相色谱（HPLC)法测 定样品中的阿魏酸含量。以煮沸灭活的酶液作为对照组，处理方法同上。
[0088] 阿魏酸酯酶的酶活定义：在50°C，pH值为6. 5的条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯， 生成1 μ mol阿魏酸所需的酶量。阿魏酸采用高效液相色谱法测定。
[0089] 纤维素酶滤纸酶活力的测定方法：将新华定性滤纸剪成大小为IX6cm，置于离心 管中，加入pH4. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液lmL，于55°C温度的水浴锅中预热。加入酶液 500 μ L，保温反应60min。加入3mL的DNS试剂，沸水浴5min显色，放置冷水中冷却至室温。 吸取200 μ L反应上清液，在波长540nm处测定样品的吸光值，根据绘制的葡萄糖浓度标准 曲线计算出反应体系中的葡萄糖浓度。以煮沸灭活的酶液作为对照组，处理方法同上。
[0090] 纤维素酶的活力单位（U)定义为：在上述条件下，每分钟分解羧甲基纤维素钠生 成I ymol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U)。
[0091] 1.酶反应最适温度测定
[0092] 将反应体系分别置于 20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、 70°C、75°C、80°C的水浴，适度稀释后，分别测定阿魏酸酯酶酶和纤维素酶活力，研宄酶促反 应最适温度。以酶在最适温度下所测酶活为100%，其它温度下所测为对其相对酶活。结果 如图1所示，阿魏酸酯酶和纤维素酶随温度上升酶的变化趋势基本相同。从20°C到65°C阿 魏酸酯酶，随着温度升高酶活性逐渐增加，温度达到65°C时，酶活达到最大值。以后随着温 度升高，酶活逐渐降低，故酶的阿魏酸酯酶最适作用温度为65°C。而纤维素酶的温度分界点 是55°C，即纤维素酶的最适合作用温度是55°C。整体看两种酶都是高温酶，在45°C -70°C 之间两种酶的酶活都在80%以上，故在这个温度范围内复合酶制剂都会发挥高效的酶解作 用。
[0093] 2.酶作用最适pH测定
[0094] 酶制剂在不同pH(3. 0~9. 0)下进行酶促反应，测定阿魏酸酯酶和纤维素酶最适 作用pH。所用缓冲液为：pH2. 0~3. 0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，pH3. 0~4. 0柠檬酸磷酸 缓冲液，PH4. 0~5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5. 0~7. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲 液，pH7. 0~9. OTris-HCl缓冲溶液。以酶在最适pH值下所测酶活为100%，其它pH值下 所测为对其相对酶活。酶制剂在以上不同pH缓冲体系中，分别在65°C和55°C下测定阿魏 酸酯酶和纤维素酶酶活性，结果如图2所示，阿魏酸酯酶在pH3. 5~7. O之间酶活性在80% 以上，最适作用pH为4. 5。纤维素酶在pH4. 5-7. 0之间所测酶活均在90%以上，最适酶活 5. 5。整体看酶制剂两种酶在pH4. 5-7. 0之间酶活性都在80%以上，故酶制剂适合在酸性条 件下酶解反应。
[0095] 3.酶的热稳定性实验
[0096] 将溶于pH6. 5磷酸缓冲液的酶制剂在40°C _80°C的不同温度下保温4h后，立即冰 浴，适度稀释后，分别测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活力。以酶在最稳定温度下所测酶活 为100%，其它温度下所测为对其相对酶活。结果见图3所示，两种酶基本随温度的上升酶 活力逐渐降低，在温度高于60°C时，阿魏酸酯酶酶活性下降显著。两种酶在60°C以下，酶活 保存率都在80%以上；55°C以下，剩余酶活都在90%以上。复合酶制剂是耐高温型。
[0097] 4. pH值对酶稳定性的影响
[0098] 酶制剂在不同pH的缓冲液中，分别于40°C保温24h，然后分别测定阿魏酸酯酶和 纤维素酶酶活力，以酶在最稳定PH下所测酶活为100%，其它pH下所测为对其相对酶活。 结果见图4所示，40°C，pH3. 0-8. 0范围内24h阿魏酸酯酶酶活性基本不发生变化，活性稳 定，相对酶活均在95%以上。纤维素酶在pH4. 0-9. 0之间酶活性基本没有下降。整体看复 合酶制剂具有较广的酸碱稳定性，在酸性条件下性质更为稳定。
[0099] 5.酶制剂的保存时间对酶活性的影响
[0100] 将制备好的固体酶制剂分别在4°C和室温下保存，每一个月检测一次酶活力，共检 测6个月，查看酶活保留情况。结果如下表所示：
[0101]
[0102] 在半年时间内，4°C下阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活保存率都在90%以上，室温条件 下酶活也在80%以上，可以看出酶的稳定性好。
【主权项】
1. 一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（ atroririofe)AWS26,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏 编号：CGMCCNo. 8673。2. 权利要求1所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 ([ricAoofe/maatroFiriofe)AWS26在饲料原料降解中的应用。3. 权利要求1所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 (fricAoofe/maatrwiriofe)AWS26在发酵麦麸制备阿魏酸中的应用。4. 根据权利要求2所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 (atrwiriofe)AWS26在饲料原料降解中的应用，其特征在于：包括以下步骤： 将干燥的玉米秸杆粉l〇g、麸皮5g、硫酸铵lg、豆柏粉lg、硝酸铵0. 4g、NaC10. 5g、磷酸二氢 钾0. 2g和MgSO4O. 05g混合，按固液质量比1:1. 3加入去离子水，再接种菌株（ Wroriritfe)AWS26, 26-30°C培养 10 天。5. 根据权利要求3所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 (atrwiri￡/e)AWS26在发酵麦麸制备阿魏酸中的应用，其特征在于：包括以下 步骤： 步骤1，将菌株（ZricAoofe/maatrwiriofe)AWS26孢子悬浮液接种到发酵培养基中， 30-35°C培养3-5d，中间翻曲2-3次； 步骤2,在步骤1所得麸曲中加入去离子水，搅拌，置于震荡摇床100r/min、5(TC浸提 2h，过滤，8000r/min离心20min，取上清液用饱和度为80% (NH4)2SO4盐析，4°C静置过夜， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用pH4. 0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，得到耐高温阿魏 酸酯酶和耐高温纤维素酶混合粗酶； 步骤3,将步骤2所得粗酶加入去淀粉麸皮，再加入水，调节pH4. 0，65°C酶解12h，得阿 魏酸。
【专利摘要】本发明公开了一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉及其应用，该深绿木霉（Trichoderma atroviride）AWS26，保藏编号为CGMCC No. 8673。本发明的深绿木霉具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸碱稳定性好。CGMCC No.867320140102
【IPC分类】C12N1/14, A23K1/14, C12R1/885, A23K1/00, A23K1/175, C12P7/42
【公开号】CN104893988
【申请号】CN201510268516
【发明人】高兆建, 张建萍, 刘恩岐, 侯进慧, 孙会刚, 徐大伟, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素 酶的深绿木霉及其应用。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C. 3. I. 1. 73，ferulicacid esterase，FAE)又称肉桂酸醋酶，是 一种新型酶制剂，它主要以阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和木质素阿魏酸酯 为底物，破坏阿魏酸与多糖相连的酯键，从植物细胞壁中释放阿魏酸，让余下的多糖主链易 被降解，有效提高了含有大量木质纤维素和阿魏酸的副产品的营养价值。阿魏酸具有多种 生理功能如清除自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突 变、防癌、增强精子活力以及调节人体免疫等。因此，在食品工业中可利用该酶打断阿魏酸 与细胞壁材料如麸皮、秸杆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，获得功能性食 品基料。阿魏酸酯酶在食品工业中具有广阔的应用前景。
[0003] 在饲料工业中，农作物植物性的纤维原材料经过阿魏酸酯酶处理后，阿魏酸从植 物细胞壁的结构中游离出来，植物材料致密的细胞骨架结构受到破坏，打破了木质素、半纤 维素及纤维素之间的连接，这种疏松的植物性原料更容易被牲畜消化吸收利用，可显著提 高饲料的利用率。
[0004] 纤维素酶是一类能降解纤维素中β -1，4糖苷键的O-糖基化水解酶。在饲料业生 产中，纤维素酶作为一种新型的饲料添加剂，添加剂量一般在〇. 1% -〇. 3%。由于植物细胞 壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的，阻止了动物对植物细胞内营养物质的消化吸收， 纤维素酶能在动物体内分解结构复杂的纤维素，摧毁植物细胞壁并释放营养物质，生成易 于消化的葡萄糖，使饲料的利用率增大，同时增进酸度，激活胃蛋白酶，促进消化吸收；纤维 素酶还能显著减少动物肠道内大肠杆菌的数量并促进有益微生物的生长，改善肠道内菌群 平衡。
[0005] 目前已经筛选到多种分泌阿魏酸酯酶和纤维素酶的微生物菌株，包括真菌、 细菌和酵母。发现的产阿魏酸醋酶微生物主要有黑曲霉（Aaspergillusniger)、链霉 菌（如 Streptomycesavermitilis)、梭菌（如 Clostridiumthermocellum)、杆菌（如 Bacillussp.)、乳酸杆菌（Lactobacilli)、假单胞菌（如 Pseudomonasfluorescens) 等。但绝大多数阿魏酸醋酶从真菌中分离得到，如米曲霉（Aspergi I Iusoryzae)、 黑曲霉（Aspergillusniger)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、尖孢镰刀 菌（Fusariumoxysporum)、嗜热侧抱霉（Sporotrichumthermophile)、黄柄 曲霉（Aspergillusflavipes)、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、塔宾曲霉 (Aspergillustubingensis)、青霉类（Penicillium) 〇
[0006] 目前，阿魏酸酯酶在饲料工业中的需求很大，而应用于工业的阿魏酸酯酶主要来 源于黑曲霉，由于黑曲霉阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，在工业生产使用过 程中，阿魏酸酯酶酶活损失严重，很大程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温 纤维素酶的深绿木霉及其应用，该菌株具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、 发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸 碱稳定性好。
[0008] -种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心CGMCC(地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号： CGMCC No. 8673。
[0009] 本发明所述的深绿木霉菌AWS26的筛选方法包括以下步骤：
[0010] 步骤1，采样及样品处理
[0011] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌的生理盐水的三角瓶中，以160r/min的转速室温振 荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理 20-30min，得土样浑浊液。
[0012] 步骤2,富集培养
[0013] 吸取2-4mL经高温处理后的土样浑浊液，加入至装有30-60mL富集培养基一的三 角瓶中，置于45-50°C、转速160-200r/min下恒温摇床中培养5-7d。然后无菌操作量取 30-50mL富集培养液至离心管中，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，以富集培养基 二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的三角瓶中，再次置于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0014] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠 0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5。121°C 15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0015] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5。121°C 15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0016] 无机盐营养液：NaN03 2. 0g，K2PO4 I. 5g，CaCl2 I. 5g，MgSO4 0· 3g，FeSO4 · 7H20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4) 2S04 5g，去离子水 1000mL。
[0017] 步骤3,初筛
[0018] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培养 箱中继续倒置培养2-4d。
[0019] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基。接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量0.1 %的刚果红染液，染色l-10min，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛平板上接种出来，进一步复筛。
[0020] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C，15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0021] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
[0022] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉1.5g，pH4. 5。121°C，灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐 渐变得不透明，在60-70 °C下倒入平板中。
[0023] 阿魏酸乙酯溶液配制：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离心管中，加入500 yLN、N_二甲 基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0024] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0025] 步骤4,复筛
[0026] 将初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45?恒温培养箱中培养 2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态 一致则认为菌株已纯化。
[0027] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的三角瓶中，在160-180r/min转速 下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10% (v/v)的接种量，将液体种子接 种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发酵 培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活 性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶 活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面培 养基上，4 °C保藏。
[0028] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0029] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0030] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL， (NH4)2S04 lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0031] 经上述筛选方法所得菌株，菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面 疏松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较 厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝 体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或 互生，呈树枝状排列，孢子梗长5. 0-12. 0 μ m，中间宽2. 5-3. 7 μ m，基部宽L 5-3. 0。分生孢 子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》 和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0032] 所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26在饲料原料降解中的应用，具体方法为：将干燥的玉米稻杆粉10g、麸皮 5g、硫酸铵lg、豆柏粉lg、硝酸铵0. 4g、NaClO. 5g、磷酸二氢钾0. 2g和MgSO40.0 5g混合，按 固液质量比1:1.3加入去离子水，再接种菌株（1'1'；[(3110(161'1]^31：1'〇￥；[1^(16)4吧26,26-30°0 培养10天。
[0033] 所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26在发酵麦麸制备阿魏酸中的应用，包括以下步骤：
[0034] 步骤1，将菌株（Trichoderma atroviride)AWS26孢子悬浮液接种到发酵培养基 中，30-35°C培养3-5d，中间翻曲2-3次；
[0035] 步骤2,在步骤1所得麸曲中加入去离子水，搅拌，置于震荡摇床100r/min、50°C浸 提211，过滤，800017 /1^11离心201^11，取上清液用饱和度为80%(见14)2304盐析，4°〇静置过夜， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用pH4. 0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，得到耐高温阿魏 酸酯酶和耐高温纤维素酶混合粗酶；
[0036] 步骤3,将步骤2所得粗酶加入去淀粉麸皮，再加入水，调节pH4. 0,65°C酶解12h， 得阿魏酸。
[0037] 本发明提供的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉，具有营养要求 低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与 纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸碱稳定性好。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明的深绿木霉初筛酶活检测平板图；
[0039] 图2为本发明的深绿木霉复筛酶活检测平板图；
[0040] 图3为实施例3中温度对阿魏酸酯酶与纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0041] 图4为实施例3中pH值对阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0042] 图5为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶酶的热稳定性曲线；
[0043] 图6为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶pH稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
[0046] 步骤1，采样及样品处理：
[0047] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬 液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理20-30min，得土样 浑浊液。
[0048] 步骤2,富集培养：
[0049] 吸取2-4mL步骤1所得土样浑浊液，加至装有30-60mL富集培养基一的容量为 250mL的三角瓶中，于45-50°C、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d，得富集培养液。 无菌操作量取30-50mL富集培养液，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，用富集培养 基二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的250mL三角瓶中，于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0050] 步骤3,初筛：
[0051] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培 养箱中继续倒置培养2-4d。
[0052] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基，接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量〇. 1 %的刚果红染液，染色Ι-lOmin，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛培养基平板上接种出来，进一步复筛。阿魏酸酯酶和纤维素酶初筛平板检测结果分 别如表1和表2所不。
[0053] 步骤4,复筛：
[0054] 将步骤3初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45 °C恒温培养箱中培 养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化，所述 菌株初筛酶活检测平板图如图1所示。
[0055] 步骤5,菌种保藏：
[0056] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/ min转速下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10 % (v/v)的接种量，将液体 种子接种到液体发酵培养中，在160_180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发 酵培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶 活性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高 酶活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面 培养基上，4°C保藏。复筛结果如表3所示，综合考虑阿魏酸酯酶和纤维素酶的酶活情况，选 择菌株AWS26作为目的菌株。复筛所得菌株AWS26阿魏酸酯酶活性检测平板如图2所示，
[0057] 其中，所使用的培养基配方如下：
[0058] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠 0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5 ，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0059] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0060] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C、15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0061] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉I. 5g，pH4. 5,121°C灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐渐 变得不透明，在60-70°C下倒入平板中。其中，阿魏酸乙酯溶液：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离 心管中，加入500 μ L N、N-二甲基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0062] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0063] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0064] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0065] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL， (NH4)2SO4 lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0066] 上述培养基中，无机盐营养液：NaNO3 2. 0g，K2PO4 L 5g，CaCl2 L 5g，MgSO4 (λ 3g， FeSO4 · 7Η20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4)2SO4 5g，去离 子水 1000 mL。
[0067] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。称取200g马铃薯，洗 净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，添加蔗糖20g，补充水至1000mL。
[0068] 表1产阿魏酸酯酶霉菌平板初筛结果
[0069]
[0071] 表2产纤维素酶霉菌平板初筛结果
[0072]
[0073] 表3各菌株粗酶液酶活
[0074]
[0075] 本发明所得菌株AWS26,菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面疏 松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较 厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝 体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或 互生，呈树枝状排列，孢子梗长5. 0-12. 0 μ m，中间宽2. 5-3. 7 μ m，基部宽L 5-3. 0。分生孢 子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》 和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0076] 提取本发明菌株AWS26基因组，依据真菌18SrDNA中最保守的序列设计引物， 扩增采用上游引物：5' -CCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（如SEQ ID NO. 2所示），下游引物： 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（如 SEQ ID NO. 30.所示）。反应条件为：95°C预变性 5min， 94°C变性40S，52°C退火40S，72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。 扩增产物连接 PMD18-T 载体。PCR 反应体系为：10XBuffer2yL，dNTP(2. 5mmol/L)2yL，上 游引物 I UL，下游引物 I yL，templatelO ~50ng，Taq 酶（2. 5U)0. 3μ 1，加水补足 20yL。 经PCR扩增得到其18S rDNA片段712bp。将该扩增片段凝胶回收并测序，提交GenBank进 行核酸同源性分析，测得序列如SEQ ID NO. 1所示，与从NCBI中比对获得的相近霉菌的 18SrDNA序列采用ClustalXl. 83进行多序列比对，然后采用MEGA4. 0生物学软件构建系统 进化树，结果显不菌株AWS26的18SrDNA核苷酸序列与Trichodermaatroviride (JX462604) 的18S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性（maxident)达到99%。综合结合其形态 特征、培养特征观察，将菌株AWS26鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0077] 实施例2产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉应用于饲料原料降 解
[0078] 干燥好的玉米秸杆粉10g，麸皮5g，硫酸铵lg，豆柏粉lg，硝酸铵0. 4g，NaCl 0. 5g， 磷酸二氢钾〇. 2g，MgS04 0. 05g，按固液质量比1:1. 3加入去离子水，将以上饲料置于三角 瓶中，灭菌接种后放入恒温恒湿培养箱，调节温度26-30°C，pH6. 0。接种菌种为本发明的活 化好的菌种AWS26。发酵过程中，每天翻动三角瓶，发酵IOd后，检测纤维素、半纤维素和木 质素的含量变化。检测结果显示，发酵原料中，木质素的降解率为77. 4%，纤维素的降解率 为67. 6%，半纤维素的降解率为47. 9%，还原糖转化率为0. 697g/g秸杆。说明采用本发明 筛选的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶菌株处理玉米秸杆、麸皮等饲料原料，可以 显著地提高不易消化的大分子碳水化合物的降解率，为其应用于饲料工业提供可能性。
[0079] 实施例3产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉应用于发酵麦麸制 备阿魏酸
[0080] 在500mL三角瓶中加入麸皮50g，硫酸铵lg，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0. 2g，硫酸镁 0. 05g，75mL水混匀灭菌。PDA培养基斜面培养接种本发明深绿木霉菌种后，30-35°C培养 3-4d，然后斜面中加无菌水IOml并充分悬浮孢子，灭菌后的培养基中加入2ml孢子悬浮 液，充分混合均匀后，于30-35°C培养3-5d，中间翻曲2-3次。向发酵好的麸曲中加入去离子 水，充分搅拌使麸曲分散，放置于震荡摇床上l〇〇r/min转速下，50°C浸提2h。过滤、8000r/ min离心20min，取上清液用饱和度为80% (NH4)2SO4盐析，4°C静置过夜，8000r/min离心 20min，收集沉淀，pH4. 0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，得到耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤 维素酶混合粗酶。
[0081] 在250mL三角瓶中加入去淀粉麸皮5g，加入本发明深绿木霉发酵自制混合酶5mL， 水115mL，调节pH4. 0,温度为65°C，酶解时间12h。沸水灭酶，离心取上清测定阿魏酸和还 原糖的质量浓度。在此条件下阿魏酸释放量最高为9. 12mg/g麦麸。利用本发明菌株发酵 所产混合酶生产阿魏酸反应温和、容易控制，不会引起褐变，是最佳的提取方法，适用于工 业生产阿魏酸。
[0082] 实施例3耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的酶活及酶学特性测定
[0083] 将筛选得到的深绿木霉AWS26菌株进行发酵，发酵培养基配方为：PDA培养基 80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL，（NH4)2SO4Ig,补充去离子水至lOOmL。 121°C，15min灭菌。发酵条件为：发酵周期2-3d，发酵温度35-40°C，接种量4-8%，摇床转 速 160-200r/min。
[0084] 发酵结束后，将发酵液8000r/min离心20min去除菌体，并用0. 22ym滤除去残余 菌体和不溶物质，收集滤出液。按照硫酸铵饱和度75%，向以上发酵滤出液中添加硫酸铵， 充分溶解后，4°C静置过夜 ，8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲 溶液溶解，上样S印hedex G25分子筛凝胶柱脱盐，层析柱以pH6. 5的磷酸缓冲液平衡后以 相同缓冲溶液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗酶液。所得发酵液阿魏酸酯酶酶 活为：262U/L ;纤维素酶酶活为：915U/mL。
[0085] 酶活性测定方法为：
[0086] 发酵液的阿魏酸酯酶活力测定
[0087] 向2mL离心管中加入0. 5mL经过1-5倍稀释后的酶液，然后再加入0. 5mL阿魏酸 甲酯溶液，充分混匀，65°C保温20min。再加入ImL体积分数为10%的冰乙酸以终止反应。 样品于12000r/min离心10min。保留上清液，稀释2-4倍后，用高效液相色谱（HPLC)法测 定样品中的阿魏酸含量。以煮沸灭活的酶液作为对照组，处理方法同上。
[0088] 阿魏酸酯酶的酶活定义：在50°C，pH值为6. 5的条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯， 生成1 μ mol阿魏酸所需的酶量。阿魏酸采用高效液相色谱法测定。
[0089] 纤维素酶滤纸酶活力的测定方法：将新华定性滤纸剪成大小为IX6cm，置于离心 管中，加入pH4. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液lmL，于55°C温度的水浴锅中预热。加入酶液 500 μ L，保温反应60min。加入3mL的DNS试剂，沸水浴5min显色，放置冷水中冷却至室温。 吸取200 μ L反应上清液，在波长540nm处测定样品的吸光值，根据绘制的葡萄糖浓度标准 曲线计算出反应体系中的葡萄糖浓度。以煮沸灭活的酶液作为对照组，处理方法同上。
[0090] 纤维素酶的活力单位（U)定义为：在上述条件下，每分钟分解羧甲基纤维素钠生 成I ymol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U)。
[0091] 1.酶反应最适温度测定
[0092] 将反应体系分别置于 20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、 70°C、75°C、80°C的水浴，适度稀释后，分别测定阿魏酸酯酶酶和纤维素酶活力，研宄酶促反 应最适温度。以酶在最适温度下所测酶活为100%，其它温度下所测为对其相对酶活。结果 如图1所示，阿魏酸酯酶和纤维素酶随温度上升酶的变化趋势基本相同。从20°C到65°C阿 魏酸酯酶，随着温度升高酶活性逐渐增加，温度达到65°C时，酶活达到最大值。以后随着温 度升高，酶活逐渐降低，故酶的阿魏酸酯酶最适作用温度为65°C。而纤维素酶的温度分界点 是55°C，即纤维素酶的最适合作用温度是55°C。整体看两种酶都是高温酶，在45°C -70°C 之间两种酶的酶活都在80%以上，故在这个温度范围内复合酶制剂都会发挥高效的酶解作 用。
[0093] 2.酶作用最适pH测定
[0094] 酶制剂在不同pH(3. 0~9. 0)下进行酶促反应，测定阿魏酸酯酶和纤维素酶最适 作用pH。所用缓冲液为：pH2. 0~3. 0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，pH3. 0~4. 0柠檬酸磷酸 缓冲液，PH4. 0~5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5. 0~7. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲 液，pH7. 0~9. OTris-HCl缓冲溶液。以酶在最适pH值下所测酶活为100%，其它pH值下 所测为对其相对酶活。酶制剂在以上不同pH缓冲体系中，分别在65°C和55°C下测定阿魏 酸酯酶和纤维素酶酶活性，结果如图2所示，阿魏酸酯酶在pH3. 5~7. O之间酶活性在80% 以上，最适作用pH为4. 5。纤维素酶在pH4. 5-7. 0之间所测酶活均在90%以上，最适酶活 5. 5。整体看酶制剂两种酶在pH4. 5-7. 0之间酶活性都在80%以上，故酶制剂适合在酸性条 件下酶解反应。
[0095] 3.酶的热稳定性实验
[0096] 将溶于pH6. 5磷酸缓冲液的酶制剂在40°C _80°C的不同温度下保温4h后，立即冰 浴，适度稀释后，分别测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活力。以酶在最稳定温度下所测酶活 为100%，其它温度下所测为对其相对酶活。结果见图3所示，两种酶基本随温度的上升酶 活力逐渐降低，在温度高于60°C时，阿魏酸酯酶酶活性下降显著。两种酶在60°C以下，酶活 保存率都在80%以上；55°C以下，剩余酶活都在90%以上。复合酶制剂是耐高温型。
[0097] 4. pH值对酶稳定性的影响
[0098] 酶制剂在不同pH的缓冲液中，分别于40°C保温24h，然后分别测定阿魏酸酯酶和 纤维素酶酶活力，以酶在最稳定PH下所测酶活为100%，其它pH下所测为对其相对酶活。 结果见图4所示，40°C，pH3. 0-8. 0范围内24h阿魏酸酯酶酶活性基本不发生变化，活性稳 定，相对酶活均在95%以上。纤维素酶在pH4. 0-9. 0之间酶活性基本没有下降。整体看复 合酶制剂具有较广的酸碱稳定性，在酸性条件下性质更为稳定。
[0099] 5.酶制剂的保存时间对酶活性的影响
[0100] 将制备好的固体酶制剂分别在4°C和室温下保存，每一个月检测一次酶活力，共检 测6个月，查看酶活保留情况。结果如下表所示：
[0101]
[0102] 在半年时间内，4°C下阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活保存率都在90%以上，室温条件 下酶活也在80%以上，可以看出酶的稳定性好。
【主权项】
1. 一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（ atroririofe)AWS26,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏 编号：CGMCCNo. 8673。2. 权利要求1所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 ([ricAoofe/maatroFiriofe)AWS26在饲料原料降解中的应用。3. 权利要求1所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 (fricAoofe/maatrwiriofe)AWS26在发酵麦麸制备阿魏酸中的应用。4. 根据权利要求2所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 (atrwiriofe)AWS26在饲料原料降解中的应用，其特征在于：包括以下步骤： 将干燥的玉米秸杆粉l〇g、麸皮5g、硫酸铵lg、豆柏粉lg、硝酸铵0. 4g、NaC10. 5g、磷酸二氢 钾0. 2g和MgSO4O. 05g混合，按固液质量比1:1. 3加入去离子水，再接种菌株（ Wroriritfe)AWS26, 26-30°C培养 10 天。5. 根据权利要求3所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉 (atrwiri￡/e)AWS26在发酵麦麸制备阿魏酸中的应用，其特征在于：包括以下 步骤： 步骤1，将菌株（ZricAoofe/maatrwiriofe)AWS26孢子悬浮液接种到发酵培养基中， 30-35°C培养3-5d，中间翻曲2-3次； 步骤2,在步骤1所得麸曲中加入去离子水，搅拌，置于震荡摇床100r/min、5(TC浸提 2h，过滤，8000r/min离心20min，取上清液用饱和度为80% (NH4)2SO4盐析，4°C静置过夜， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用pH4. 0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，得到耐高温阿魏 酸酯酶和耐高温纤维素酶混合粗酶； 步骤3,将步骤2所得粗酶加入去淀粉麸皮，再加入水，调节pH4. 0，65°C酶解12h，得阿 魏酸。
【专利摘要】本发明公开了一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉及其应用，该深绿木霉（Trichoderma atroviride）AWS26，保藏编号为CGMCC No. 8673。本发明的深绿木霉具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸碱稳定性好。CGMCC No.867320140102
【IPC分类】C12N1/14, A23K1/14, C12R1/885, A23K1/00, A23K1/175, C12P7/42
【公开号】CN104893988
【申请号】CN201510268516
【发明人】高兆建, 张建萍, 刘恩岐, 侯进慧, 孙会刚, 徐大伟, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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