一种灵芝菌的深层发酵方法
一种灵芝菌的深层发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药用真菌深层发酵生产技术及生物医药领域，具体涉及一种灵芝菌的 深层发酵方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝（Ganoderma Iucidum)是担子菌纲多孔菌科（Polyporaceae)灵芝属 (Ganodelma)真菌赤芝G. Iucidum .karst和紫芝G. japonicrnLloyd的总称，具有扶正固 本等功效，被《本经》称为上品。近年来，对灵芝属真菌的化学成分及临床研宄颇多，对灵芝 的生殖细胞一一孢子药用价值的研宄也颇受重视。
[0003] 灵芝孢子褐色，卵形，一端平截，（8. 5~IL 2) μ mX (5. 2~6.9) μ m，具双层壁。 在每个孢子的褐色内层产生许多针状小突起，深深地伸入孢子壁的透明外层，外层孢壁光 滑。灵芝孢子包裹的两层壁十分坚韧，一般的化学，物理方法很难将其打破，故限制了对其 化学成分、生物活性成分的研宄。
[0004] 灵芝在全国最大的原始森林，长白山和海南自然保护区最适宜生长。但是由于多 年来人类的过度采摘，野生灵芝的存量越来越少。灵芝对多种理化及生物因素引起的肝损 伤有保护作用。无论在肝脏损害发生前还是发生后，服用灵芝都可保护肝脏，减轻肝损伤。 灵芝能促进肝脏对药物、毒物的代谢，对于中毒性肝炎有确切的疗效。尤其是慢性肝炎，灵 芝可明显消除头晕、乏力、恶心、肝区不适等症状，并可有效地改善肝功能，使各项指标趋于 正常。所以，灵芝可用于治疗慢性中毒、各类慢性肝炎、肝硬化、肝功能障碍。灵芝可有效地 扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，改善心肌微循环，增强心肌氧和能量的供给，因此，对心肌 缺血具有保护作用，可广泛用于冠心病、心绞痛等的治疗和预防。另外，服用灵芝后可取代 胰岛素抑制脂肪酸的释出，可改善血糖、尿糖等症状。灵芝中的水溶性多糖，可减轻非胰岛 素依赖型糖尿病的发病程度。
[0005] 灵芝属的化学成分较为复杂，且因所用菌种、菌种产地、栽培方法、提取工艺、制剂 方法不同而各异。灵芝属的子实体、菌丝体和孢子中含有多糖类、核苷类、呋喃类衍生物、留 酵类、生物碱类、蛋白质、多肽、氨基酸类、三萜类、倍半萜、有机锗、无机盐等。灵芝多糖是灵 芝的主要有效成分之一。
[0006] 灵芝一般生长在湿度高且光线昏暗的山林中，主要生长在腐树或是其树木的根 部。灵芝不是植物，自身不能进行光合作用，只能从其他有机物或是腐树中摄取养料。灵芝 是一种坚硬、多孢子和微带苦涩的大型真菌。当达到成熟期的灵芝就会喷出粉状的孢子，从 而进行繁殖。现在野生的灵芝已经很少见，且质量不容易控制。
[0007] 灵芝及灵芝生物活性物质因其独特的理化特性和神奇的生物学功能而成为新型 的保健食品和药品领域的研宄热点。然而，人工栽培灵芝的生长周期长(大于2~3个月）， 受环境影响大，产量低、品质不稳定，生产成本高，极大地影响了灵芝及其生物活性物质在 健康产业中的发展。因此，近年来运用生物工程技术，对灵芝菌液体深层发酵培养的研宄， 获得灵芝菌丝体及其活性生长代谢产物(灵芝酸、灵芝多糖等)，并通过发酵条件的控制，缩 短生产周期，降低生产成本，使灵芝及其生物活性物质在食品和药品中得到应用和推广。
[0008] 人参(学名：Panax ginseng)，是具有肉质的根，可药用。人参属于五加科，主要生 长在东亚，特别是寒冷地区。人参是常见药材，用于愈后恢复、增强体力、调节荷尔蒙、降低 血糖和控制血压、控制肝指数和肝功能保健等。人参根部所含皂苷是其有效成分，中国长白 山野参皂苷成分较高，但取得不易，价格高昂。人参营养成分含量（每100克）热量80.0 大卡碳水化合物21. 2克脂肪0. 7克蛋白质0. 6克纤维素3. 5克，既是产生发酵培养基碳源 和氮源的有效物质，又可促进衍生营养成分的代谢产物。
[0009] 蜂花粉(学名POLLEN)，花粉含有多种营养物质，其中包括22种氨基酸、14种维生 素和30多种微量元素以及大量的活性蛋白酶、核酸、黄酮类化合物及其它活性物质。花粉 富含的蛋白质蛋白质20 % -25 %，氨基酸总量20 %以上，游离氨基酸1 % -2 %，碳水化合物 40% -50%，脂肪5% -10% ;还有丰富的天然维生素、微量元素、酶类、激素、生物活性物质 等多种营养物质。特别是B族维生素的含量极为丰富。每100克花粉含硫胺素600微克， 核黄素1670微克，吡哆醇900微克，泛酸2700微克，烟酸10000微克。它含有多种矿物质， 这些矿物质中，一些元素的含量分别是：钾20~40%、镁1~20%、钙1~15%、铁1~12%、 硅2~10%、磷1~20%。以及大量的的活性蛋白酶、核酸、黄酮类化合物及其它活性物质等。 作为复合碳源氮源进行发酵培养时，有利于菌丝体生长。
[0010] 灵芝孢子粉(英文名：Ganoderma spore)。灵芝孢子粉粗蛋白含量为18. 12%，氨基 酸含量为5. 869%，粗脂肪含量为20. 39%。不饱和脂肪酸是优势脂肪酸.以油酸，亚油酸为 主。还含有丰富的三萜类化合物、多种有益矿物元素。以灵芝孢子粉灵芝深层发酵培养基 的原料之一，能够促进菌丝体胞外多糖合成的前体诱导物而促使胞外多糖的大量合成。其 生物量、粗多糖及粗灵芝酸含量均较高，有利于灵芝活性物质（灵芝酸）的形成和灵芝酸含 量的提尚。
[0011] 茯苓(学名Wolfiporia cocos)。茯苓营养丰富，每100克茯苓的营养成分：能量16 千卡、蛋白质1. 2克、脂肪0. 5克、碳水化合物82. 6克、膳食纤维80. 9克、核黄素0. 12克、 钾58毫克、钠1毫克、钙2毫克、镁8毫克、铁9. 4毫克、锰1. 39毫克、锌0. 44毫克铜0. 23 毫克磷32毫克、硒4. 55微克、烟酸0. 4毫克等等。将茯苓粉作为中药培养基原料，可以促 进灵芝多糖的合成，有利于灵芝多糖含量的提高。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种灵芝菌的深层发酵方法，具有目的产物的产量高、质 量稳定、菌丝体生长良好、发酵周期短、生产工艺简单、提取得率高、营养物质丰富、成本低 等特点，是一项经济效益显著的环保型的药用真菌深层发酵技术，具有显著的开发应用前 景。
[0013] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 将接种的斜面放于26-28°C下培养5-7d ; (2) 将长满菌丝体的斜面接种于液体培养基，于摇床转速80-100r/min，冲程7-8cm往 复震荡，26-28 °C振荡培养2-3d，制成种子悬浮液； (3) 种子罐种子培养，按种量15%-20%、温度27-30°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速 度160-180r/min，无菌空气通气量为每分钟2. 5m3,罐压0. 04MPa，发酵培养48-72h ;pH降至 4. 5-5. 0 ； (4) 发酵罐发酵培养：接种量25-30%，温度27-30°C，搅拌速度为150-200r/min，无菌 空气通气量为每分钟2m 3,罐压0. 05MPa，培养48-72h ;发酵液变稠，菌体开始自溶，pH降至 3. 0-3. 5,残糖量降至 0· 2-0. 3% ; (5) 酶解：加入复合蛋白酶0. 5%，淀粉酶0. 75%，纤维素酶0. 75% ;蛋白酶为2X105u/kg， 淀粉酶为I. 〇Xl〇5u/kg，纤维素酶为I. 5X105u/kg ;温度55-60°C，时间3-4h。
[0014] 斜面培养基：马铃薯煮汁1000 mU脱脂奶粉30g、葡萄糖30g、琼脂30g、蛋白胨 30g、酵母膏5g、硫酸镁0· 2g、维生素 BI 0· lg，pH自然； 深层发酵培养基，按重量百分数计：人参粉2. 0%、蜂花粉2. 0%、灵芝孢子粉1. 0%、茯苓 粉1. 0%、大豆粉2. 0%、酵母粉0. 5%、葡萄糖3. 0%、硫酸镁0. 2%、磷酸氢二钾0. 3%、氯化钠 0. 2%、维生素 Bl 0. 1%、山茶油0. 3%，余量为水，pH=6-7,粉末细度：80-100目。
[0015] 发酵产物的提取方法包括以下步骤： (1) 高压均质处理：经酶解处理的发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速800-1000r/ min，使菌丝体颗粒崩解，达到均质，再经高压均质机，使发酵液在40MPa-60MPa高压作用下 通过200目膜过滤； (2) 超临界0)2萃取：在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有 选择性地把沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取析出有效活性物质； (3) 发酵液浓缩：将发酵液浓缩至浓度Brix=28-32% ; (4) 采用真空冷冻干燥，冷阱温度< -60°C，获得发酵产物灵芝多糖和灵芝三萜活性物 质干粉制品。
[0016] 本发明的显著优点在于：选用人参、蜂花粉、灵芝孢子粉和茯苓等天然中草药原料 作为灵芝菌深层发酵培养基，具有目的产物的产量高、质量稳定、菌丝体生长良好、发酵周 期短、生产工艺简单、提取得率高、营养物质丰富、成本低等特点，是一项经济效益显著的环 保型的药用真菌深层发酵技术，具有显著的 开发应用前景。
[0017] 采用天然植物人参粉、蜂花粉、灵芝孢子粉、茯苓粉等中草药作为灵芝菌深层发酵 培养基的原料，优化培养基营养物质，充分利用氮源、碳源，促进灵芝菌丝体生长，提高获得 大量菌体与代谢产物，大幅提高灵芝多糖和三萜等有效活性成分的含量。采用天然植物人 参粉、蜂花粉、灵芝孢子粉、茯苓粉等中草药作为灵芝菌深层发酵培养基，并采用超临界CO 2 萃取、酶解工艺，提取灵芝多醣和三萜尚未见有相关报道。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 : 菌种：由中国长白山野生灵芝组织分离选育的菌株菌种。
[0019] 灵芝菌的深层发酵培养方法和发酵产物干粉提取制备方法： 1、配制斜面培养基：马铃薯煮汁1000ml、脱脂奶粉30g、葡萄糖30g、琼脂30g、蛋白胨 30g、酵母膏5g、硫酸镁0· 2g、维生素 BI 0· lg，pH自然。
[0020] 2、斜面菌种培养：将优质菌种接种在固体斜面培养基上，放于26-28°C下培养 5-7d，菌丝体长满斜面，微带白色，菌种生长旺盛。
[0021] 3、三角瓶摇瓶培养：将斜面菌种移入盛200ml液体培养基的三角瓶中，采用摇床 转速80-100r/min，冲程7-8cm往复震荡，26-28°C振荡培养2-3d，长满白色的菌丝，制成种 子悬浮液。
[0022] 4、配制深层发酵培养基。按以下重量百分比配制液体培养基：深层发酵培养基(按 重量百分比）：人参粉2. 0%、蜂花粉2. 0%、灵芝孢子粉1. 0%、茯苓粉1. 0%、大豆粉2. 0%、酵母 粉0. 5%、葡萄糖3. 0%、硫酸镁0. 2%、磷酸氢二钾0. 3%、氯化钠0. 2%、维生素 Bl 0. 1%、山茶油 0. 3%，余量：水，pH :6. 5,粉末细度：80-100目。（蜂花粉选用茶花蜂花粉） 按上述重量百分比，取人参粉6000g、蜂花粉6000g、灵芝孢子粉3000g、茯苓粉3000g、 大豆粉6000g、酵母粉1500g、葡萄糖9000g、硫酸镁600g、磷酸氢二钾900g、氯化钠600g、维 生素 BI 300g、山茶油900g，余量：水，pH :6. 5,粉末细度：80-100目。配制液体培养基。培 养基在120-125°C条件下灭菌30min，冷却后备用。（蜂花粉选用茶花蜂花粉） 5、种子罐种子扩大培养(一级发酵）:种子罐采用500L不锈钢罐，投料300L。将种子悬 浮液移入种子罐，进行种子扩大培养，按种量17. 5%、温度27-30?，光照条件：连续黑暗条 件，搅拌速度160-180r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0. 4m3v/v，min，罐压0. 04MPa，发酵 培养56h ;pH降至4. 7,种子罐菌种培养成熟。
[0023] 6、发酵罐深层发酵培养(二级发酵):发酵罐采用5000L不锈钢罐，投料3000L。按种 量27. 5%、温度27-30°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速度160-180r/min，无菌空气通气 量为每分钟1: 〇. 4m3v/v，min，罐压0. 04MPa，发酵培养60h ;pH降至3. 3,残糖量降至0. 25%， 发酵结束，形成深层发酵菌丝液。
[0024] 7、酶解：按重量百分比，加入复合蛋白酶0. 5%，淀粉酶0. 75%，纤维素酶0. 75%， 蛋白酶为2X105u/kg，淀粉酶为1.0X105u/kg，纤维素酶为1.5X10 5u/kg。温度保持在 55-60°C，酶解时间 3. 5h。
[0025] 8、高压均质处理：经酶解处理的发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速SOO-1000 r/ min。使菌丝体等物料颗粒崩解，达到均质，再经高压均质机（40MPa-60MPa)，使发酵液在高 压作用下通过200目膜过滤。
[0026] 9、超临界CO2萃取，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，在超临界状 态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把沸点高低和分子量大小 不同的成分依次萃取析出有效活性物质。
[0027] 10、发酵液浓缩，采用双效浓缩器，蒸发温度55_70°C，蒸汽压力0. 25MPa，将发酵 液液体浓缩至浓度Brix=30%。
[0028] 11、真空冷冻干燥，采用工作真空度< 130Pa，冷阱温度<-60°C的真空冷冻干燥 设备，获的发酵产物活性物质干粉。
[0029] 12、经计量测定获得发酵产物活性物质干粉计106. 5kg，得率为35. 5g/L。（干粉实 测含水量为5. 0%)。
[0030] 按上述实施方法和配比再重复生产，实施例2和实施例3 : 实施例2,经计量测定获得发酵产物活性物质干粉计108. 5kg，得率为36. 2g/L。（干粉 实测含水量为5. 0%)。
[0031] 实施例3，经计量测定获得发酵产物活性物质干粉计107. 8kg，得率为35. 9g/L。 (干粉实测含水量为5. 0%)。
[0032] 表1灵芝菌发酵干粉主要成分及含量（g/lOOg干重）
上述主要成分检测标准与方法： 1、多糖体（以葡萄糖计)，苯酚-硫酸法。
[0033] 2、总三萜（以熊果酸计)，紫外分光光度测定法。
[0034] 3、蛋白质（以干基计，NX6. 25)，采用GB5009-2010标准检测。
[0035] 4、氨基酸采用GB/T 5009. 124-2003氨基酸自动分析仪测定食物中氨基酸的方法 测定。
[0036] 5、可溶性膳食纤维，采用GB/T5009. 88标准测定方法。
[0037] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 将接种的斜面放于26-28°C下培养5-7d; (2) 将长满菌丝体的斜面接种于液体培养基，于摇床转速80-100r/min，冲程7-8cm往 复震荡，26-28 °C振荡培养2-3d，制成种子悬浮液； (3) 种子罐种子培养，按种量15%-20%、温度27-30°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速 度160-180r/min，无菌空气通气量为每分钟2. 5m3,罐压0. 04MPa，发酵培养48-72h;pH降至 4. 5-5. 0 ； (4)发酵罐发酵培养：接种量25-30%，温度27-30°C，搅拌速度为150-200r/min，无菌 空气通气量为每分钟2m3,罐压0. 05MPa，培养48-72h ;发酵液变稠，菌体开始自溶，pH降至 3. 0-3. 5,残糖量降至0? 2-0. 3% ; (5)酶解：加入复合蛋白酶0. 5%，淀粉酶0. 75%，纤维素酶0. 75%;蛋白酶为2X105u/kg， 淀粉酶为I. 〇X105u/kg，纤维素酶为I. 5X105u/kg ;温度55-60°C，时间3-4h。2. 根据权利要求1所述的灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：斜面培养基：马铃薯煮 汁1000 mU脱脂奶粉30g、葡萄糖30g、琼脂30g、蛋白胨30g、酵母膏5g、硫酸镁0. 2g、维生素 Bl0?lg，pH自然； 深层发酵培养基，按重量百分数计：人参粉2. 0%、蜂花粉2. 0%、灵芝孢子粉1. 0%、茯苓 粉1. 0%、大豆粉2. 0%、酵母粉0. 5%、葡萄糖3. 0%、硫酸镁0. 2%、磷酸氢二钾0. 3%、氯化钠 0. 2%、维生素Bl0. 1%、山茶油0. 3%，余量为水，pH=6-7,粉末细度：80-100目，制成液体培养 基。3. 根据权利要求1所述的灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：发酵产物的提取方法 包括以下步骤： (1) 高压均质处理：经酶解处理的发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速800-1000r/ min，使菌丝体颗粒崩解，达到均质，再经高压均质机，使发酵液在40MPa-60MPa高压作用下 通过200目膜过滤； (2) 超临界0)2萃取：在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其 有选择性地把沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取析出有效活性物质； (3) 发酵液浓缩：将发酵液浓缩至浓度Brix=28-32% ; (4) 采用真空冷冻干燥，冷阱温度<-60°C，获得发酵产物灵芝多糖和灵芝三萜活性物 质干粉制品。
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝菌的深层发酵方法，选用人参、蜂花粉、灵芝孢子粉和茯苓等天然中草药原料作为灵芝菌深层发酵培养基，具有目的产物的产量高、质量稳定、菌丝体生长良好、发酵周期短、生产工艺简单、提取得率高、营养物质丰富、成本低等特点，是一项经济效益显著的环保型的药用真菌深层发酵技术，具有显著的开发应用前景。
【IPC分类】C12N1/14
【公开号】CN104893992
【申请号】CN201510384620
【发明人】郭震宇, 郭耀荣, 吴松刚
【申请人】福建天斯顿生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月30日
【技术领域】
[0001] 本发明属于药用真菌深层发酵生产技术及生物医药领域，具体涉及一种灵芝菌的 深层发酵方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝（Ganoderma Iucidum)是担子菌纲多孔菌科（Polyporaceae)灵芝属 (Ganodelma)真菌赤芝G. Iucidum .karst和紫芝G. japonicrnLloyd的总称，具有扶正固 本等功效，被《本经》称为上品。近年来，对灵芝属真菌的化学成分及临床研宄颇多，对灵芝 的生殖细胞一一孢子药用价值的研宄也颇受重视。
[0003] 灵芝孢子褐色，卵形，一端平截，（8. 5~IL 2) μ mX (5. 2~6.9) μ m，具双层壁。 在每个孢子的褐色内层产生许多针状小突起，深深地伸入孢子壁的透明外层，外层孢壁光 滑。灵芝孢子包裹的两层壁十分坚韧，一般的化学，物理方法很难将其打破，故限制了对其 化学成分、生物活性成分的研宄。
[0004] 灵芝在全国最大的原始森林，长白山和海南自然保护区最适宜生长。但是由于多 年来人类的过度采摘，野生灵芝的存量越来越少。灵芝对多种理化及生物因素引起的肝损 伤有保护作用。无论在肝脏损害发生前还是发生后，服用灵芝都可保护肝脏，减轻肝损伤。 灵芝能促进肝脏对药物、毒物的代谢，对于中毒性肝炎有确切的疗效。尤其是慢性肝炎，灵 芝可明显消除头晕、乏力、恶心、肝区不适等症状，并可有效地改善肝功能，使各项指标趋于 正常。所以，灵芝可用于治疗慢性中毒、各类慢性肝炎、肝硬化、肝功能障碍。灵芝可有效地 扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，改善心肌微循环，增强心肌氧和能量的供给，因此，对心肌 缺血具有保护作用，可广泛用于冠心病、心绞痛等的治疗和预防。另外，服用灵芝后可取代 胰岛素抑制脂肪酸的释出，可改善血糖、尿糖等症状。灵芝中的水溶性多糖，可减轻非胰岛 素依赖型糖尿病的发病程度。
[0005] 灵芝属的化学成分较为复杂，且因所用菌种、菌种产地、栽培方法、提取工艺、制剂 方法不同而各异。灵芝属的子实体、菌丝体和孢子中含有多糖类、核苷类、呋喃类衍生物、留 酵类、生物碱类、蛋白质、多肽、氨基酸类、三萜类、倍半萜、有机锗、无机盐等。灵芝多糖是灵 芝的主要有效成分之一。
[0006] 灵芝一般生长在湿度高且光线昏暗的山林中，主要生长在腐树或是其树木的根 部。灵芝不是植物，自身不能进行光合作用，只能从其他有机物或是腐树中摄取养料。灵芝 是一种坚硬、多孢子和微带苦涩的大型真菌。当达到成熟期的灵芝就会喷出粉状的孢子，从 而进行繁殖。现在野生的灵芝已经很少见，且质量不容易控制。
[0007] 灵芝及灵芝生物活性物质因其独特的理化特性和神奇的生物学功能而成为新型 的保健食品和药品领域的研宄热点。然而，人工栽培灵芝的生长周期长(大于2~3个月）， 受环境影响大，产量低、品质不稳定，生产成本高，极大地影响了灵芝及其生物活性物质在 健康产业中的发展。因此，近年来运用生物工程技术，对灵芝菌液体深层发酵培养的研宄， 获得灵芝菌丝体及其活性生长代谢产物(灵芝酸、灵芝多糖等)，并通过发酵条件的控制，缩 短生产周期，降低生产成本，使灵芝及其生物活性物质在食品和药品中得到应用和推广。
[0008] 人参(学名：Panax ginseng)，是具有肉质的根，可药用。人参属于五加科，主要生 长在东亚，特别是寒冷地区。人参是常见药材，用于愈后恢复、增强体力、调节荷尔蒙、降低 血糖和控制血压、控制肝指数和肝功能保健等。人参根部所含皂苷是其有效成分，中国长白 山野参皂苷成分较高，但取得不易，价格高昂。人参营养成分含量（每100克）热量80.0 大卡碳水化合物21. 2克脂肪0. 7克蛋白质0. 6克纤维素3. 5克，既是产生发酵培养基碳源 和氮源的有效物质，又可促进衍生营养成分的代谢产物。
[0009] 蜂花粉(学名POLLEN)，花粉含有多种营养物质，其中包括22种氨基酸、14种维生 素和30多种微量元素以及大量的活性蛋白酶、核酸、黄酮类化合物及其它活性物质。花粉 富含的蛋白质蛋白质20 % -25 %，氨基酸总量20 %以上，游离氨基酸1 % -2 %，碳水化合物 40% -50%，脂肪5% -10% ;还有丰富的天然维生素、微量元素、酶类、激素、生物活性物质 等多种营养物质。特别是B族维生素的含量极为丰富。每100克花粉含硫胺素600微克， 核黄素1670微克，吡哆醇900微克，泛酸2700微克，烟酸10000微克。它含有多种矿物质， 这些矿物质中，一些元素的含量分别是：钾20~40%、镁1~20%、钙1~15%、铁1~12%、 硅2~10%、磷1~20%。以及大量的的活性蛋白酶、核酸、黄酮类化合物及其它活性物质等。 作为复合碳源氮源进行发酵培养时，有利于菌丝体生长。
[0010] 灵芝孢子粉(英文名：Ganoderma spore)。灵芝孢子粉粗蛋白含量为18. 12%，氨基 酸含量为5. 869%，粗脂肪含量为20. 39%。不饱和脂肪酸是优势脂肪酸.以油酸，亚油酸为 主。还含有丰富的三萜类化合物、多种有益矿物元素。以灵芝孢子粉灵芝深层发酵培养基 的原料之一，能够促进菌丝体胞外多糖合成的前体诱导物而促使胞外多糖的大量合成。其 生物量、粗多糖及粗灵芝酸含量均较高，有利于灵芝活性物质（灵芝酸）的形成和灵芝酸含 量的提尚。
[0011] 茯苓(学名Wolfiporia cocos)。茯苓营养丰富，每100克茯苓的营养成分：能量16 千卡、蛋白质1. 2克、脂肪0. 5克、碳水化合物82. 6克、膳食纤维80. 9克、核黄素0. 12克、 钾58毫克、钠1毫克、钙2毫克、镁8毫克、铁9. 4毫克、锰1. 39毫克、锌0. 44毫克铜0. 23 毫克磷32毫克、硒4. 55微克、烟酸0. 4毫克等等。将茯苓粉作为中药培养基原料，可以促 进灵芝多糖的合成，有利于灵芝多糖含量的提高。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种灵芝菌的深层发酵方法，具有目的产物的产量高、质 量稳定、菌丝体生长良好、发酵周期短、生产工艺简单、提取得率高、营养物质丰富、成本低 等特点，是一项经济效益显著的环保型的药用真菌深层发酵技术，具有显著的开发应用前 景。
[0013] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 将接种的斜面放于26-28°C下培养5-7d ; (2) 将长满菌丝体的斜面接种于液体培养基，于摇床转速80-100r/min，冲程7-8cm往 复震荡，26-28 °C振荡培养2-3d，制成种子悬浮液； (3) 种子罐种子培养，按种量15%-20%、温度27-30°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速 度160-180r/min，无菌空气通气量为每分钟2. 5m3,罐压0. 04MPa，发酵培养48-72h ;pH降至 4. 5-5. 0 ； (4) 发酵罐发酵培养：接种量25-30%，温度27-30°C，搅拌速度为150-200r/min，无菌 空气通气量为每分钟2m 3,罐压0. 05MPa，培养48-72h ;发酵液变稠，菌体开始自溶，pH降至 3. 0-3. 5,残糖量降至 0· 2-0. 3% ; (5) 酶解：加入复合蛋白酶0. 5%，淀粉酶0. 75%，纤维素酶0. 75% ;蛋白酶为2X105u/kg， 淀粉酶为I. 〇Xl〇5u/kg，纤维素酶为I. 5X105u/kg ;温度55-60°C，时间3-4h。
[0014] 斜面培养基：马铃薯煮汁1000 mU脱脂奶粉30g、葡萄糖30g、琼脂30g、蛋白胨 30g、酵母膏5g、硫酸镁0· 2g、维生素 BI 0· lg，pH自然； 深层发酵培养基，按重量百分数计：人参粉2. 0%、蜂花粉2. 0%、灵芝孢子粉1. 0%、茯苓 粉1. 0%、大豆粉2. 0%、酵母粉0. 5%、葡萄糖3. 0%、硫酸镁0. 2%、磷酸氢二钾0. 3%、氯化钠 0. 2%、维生素 Bl 0. 1%、山茶油0. 3%，余量为水，pH=6-7,粉末细度：80-100目。
[0015] 发酵产物的提取方法包括以下步骤： (1) 高压均质处理：经酶解处理的发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速800-1000r/ min，使菌丝体颗粒崩解，达到均质，再经高压均质机，使发酵液在40MPa-60MPa高压作用下 通过200目膜过滤； (2) 超临界0)2萃取：在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有 选择性地把沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取析出有效活性物质； (3) 发酵液浓缩：将发酵液浓缩至浓度Brix=28-32% ; (4) 采用真空冷冻干燥，冷阱温度< -60°C，获得发酵产物灵芝多糖和灵芝三萜活性物 质干粉制品。
[0016] 本发明的显著优点在于：选用人参、蜂花粉、灵芝孢子粉和茯苓等天然中草药原料 作为灵芝菌深层发酵培养基，具有目的产物的产量高、质量稳定、菌丝体生长良好、发酵周 期短、生产工艺简单、提取得率高、营养物质丰富、成本低等特点，是一项经济效益显著的环 保型的药用真菌深层发酵技术，具有显著的 开发应用前景。
[0017] 采用天然植物人参粉、蜂花粉、灵芝孢子粉、茯苓粉等中草药作为灵芝菌深层发酵 培养基的原料，优化培养基营养物质，充分利用氮源、碳源，促进灵芝菌丝体生长，提高获得 大量菌体与代谢产物，大幅提高灵芝多糖和三萜等有效活性成分的含量。采用天然植物人 参粉、蜂花粉、灵芝孢子粉、茯苓粉等中草药作为灵芝菌深层发酵培养基，并采用超临界CO 2 萃取、酶解工艺，提取灵芝多醣和三萜尚未见有相关报道。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 : 菌种：由中国长白山野生灵芝组织分离选育的菌株菌种。
[0019] 灵芝菌的深层发酵培养方法和发酵产物干粉提取制备方法： 1、配制斜面培养基：马铃薯煮汁1000ml、脱脂奶粉30g、葡萄糖30g、琼脂30g、蛋白胨 30g、酵母膏5g、硫酸镁0· 2g、维生素 BI 0· lg，pH自然。
[0020] 2、斜面菌种培养：将优质菌种接种在固体斜面培养基上，放于26-28°C下培养 5-7d，菌丝体长满斜面，微带白色，菌种生长旺盛。
[0021] 3、三角瓶摇瓶培养：将斜面菌种移入盛200ml液体培养基的三角瓶中，采用摇床 转速80-100r/min，冲程7-8cm往复震荡，26-28°C振荡培养2-3d，长满白色的菌丝，制成种 子悬浮液。
[0022] 4、配制深层发酵培养基。按以下重量百分比配制液体培养基：深层发酵培养基(按 重量百分比）：人参粉2. 0%、蜂花粉2. 0%、灵芝孢子粉1. 0%、茯苓粉1. 0%、大豆粉2. 0%、酵母 粉0. 5%、葡萄糖3. 0%、硫酸镁0. 2%、磷酸氢二钾0. 3%、氯化钠0. 2%、维生素 Bl 0. 1%、山茶油 0. 3%，余量：水，pH :6. 5,粉末细度：80-100目。（蜂花粉选用茶花蜂花粉） 按上述重量百分比，取人参粉6000g、蜂花粉6000g、灵芝孢子粉3000g、茯苓粉3000g、 大豆粉6000g、酵母粉1500g、葡萄糖9000g、硫酸镁600g、磷酸氢二钾900g、氯化钠600g、维 生素 BI 300g、山茶油900g，余量：水，pH :6. 5,粉末细度：80-100目。配制液体培养基。培 养基在120-125°C条件下灭菌30min，冷却后备用。（蜂花粉选用茶花蜂花粉） 5、种子罐种子扩大培养(一级发酵）:种子罐采用500L不锈钢罐，投料300L。将种子悬 浮液移入种子罐，进行种子扩大培养，按种量17. 5%、温度27-30?，光照条件：连续黑暗条 件，搅拌速度160-180r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0. 4m3v/v，min，罐压0. 04MPa，发酵 培养56h ;pH降至4. 7,种子罐菌种培养成熟。
[0023] 6、发酵罐深层发酵培养(二级发酵):发酵罐采用5000L不锈钢罐，投料3000L。按种 量27. 5%、温度27-30°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速度160-180r/min，无菌空气通气 量为每分钟1: 〇. 4m3v/v，min，罐压0. 04MPa，发酵培养60h ;pH降至3. 3,残糖量降至0. 25%， 发酵结束，形成深层发酵菌丝液。
[0024] 7、酶解：按重量百分比，加入复合蛋白酶0. 5%，淀粉酶0. 75%，纤维素酶0. 75%， 蛋白酶为2X105u/kg，淀粉酶为1.0X105u/kg，纤维素酶为1.5X10 5u/kg。温度保持在 55-60°C，酶解时间 3. 5h。
[0025] 8、高压均质处理：经酶解处理的发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速SOO-1000 r/ min。使菌丝体等物料颗粒崩解，达到均质，再经高压均质机（40MPa-60MPa)，使发酵液在高 压作用下通过200目膜过滤。
[0026] 9、超临界CO2萃取，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，在超临界状 态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把沸点高低和分子量大小 不同的成分依次萃取析出有效活性物质。
[0027] 10、发酵液浓缩，采用双效浓缩器，蒸发温度55_70°C，蒸汽压力0. 25MPa，将发酵 液液体浓缩至浓度Brix=30%。
[0028] 11、真空冷冻干燥，采用工作真空度< 130Pa，冷阱温度<-60°C的真空冷冻干燥 设备，获的发酵产物活性物质干粉。
[0029] 12、经计量测定获得发酵产物活性物质干粉计106. 5kg，得率为35. 5g/L。（干粉实 测含水量为5. 0%)。
[0030] 按上述实施方法和配比再重复生产，实施例2和实施例3 : 实施例2,经计量测定获得发酵产物活性物质干粉计108. 5kg，得率为36. 2g/L。（干粉 实测含水量为5. 0%)。
[0031] 实施例3，经计量测定获得发酵产物活性物质干粉计107. 8kg，得率为35. 9g/L。 (干粉实测含水量为5. 0%)。
[0032] 表1灵芝菌发酵干粉主要成分及含量（g/lOOg干重）
上述主要成分检测标准与方法： 1、多糖体（以葡萄糖计)，苯酚-硫酸法。
[0033] 2、总三萜（以熊果酸计)，紫外分光光度测定法。
[0034] 3、蛋白质（以干基计，NX6. 25)，采用GB5009-2010标准检测。
[0035] 4、氨基酸采用GB/T 5009. 124-2003氨基酸自动分析仪测定食物中氨基酸的方法 测定。
[0036] 5、可溶性膳食纤维，采用GB/T5009. 88标准测定方法。
[0037] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 将接种的斜面放于26-28°C下培养5-7d; (2) 将长满菌丝体的斜面接种于液体培养基，于摇床转速80-100r/min，冲程7-8cm往 复震荡，26-28 °C振荡培养2-3d，制成种子悬浮液； (3) 种子罐种子培养，按种量15%-20%、温度27-30°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速 度160-180r/min，无菌空气通气量为每分钟2. 5m3,罐压0. 04MPa，发酵培养48-72h;pH降至 4. 5-5. 0 ； (4)发酵罐发酵培养：接种量25-30%，温度27-30°C，搅拌速度为150-200r/min，无菌 空气通气量为每分钟2m3,罐压0. 05MPa，培养48-72h ;发酵液变稠，菌体开始自溶，pH降至 3. 0-3. 5,残糖量降至0? 2-0. 3% ; (5)酶解：加入复合蛋白酶0. 5%，淀粉酶0. 75%，纤维素酶0. 75%;蛋白酶为2X105u/kg， 淀粉酶为I. 〇X105u/kg，纤维素酶为I. 5X105u/kg ;温度55-60°C，时间3-4h。2. 根据权利要求1所述的灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：斜面培养基：马铃薯煮 汁1000 mU脱脂奶粉30g、葡萄糖30g、琼脂30g、蛋白胨30g、酵母膏5g、硫酸镁0. 2g、维生素 Bl0?lg，pH自然； 深层发酵培养基，按重量百分数计：人参粉2. 0%、蜂花粉2. 0%、灵芝孢子粉1. 0%、茯苓 粉1. 0%、大豆粉2. 0%、酵母粉0. 5%、葡萄糖3. 0%、硫酸镁0. 2%、磷酸氢二钾0. 3%、氯化钠 0. 2%、维生素Bl0. 1%、山茶油0. 3%，余量为水，pH=6-7,粉末细度：80-100目，制成液体培养 基。3. 根据权利要求1所述的灵芝菌的深层发酵方法，其特征在于：发酵产物的提取方法 包括以下步骤： (1) 高压均质处理：经酶解处理的发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速800-1000r/ min，使菌丝体颗粒崩解，达到均质，再经高压均质机，使发酵液在40MPa-60MPa高压作用下 通过200目膜过滤； (2) 超临界0)2萃取：在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其 有选择性地把沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取析出有效活性物质； (3) 发酵液浓缩：将发酵液浓缩至浓度Brix=28-32% ; (4) 采用真空冷冻干燥，冷阱温度<-60°C，获得发酵产物灵芝多糖和灵芝三萜活性物 质干粉制品。
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝菌的深层发酵方法，选用人参、蜂花粉、灵芝孢子粉和茯苓等天然中草药原料作为灵芝菌深层发酵培养基，具有目的产物的产量高、质量稳定、菌丝体生长良好、发酵周期短、生产工艺简单、提取得率高、营养物质丰富、成本低等特点，是一项经济效益显著的环保型的药用真菌深层发酵技术，具有显著的开发应用前景。
【IPC分类】C12N1/14
【公开号】CN104893992
【申请号】CN201510384620
【发明人】郭震宇, 郭耀荣, 吴松刚
【申请人】福建天斯顿生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月30日
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