大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用图
大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用途。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是一种土传的维管束系统病害，是由大丽轮枝菌引起的，其对棉花的 生产造成了严重的危害。自1935年，棉花黄萎病随着棉花种子的引进而传入我国，随后便 开始逐渐蔓延全国。尤其从20世纪90年代以后，棉花黄萎病在我国扩展蔓延极为迅速，其 中1993年棉花黄萎病最为严重，发病面积达266. 67万hm2,随后在1995、1996、1999、2000、 2002、2003年全国范围内连续爆发，损失十分严重，棉花黄萎病已对我国棉花生产以及可持 续发展构成极大威胁。
[0003] 棉花黄萎病是由半知菌亚门（Deutermycotina)淡色菌科（Mmonilaceae)轮 枝菌属（Verticillium)真菌引起，属内有若干个种，其中危害棉花的有大丽轮枝菌 (V. dahliae)和黑白轮枝菌（V. albo-atum)两个种。我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌 引起的。大丽轮枝菌没有寄主专化性，可以危害多种植物，从一年生的草本植物到多年生的 木本植物。大丽轮枝菌可以形成一种叫做黑色微菌核的休眠结构，可以在缺乏寄主的土壤 中存活长达数年。
[0004] 大丽轮枝菌主要以微菌核的形式越冬，微菌核作为其最主要的初侵染来源，在受 到植物根部分泌物的刺激时便会萌发。菌丝一般从植物根部侵入，随着植物的蒸腾作用向 植物的茎叶中扩展、定植，最终侵染整个植株。一般被大丽轮枝菌侵染过的植株都会表现出 萎蔫，干枯，叶脉失色，坏死等症状，维管束变褐是黄萎病最典型的症状。
[0005] 田黎等的研宄认为棉花黄萎病的发生发展与土壤中微菌核的数量密切相关。大丽 轮枝菌微菌核的多少通常与其致病力和抗逆性相关。有研宄显示，当土壤里棉花黄萎菌微 菌核达到〇. 03个/g 土时，就会导致棉花出现萎蔫症状，当土壤中微菌核含量达到0. 3个/g 土~I. 0个/g 土时，就会有20 %~50%的棉花植株发病，当土壤中微菌核含量达到3. 5个 /g 土以上，棉花植株都会发病。另有研宄表明，当土壤中微菌核含量达到0. 5个/g 土为引 起棉花发病的临界值。在田里面，当黄萎菌侵染莴苣后，土壤中的微菌核数量为至少50个 /g 土，而病害很重的田块，微菌核数目高达2400个/g 土。
[0006] 棉花是目前世界上种植面积最大的工业原料作物，在我国是仅次于粮食的第二大 农作物。棉花黄萎病是目前我国棉花生产过程中最具毁灭性的真菌病害。由于至今尚未研 制出效果显著的防治药剂和抗病品种，被称为棉花的"癌症"，因此如何控制黄萎病的猖獗 危害，已成为棉花生产可持续发展的关键问题。在这种情况下，研宄大丽轮枝菌的致病机 理，了解大丽轮枝菌与寄主的互作机理就显得更为重要。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2或其基因。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备分生孢子产量降低的重组大丽 轮枝菌的方法。
[0009] 本发明所提供的一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法，是抑制目 的大丽轮枝菌中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因的表达，得到分生孢子 产量低于所述目的大丽轮枝菌的重组大丽轮枝菌；
[0010] 所述大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2为a)或b):
[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 1所示的蛋白质；
[0012] b)将SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的由a)衍生的 蛋白质。
[0013] 其中，SEQ ID No. 1由395个氨基酸残基组成。
[0014] 上述b)中所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述b)中所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。
[0016] 上述b)中所述蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 2所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到的。
[0017] 上述方法中，所述分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的分生孢子产量低于所 述目的大丽轮枝菌；所述目的大丽轮枝菌为含有所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2的基因的大丽轮枝菌，如大丽轮枝菌野生型菌株V592。
[0018] 上述方法中，所述抑制目的大丽轮枝菌中所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2的基因的表达是通过将所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因敲 除的方式实现的。
[0019] 上述方法中，所述基因敲除可通过同源重组实现。
[0020] 本发明提供的利用所述制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法获得的 分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌也属于本发明保护的范围。
[0021] 本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2表达的物 质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质或降低所述大 丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的物质在培育抗大丽轮枝菌植物中的应用 也属于本发明保护的范围。
[0022] 上述应用中，所述抗大丽轮枝菌植物可为转基因植物。
[0023] 上述应用中，所述植物可为大丽轮枝菌的寄主；所述大丽轮枝菌的寄主可为双子 叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物可为棉花、番茄、向日葵、黄瓜等；所述单子叶植物 可为水稻、玉米、高粱、麦类、谷子等；所述大丽轮枝菌的寄主具体可为棉花。
[0024] 本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2表达的物 质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质或降低所述大 丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的物质在制备大丽轮枝菌抑制剂中的应用 也属于本发明保护的范围。
[0025] 上述应用中，所述大丽轮枝菌抑制剂可通过所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋 白VdpdaA2或所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因为靶点进行筛选。
[0026] 上文中，所述抑制大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物 质可为干扰大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质，如microRNA、 VdpdaA2的基因的反义基因表达的RNA。
[0027] 本发明还提供了所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2,或所述大丽轮 枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料在调控大_轮枝菌分生孢子产量中 的应用；
[0028] 所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料为下述Al)至 A20)中的任一种：
[0029] Al)核酸分子；所述核酸分子为编码大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2 的核酸分子；
[0030] A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒；
[0031] A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体；
[0032] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0033] A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物；
[0034] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0035] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0036] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0037] A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0038] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0039] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0040] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0041] A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0042] A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0043] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0044] A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0045] A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0046] A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0047] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0048] A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0049] 上述应用中，所述调控大丽轮枝菌分生孢子产量可为降低大丽轮枝菌分生孢子产 量。
[0050] 上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸 分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0051] 所述核酸分子为如下1)-5)中任一所不的基因：
[0052] 1)其编码序列是SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0053] 2)序列是SEQ ID No. 3的cDNA分子或DNA分子；
[0054] 3)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0055] 4)与2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0056] 5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述大丽 轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0057] 上述用于编码所述大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的核酸分子，本领 域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明 的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的核酸分子的核苷酸序列进行突 变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋 白VdpdaA2的核酸分子的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且编码所述大丽轮枝菌分 生孢子产量相关蛋白VdpdaA2,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0058] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 2的第1-1188位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。与本发明的SEQ ID No. 3的第1-1359位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或85%或更高， 或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软 件进行 评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用 来评价相关序列之间的同一性。
[0059] 所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次15min。
[0060] 上述75%或75%以上同一性，可为80 %、85%、90%或95%以上的同一性。
[0061] 其中，SEQ ID No. 2由1188个核苷酸组成，其编码序列是第1-1188位，编码SEQ ID No. 1所不的蛋白质。
[0062] 上述与所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料中，所述 表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转 录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如A2)所述的含有编码所述大丽轮枝 菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的DNA。
[0063] 上述与所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料中， A5)-A8)中任一所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希 氏菌属（Escherichia),欧文氏菌（Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium)、黄杆菌属 (Flavobacterium),产喊菌属（Alcaligenes),假单胞菌属（Pseudomonas),芽胞杆菌属 (Bacillus)等。A9)-A12)中任一所述的转基因细胞系，A13)-A16)中任一所述的转基因植 物组织，A17)-A20)中任一所述的转基因植物器官均不包括植物的繁殖材料。
[0064] 实验证明，将大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株中的VdpdaA2基因敲除后获得的 VdpdaA2基因敲除突变体产孢量明显低于大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株，VdpdaA2基因 与分生孢子产量相关，表明VdpdaA2基因参与了分生孢子的形成。在实际应用中，可以在目 的植物（如棉花）中表达干扰VdpdaA2基因表达的物质（如microRNA、VdpdaA2基因的反 义基因表达的RNA)提高目的植物对大丽轮枝菌的抗性，具体可以将干扰VdpdaA2基因表达 的DNA(如VdpdaA2基因的反义基因）导入受体植物中得到对大丽轮枝菌抗性提高的转基 因植物。在实际应用中，也可以以大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2或其基因为 靶点筛选防治大丽轮枝菌的药物。本发明首次鉴定了与大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2及其基因，为进一步阐明大丽轮枝菌的致病机理提供基础，将野生型大丽轮枝菌的 VdpdaA2基因敲除得到的大丽轮枝菌突变体为大丽轮枝菌与宿主的互作机理研宄提供了病 原菌资源，本发明对棉花黄萎病的防治及培育抗大丽轮枝菌的棉花新品种具有重要的应用 价值。
【附图说明】
[0065] 图1为PRF-HU2载体结构示意图。
[0066] 图2为重组载体pRF-HU2-PDA2的构建流程图。
[0067] 图3为敲除载体的构建策略图。
[0068] 图4为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的表型及Southern杂交验证结果。其 中，A为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的表型；B为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的 Southern杂交验证图谱：泳道1为大丽轮枝菌野生型菌株V592,泳道2和3分别为大丽轮 枝菌 VdpdaA2 敲除突变体Λ VdpdaA2_a 和Λ VdpdaA2_b。
[0069] 图5为VdpdaA2基因在大丽轮枝菌野生型菌株V592的菌核、菌丝和分生孢子中的 转录水平。其中，1为分生孢子，2为菌丝，3为菌核。
[0070] 图6为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的生物学性状。其中，图A为表型结果；图 B为分生孢子产量的测定结果；图C为菌丝形态结果；WT和V592均为大丽轮枝菌野生型菌 株V592, Λ VdpdaA2为敲除突变体Λ VdpdaA2-a，EC2为敲除突变体VdpdaA2-a的互补转化 子。
[0071] 图7为敲除突变体Λ VdpdaA2分生孢子的萌发。WT为大丽轮枝菌野生型菌株 V592, Λ VdpdaA2 为敲除突变体Λ VdpdaA2-a。
[0072] 图8为以PDA2-S和PDA2-X为引物对对V592菌株的基因组DNA进行PCR扩增得 到的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为markerfOOO ;泳道1为阴性对照， 泳道2-7均为VdpdaA2基因全长的PCR扩增产物。
[0073] 图9为载体pSULPH-mut-RG#PB的结构示意图。
[0074] 图10为互补转化子的表型。
【具体实施方式】
[0075] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0076] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0077] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0078] 下述实施例中的棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌（V. dahliae)野生型菌株V592(彭 姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008， 20 (3) : 174~178.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所 用，不可作为其它用途使用。
[0079] 下述实施例中的载体 pRF_HU2 (Ronnie de Jonge，H. Peter van Esse， Karunakaran Maruthachalam，et al. Tomato immune receptor Velrecognizes effector of multiple fungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing[J]. PNAS，2012, 4(27) :5110~5115.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明 的相关实验所用，不可作为其它用途使用。该载体上有任何真菌生物基因组中没有的两个 酶切位点PacI和Nt. BbvCI，还含有真菌选择性标记一潮霉素标记和细菌选择性标记一卡 那霉素（Kan)标记，该载体的示意图如图1所示。
[0080] 下述实施例中的根癌农杆菌 EHA105 (Feng Gao，Bang-Jun Zhou，Guo-Ying Li， et al. A Glutamic Acid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae from an Insertional Mutagenesis Affects icrosclerotial Formation and Pathogenicity[J]. PLos One, 2010, 12(5) :el5319)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的 相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0081] 下述实施例中棉花为棉花品种108夫（Gossypium hirsutum L.)(彭姗，吕学莲， 高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008, 20 (3): 174~ 178.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其 它用途使用。
[0082] 下述实施例中的USER enzyme mix为NEB公司产品。
[0083] 下述实施例中的相关抗生素溶液的配制如下：
[0084] 潮霉素（Hyg，罗氏公司）工作浓度100 μ g/mL，头孢霉素（Cef)工作浓度为 300 μ g/mL，卡那霉素（Kan)工作浓度为50 μ g/mL，利福平（Rif)工作浓度为10 μ g/mL ;
[0085] 乙酰丁香酮（AS，IOmM):称取19. 62mg乙酰丁香酮，用IOmL蒸馏水溶解，采用浓度 为5M的KOH溶液调节pH至8,过滤灭菌后-20°C保存。
[0086] 2-N-玛琳乙磺酸（MES，1M):称取19. 52g MES，用80mL蒸馏水溶解，采用浓度为5M 的KOH溶液调节pH至5. 3,然后定容至IOOmL并用过滤器过滤灭菌，-20°C保存。
[0087] 10% (v/v)的甘油：10mL纯甘油，90mL蒸馏水，混匀。
[0088] 20% (v/v)的甘油：20mL纯甘油，80mL蒸馏水，混匀。
[0089] 50mM的L-天冬酰胺：将6. 6g L-天冬酰胺溶解到IL蒸馏水中，过滤灭菌。
[0090] 200 XTrace solution for Vogels salts: 5g 朽1 樣酸，5gZnS04 · 7H20, Ig Fe (NH4)2 (SO4) 2.6H20,0.25g CuSO4 .5H20,0.05g MgSO4 .H20,0.05g H3B03,0.05g Na2Mo O4 · 2H20, 1000 mL蒸馏水，过滤灭菌。
[0091] 50 X Vogels salts : 125g C6H9Na3O9, 250g KH2P04, 9. 3g MgSO4 · 6H20, 5g CaCl2 · 2H20,5mL 200XTrace solution，定容至 1000mL，过滤灭菌。
[0092] 1000 XTrace elements for DFM medium ：40mg Na2B4O7 ·IOH20,400mg CuSO4 ·5Η20, I. 2g FeSO4 · 7H20,700mg MnSO4 · H20,800mg Na2MoO4 · 2H20, IOg ZnSO 4 · 7H20, 1000 mL 蒸馏 水，过滤灭菌。
[0093] 2. 5XSalt solution ：3. 625g KH2PO4, 5. 125g K2HPO4, 0. 375g NaCl,1.160g MgSO4 · 6H20,0. 165g CaCl2 · 2H20,0. 0062g FeSO4 · 7H20,1. 250g (NH4)2SO4, 1000 mL 蒸馏水， 过滤灭菌。每种组分需称取一个溶解一个避免形成不溶物。
[0094] RA 培养基：50g 丁 二酸钠（C4H 404Na2 · 6H20)，12. Ig NaN03,20mL 50XVogels salts ( - N, - C)，950mL蒸馏水，高压灭菌，在用之前加上50mL灭过菌的浓度为20g/100mL 的葡萄糖水溶液。
[0095] 水琼脂IMAS培养基：将6g琼脂粉和146mL蒸馏水混合，高压灭菌保存。用的时候 微波炉融化后加入IMAS培养基的其它成分。
[0096] IMAS 固体培养基：将 120.0mL 2.5XSalt solution(60°C 预热），7mL 浓度为 20g/100mL的葡萄糖水溶液，7. 5mL 20% (v/v)的甘油和146mL水琼脂IMS培养基混合，使 得混合液中琼脂粉的最终浓度2g/100mL。待混合液冷却至55°C时，再加入12. OmL MES (浓 度为1M)，6. OmL乙酰丁香酮（浓度为IOmM)。
[0097] IMAS 液体培养基：120.0 mL 2. 5 X Salt solution (60 °C 预热），7mL 浓度为 20g/100mL 的葡萄糖水溶液，7. 5mL 20 % (v/v)的甘油，12. OmL MES (浓度为 1M)，6. OmL 乙 酰丁香酮（浓度为IOmM)。
[0098] 水琼脂DFM培养基：将IOg琼脂粉和358mL蒸馏水混合，高压灭菌保存。用的时候 微波炉融化后加入DFM培养基的其它成分。
[0099] DFM固体培养基：将31. 25mL浓度为20g/100mL的葡萄糖水溶液，100.0 mL浓度为 50mM的L-天冬酰胺（60°C预热），5. OmL浓度为2IOmM的MgSO4, 5. OmL溶液A (溶液A的pH 值为6,由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1. 12M的KH2POjP 0. 7M的KCL)， 0. 5mL 1000 XTrace elements和358mL的水琼脂DFM培养基混合，使得混合液中琼脂的终 浓度为2g/100mL。待混合液冷却到55°C加入所要求的抗生素。
[0100] 1 % (w/v)水琼脂培养基：将Ig的琼脂粉和99mL的蒸馏水混勾，高压灭菌保存。
[0101] 查氏液体培养基：2g NaNO3, Ig K2HPO4,0· 5g KCl，0· 5g MgSO4 · 7Η20,0· Olg FeSO4 · 7H20,30g鹿糖，蒸馏水定容至1000 mL ;高压灭菌。
[0102] 表1、引物序列（下划线表示酶切位点）
[0105] 实施例1、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的制备
[0106] 一、重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2的制备
[0107] 以棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌（V. dahliae)野生型菌株V592 (简称V592菌株） 的基因组DNA为模板，以PDA2up-s和PDA2up-x为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物， 将其命名为VdpdaA2基因左同源臂片段；
[0108] 以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA2down-s和PDA2down-x为引物进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物，将其命名为VdpdaA2基因右同源臂片段。
[0109] 采用PacI和Nt. BbvCI限制性内切酶双酶切pRF-HU2载体（图1)得到pRF-HU2 载体的两个线性化片段。
[0110] 将VdpdaA2基因左同源臂片段、VdpdaA2基因右同源臂片段与获得的PRF-HU2载 体的两个线性化片段进行连接，连接体系如表2所示，在37°C孵育20min，然后在25°C孵育 20min，即获得重组载体，命名为重组载体pRF-HU2-PDA2 (图2)。将重组载体pRF-HU2-PDA2 进行测序，结果正确，表明VdpdaA2基因左同源臂片段和VdpdaA2基因右同源臂片段分别插 入到了 PRF-HU2载体的。pRF-HU2-PDA2中的VdpdaA2基因左同源臂片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4所示，VdpdaA2基因右同源臂片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0111] 将重组载体PRF-HU2-PDA2转化入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，将其命 名为重组农杆菌PRF-HU2: :PDA2。
[0112] 表2、USER克隆体系
[0113]
[0114] 二、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的制备
[0115] 1、大丽轮枝菌分生孢子的获得
[0116] 将培养好的V592菌株打菌饼若干，并接种于含有250mL RA培养基的IL三角瓶 中，在26°C、200rpm的水平摇床上摇培5d，获得V592菌株的培养物。用灭过菌的微孔滤布 过滤V592菌株的培养物至无菌的50mL离心管中，然后将过滤物在14000g、4°C条件下离心 40min，弃上清，收集菌体沉淀。用IOmL ddH20重新悬浮菌体沉淀，然后在14000g、4°C条件 下再离心40min，弃上清，收集菌体沉淀；用5mL ddH20重新悬浮菌体沉淀，得到V592菌株的 分生孢子悬浮液。使用光学显微镜和血球计数板测定V592菌株的分生孢子悬浮液中的分 生孢子浓度，然后将V592菌株的分生孢子悬浮液在14000g、8°C条件下离心30min后，收集 分生孢子沉淀，用10% (v/v)的甘油重新悬浮沉淀的分生孢子，最终得到的分生孢子浓度 为I X IO8CfVmL的分生孢子悬浮液。将分生孢子悬浮液以每份ImL置于-80°C保存，可保 存1年，待用时用IMAS液体培养基将分生孢子浓度调至IX 107cfu/mL。
[0117] 2、重组农杆菌的培养
[0118] 将步骤一制备的重组农杆菌PRF-HU2: :PDA2的单菌落接种于50mL三角瓶中，装 有IOmL含有浓度为50 μ g/mL Kan (卡那霉素）和浓度为10 μ g/mL Rif (利福平）的LB液 体培养基，在28°C、100rpm条件下培养l-2d，得到重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2的种子液；将 100 μ L重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2的种子液接种于50mL锥形瓶中，装有IOmL含有浓度为 50 μ g/mL Kan的IMAS液体培养基，在28°C、IOOrpm条件下摇培至OD6c?达到0· 5-0. 7 ( -般 到第二天即可），得到重组农杆菌PRF-HU2: :PDA2菌液。
[0119] 3、将步骤2获得的重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2菌液与步骤1的分生孢子浓度为 I X 107cfu/mL的分生孢子悬浮液等体积混合均匀，得到混合液。吸取200 μ L混合液并使 用涂布器将其均匀的涂布于铺有NC膜的IMAS固体培养基上，然后在26°C暗培养36小时。 培养结束后在无菌条件下将NC膜从IMAS固体培养基上转移到DFM(潮霉素浓度为150mg/ mL，头孢霉素浓度为300mg/mL)固体培养基上培养6-8d，待长出转化子后再将转化子转移 至PDA(潮霉素浓度为150mg/mL，头孢霉素浓度为300mg/mL)培养基中继续培养，其构建策 略如图3。挑选2个转化子分别命名为Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b，其表型如图4中A所 示。Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b是将V592菌株中的大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA2 的基因（简称VdpdaA2基因）敲除得到的重组大丽轮枝菌。大丽轮枝菌致病性相关蛋白 VdpdaA2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA2的基因 组基因如SEQ ID No. 3所示，大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA2的cDNA基因如SEQ ID No. 2所示。
[0120] 三、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的验证
[0121] 以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA2-ts和PDA2-tx为引物进行PCR扩增，获 得V592菌株的PCR产物，将V592菌株的PCR产物（SEQ ID NO. 3中的第17位至422位所示 的核苷酸序列）作为探针DNA，参照Riboprobe Systtem-SP6探针标记试剂盒（为Promega 产品，产品目录号为P1420)的说明书，使用a-[32P]dCTP进行探针DNA的标记。分别提取 步骤二得到的转化子（AVdpdaA2-a和AVdpdaA2-b)的基因组DNA，以PDA2-ts和PDA2-tx 为引物，进行Southern杂交验证，检测转化子中的VdpdaA2基因是否被敲除。
[0122] 图4中B的结果表明，V592菌株中可杂交得到一条明亮的条带，即VdpdaA2基因 的目的片段，而两个敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b中在相应的位置没有杂交出 相应的条带，此结果说明敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b中的VdpdaA2基因已经 被敲除。
[0123] 四、VdpdaA2基因在V592菌株中的表达分析
[0124] 分别提取V592菌株的菌核、菌丝和分生孢子的RNA，并反转录为cDNA，分别以 cDNA为模板，以PDA2_qs和PDA2_qx为引物，进行荧光定量qRT-PCR。以β -tubline基因 (DQ266153)作为内参基因，β-tubline-f 和 β-tubline-r 作为引物。
[0125] 图5中结果表明，VdpdaA2基因在V592菌株的菌丝中的转录水平明显高于在分生 孢子和菌核中的转录水平，在菌核中的转录水平最低，表明VdpdaA2基因在V592菌株中的 表达具有组织特异性。
[0126] 五、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的生物学性状
[0127] 首先将步骤二获得的大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体Λ VdpdaA2_a和 Λ VdpdaA2-b分别移植到普通PDA培养基上，在26°C培养10d，然后分别对各菌株进行下述 生物学特性的观察和测定，以V592菌株为对照。
[0128] 1、培养性状观察
[0129] 用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板 中央，在26°C暗培养10d，根据突变菌株的菌落形态和黑色微菌核的多少等特征对突变菌 株进行表型类型分类，分类标准参考文献：彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病 快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008, 20(3) : 174~178。结果如图6中A，表明敲除突 变体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b在PDA培养基上的表型均为菌核型，在培养基的正面和 背面都产生黑色的微菌核，与V592菌株没有明显的差异。
[0130] 2、菌落生长速度测定
[0131] 用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板 中央，26°C暗培养，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，从第三天到第九天每天测量一次 菌落直径，共测7次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的菌落直径是其三个重复的平均 值，菌落生长速度=(第九天直径-第五天直径）+4。
[0132] 菌落生长速度测定结果显示：
[0133] A.在普通PDA培养基平板上，V592菌株的生长速度为3. 667mm/d，敲除突变体 Λ VdpdaA2_a 和Λ VdpdaA2_b 的分别为 3. 83mm/d、3. 82mm/d，敲除突变体Λ VdpdaA2_a 和 Λ VdpdaA2-b的菌落生长速度要比野生型菌株的菌落生长速度快。
[0134] V592菌株在第九天时的菌落直径为37mm，敲除突变体Λ VdpdaA2_a和 Λ VdpdaA2_b的分别为39mm、39mm，大于V592菌株的菌落直径。
[0135] 3、产孢量测定
[0136] 用打孔器在菌株菌落边缘打取10个直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于装有查氏液 体培养基的锥形瓶中，在26°C、200rpm条件下摇培5天，用无菌的微孔滤布过滤培养物至无 菌的离心管中，再用250mL超纯水洗锥形瓶并用微孔滤布过滤至新的无菌离心管中，收集 分生孢子。将收集的分生孢子在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，用IOmL超纯水 重新悬浮沉淀，转移至无菌离心管，在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，收集沉淀， 获得分生孢子。用无菌水将收集的分生孢子浓度调至IX 106cfu/mL，然后准确吸取ImL分 生孢子悬浮液，接种至装有IOOmL查氏液体培养基的150mL的三角瓶中，在26°C，200rpm条 件下暗培养。在显微镜下用血球计数板测量分生孢子浓度，从第二天到第九天每24h测量1 次分生孢子浓度，共测8次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的分生孢子浓度是其三个 重复的平均值。
[0137] 结果表明从第三天开始，敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b的产孢量均明 显低于V592菌株（图6中B)，敲除突变体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b在各个检测时间点 的产孢量没有显著差异，这表明VdpdaA2基因与分生孢子产量相关，VdpdaA2基因参与了分 生孢子的形成。
[0138] 4、分生孢子和菌丝形态观察
[0139] 分生孢子形态观察：收集同一时期相同培养条件下敲除突变体Λ VdpdaA2_a、 Λ VdpdaA2-b和V592菌株的分生孢子在显微镜下观察，以V592菌株为对照，观察敲除突变 体的分生孢子与V592菌株之间的差异。
[0140] 分生孢子形态观察结果：敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b的分生孢子形 态多为椭圆形，大多数里面有油滴，与V592菌株相比没有差异。
[0141] 菌丝形态观察：采用小室培养的方法（载玻片培养法），对菌株菌丝的形态进行观 察，即用灭菌的牙签在菌株菌落边缘打取直径约为5_的菌饼，倒置放在无菌的载玻片上， 将载玻片置于保湿的培养皿内，26°C暗培养3天，取出载玻片在显微镜下观察敲除突变体 的菌丝与V592菌株的菌丝微观结构。
[0142] 结果表明在保湿的培养皿中培养3天之后，敲除突变体Λ VdpdaA2-a和 Λ VdpdaA2_b形成的菌丝形态和V592菌株的菌丝形态无明显差异（图6中C)。
[0143] 5、显微观察敲除突变体分生孢子的萌发情况
[0144] 将敲除突变体Λ VdpdaA2_a、A VdpdaA2_b和V592菌株的菌饼分别接种在查氏培 养基中，在26°C、200rpm的摇床中培养24h，用无菌的滤布收集分生孢子悬浮液，用移液枪 吸取定量的分生孢子悬浮液，在显微镜下观察分生孢子萌发的情况。
[0145] 结果表明，V592菌株与敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b的分生孢子萌发 并没有明显差异（图7)。
[0146] 实施例2、互补突变体的表型
[0147] -、互补载体的构建
[0148] 1、以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA2-S和PDA2-X为引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为VdpdaA2基因（图8)，包含起始 密码子ATG和终止密码子TAG，大小为1359bp。以水为模板，进行上述实验，作为阴性对照。 该PCR产物的核苷酸序列是SEQ ID No. 3的第1位-第1359位所示的核苷酸序列。
[0149] 2、使用限制性内切酶Sail和SpeI双酶切步骤1得到的VdpdaA2基因的PCR扩 增产物，得到目的基因片段；将目的基因片段插入载体pSULPH-mut-RG#PB(其核苷酸序列 如SEQIDNo·6所示）的SalI和SpeI识别位点间，，保持载体pSULPH-mut-RG#PB的其它 序列不变，得到重组载体，将其命名为重组载体VdpdaA2: :pSULPH-mut-RG#PB。将重组载体 VdpdaA2: :pSULPH_mut-RG#PB 进行测序，结果表明重组载体 VdpdaA2: :pSULPH_mut-RG#PB 上自5'末端起第12617bp至第13976bp位为VdpdaA2的基因序列（编码SEQ ID No. 1所 示的VdpdaA2)，该基因位于ToxA启动子和其终止子之间，目的基因片段插入成功。
[0150] 二、互补突变体的获得及表型鉴定
[0151] 将步骤一获得重组载体VdpdaA2: :pSULPH-mut-RG#PB通过电击法转化导入根癌 农杆菌EHA105,获得重组农杆菌pSULPH-mut-RG#PB: :PDA2。按照实施例1的方法，将重组 农杆菌口3^^!1111^-1?#?8::?042与实施例1中的敲除突变体八￥(1?(1 &42-&共培养，得到敲 除突变体Λ VdpdaA2_a的互补转化子（以下简称互补转化子）。将互补转化子和敲除突变 体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b分别在PDA固体培养基上进行培养，进行表型观察。结果 如图10所示，与敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b相比，互补转化子的表型和敲除 突变体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b的表型没有明显的差异，都与V592菌株的表型基本一 致。
[0152] 三、产孢量测定
[0153] 用打孔器在菌株菌落边缘打取10个直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于装有查氏液 体培养基的锥形瓶中，在26°C、200rpm条件下摇培5天，用无菌的微孔滤布过滤培养物至无 菌的离心管中，再用250mL超纯水洗锥形瓶并用微孔滤布过滤至新的无菌离心管中，收集 分生孢子。将收集的分生孢子在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，用IOmL超纯水 重新悬浮沉淀，转移至无菌离心管，在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，收集沉淀， 获得分生孢子。用无菌水将收集的分生孢子浓度调至IX 106cfu/mL，然后准确吸取ImL分 生孢子悬浮液，接种至装有IOOmL查氏液体培养基的150mL的三角瓶中，在26°C，200rpm条 件下暗培养。在显微镜下用血球计数板测量分生孢子浓度，从第二天到第九天每24h测量1 次分生孢子浓度，共测8次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的分生孢子浓度是其三个 重复的平均值。
[0154] 结果表明从第六天开始，互补转化子的分生孢子产量明显高于敲除突变体 Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b (图6中B)，说明VdpdaA2基因与分生孢子产量相关VdpdaA2 基因参与了分生孢子的形成。
【主权项】
1. 一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法，是抑制目的大丽轮枝菌中 VdpdaA2的基因的表达，得到分生孢子产量低于所述目的大丽轮枝菌的重组大丽轮枝菌； 所述VdpdaA2为a)或b): a) 氨基酸序列是SEQIDNo. 1所示的蛋白质； b) 将SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有VdpdaA2活性的由a)衍生的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制目的大丽轮枝菌中VdpdaA2的 基因的表达是通过将所述VdpdaA2的基因敲除的方式实现的。3. 利用权利要求1或2所述方法获得的分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌。4. 抑制权利要求1所述VdpdaA2表达的物质、抑制权利要求1所述VdpdaA2的基因表 达的物质或降低权利要求1所述VdpdaA2活性的物质在培育抗大丽轮枝菌植物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为大丽轮枝菌的寄主。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述大丽轮枝菌的寄主为棉花。7. 抑制权利要求1所述VdpdaA2表达的物质、抑制权利要求1所述VdpdaA2的基因表 达的物质或降低权利要求1所述VdpdaA2活性的物质在制备大丽轮枝菌抑制剂中的应用。8. 权利要求1所述VdpdaA2,或权利要求1所述VdpdaA2相关的生物材料在调控大丽 轮枝菌分生孢子产量中的应用； 所述VdpdaA2相关的生物材料为下述Al)至A20)中的任一种： Al)核酸分子；所述核酸分子为编码权利要求1所述VdpdaA2的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织； A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官； A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-5)中任一所示 的基因： 1)其编码序列是SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子； 2)序列是SEQ ID No. 3的cDNA分子或DNA分子； 3)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述 VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子； 4)与2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述 VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子； 5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所 述VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子。
【专利摘要】本发明公开了大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用途。将大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株中的VdpdaA2基因敲除后获得的VdpdaA2基因敲除突变体产孢量明显低于大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株，表明VdpdaA2基因参与了分生孢子的形成。本发明首次鉴定了与大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2及其基因，为进一步阐明大丽轮枝菌的致病机理提供基础，将野生型大丽轮枝菌的VdpdaA2基因敲除得到的大丽轮枝菌突变体为大丽轮枝菌与宿主的互作机理研究提供了病原菌资源，本发明对棉花黄萎病的防治及培育抗大丽轮枝菌的棉花新品种具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12N1/15, C12N5/10, C12N1/21, C12N15/09, A01H5/00, C12N15/31, C12N15/63
【公开号】CN104893993
【申请号】CN201510297266
【发明人】高峰, 毛建才
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用途。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是一种土传的维管束系统病害，是由大丽轮枝菌引起的，其对棉花的 生产造成了严重的危害。自1935年，棉花黄萎病随着棉花种子的引进而传入我国，随后便 开始逐渐蔓延全国。尤其从20世纪90年代以后，棉花黄萎病在我国扩展蔓延极为迅速，其 中1993年棉花黄萎病最为严重，发病面积达266. 67万hm2,随后在1995、1996、1999、2000、 2002、2003年全国范围内连续爆发，损失十分严重，棉花黄萎病已对我国棉花生产以及可持 续发展构成极大威胁。
[0003] 棉花黄萎病是由半知菌亚门（Deutermycotina)淡色菌科（Mmonilaceae)轮 枝菌属（Verticillium)真菌引起，属内有若干个种，其中危害棉花的有大丽轮枝菌 (V. dahliae)和黑白轮枝菌（V. albo-atum)两个种。我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌 引起的。大丽轮枝菌没有寄主专化性，可以危害多种植物，从一年生的草本植物到多年生的 木本植物。大丽轮枝菌可以形成一种叫做黑色微菌核的休眠结构，可以在缺乏寄主的土壤 中存活长达数年。
[0004] 大丽轮枝菌主要以微菌核的形式越冬，微菌核作为其最主要的初侵染来源，在受 到植物根部分泌物的刺激时便会萌发。菌丝一般从植物根部侵入，随着植物的蒸腾作用向 植物的茎叶中扩展、定植，最终侵染整个植株。一般被大丽轮枝菌侵染过的植株都会表现出 萎蔫，干枯，叶脉失色，坏死等症状，维管束变褐是黄萎病最典型的症状。
[0005] 田黎等的研宄认为棉花黄萎病的发生发展与土壤中微菌核的数量密切相关。大丽 轮枝菌微菌核的多少通常与其致病力和抗逆性相关。有研宄显示，当土壤里棉花黄萎菌微 菌核达到〇. 03个/g 土时，就会导致棉花出现萎蔫症状，当土壤中微菌核含量达到0. 3个/g 土~I. 0个/g 土时，就会有20 %~50%的棉花植株发病，当土壤中微菌核含量达到3. 5个 /g 土以上，棉花植株都会发病。另有研宄表明，当土壤中微菌核含量达到0. 5个/g 土为引 起棉花发病的临界值。在田里面，当黄萎菌侵染莴苣后，土壤中的微菌核数量为至少50个 /g 土，而病害很重的田块，微菌核数目高达2400个/g 土。
[0006] 棉花是目前世界上种植面积最大的工业原料作物，在我国是仅次于粮食的第二大 农作物。棉花黄萎病是目前我国棉花生产过程中最具毁灭性的真菌病害。由于至今尚未研 制出效果显著的防治药剂和抗病品种，被称为棉花的"癌症"，因此如何控制黄萎病的猖獗 危害，已成为棉花生产可持续发展的关键问题。在这种情况下，研宄大丽轮枝菌的致病机 理，了解大丽轮枝菌与寄主的互作机理就显得更为重要。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2或其基因。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备分生孢子产量降低的重组大丽 轮枝菌的方法。
[0009] 本发明所提供的一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法，是抑制目 的大丽轮枝菌中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因的表达，得到分生孢子 产量低于所述目的大丽轮枝菌的重组大丽轮枝菌；
[0010] 所述大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2为a)或b):
[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 1所示的蛋白质；
[0012] b)将SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的由a)衍生的 蛋白质。
[0013] 其中，SEQ ID No. 1由395个氨基酸残基组成。
[0014] 上述b)中所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述b)中所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。
[0016] 上述b)中所述蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 2所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到的。
[0017] 上述方法中，所述分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的分生孢子产量低于所 述目的大丽轮枝菌；所述目的大丽轮枝菌为含有所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2的基因的大丽轮枝菌，如大丽轮枝菌野生型菌株V592。
[0018] 上述方法中，所述抑制目的大丽轮枝菌中所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2的基因的表达是通过将所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因敲 除的方式实现的。
[0019] 上述方法中，所述基因敲除可通过同源重组实现。
[0020] 本发明提供的利用所述制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法获得的 分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌也属于本发明保护的范围。
[0021] 本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2表达的物 质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质或降低所述大 丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的物质在培育抗大丽轮枝菌植物中的应用 也属于本发明保护的范围。
[0022] 上述应用中，所述抗大丽轮枝菌植物可为转基因植物。
[0023] 上述应用中，所述植物可为大丽轮枝菌的寄主；所述大丽轮枝菌的寄主可为双子 叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物可为棉花、番茄、向日葵、黄瓜等；所述单子叶植物 可为水稻、玉米、高粱、麦类、谷子等；所述大丽轮枝菌的寄主具体可为棉花。
[0024] 本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2表达的物 质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质或降低所述大 丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的物质在制备大丽轮枝菌抑制剂中的应用 也属于本发明保护的范围。
[0025] 上述应用中，所述大丽轮枝菌抑制剂可通过所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋 白VdpdaA2或所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因为靶点进行筛选。
[0026] 上文中，所述抑制大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物 质可为干扰大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质，如microRNA、 VdpdaA2的基因的反义基因表达的RNA。
[0027] 本发明还提供了所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2,或所述大丽轮 枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料在调控大_轮枝菌分生孢子产量中 的应用；
[0028] 所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料为下述Al)至 A20)中的任一种：
[0029] Al)核酸分子；所述核酸分子为编码大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2 的核酸分子；
[0030] A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒；
[0031] A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体；
[0032] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0033] A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物；
[0034] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0035] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0036] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0037] A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0038] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0039] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0040] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0041] A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0042] A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0043] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0044] A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0045] A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0046] A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0047] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0048] A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0049] 上述应用中，所述调控大丽轮枝菌分生孢子产量可为降低大丽轮枝菌分生孢子产 量。
[0050] 上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸 分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0051] 所述核酸分子为如下1)-5)中任一所不的基因：
[0052] 1)其编码序列是SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0053] 2)序列是SEQ ID No. 3的cDNA分子或DNA分子；
[0054] 3)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0055] 4)与2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0056] 5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述大丽 轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0057] 上述用于编码所述大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的核酸分子，本领 域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明 的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的核酸分子的核苷酸序列进行突 变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋 白VdpdaA2的核酸分子的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且编码所述大丽轮枝菌分 生孢子产量相关蛋白VdpdaA2,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0058] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 2的第1-1188位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。与本发明的SEQ ID No. 3的第1-1359位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或85%或更高， 或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软 件进行 评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用 来评价相关序列之间的同一性。
[0059] 所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次15min。
[0060] 上述75%或75%以上同一性，可为80 %、85%、90%或95%以上的同一性。
[0061] 其中，SEQ ID No. 2由1188个核苷酸组成，其编码序列是第1-1188位，编码SEQ ID No. 1所不的蛋白质。
[0062] 上述与所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料中，所述 表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转 录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如A2)所述的含有编码所述大丽轮枝 菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的DNA。
[0063] 上述与所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料中， A5)-A8)中任一所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希 氏菌属（Escherichia),欧文氏菌（Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium)、黄杆菌属 (Flavobacterium),产喊菌属（Alcaligenes),假单胞菌属（Pseudomonas),芽胞杆菌属 (Bacillus)等。A9)-A12)中任一所述的转基因细胞系，A13)-A16)中任一所述的转基因植 物组织，A17)-A20)中任一所述的转基因植物器官均不包括植物的繁殖材料。
[0064] 实验证明，将大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株中的VdpdaA2基因敲除后获得的 VdpdaA2基因敲除突变体产孢量明显低于大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株，VdpdaA2基因 与分生孢子产量相关，表明VdpdaA2基因参与了分生孢子的形成。在实际应用中，可以在目 的植物（如棉花）中表达干扰VdpdaA2基因表达的物质（如microRNA、VdpdaA2基因的反 义基因表达的RNA)提高目的植物对大丽轮枝菌的抗性，具体可以将干扰VdpdaA2基因表达 的DNA(如VdpdaA2基因的反义基因）导入受体植物中得到对大丽轮枝菌抗性提高的转基 因植物。在实际应用中，也可以以大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2或其基因为 靶点筛选防治大丽轮枝菌的药物。本发明首次鉴定了与大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2及其基因，为进一步阐明大丽轮枝菌的致病机理提供基础，将野生型大丽轮枝菌的 VdpdaA2基因敲除得到的大丽轮枝菌突变体为大丽轮枝菌与宿主的互作机理研宄提供了病 原菌资源，本发明对棉花黄萎病的防治及培育抗大丽轮枝菌的棉花新品种具有重要的应用 价值。
【附图说明】
[0065] 图1为PRF-HU2载体结构示意图。
[0066] 图2为重组载体pRF-HU2-PDA2的构建流程图。
[0067] 图3为敲除载体的构建策略图。
[0068] 图4为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的表型及Southern杂交验证结果。其 中，A为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的表型；B为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的 Southern杂交验证图谱：泳道1为大丽轮枝菌野生型菌株V592,泳道2和3分别为大丽轮 枝菌 VdpdaA2 敲除突变体Λ VdpdaA2_a 和Λ VdpdaA2_b。
[0069] 图5为VdpdaA2基因在大丽轮枝菌野生型菌株V592的菌核、菌丝和分生孢子中的 转录水平。其中，1为分生孢子，2为菌丝，3为菌核。
[0070] 图6为大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的生物学性状。其中，图A为表型结果；图 B为分生孢子产量的测定结果；图C为菌丝形态结果；WT和V592均为大丽轮枝菌野生型菌 株V592, Λ VdpdaA2为敲除突变体Λ VdpdaA2-a，EC2为敲除突变体VdpdaA2-a的互补转化 子。
[0071] 图7为敲除突变体Λ VdpdaA2分生孢子的萌发。WT为大丽轮枝菌野生型菌株 V592, Λ VdpdaA2 为敲除突变体Λ VdpdaA2-a。
[0072] 图8为以PDA2-S和PDA2-X为引物对对V592菌株的基因组DNA进行PCR扩增得 到的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为markerfOOO ;泳道1为阴性对照， 泳道2-7均为VdpdaA2基因全长的PCR扩增产物。
[0073] 图9为载体pSULPH-mut-RG#PB的结构示意图。
[0074] 图10为互补转化子的表型。
【具体实施方式】
[0075] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0076] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0077] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0078] 下述实施例中的棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌（V. dahliae)野生型菌株V592(彭 姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008， 20 (3) : 174~178.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所 用，不可作为其它用途使用。
[0079] 下述实施例中的载体 pRF_HU2 (Ronnie de Jonge，H. Peter van Esse， Karunakaran Maruthachalam，et al. Tomato immune receptor Velrecognizes effector of multiple fungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing[J]. PNAS，2012, 4(27) :5110~5115.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明 的相关实验所用，不可作为其它用途使用。该载体上有任何真菌生物基因组中没有的两个 酶切位点PacI和Nt. BbvCI，还含有真菌选择性标记一潮霉素标记和细菌选择性标记一卡 那霉素（Kan)标记，该载体的示意图如图1所示。
[0080] 下述实施例中的根癌农杆菌 EHA105 (Feng Gao，Bang-Jun Zhou，Guo-Ying Li， et al. A Glutamic Acid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae from an Insertional Mutagenesis Affects icrosclerotial Formation and Pathogenicity[J]. PLos One, 2010, 12(5) :el5319)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的 相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0081] 下述实施例中棉花为棉花品种108夫（Gossypium hirsutum L.)(彭姗，吕学莲， 高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008, 20 (3): 174~ 178.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其 它用途使用。
[0082] 下述实施例中的USER enzyme mix为NEB公司产品。
[0083] 下述实施例中的相关抗生素溶液的配制如下：
[0084] 潮霉素（Hyg，罗氏公司）工作浓度100 μ g/mL，头孢霉素（Cef)工作浓度为 300 μ g/mL，卡那霉素（Kan)工作浓度为50 μ g/mL，利福平（Rif)工作浓度为10 μ g/mL ;
[0085] 乙酰丁香酮（AS，IOmM):称取19. 62mg乙酰丁香酮，用IOmL蒸馏水溶解，采用浓度 为5M的KOH溶液调节pH至8,过滤灭菌后-20°C保存。
[0086] 2-N-玛琳乙磺酸（MES，1M):称取19. 52g MES，用80mL蒸馏水溶解，采用浓度为5M 的KOH溶液调节pH至5. 3,然后定容至IOOmL并用过滤器过滤灭菌，-20°C保存。
[0087] 10% (v/v)的甘油：10mL纯甘油，90mL蒸馏水，混匀。
[0088] 20% (v/v)的甘油：20mL纯甘油，80mL蒸馏水，混匀。
[0089] 50mM的L-天冬酰胺：将6. 6g L-天冬酰胺溶解到IL蒸馏水中，过滤灭菌。
[0090] 200 XTrace solution for Vogels salts: 5g 朽1 樣酸，5gZnS04 · 7H20, Ig Fe (NH4)2 (SO4) 2.6H20,0.25g CuSO4 .5H20,0.05g MgSO4 .H20,0.05g H3B03,0.05g Na2Mo O4 · 2H20, 1000 mL蒸馏水，过滤灭菌。
[0091] 50 X Vogels salts : 125g C6H9Na3O9, 250g KH2P04, 9. 3g MgSO4 · 6H20, 5g CaCl2 · 2H20,5mL 200XTrace solution，定容至 1000mL，过滤灭菌。
[0092] 1000 XTrace elements for DFM medium ：40mg Na2B4O7 ·IOH20,400mg CuSO4 ·5Η20, I. 2g FeSO4 · 7H20,700mg MnSO4 · H20,800mg Na2MoO4 · 2H20, IOg ZnSO 4 · 7H20, 1000 mL 蒸馏 水，过滤灭菌。
[0093] 2. 5XSalt solution ：3. 625g KH2PO4, 5. 125g K2HPO4, 0. 375g NaCl,1.160g MgSO4 · 6H20,0. 165g CaCl2 · 2H20,0. 0062g FeSO4 · 7H20,1. 250g (NH4)2SO4, 1000 mL 蒸馏水， 过滤灭菌。每种组分需称取一个溶解一个避免形成不溶物。
[0094] RA 培养基：50g 丁 二酸钠（C4H 404Na2 · 6H20)，12. Ig NaN03,20mL 50XVogels salts ( - N, - C)，950mL蒸馏水，高压灭菌，在用之前加上50mL灭过菌的浓度为20g/100mL 的葡萄糖水溶液。
[0095] 水琼脂IMAS培养基：将6g琼脂粉和146mL蒸馏水混合，高压灭菌保存。用的时候 微波炉融化后加入IMAS培养基的其它成分。
[0096] IMAS 固体培养基：将 120.0mL 2.5XSalt solution(60°C 预热），7mL 浓度为 20g/100mL的葡萄糖水溶液，7. 5mL 20% (v/v)的甘油和146mL水琼脂IMS培养基混合，使 得混合液中琼脂粉的最终浓度2g/100mL。待混合液冷却至55°C时，再加入12. OmL MES (浓 度为1M)，6. OmL乙酰丁香酮（浓度为IOmM)。
[0097] IMAS 液体培养基：120.0 mL 2. 5 X Salt solution (60 °C 预热），7mL 浓度为 20g/100mL 的葡萄糖水溶液，7. 5mL 20 % (v/v)的甘油，12. OmL MES (浓度为 1M)，6. OmL 乙 酰丁香酮（浓度为IOmM)。
[0098] 水琼脂DFM培养基：将IOg琼脂粉和358mL蒸馏水混合，高压灭菌保存。用的时候 微波炉融化后加入DFM培养基的其它成分。
[0099] DFM固体培养基：将31. 25mL浓度为20g/100mL的葡萄糖水溶液，100.0 mL浓度为 50mM的L-天冬酰胺（60°C预热），5. OmL浓度为2IOmM的MgSO4, 5. OmL溶液A (溶液A的pH 值为6,由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1. 12M的KH2POjP 0. 7M的KCL)， 0. 5mL 1000 XTrace elements和358mL的水琼脂DFM培养基混合，使得混合液中琼脂的终 浓度为2g/100mL。待混合液冷却到55°C加入所要求的抗生素。
[0100] 1 % (w/v)水琼脂培养基：将Ig的琼脂粉和99mL的蒸馏水混勾，高压灭菌保存。
[0101] 查氏液体培养基：2g NaNO3, Ig K2HPO4,0· 5g KCl，0· 5g MgSO4 · 7Η20,0· Olg FeSO4 · 7H20,30g鹿糖，蒸馏水定容至1000 mL ;高压灭菌。
[0102] 表1、引物序列（下划线表示酶切位点）
[0105] 实施例1、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的制备
[0106] 一、重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2的制备
[0107] 以棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌（V. dahliae)野生型菌株V592 (简称V592菌株） 的基因组DNA为模板，以PDA2up-s和PDA2up-x为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物， 将其命名为VdpdaA2基因左同源臂片段；
[0108] 以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA2down-s和PDA2down-x为引物进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物，将其命名为VdpdaA2基因右同源臂片段。
[0109] 采用PacI和Nt. BbvCI限制性内切酶双酶切pRF-HU2载体（图1)得到pRF-HU2 载体的两个线性化片段。
[0110] 将VdpdaA2基因左同源臂片段、VdpdaA2基因右同源臂片段与获得的PRF-HU2载 体的两个线性化片段进行连接，连接体系如表2所示，在37°C孵育20min，然后在25°C孵育 20min，即获得重组载体，命名为重组载体pRF-HU2-PDA2 (图2)。将重组载体pRF-HU2-PDA2 进行测序，结果正确，表明VdpdaA2基因左同源臂片段和VdpdaA2基因右同源臂片段分别插 入到了 PRF-HU2载体的。pRF-HU2-PDA2中的VdpdaA2基因左同源臂片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4所示，VdpdaA2基因右同源臂片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0111] 将重组载体PRF-HU2-PDA2转化入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，将其命 名为重组农杆菌PRF-HU2: :PDA2。
[0112] 表2、USER克隆体系
[0113]
[0114] 二、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的制备
[0115] 1、大丽轮枝菌分生孢子的获得
[0116] 将培养好的V592菌株打菌饼若干，并接种于含有250mL RA培养基的IL三角瓶 中，在26°C、200rpm的水平摇床上摇培5d，获得V592菌株的培养物。用灭过菌的微孔滤布 过滤V592菌株的培养物至无菌的50mL离心管中，然后将过滤物在14000g、4°C条件下离心 40min，弃上清，收集菌体沉淀。用IOmL ddH20重新悬浮菌体沉淀，然后在14000g、4°C条件 下再离心40min，弃上清，收集菌体沉淀；用5mL ddH20重新悬浮菌体沉淀，得到V592菌株的 分生孢子悬浮液。使用光学显微镜和血球计数板测定V592菌株的分生孢子悬浮液中的分 生孢子浓度，然后将V592菌株的分生孢子悬浮液在14000g、8°C条件下离心30min后，收集 分生孢子沉淀，用10% (v/v)的甘油重新悬浮沉淀的分生孢子，最终得到的分生孢子浓度 为I X IO8CfVmL的分生孢子悬浮液。将分生孢子悬浮液以每份ImL置于-80°C保存，可保 存1年，待用时用IMAS液体培养基将分生孢子浓度调至IX 107cfu/mL。
[0117] 2、重组农杆菌的培养
[0118] 将步骤一制备的重组农杆菌PRF-HU2: :PDA2的单菌落接种于50mL三角瓶中，装 有IOmL含有浓度为50 μ g/mL Kan (卡那霉素）和浓度为10 μ g/mL Rif (利福平）的LB液 体培养基，在28°C、100rpm条件下培养l-2d，得到重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2的种子液；将 100 μ L重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2的种子液接种于50mL锥形瓶中，装有IOmL含有浓度为 50 μ g/mL Kan的IMAS液体培养基，在28°C、IOOrpm条件下摇培至OD6c?达到0· 5-0. 7 ( -般 到第二天即可），得到重组农杆菌PRF-HU2: :PDA2菌液。
[0119] 3、将步骤2获得的重组农杆菌pRF-HU2: :PDA2菌液与步骤1的分生孢子浓度为 I X 107cfu/mL的分生孢子悬浮液等体积混合均匀，得到混合液。吸取200 μ L混合液并使 用涂布器将其均匀的涂布于铺有NC膜的IMAS固体培养基上，然后在26°C暗培养36小时。 培养结束后在无菌条件下将NC膜从IMAS固体培养基上转移到DFM(潮霉素浓度为150mg/ mL，头孢霉素浓度为300mg/mL)固体培养基上培养6-8d，待长出转化子后再将转化子转移 至PDA(潮霉素浓度为150mg/mL，头孢霉素浓度为300mg/mL)培养基中继续培养，其构建策 略如图3。挑选2个转化子分别命名为Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b，其表型如图4中A所 示。Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b是将V592菌株中的大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA2 的基因（简称VdpdaA2基因）敲除得到的重组大丽轮枝菌。大丽轮枝菌致病性相关蛋白 VdpdaA2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA2的基因 组基因如SEQ ID No. 3所示，大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA2的cDNA基因如SEQ ID No. 2所示。
[0120] 三、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的验证
[0121] 以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA2-ts和PDA2-tx为引物进行PCR扩增，获 得V592菌株的PCR产物，将V592菌株的PCR产物（SEQ ID NO. 3中的第17位至422位所示 的核苷酸序列）作为探针DNA，参照Riboprobe Systtem-SP6探针标记试剂盒（为Promega 产品，产品目录号为P1420)的说明书，使用a-[32P]dCTP进行探针DNA的标记。分别提取 步骤二得到的转化子（AVdpdaA2-a和AVdpdaA2-b)的基因组DNA，以PDA2-ts和PDA2-tx 为引物，进行Southern杂交验证，检测转化子中的VdpdaA2基因是否被敲除。
[0122] 图4中B的结果表明，V592菌株中可杂交得到一条明亮的条带，即VdpdaA2基因 的目的片段，而两个敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b中在相应的位置没有杂交出 相应的条带，此结果说明敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b中的VdpdaA2基因已经 被敲除。
[0123] 四、VdpdaA2基因在V592菌株中的表达分析
[0124] 分别提取V592菌株的菌核、菌丝和分生孢子的RNA，并反转录为cDNA，分别以 cDNA为模板，以PDA2_qs和PDA2_qx为引物，进行荧光定量qRT-PCR。以β -tubline基因 (DQ266153)作为内参基因，β-tubline-f 和 β-tubline-r 作为引物。
[0125] 图5中结果表明，VdpdaA2基因在V592菌株的菌丝中的转录水平明显高于在分生 孢子和菌核中的转录水平，在菌核中的转录水平最低，表明VdpdaA2基因在V592菌株中的 表达具有组织特异性。
[0126] 五、大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体的生物学性状
[0127] 首先将步骤二获得的大丽轮枝菌VdpdaA2敲除突变体Λ VdpdaA2_a和 Λ VdpdaA2-b分别移植到普通PDA培养基上，在26°C培养10d，然后分别对各菌株进行下述 生物学特性的观察和测定，以V592菌株为对照。
[0128] 1、培养性状观察
[0129] 用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板 中央，在26°C暗培养10d，根据突变菌株的菌落形态和黑色微菌核的多少等特征对突变菌 株进行表型类型分类，分类标准参考文献：彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病 快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008, 20(3) : 174~178。结果如图6中A，表明敲除突 变体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b在PDA培养基上的表型均为菌核型，在培养基的正面和 背面都产生黑色的微菌核，与V592菌株没有明显的差异。
[0130] 2、菌落生长速度测定
[0131] 用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板 中央，26°C暗培养，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，从第三天到第九天每天测量一次 菌落直径，共测7次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的菌落直径是其三个重复的平均 值，菌落生长速度=(第九天直径-第五天直径）+4。
[0132] 菌落生长速度测定结果显示：
[0133] A.在普通PDA培养基平板上，V592菌株的生长速度为3. 667mm/d，敲除突变体 Λ VdpdaA2_a 和Λ VdpdaA2_b 的分别为 3. 83mm/d、3. 82mm/d，敲除突变体Λ VdpdaA2_a 和 Λ VdpdaA2-b的菌落生长速度要比野生型菌株的菌落生长速度快。
[0134] V592菌株在第九天时的菌落直径为37mm，敲除突变体Λ VdpdaA2_a和 Λ VdpdaA2_b的分别为39mm、39mm，大于V592菌株的菌落直径。
[0135] 3、产孢量测定
[0136] 用打孔器在菌株菌落边缘打取10个直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于装有查氏液 体培养基的锥形瓶中，在26°C、200rpm条件下摇培5天，用无菌的微孔滤布过滤培养物至无 菌的离心管中，再用250mL超纯水洗锥形瓶并用微孔滤布过滤至新的无菌离心管中，收集 分生孢子。将收集的分生孢子在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，用IOmL超纯水 重新悬浮沉淀，转移至无菌离心管，在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，收集沉淀， 获得分生孢子。用无菌水将收集的分生孢子浓度调至IX 106cfu/mL，然后准确吸取ImL分 生孢子悬浮液，接种至装有IOOmL查氏液体培养基的150mL的三角瓶中，在26°C，200rpm条 件下暗培养。在显微镜下用血球计数板测量分生孢子浓度，从第二天到第九天每24h测量1 次分生孢子浓度，共测8次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的分生孢子浓度是其三个 重复的平均值。
[0137] 结果表明从第三天开始，敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b的产孢量均明 显低于V592菌株（图6中B)，敲除突变体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b在各个检测时间点 的产孢量没有显著差异，这表明VdpdaA2基因与分生孢子产量相关，VdpdaA2基因参与了分 生孢子的形成。
[0138] 4、分生孢子和菌丝形态观察
[0139] 分生孢子形态观察：收集同一时期相同培养条件下敲除突变体Λ VdpdaA2_a、 Λ VdpdaA2-b和V592菌株的分生孢子在显微镜下观察，以V592菌株为对照，观察敲除突变 体的分生孢子与V592菌株之间的差异。
[0140] 分生孢子形态观察结果：敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b的分生孢子形 态多为椭圆形，大多数里面有油滴，与V592菌株相比没有差异。
[0141] 菌丝形态观察：采用小室培养的方法（载玻片培养法），对菌株菌丝的形态进行观 察，即用灭菌的牙签在菌株菌落边缘打取直径约为5_的菌饼，倒置放在无菌的载玻片上， 将载玻片置于保湿的培养皿内，26°C暗培养3天，取出载玻片在显微镜下观察敲除突变体 的菌丝与V592菌株的菌丝微观结构。
[0142] 结果表明在保湿的培养皿中培养3天之后，敲除突变体Λ VdpdaA2-a和 Λ VdpdaA2_b形成的菌丝形态和V592菌株的菌丝形态无明显差异（图6中C)。
[0143] 5、显微观察敲除突变体分生孢子的萌发情况
[0144] 将敲除突变体Λ VdpdaA2_a、A VdpdaA2_b和V592菌株的菌饼分别接种在查氏培 养基中，在26°C、200rpm的摇床中培养24h，用无菌的滤布收集分生孢子悬浮液，用移液枪 吸取定量的分生孢子悬浮液，在显微镜下观察分生孢子萌发的情况。
[0145] 结果表明，V592菌株与敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b的分生孢子萌发 并没有明显差异（图7)。
[0146] 实施例2、互补突变体的表型
[0147] -、互补载体的构建
[0148] 1、以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA2-S和PDA2-X为引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为VdpdaA2基因（图8)，包含起始 密码子ATG和终止密码子TAG，大小为1359bp。以水为模板，进行上述实验，作为阴性对照。 该PCR产物的核苷酸序列是SEQ ID No. 3的第1位-第1359位所示的核苷酸序列。
[0149] 2、使用限制性内切酶Sail和SpeI双酶切步骤1得到的VdpdaA2基因的PCR扩 增产物，得到目的基因片段；将目的基因片段插入载体pSULPH-mut-RG#PB(其核苷酸序列 如SEQIDNo·6所示）的SalI和SpeI识别位点间，，保持载体pSULPH-mut-RG#PB的其它 序列不变，得到重组载体，将其命名为重组载体VdpdaA2: :pSULPH-mut-RG#PB。将重组载体 VdpdaA2: :pSULPH_mut-RG#PB 进行测序，结果表明重组载体 VdpdaA2: :pSULPH_mut-RG#PB 上自5'末端起第12617bp至第13976bp位为VdpdaA2的基因序列（编码SEQ ID No. 1所 示的VdpdaA2)，该基因位于ToxA启动子和其终止子之间，目的基因片段插入成功。
[0150] 二、互补突变体的获得及表型鉴定
[0151] 将步骤一获得重组载体VdpdaA2: :pSULPH-mut-RG#PB通过电击法转化导入根癌 农杆菌EHA105,获得重组农杆菌pSULPH-mut-RG#PB: :PDA2。按照实施例1的方法，将重组 农杆菌口3^^!1111^-1?#?8::?042与实施例1中的敲除突变体八￥(1?(1 &42-&共培养，得到敲 除突变体Λ VdpdaA2_a的互补转化子（以下简称互补转化子）。将互补转化子和敲除突变 体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b分别在PDA固体培养基上进行培养，进行表型观察。结果 如图10所示，与敲除突变体Λ VdpdaA2_a和Λ VdpdaA2_b相比，互补转化子的表型和敲除 突变体Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b的表型没有明显的差异，都与V592菌株的表型基本一 致。
[0152] 三、产孢量测定
[0153] 用打孔器在菌株菌落边缘打取10个直径为Icm的菌饼，将菌饼接种于装有查氏液 体培养基的锥形瓶中，在26°C、200rpm条件下摇培5天，用无菌的微孔滤布过滤培养物至无 菌的离心管中，再用250mL超纯水洗锥形瓶并用微孔滤布过滤至新的无菌离心管中，收集 分生孢子。将收集的分生孢子在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，用IOmL超纯水 重新悬浮沉淀，转移至无菌离心管，在4°C、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，收集沉淀， 获得分生孢子。用无菌水将收集的分生孢子浓度调至IX 106cfu/mL，然后准确吸取ImL分 生孢子悬浮液，接种至装有IOOmL查氏液体培养基的150mL的三角瓶中，在26°C，200rpm条 件下暗培养。在显微镜下用血球计数板测量分生孢子浓度，从第二天到第九天每24h测量1 次分生孢子浓度，共测8次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的分生孢子浓度是其三个 重复的平均值。
[0154] 结果表明从第六天开始，互补转化子的分生孢子产量明显高于敲除突变体 Λ VdpdaA2-a和Λ VdpdaA2-b (图6中B)，说明VdpdaA2基因与分生孢子产量相关VdpdaA2 基因参与了分生孢子的形成。
【主权项】
1. 一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法，是抑制目的大丽轮枝菌中 VdpdaA2的基因的表达，得到分生孢子产量低于所述目的大丽轮枝菌的重组大丽轮枝菌； 所述VdpdaA2为a)或b): a) 氨基酸序列是SEQIDNo. 1所示的蛋白质； b) 将SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有VdpdaA2活性的由a)衍生的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制目的大丽轮枝菌中VdpdaA2的 基因的表达是通过将所述VdpdaA2的基因敲除的方式实现的。3. 利用权利要求1或2所述方法获得的分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌。4. 抑制权利要求1所述VdpdaA2表达的物质、抑制权利要求1所述VdpdaA2的基因表 达的物质或降低权利要求1所述VdpdaA2活性的物质在培育抗大丽轮枝菌植物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为大丽轮枝菌的寄主。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述大丽轮枝菌的寄主为棉花。7. 抑制权利要求1所述VdpdaA2表达的物质、抑制权利要求1所述VdpdaA2的基因表 达的物质或降低权利要求1所述VdpdaA2活性的物质在制备大丽轮枝菌抑制剂中的应用。8. 权利要求1所述VdpdaA2,或权利要求1所述VdpdaA2相关的生物材料在调控大丽 轮枝菌分生孢子产量中的应用； 所述VdpdaA2相关的生物材料为下述Al)至A20)中的任一种： Al)核酸分子；所述核酸分子为编码权利要求1所述VdpdaA2的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织； A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官； A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-5)中任一所示 的基因： 1)其编码序列是SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子； 2)序列是SEQ ID No. 3的cDNA分子或DNA分子； 3)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述 VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子； 4)与2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述 VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子； 5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所 述VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子。
【专利摘要】本发明公开了大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用途。将大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株中的VdpdaA2基因敲除后获得的VdpdaA2基因敲除突变体产孢量明显低于大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株，表明VdpdaA2基因参与了分生孢子的形成。本发明首次鉴定了与大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2及其基因，为进一步阐明大丽轮枝菌的致病机理提供基础，将野生型大丽轮枝菌的VdpdaA2基因敲除得到的大丽轮枝菌突变体为大丽轮枝菌与宿主的互作机理研究提供了病原菌资源，本发明对棉花黄萎病的防治及培育抗大丽轮枝菌的棉花新品种具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12N1/15, C12N5/10, C12N1/21, C12N15/09, A01H5/00, C12N15/31, C12N15/63
【公开号】CN104893993
【申请号】CN201510297266
【发明人】高峰, 毛建才
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
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