一种微生物复合制剂及其应用
一种微生物复合制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物修复领域，具体而言，涉及一种微生物复合制剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着生态环境的建设，我国关停矿区生态环境脆弱，立地环境条件差，修复成本 高，效果差，修复效果不稳定，甚至，严重污染的矿区还存在着危害矿区及周边居民生命与 生活的安全问题。目前的生态修复可采用物理方法固土、种植植物进行生态修复。
[0003] 然而，由于矿区产地条件差，有些矿区甚至没有土壤或水资源极为匮乏。常规生物 修复方法中植物种类选择单一、种植成活率低、有些不能够正常生长发育等。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种微生物复合制剂，所述的微生物复合制剂建立植 物与菌根真菌的共生关系，提高植物与菌根的共生程度，菌丝活化土壤中难溶性成分，促进 营养元素吸收，增大植物生物量等优点。
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种所述的微生物复合制剂的应用。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] -种微生物复合制剂，主要含有丛枝菌根真菌和地表球囊霉。
[0009] 本发明提供的微生物复合制剂，是将丛枝菌根真菌和地表球囊霉两者配合使用， 得到的微生物复合制剂使用效果明显好于单独使用丛枝菌根真菌菌剂或地表球囊霉菌剂 的使用效果，具有显著的促进生物量增加，改良土壤结构，修复土壤，降低重金属含量，克服 土壤重茬的效果。
[0010] 丛枝菌根真菌菌剂是常见的丛枝菌根真菌的生物制剂，同样地，地表球囊霉菌剂 是常见的地表球囊霉的生物制剂。丛枝菌根真菌菌剂和地表球囊霉菌剂按照现有的方法进 行制备或是通过市售购买均可。丛枝菌根真菌和地表球囊霉为现有技术公开的常见菌种， 可以从菌种保藏中心购买，也可以通过其他的途径购买即可。
[0011] 优选地，所述丛枝菌根真菌以丛枝菌根真菌菌剂的形式存在，所述地表球囊霉以 地表球囊霉菌剂的形式存在。
[0012] 为了增强丛枝菌根真菌和地表球囊霉之间的相互协同增强作用，以更好的增强丛 枝菌根真菌和地表球囊霉协同增强的效果，优选地，按重量份计，所述丛枝菌根真菌菌剂 3-8份，所述地表球囊霉菌剂1-5份。
[0013] 更优选地，按重量份计，所述丛枝菌根真菌菌剂5-7份，所述地表球囊霉菌剂2-3 份。
[0014] 进一步地，所述丛枝菌根真菌菌剂通过以下方法制备：
[0015] 以玉米为寄主，按重量份计，以0. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后， 接种丛枝菌根真菌，扩繁55-65天，得到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段 的混合接种剂即为所述丛枝菌根真菌菌剂。其中，丛枝菌根真菌的接种量为基质重量的 8% -15%〇
[0016] 进一步地，所述地表球囊霉菌剂通过以下方法制备：
[0017] 以玉米为寄主，按重量份计，以0. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后，接 种地表球囊霉，扩繁55-65天，得到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合 接种剂即为所述地表球囊霉菌剂。其中，地表球囊霉的接种量为基质重量的8% -15%。
[0018] 以玉米为寄主扩繁得到的丛枝菌根真菌菌剂和地表球囊霉菌剂菌之间的相容性 好，菌体生长旺盛，易于协同生长，并协同增强之间的相互效果。
[0019] 为了微生物复合制剂达到更好的效果，且易于保藏，优选地，所述微生物复合制剂 还包括辅料。
[0020] 具体地，按重量百分比计，所述辅料主要由以下原料制成：
[0021] 丙烯酰胺 60% -70%，丙烯酸钾 20% -25%，水 5% -10%，交联剂 0· 4% -0· 7%。
[0022] 更优选地，按重量百分比计，所述辅料主要由以下原料制成：
[0023] 丙烯酰胺65 %，丙烯酸钾23 %，水8 %，交联剂0. 5 %。
[0024] 进一步地，按重量份计，所述辅料为0. 5-1. 5份。
[0025] 本发明还提供了所述的微生物复合制剂在改善土壤中的应用。
[0026] 优选地，所述微生物复合制剂与种子配合使用，所述微生物复合制剂的使用量为 种子重量的20% -30%。
[0027] 微生物复合制剂主要有以下使用方式：
[0028] (1)种子消毒：将需用播种的种子用高锰酸钾2000-3000倍液消毒5分钟，用凉水 配制；
[0029] 接种活性菌剂：在播种时，在播种沟或穴内施用制剂，使用量为种子重量的 20-30%，先放微生物复合制剂后放种子于其上，之后按正常播种后进行管理。
[0030] (2)制剂拌种使用：将种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量 以形成稀糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后正常播种管理。
[0031] 本发明提供的微生物复合制剂的共生植物包括：
[0032] 除十字花科、藜科、苋科、灯芯草科、兰科、松科、柏科、山毛榉科、杨科、榛科之外的 蔷薇科、禾本科、萌芦科、茄科等大部分园艺植物。
[0033] 优选地，所述微生物复合制剂与除十字花科、藜科、苋科、灯芯草科、兰科、松科、柏 科、山毛榉科、杨科、榛科之外的园艺植物配合使用。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0035] (1)促进植物生长，增加磷吸收
[0036] 在煤矿等地立条件差的矿区，利用微生物制剂组合应用于不同的植物，根系形成 典型的菌根，菌丝扩大根系的吸收面积，增强根系对土壤难溶性营养的利用效率，促进植物 生物量增加，提高矿区植物修复的效果。
[0037] (2)降低土壤某些重金属含量，改良土壤结构
[0038] 通过使用本发明提供的微生物复合制剂，促进根系对土壤中重金属的吸收，矿区 土壤中镉、铅等重金属有一定的降低；菌根的形成还改善了根际土壤的结构，孔隙度和含水 量等有所提尚。
[0039] (3)克服重茬
[0040] 通过接种微生物制剂的幼苗定植于重茬土壤中，能够正常生长发育。
[0041] (4)建立植物与菌根真菌的共生关系，提高植物与菌根的共生程度，菌丝活化土壤 中难溶性成分，促进营养元素吸收，增大植物生物量。
【附图说明】
[0042] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0043] 图1为本发明实施例4中冰草菌根图（100X);
[0044] 图2为本发明实施例4中冰草菌根图（400X);
[0045] 图3为本发明实施例4中杏树菌根图（100X);
[0046] 图4为本发明实施例4中杏树菌根图（400X);
[0047] 图5为本发明实施例4中使用本发明提供的微生物复合制剂的草莓菌根图；
[0048] 图6为本发明实施例4中未使用本发明提供的微生物复合制剂的草莓菌根图。
【具体实施方式】
[0049] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售获得的常规产品。
[0050] 实施例1
[0051] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和Ikg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝菌根 真菌的接种量为基质重量的10 %，即丛枝菌根真菌的接种量为〇. 2kg，扩繁60天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂，备用；
[0052] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和Ikg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球囊霉 的接种量为基质重量的10%，即地表球囊霉的接种量为〇. 2kg，扩繁60天，得到的其中含有 真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0053] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺65%，丙烯酸钾23%，水7%，交联剂 0. 5 %，备用；
[0054] 取丛枝菌根真菌菌剂5kg，地表球囊霉菌剂3kg，辅料1kg，混匀即得微生物复合制 剂；
[0055] 草种子消毒：将需用播种的种子用高锰酸钾2000倍液消毒5分钟，用凉水配制；
[0056] 接种微生物复合制剂：在矿区播种，先在播种沟或穴内施用微生物复合制剂，使用 量为种子重量的20%，再将种子放于微生物复合制剂上，之后按正常播种后进行管理。
[0057] 同时，以不接种任何菌剂作为对照组1 ;以单独接种丛枝菌根真菌菌剂作为对照 组2 ;以单独接种地表球囊霉菌剂作为对照组3。
[0058] 1.改良土壤结构
[0059] 菌剂与种子混用2个月后，随机取土壤测定土壤容重、土壤孔隙度、含水量。具体 测定方法为：
[0060] I. 1 土壤含水量测定采用酒精燃烧法：用1/100天平称蒸发皿重量（A);取欲测 土样8-10g，迅速放入己知重量的蒸发皿中，用1/100天平称重（B);用滴管向蒸发皿中滴 加酒精，直到土面全部浸没即可，稍加振荡，使土样均匀分布于皿中；用火柴点燃酒精，待火 焰熄灭样品冷却后，再滴加 I. 5-2ml酒精进行第二次燃烧；待土样冷却后称重（C)，精确到 〇. Olg ；
[0061]
[0062] 式中：A-蒸发皿重（g);
[0063] B-湿土重加蒸发皿重（g);
[0064] C-干土重加蒸发皿重（g)。
[0065] 1. 2 土壤容重测定采用环刀法：利用一定体积的钢制环刀切割自然状况的土样， 使其充满其中，然后称量计算单位体积的烘干土重量。取干净的环刀（不带上部铁圈）放 入1/10天平上称重（A)，并准确计算环刀的容积（B);环刀上部套上铁圈，然后将刀刃一端 轻轻按入欲测土层中，使土装满并达到铁圈上缘，然后用剖面刀仔细挖出取土器，反置于小 木板上，用剖面刀将环刀周围土削净，并将刀刃一端削平，用小木板盖好，最后使土壤体积 与取土器体积完全相同；将带有土样的环刀放在1/10天平上称重（C)，再从环刀内取出10 左右土测定水分含量，换算成烘干土重；
[0066]
[0067] 式中：A-环刀重（g);
[0068] B-环刀体积（cm3);
[0069] C-环刀重加环刀内湿土重（g)。
[0070] 1. 3 土壤孔隙度测定：
[0071] 土壤孔隙度大小直接关系到土壤的通气和水分状况，是土壤的主要物理性质之 一。土壤总孔隙度一般都不直接测定，而是由土壤比重和容重间接计算求得。土壤比重是 单位体积的土壤重量与4°C时同体积水重量的比值。
[0072]
[0073] 测定的土壤结构的结果见表1。
[0074] 表1不同处理对土壤结构的影响
[0075]
[0076] 从表1可以看出，本发明提供的微生物复合制剂处理土壤后，土壤孔隙度增加，土 壤容重下降，含水量适中。
[0077] 2.矿区生草试验：第一茬草于7月上旬收获，不同处理菌根形成与第一茬草的生 物量见表2。
[0078] 表2不同处理菌根形成与第一茬草的生物量
[0079]
[0080] 从表2可以看出，使用本发明提供的微生物复合制剂处理后的矿区，草的菌根率 有了很大幅度的提尚，鲜生物量也有了大幅的提尚。
[0081] 在生长后期（8月份），牧草的生长量大，接种本发明提供的微生物复合制剂的第 二茬草平均6. 08g/株，未接种菌剂的对照为I. 41g/株，单独接种丛枝菌根真菌菌剂的对照 为3. Ig/株；单独接种地表球囊霉菌剂的对照为3. 4g/株。根据密度、单株重和其含水量计 算，每年割3次，使用本发明提供的微生物复合制剂处理总产草量可达1200-1600kg/亩，未 接种菌剂的对照为500-1100kg/亩，单独接种丛枝菌根真菌菌剂的对照为700-750kg/亩； 单独接种地表球囊霉菌剂的对照为720-780kg/亩。
[0082] 3.修复土壤，降低重金属含量
[0083] 土壤镉、铅的测定方法：采用电感耦合等离子发射光谱仪测定土壤中重金属 Cd (镉）和Pb (铅）的含量，称取菌剂与种子混用2个月后的测试土壤Ig于消化管内，加 入IOml浓硫酸，160°C过夜。260°C消化lh，320°C消化Ih后，加入双氧水4、5滴，320°C加 热lh，加入双氧水lml。重复5-6次后直到消化管内为残渣为止。将溶液用去离子水定容 至100mL用于元素测定。
[0084] 得到的结果如表3所示。
[0085] 表3不同处理土壤中重金属含量
[0086]
[0087] 从表3可以看出，应用本发明提供的微生物复合制剂后的土壤中重金属Cd和Pb 含量均有所下降。
[0088] 实施例2
[0089] 以玉米为寄主，以0.8kg草炭和1.5kg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝 菌根真菌的接种量为基质重量的15%，即丛枝菌根真菌的接种量为0. 345kg，扩繁55天，得 到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂， 备用；
[0090] 以玉米为寄主，以0. 8kg草炭和I. 5kg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球 囊霉的接种量为基质重量的15%，即地表球囊霉的接种量为0. 345kg，扩繁55天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0091] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺60%，丙烯酸钾20%，水5%，交联剂 0.4%，备用；
[0092] 取丛枝菌根真菌菌剂3kg，地表球囊霉菌剂5kg，辅料0. 5kg，混匀即得微生物复合 制剂；
[0093] 草种子消毒：将需用播种的种子用高锰酸钾3000倍液消毒5分钟，用凉水配制；
[0094] 接种微生物复合制剂：在矿区播种，先在播种沟或穴内施用微生物复合制剂，使用 量为种子重量的30%，再将种子放于微生物复合制剂上，之后按正常播种后进行管理。
[0095] 同时，以不接种任何菌剂作为对照组1 ;以单独接种丛枝菌根真菌菌剂作为对照 组2 ;以单独接种地表球囊霉菌剂作为对照组3。
[0096] 1.改良土壤结构
[0097] 测定方法同实施例1，结果与实施例1 一致。
[0098] 2.矿区生草试验
[0099] 测定方法同实施例1，结果与实施例1 一致。
[0100] 3.修复土壤，降低重金属含量
[0101] 测定方法同实施例1，结果与实施例1 一致。
[0102] 实施例3
[0103] 以玉米为寄主，以I. 5kg草炭和0. 8kg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝 菌根真菌的接种量为基质重量的8%，即丛枝菌根真菌的接种量为0. 184kg，扩繁65天，得 到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂， 备用；
[0104] 以玉米为寄主，以I. 5kg草 炭和0. 8kg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球 囊霉的接种量为基质重量的8%，即地表球囊霉的接种量为0. 184kg，扩繁65天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0105] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺70%，丙烯酸钾25%，水10%，交联剂 0. 7 %，备用；
[0106] 取丛枝菌根真菌菌剂8kg，地表球囊霉菌剂1kg，辅料I. 5kg，混匀即得微生物复合 制剂；
[0107] 将黄瓜种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀糊状 为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种于重茬的土壤中，正常管理。
[0108] 同时，以不接种任何菌剂作为对照组1 ;以单独接种丛枝菌根真菌菌剂作为对照 组2 ;以单独接种地表球囊霉菌剂作为对照组3。
[0109] 对种植的黄瓜指标进行测定，具体如表4所示。
[0110] 表4接种微生物复合制剂后黄瓜苗在重茬土壤生长量
[0111]
[0113] 从表4可以看出，本发明提供的微生物复合制剂种植于重茬的土壤中，定植后利 用微生物复合制剂的种苗地上生物量明显高于其他组。
[0114] 实施例4
[0115] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和1.2kg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝菌 根真菌的接种量为基质重量的10%，即丛枝菌根真菌的接种量为〇. 22kg，扩繁60天，得到 的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂，备 用；
[0116] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和I. 2kg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球囊 霉的接种量为基质重量的15%，即地表球囊霉的接种量为0. 33kg，扩繁60天，得到的其中 含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0117] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺65%，丙烯酸钾25%，水8%，交联剂 0. 5 %，备用；
[0118] 取丛枝菌根真菌菌剂5kg，地表球囊霉菌剂2kg，辅料1kg，混匀即得微生物复合制 剂；
[0119] 组I :将冰草种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀 糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种，正常管理；
[0120] 组2 :将杏树种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀 糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种，正常管理；
[0121] 组3 :将草莓种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀 糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种，正常管理。
[0122] 分别对冰草、杏树和草莓的菌根进行观察，菌根染色采用TBCTrypan Blue曲利 苯蓝）染色方法。TB染色方法具体操作为：将植物根段放入小瓶中，加入10% (w/v)KOH， 于90°C消化20分钟，倒掉KOH，再用水清洗，用2 % (v/v) HCl中和15分钟，倒掉HCl，加入 0.05% TB染料，于90°C染色10分钟。将染色的根段用清水洗净后，剪成0.5-1. Ocm的大 小，于解剖镜下观察并挑选感染根段。
[0123] 其中，冰草菌根图如图I(IOOX)和图2(400X)所示；
[0124] 杏树菌根图如图3 (100X)和图4 (400 X)所示；
[0125] 草莓菌根图如图5 (100X)和图6 (100X)所示，图5为使用本发明提供的微生物 复合制剂的菌根，图6为未施用本发明提供的微生物复合制剂的菌根。
[0126] 从图1和图2可以看出，冰草菌根有VA孢子和菌丝；从图3和图4可以看出，杏树 菌根有VA菌根；从图5可以看出，草莓形成的VA菌根，而未施用本发明提供的微生物复合 制剂则未形成VA菌根。
[0127] VA菌根能促进植物生长，其机制在于菌丝扩大了根系的养分吸收空间，促进植物 对矿质养分的吸收，尤其是对磷的吸收，VA菌根促进吸磷是由于菌根真菌活化土壤中的难 溶性无机磷酸盐、有机磷以及与解磷细菌的互作。说明本发明提供的微生物复合制剂具有 建立植物与菌根真菌的共生关系，提高植物与菌根的共生程度，菌丝活化土壤中难溶性成 分，促进营养元素吸收，增大植物生物量的作用。
[0128] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. 一种微生物复合制剂，其特征在于，主要含有丛枝菌根真菌和地表球囊霉。2. 根据权利要求1所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述丛枝菌根真菌以丛枝菌 根真菌菌剂的形式存在，所述地表球囊霉以地表球囊霉菌剂的形式存在； 按重量份计，所述丛枝菌根真菌菌剂3-8份，所述地表球囊霉菌剂1-5份。3. 根据权利要求2所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述丛枝菌根真菌菌剂通过 以下方法制备： 以玉米为寄主，按重量份计，以〇. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后，接种丛 枝菌根真菌，所述丛枝菌根真菌的接种量为基质重量的8%-15%，扩繁55-65天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即为所述丛枝菌根真菌菌剂。4. 根据权利要求2所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述地表球囊霉菌剂通过以 下方法制备： 以玉米为寄主，按重量份计，以〇. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后，接种地 表球囊霉，所述地表球囊霉的接种量为基质重量的8% -15%，扩繁55-65天，得到的其中含 有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即为所述地表球囊霉菌剂。5. 根据权利要求1所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述微生物复合制剂还包括 辅料。6. 根据权利要求5所述的微生物复合制剂，其特征在于，按重量百分比计，所述辅料主 要由以下原料制成： 丙烯酰胺60% -70%，丙烯酸钾20% -25%，水5% -10%，交联剂0? 4% -0? 7%。7. 根据权利要求6所述的微生物复合制剂，其特征在于，按重量份计，所述辅料为 0? 5-1. 5 份。8. 权利要求1-7任一项所述的微生物复合制剂在改善土壤中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物复合制剂与种子配合使用，所 述微生物复合制剂的使用量为种子重量的20% -30%。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物复合制剂与除十字花科、藜 科、苋科、灯芯草科、兰科、松科、柏科、山毛榉科、杨科、榛科之外的园艺植物配合使用。
【专利摘要】本发明涉及微生物修复领域，具体而言，涉及一种微生物复合制剂及其应用。一种微生物复合制剂，主要含有丛枝菌根真菌和地表球囊霉。本发明还提供了所述的微生物复合制剂在改善土壤中的应用。本发明提供的微生物复合制剂，是将丛枝菌根真菌和地表球囊霉两者配合使用，得到的微生物复合制剂使用效果明显好于单独使用丛枝菌根真菌菌剂或地表球囊霉菌剂的使用效果，具有显著的促进生物量增加，改良土壤结构，修复土壤，降低重金属含量，克服土壤重茬的效果。
【IPC分类】C12N1/14, C09K101/00, C12R1/645, A01N63/04, C09K17/00, A01P21/00
【公开号】CN104893991
【申请号】CN201510360012
【发明人】秦岭, 曹庆芹, 张卿, 邢宇, 房克凤, 闫伯前, 刘志强
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物修复领域，具体而言，涉及一种微生物复合制剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着生态环境的建设，我国关停矿区生态环境脆弱，立地环境条件差，修复成本 高，效果差，修复效果不稳定，甚至，严重污染的矿区还存在着危害矿区及周边居民生命与 生活的安全问题。目前的生态修复可采用物理方法固土、种植植物进行生态修复。
[0003] 然而，由于矿区产地条件差，有些矿区甚至没有土壤或水资源极为匮乏。常规生物 修复方法中植物种类选择单一、种植成活率低、有些不能够正常生长发育等。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种微生物复合制剂，所述的微生物复合制剂建立植 物与菌根真菌的共生关系，提高植物与菌根的共生程度，菌丝活化土壤中难溶性成分，促进 营养元素吸收，增大植物生物量等优点。
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种所述的微生物复合制剂的应用。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] -种微生物复合制剂，主要含有丛枝菌根真菌和地表球囊霉。
[0009] 本发明提供的微生物复合制剂，是将丛枝菌根真菌和地表球囊霉两者配合使用， 得到的微生物复合制剂使用效果明显好于单独使用丛枝菌根真菌菌剂或地表球囊霉菌剂 的使用效果，具有显著的促进生物量增加，改良土壤结构，修复土壤，降低重金属含量，克服 土壤重茬的效果。
[0010] 丛枝菌根真菌菌剂是常见的丛枝菌根真菌的生物制剂，同样地，地表球囊霉菌剂 是常见的地表球囊霉的生物制剂。丛枝菌根真菌菌剂和地表球囊霉菌剂按照现有的方法进 行制备或是通过市售购买均可。丛枝菌根真菌和地表球囊霉为现有技术公开的常见菌种， 可以从菌种保藏中心购买，也可以通过其他的途径购买即可。
[0011] 优选地，所述丛枝菌根真菌以丛枝菌根真菌菌剂的形式存在，所述地表球囊霉以 地表球囊霉菌剂的形式存在。
[0012] 为了增强丛枝菌根真菌和地表球囊霉之间的相互协同增强作用，以更好的增强丛 枝菌根真菌和地表球囊霉协同增强的效果，优选地，按重量份计，所述丛枝菌根真菌菌剂 3-8份，所述地表球囊霉菌剂1-5份。
[0013] 更优选地，按重量份计，所述丛枝菌根真菌菌剂5-7份，所述地表球囊霉菌剂2-3 份。
[0014] 进一步地，所述丛枝菌根真菌菌剂通过以下方法制备：
[0015] 以玉米为寄主，按重量份计，以0. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后， 接种丛枝菌根真菌，扩繁55-65天，得到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段 的混合接种剂即为所述丛枝菌根真菌菌剂。其中，丛枝菌根真菌的接种量为基质重量的 8% -15%〇
[0016] 进一步地，所述地表球囊霉菌剂通过以下方法制备：
[0017] 以玉米为寄主，按重量份计，以0. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后，接 种地表球囊霉，扩繁55-65天，得到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合 接种剂即为所述地表球囊霉菌剂。其中，地表球囊霉的接种量为基质重量的8% -15%。
[0018] 以玉米为寄主扩繁得到的丛枝菌根真菌菌剂和地表球囊霉菌剂菌之间的相容性 好，菌体生长旺盛，易于协同生长，并协同增强之间的相互效果。
[0019] 为了微生物复合制剂达到更好的效果，且易于保藏，优选地，所述微生物复合制剂 还包括辅料。
[0020] 具体地，按重量百分比计，所述辅料主要由以下原料制成：
[0021] 丙烯酰胺 60% -70%，丙烯酸钾 20% -25%，水 5% -10%，交联剂 0· 4% -0· 7%。
[0022] 更优选地，按重量百分比计，所述辅料主要由以下原料制成：
[0023] 丙烯酰胺65 %，丙烯酸钾23 %，水8 %，交联剂0. 5 %。
[0024] 进一步地，按重量份计，所述辅料为0. 5-1. 5份。
[0025] 本发明还提供了所述的微生物复合制剂在改善土壤中的应用。
[0026] 优选地，所述微生物复合制剂与种子配合使用，所述微生物复合制剂的使用量为 种子重量的20% -30%。
[0027] 微生物复合制剂主要有以下使用方式：
[0028] (1)种子消毒：将需用播种的种子用高锰酸钾2000-3000倍液消毒5分钟，用凉水 配制；
[0029] 接种活性菌剂：在播种时，在播种沟或穴内施用制剂，使用量为种子重量的 20-30%，先放微生物复合制剂后放种子于其上，之后按正常播种后进行管理。
[0030] (2)制剂拌种使用：将种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量 以形成稀糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后正常播种管理。
[0031] 本发明提供的微生物复合制剂的共生植物包括：
[0032] 除十字花科、藜科、苋科、灯芯草科、兰科、松科、柏科、山毛榉科、杨科、榛科之外的 蔷薇科、禾本科、萌芦科、茄科等大部分园艺植物。
[0033] 优选地，所述微生物复合制剂与除十字花科、藜科、苋科、灯芯草科、兰科、松科、柏 科、山毛榉科、杨科、榛科之外的园艺植物配合使用。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0035] (1)促进植物生长，增加磷吸收
[0036] 在煤矿等地立条件差的矿区，利用微生物制剂组合应用于不同的植物，根系形成 典型的菌根，菌丝扩大根系的吸收面积，增强根系对土壤难溶性营养的利用效率，促进植物 生物量增加，提高矿区植物修复的效果。
[0037] (2)降低土壤某些重金属含量，改良土壤结构
[0038] 通过使用本发明提供的微生物复合制剂，促进根系对土壤中重金属的吸收，矿区 土壤中镉、铅等重金属有一定的降低；菌根的形成还改善了根际土壤的结构，孔隙度和含水 量等有所提尚。
[0039] (3)克服重茬
[0040] 通过接种微生物制剂的幼苗定植于重茬土壤中，能够正常生长发育。
[0041] (4)建立植物与菌根真菌的共生关系，提高植物与菌根的共生程度，菌丝活化土壤 中难溶性成分，促进营养元素吸收，增大植物生物量。
【附图说明】
[0042] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0043] 图1为本发明实施例4中冰草菌根图（100X);
[0044] 图2为本发明实施例4中冰草菌根图（400X);
[0045] 图3为本发明实施例4中杏树菌根图（100X);
[0046] 图4为本发明实施例4中杏树菌根图（400X);
[0047] 图5为本发明实施例4中使用本发明提供的微生物复合制剂的草莓菌根图；
[0048] 图6为本发明实施例4中未使用本发明提供的微生物复合制剂的草莓菌根图。
【具体实施方式】
[0049] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售获得的常规产品。
[0050] 实施例1
[0051] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和Ikg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝菌根 真菌的接种量为基质重量的10 %，即丛枝菌根真菌的接种量为〇. 2kg，扩繁60天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂，备用；
[0052] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和Ikg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球囊霉 的接种量为基质重量的10%，即地表球囊霉的接种量为〇. 2kg，扩繁60天，得到的其中含有 真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0053] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺65%，丙烯酸钾23%，水7%，交联剂 0. 5 %，备用；
[0054] 取丛枝菌根真菌菌剂5kg，地表球囊霉菌剂3kg，辅料1kg，混匀即得微生物复合制 剂；
[0055] 草种子消毒：将需用播种的种子用高锰酸钾2000倍液消毒5分钟，用凉水配制；
[0056] 接种微生物复合制剂：在矿区播种，先在播种沟或穴内施用微生物复合制剂，使用 量为种子重量的20%，再将种子放于微生物复合制剂上，之后按正常播种后进行管理。
[0057] 同时，以不接种任何菌剂作为对照组1 ;以单独接种丛枝菌根真菌菌剂作为对照 组2 ;以单独接种地表球囊霉菌剂作为对照组3。
[0058] 1.改良土壤结构
[0059] 菌剂与种子混用2个月后，随机取土壤测定土壤容重、土壤孔隙度、含水量。具体 测定方法为：
[0060] I. 1 土壤含水量测定采用酒精燃烧法：用1/100天平称蒸发皿重量（A);取欲测 土样8-10g，迅速放入己知重量的蒸发皿中，用1/100天平称重（B);用滴管向蒸发皿中滴 加酒精，直到土面全部浸没即可，稍加振荡，使土样均匀分布于皿中；用火柴点燃酒精，待火 焰熄灭样品冷却后，再滴加 I. 5-2ml酒精进行第二次燃烧；待土样冷却后称重（C)，精确到 〇. Olg ；
[0061]
[0062] 式中：A-蒸发皿重（g);
[0063] B-湿土重加蒸发皿重（g);
[0064] C-干土重加蒸发皿重（g)。
[0065] 1. 2 土壤容重测定采用环刀法：利用一定体积的钢制环刀切割自然状况的土样， 使其充满其中，然后称量计算单位体积的烘干土重量。取干净的环刀（不带上部铁圈）放 入1/10天平上称重（A)，并准确计算环刀的容积（B);环刀上部套上铁圈，然后将刀刃一端 轻轻按入欲测土层中，使土装满并达到铁圈上缘，然后用剖面刀仔细挖出取土器，反置于小 木板上，用剖面刀将环刀周围土削净，并将刀刃一端削平，用小木板盖好，最后使土壤体积 与取土器体积完全相同；将带有土样的环刀放在1/10天平上称重（C)，再从环刀内取出10 左右土测定水分含量，换算成烘干土重；
[0066]
[0067] 式中：A-环刀重（g);
[0068] B-环刀体积（cm3);
[0069] C-环刀重加环刀内湿土重（g)。
[0070] 1. 3 土壤孔隙度测定：
[0071] 土壤孔隙度大小直接关系到土壤的通气和水分状况，是土壤的主要物理性质之 一。土壤总孔隙度一般都不直接测定，而是由土壤比重和容重间接计算求得。土壤比重是 单位体积的土壤重量与4°C时同体积水重量的比值。
[0072]
[0073] 测定的土壤结构的结果见表1。
[0074] 表1不同处理对土壤结构的影响
[0075]
[0076] 从表1可以看出，本发明提供的微生物复合制剂处理土壤后，土壤孔隙度增加，土 壤容重下降，含水量适中。
[0077] 2.矿区生草试验：第一茬草于7月上旬收获，不同处理菌根形成与第一茬草的生 物量见表2。
[0078] 表2不同处理菌根形成与第一茬草的生物量
[0079]
[0080] 从表2可以看出，使用本发明提供的微生物复合制剂处理后的矿区，草的菌根率 有了很大幅度的提尚，鲜生物量也有了大幅的提尚。
[0081] 在生长后期（8月份），牧草的生长量大，接种本发明提供的微生物复合制剂的第 二茬草平均6. 08g/株，未接种菌剂的对照为I. 41g/株，单独接种丛枝菌根真菌菌剂的对照 为3. Ig/株；单独接种地表球囊霉菌剂的对照为3. 4g/株。根据密度、单株重和其含水量计 算，每年割3次，使用本发明提供的微生物复合制剂处理总产草量可达1200-1600kg/亩，未 接种菌剂的对照为500-1100kg/亩，单独接种丛枝菌根真菌菌剂的对照为700-750kg/亩； 单独接种地表球囊霉菌剂的对照为720-780kg/亩。
[0082] 3.修复土壤，降低重金属含量
[0083] 土壤镉、铅的测定方法：采用电感耦合等离子发射光谱仪测定土壤中重金属 Cd (镉）和Pb (铅）的含量，称取菌剂与种子混用2个月后的测试土壤Ig于消化管内，加 入IOml浓硫酸，160°C过夜。260°C消化lh，320°C消化Ih后，加入双氧水4、5滴，320°C加 热lh，加入双氧水lml。重复5-6次后直到消化管内为残渣为止。将溶液用去离子水定容 至100mL用于元素测定。
[0084] 得到的结果如表3所示。
[0085] 表3不同处理土壤中重金属含量
[0086]
[0087] 从表3可以看出，应用本发明提供的微生物复合制剂后的土壤中重金属Cd和Pb 含量均有所下降。
[0088] 实施例2
[0089] 以玉米为寄主，以0.8kg草炭和1.5kg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝 菌根真菌的接种量为基质重量的15%，即丛枝菌根真菌的接种量为0. 345kg，扩繁55天，得 到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂， 备用；
[0090] 以玉米为寄主，以0. 8kg草炭和I. 5kg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球 囊霉的接种量为基质重量的15%，即地表球囊霉的接种量为0. 345kg，扩繁55天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0091] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺60%，丙烯酸钾20%，水5%，交联剂 0.4%，备用；
[0092] 取丛枝菌根真菌菌剂3kg，地表球囊霉菌剂5kg，辅料0. 5kg，混匀即得微生物复合 制剂；
[0093] 草种子消毒：将需用播种的种子用高锰酸钾3000倍液消毒5分钟，用凉水配制；
[0094] 接种微生物复合制剂：在矿区播种，先在播种沟或穴内施用微生物复合制剂，使用 量为种子重量的30%，再将种子放于微生物复合制剂上，之后按正常播种后进行管理。
[0095] 同时，以不接种任何菌剂作为对照组1 ;以单独接种丛枝菌根真菌菌剂作为对照 组2 ;以单独接种地表球囊霉菌剂作为对照组3。
[0096] 1.改良土壤结构
[0097] 测定方法同实施例1，结果与实施例1 一致。
[0098] 2.矿区生草试验
[0099] 测定方法同实施例1，结果与实施例1 一致。
[0100] 3.修复土壤，降低重金属含量
[0101] 测定方法同实施例1，结果与实施例1 一致。
[0102] 实施例3
[0103] 以玉米为寄主，以I. 5kg草炭和0. 8kg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝 菌根真菌的接种量为基质重量的8%，即丛枝菌根真菌的接种量为0. 184kg，扩繁65天，得 到的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂， 备用；
[0104] 以玉米为寄主，以I. 5kg草 炭和0. 8kg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球 囊霉的接种量为基质重量的8%，即地表球囊霉的接种量为0. 184kg，扩繁65天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0105] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺70%，丙烯酸钾25%，水10%，交联剂 0. 7 %，备用；
[0106] 取丛枝菌根真菌菌剂8kg，地表球囊霉菌剂1kg，辅料I. 5kg，混匀即得微生物复合 制剂；
[0107] 将黄瓜种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀糊状 为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种于重茬的土壤中，正常管理。
[0108] 同时，以不接种任何菌剂作为对照组1 ;以单独接种丛枝菌根真菌菌剂作为对照 组2 ;以单独接种地表球囊霉菌剂作为对照组3。
[0109] 对种植的黄瓜指标进行测定，具体如表4所示。
[0110] 表4接种微生物复合制剂后黄瓜苗在重茬土壤生长量
[0111]
[0113] 从表4可以看出，本发明提供的微生物复合制剂种植于重茬的土壤中，定植后利 用微生物复合制剂的种苗地上生物量明显高于其他组。
[0114] 实施例4
[0115] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和1.2kg沙为基质灭菌后，接种丛枝菌根真菌，丛枝菌 根真菌的接种量为基质重量的10%，即丛枝菌根真菌的接种量为〇. 22kg，扩繁60天，得到 的其中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到丛枝菌根真菌菌剂，备 用；
[0116] 以玉米为寄主，以Ikg草炭和I. 2kg沙为基质灭菌后，接种地表球囊霉，地表球囊 霉的接种量为基质重量的15%，即地表球囊霉的接种量为0. 33kg，扩繁60天，得到的其中 含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即得到地表球囊霉菌剂，备用；
[0117] 按以下重量百分比制成辅料，丙烯酰胺65%，丙烯酸钾25%，水8%，交联剂 0. 5 %，备用；
[0118] 取丛枝菌根真菌菌剂5kg，地表球囊霉菌剂2kg，辅料1kg，混匀即得微生物复合制 剂；
[0119] 组I :将冰草种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀 糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种，正常管理；
[0120] 组2 :将杏树种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀 糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种，正常管理；
[0121] 组3 :将草莓种子与微生物复合制剂按照10:2比例放入洁净水中，用量以形成稀 糊状为适度，种子表面形成粘着为宜，之后播种，正常管理。
[0122] 分别对冰草、杏树和草莓的菌根进行观察，菌根染色采用TBCTrypan Blue曲利 苯蓝）染色方法。TB染色方法具体操作为：将植物根段放入小瓶中，加入10% (w/v)KOH， 于90°C消化20分钟，倒掉KOH，再用水清洗，用2 % (v/v) HCl中和15分钟，倒掉HCl，加入 0.05% TB染料，于90°C染色10分钟。将染色的根段用清水洗净后，剪成0.5-1. Ocm的大 小，于解剖镜下观察并挑选感染根段。
[0123] 其中，冰草菌根图如图I(IOOX)和图2(400X)所示；
[0124] 杏树菌根图如图3 (100X)和图4 (400 X)所示；
[0125] 草莓菌根图如图5 (100X)和图6 (100X)所示，图5为使用本发明提供的微生物 复合制剂的菌根，图6为未施用本发明提供的微生物复合制剂的菌根。
[0126] 从图1和图2可以看出，冰草菌根有VA孢子和菌丝；从图3和图4可以看出，杏树 菌根有VA菌根；从图5可以看出，草莓形成的VA菌根，而未施用本发明提供的微生物复合 制剂则未形成VA菌根。
[0127] VA菌根能促进植物生长，其机制在于菌丝扩大了根系的养分吸收空间，促进植物 对矿质养分的吸收，尤其是对磷的吸收，VA菌根促进吸磷是由于菌根真菌活化土壤中的难 溶性无机磷酸盐、有机磷以及与解磷细菌的互作。说明本发明提供的微生物复合制剂具有 建立植物与菌根真菌的共生关系，提高植物与菌根的共生程度，菌丝活化土壤中难溶性成 分，促进营养元素吸收，增大植物生物量的作用。
[0128] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. 一种微生物复合制剂，其特征在于，主要含有丛枝菌根真菌和地表球囊霉。2. 根据权利要求1所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述丛枝菌根真菌以丛枝菌 根真菌菌剂的形式存在，所述地表球囊霉以地表球囊霉菌剂的形式存在； 按重量份计，所述丛枝菌根真菌菌剂3-8份，所述地表球囊霉菌剂1-5份。3. 根据权利要求2所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述丛枝菌根真菌菌剂通过 以下方法制备： 以玉米为寄主，按重量份计，以〇. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后，接种丛 枝菌根真菌，所述丛枝菌根真菌的接种量为基质重量的8%-15%，扩繁55-65天，得到的其 中含有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即为所述丛枝菌根真菌菌剂。4. 根据权利要求2所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述地表球囊霉菌剂通过以 下方法制备： 以玉米为寄主，按重量份计，以〇. 8-1. 5份草炭和0. 8-1. 5份沙为基质灭菌后，接种地 表球囊霉，所述地表球囊霉的接种量为基质重量的8% -15%，扩繁55-65天，得到的其中含 有真菌的孢子、菌丝、和被浸染的根段的混合接种剂即为所述地表球囊霉菌剂。5. 根据权利要求1所述的微生物复合制剂，其特征在于，所述微生物复合制剂还包括 辅料。6. 根据权利要求5所述的微生物复合制剂，其特征在于，按重量百分比计，所述辅料主 要由以下原料制成： 丙烯酰胺60% -70%，丙烯酸钾20% -25%，水5% -10%，交联剂0? 4% -0? 7%。7. 根据权利要求6所述的微生物复合制剂，其特征在于，按重量份计，所述辅料为 0? 5-1. 5 份。8. 权利要求1-7任一项所述的微生物复合制剂在改善土壤中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物复合制剂与种子配合使用，所 述微生物复合制剂的使用量为种子重量的20% -30%。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物复合制剂与除十字花科、藜 科、苋科、灯芯草科、兰科、松科、柏科、山毛榉科、杨科、榛科之外的园艺植物配合使用。
【专利摘要】本发明涉及微生物修复领域，具体而言，涉及一种微生物复合制剂及其应用。一种微生物复合制剂，主要含有丛枝菌根真菌和地表球囊霉。本发明还提供了所述的微生物复合制剂在改善土壤中的应用。本发明提供的微生物复合制剂，是将丛枝菌根真菌和地表球囊霉两者配合使用，得到的微生物复合制剂使用效果明显好于单独使用丛枝菌根真菌菌剂或地表球囊霉菌剂的使用效果，具有显著的促进生物量增加，改良土壤结构，修复土壤，降低重金属含量，克服土壤重茬的效果。
【IPC分类】C12N1/14, C09K101/00, C12R1/645, A01N63/04, C09K17/00, A01P21/00
【公开号】CN104893991
【申请号】CN201510360012
【发明人】秦岭, 曹庆芹, 张卿, 邢宇, 房克凤, 闫伯前, 刘志强
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
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