长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应用
长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 硒是水产动物的必需微量元素之一，具有抗氧化，增强机体免疫能力，调节机体代 谢，增强繁殖能力，降低某些重金属中毒等功能。硒缺乏会造成鱼的谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)活性降低，机体抗氧化能力减弱，致使机体自由基堆积，防病抗病能力下降。硒能 显著提高水产动物的生长，增强水产动物的抵抗力，并且有机硒的效果要优于无机硒。
[0003] 酵母因为其生长速度快，培养方便，含有高达50 %以上的蛋白质，更富含丰富的B 族维生素（尤其是B1，B2)和众多对人体有益的矿物质，而成为了应用最广泛最安全的营养 微生物。对于一些微量营养元素，酵母还具有很强的富集作用，更能将有毒无机硒转化为被 无毒易吸收的有机硒，与其他的一些无机硒相比，富硒酵母存在以下几点优势：1.利用率 高；2.毒性低；3.营养价值高；4.硒含量高；5.生理活性高。因此利用酵母来富集硒是一 个安全又高效的办法，所以富硒酵母渐渐成为了目前科研中的研宄热点之一，目前实验室 应用较多的有：假丝酵母、裂殖酵母和一些酿酒酵母。而针对宿主动物筛选的内源益生菌可 以更好地竞争宿主肠道中的黏附位点，成为优势菌群并在停止摄入后具有持续定植功能。
[0004] 作为富硒酵母，富硒效率是评价其富硒性能的基本指标，包括酵母的生物量及有 机硒的转化率，而从原料利用与转化上来看，富硒条件是直接影响酵母富硒效率的重要因 素，因此确定富硒的最优发酵条件，可以有效地提高酵母的生物量及有机硒的转化率，综合 提高富硒效率，对富硒酵母的产品开发及生产应用具有实际指导意义。
[0005] 目前国内外常见的富硒酵母有酿酒酵母、汉逊酵母、假丝酵母等，细胞含硒量在 650~2050 μ g/g之间。未见有关长孢娄徳酵母作为富硒酵母的相关研宄的公开报导。
【发明内容】
[0006] 基于此，本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的富硒长孢娄徳酵母。
[0007] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0008] 一种长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)，其保藏编号为 CCTCC NO :M 2015301。
[0009] 本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法。
[0010] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0011] 长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，包括以下步骤：
[0012] 将长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)接种于所述YEF1D培养基中培 养，体积比百分比5% -10%的接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量分别为 20-30 %，20-30 %，40-60 %，使硒在 YEPD 培养基中终浓度为 10-20 μ g/mL，28-37 °C 振荡培 养24h_48h，得到富硒的长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)。
[0013] 在其中一个实施例中，接种量为10 %，培养时间为36h。
[0014] 在其中一个实施例中，于对数期6h，9h，12h时分3次梯度加硒，添加量分别为 25 %，25 %，50 %，使硒在YEH)培养基中终浓度为20 μ g/mL。
[0015] 本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的应用。
[0016] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0017] 上述保藏编号为CCTCC NO :M 2015301的长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)或者富硒的长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)在制备水产动物 有机硒饲料添加剂中的应用。
[0018] 在其中一个实施例中，所述水产动物为日本鳗麵。
[0019] 一种水产动物有机硒饲料添加剂，其活性物质含有上述长孢娄徳酵母 (Lodderomyces elongisporus)〇
[0020] 本发明所述的长抱类徳酵母（Lodderomyces elongisporus)已于2015年5月15 日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection,简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学），保藏日期 2015 年 5 月 15 日，保藏编号 CCTCC NO :M 2015301。
[0021] 本发明提供了一种新的长孢娄徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生产有机 硒的可行性，可作为富硒酵母菌株，在有机硒动物饲料添加剂的产品开发中具有良好应用 前景。
【附图说明】
[0022] 图1加硒方式对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
[0023] 图2为接种量对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
[0024] 图3为培养时间对SCLE01富集硒的影响结果示意图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0026] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0027] 实施例1
[0028] 实材料与方法
[0029] I. 1试验材料
[0030] I. I. 1 菌种
[0031] 本发明由发明人利用选择性培养基筛选分离自淡水鱼类肠道的长孢娄徳酵母，对 其进行ITS序列和hsp78基因分析，鉴定结果表明该菌属于长孢娄德酵母，是一株新的长孢 娄德酵母，其分类命名为Lodderomyces elongisporus，编号为SCLE01，并已于2015年5月 15日保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号为CCTCC NO :M 2015301。
[0032] 本发明所述的长孢洛德酵母SCLEOl (L. elongisporus SCLE01，保藏号为CCTCC NO :M 2015301)菌株的形态学特征为：菌落呈乳白色，略粗糙，固体培养基过夜培养后，菌 落小0. 5-lmm，表面比较光滑，边缘整齐，菌落隆起，致密度较高；在液体培养基中静置培养 后，培养液澄清且有沉淀，并有菌蹼出现；显微镜观察显示菌体呈椭圆形。
[0033] 以下保藏号为CCTCC NO :M 2015301的长孢娄徳酵母简称为SCLE01。
[0034] I. 1. 2 培养基
[0035] YEro :酵母粉（YE)1%，蛋白胨（P)2%，葡萄糖（D)2%。固体培养基添加1. 5% 的琼脂粉。
[0036] 麦芽汁培养基（ME):购自环凯微生物有限公司，固体培养基添加1. 5%的琼脂粉。
[0037] I. 1. 3试剂与设备
[0038] 亚硒酸钠、变色酸、盐酸苯肼、高氯酸、氯化钾、盐酸、EDTA_2Na均为分析纯。
[0039] 紫外-可见分光光度计（上海精科，UV 759)，洁净工作台（苏州安泰，SW-CJ)，台 式高速离心机（德国Sigma，3-18K)，恒温鼓风干燥箱（上海齐欣，DHG-9070A)，调温电热板 (常州澳华，DB-3C)，振荡培养箱（哈尔滨东联，HZQ-F160)。
[0040] 1. 2试验方法
[0041] 1.2.1菌种活化
[0042] SCLE01菌株保种菌液2%接种量接种于YEH)液体培养基中，30°C，190rpm，24h，活 化3次后备用。
[0043] 1. 2. 2菌株鉴定
[0044] 将SCLE01菌株纯化后富集，用生理盐水洗去培养基，加入小钢珠，用新芝高通量 组织研磨机进行研磨破碎后利用天根细菌基因组试剂盒进行DNA提取，将提取的DNA进行 ITS序列及hsp78序列扩增，并对扩增产物进行检测，将扩增成功的PCR产物送往生工生物 工程（上海）股份有限公司测序。测序结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据中进行同 源性检索。对测序结果进行分析。
[0045] ITS PCR扩增引物序列如下：
[0046] ITSl :5' 一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（SEQ ID NO. 1)
[0047] ITS4 :5' 一TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'（SEQ ID NO. 2)
[0048] Hsp78PCR扩增引物序列如下：
[0049] LEhsp78-F :5' 一TTGCTCCTCCAAGTGCT- 3,（SEQ ID NO. 3)
[0050] LEhsp78-R :5' 一CAACCCAAACATCTCCC-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0051] 长孢娄德酵母SCLE01经ITSl和ITS4引物扩增、测序、鉴定后获得了 495bp的扩 增产物，序列结果为 （SEQ ID NO. 5):
[0052] CTTACTGCACTTTTCTTATCTACACACGTGTTTTTGTTTTATTCTTAAAACTTGCTTTGGCAGTGGCTG CTTAATTGCTCTGCTGCCAGAGGATAAACTCAACCTAAATTTTTTATTTTAAACTAGTCAACTGATTATATTTATTA ATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATG AATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTT GAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGATGAGCAATACGCCAGGTTTGCTTGAAAGTTAGGAGGAGTA TTTATAACAATGTATTAGGTCTAACCACTCCATTGTGCTTAATAAAAAGCTCCAATCTATATTTCAAACTTCGACCT CAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAo
[0053] 长孢娄德酵母SCLEOl经LEhsp78-F和LEhsp78-R引物扩增、测序、鉴定后获得了 453bp的扩增产物，序列结果为（SEQ ID N0.6)
[0054] ACAAGATTGATTTCAAAAACACAATTATTGTTCTTACATCGAATTTGGGACA ACAAATATTGTTTGAT GATCCAAATGCTAGAGAAGACGGCAAAATTAATAAAGAGGTTAAAGACGCGGTATTGGAAAATCTCAAAAACCATT ACCCACCCGAATTTCTCAATCGTTTAGACGAATGCCTTGTCTTTAACAGGTTATCTAAGCATTCACTTCGTGAGATT CTTGCCATCAAGTTAAGAGAGATTGACGATAGATTATCACTGAAACGTATTGTACTCGATGTTTCCGAAAAAGCAAA GAAGATTCTTACTCAAAAGGGTTATGATCCAGCGTATGGTGCAAGACCATTGAATCGTGTATTGGCCAAGGAGGTGT TGAACCCATTGGCCAGAATGTTGATTAGTGGACAAATCCAAGAAGGTGAAACAGCAAAAATTGTAGATAAAAGGGG AG 0
[0055] 实施例2
[0056] 本实施例通过研宄淡水鱼源长孢娄徳酵母的耐硒能力、富硒发酵条件以评价其富 硒性能，通过单因素试验得出培养基加硒浓度、加硒方式、接种量和培养时间4因素的水平 范围，为评价淡水鱼源长孢娄徳酵母作为富硒酵母菌株的可行性提供依据。
[0057] 2. 1生物量及硒含量测定方法
[0058] 2. I. 1生物量测定
[0059] 振荡培养完成后取培养液，6000rpm离心5min，菌体沉淀用蒸馏水洗绦3次，收集 菌体，90°C干燥至恒重后称量。
[0060] 2. 1. 2硒含量的测定
[0061] Se ( IV )能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮 染料，生成的红色偶氮染料的吸光度与一定含量范围的硒成正比，利用紫外-可见分光光 度计在520波长下测定其吸光度，用标准曲线法便可求得的硒酵母中的硒含量。
[0062] 2. 2耐硒性能的确定
[0063] 向YEH)液体培养基中加入已灭菌的浓度为lmg/mL的Na2SeO3溶液，使培养基中的 Na2SeO3浓度分别为0、10、20、30、40、50、90 μ g/mL。将实施例1所述活化好的SCLEOl菌种 按3%接种量接种，用装液量为501^的2501^摇瓶，30°〇振荡培养（190印111)3011，观察菌体 颜色，并测定SCLEOl生物量及菌体硒含量，考察SCLEOl的耐硒性能，初步确定最适加硒浓 度。结果请参见表2-1
[0064] 表2-1 SCLEOl菌株的耐硒性能
[0065]
[0066] 注：+为红色，代表有红色单质硒出现；一为白色，代表无红色单质硒出现。
[0067] 从表2-1可以看出，随着硒浓度的升高，SCLEOl的生物量逐渐减少，当培养基硒浓 度达到30 μ g/mL生物量只有2. 51g/L，并且开始出现单质硒，因此，长孢娄徳酵母SCLEO1的 最大耐硒浓度为20 μ g/mL，为保证其生长不受抑制，同时获得较高的菌体硒含量，确定培养 基中硒的终浓度在10-20 μ g/mL为适宜。
[0068] 2· 3硒添加方式的选择
[0069] 根据初步确定的加硒浓度，设计5种硒添加方式，分别是方式1 :培养初期（Oh) - 次性添加，方式2 :对数生长期^h) -次性添加，方式3 :对数生长期^h，12h)两次等量添 加（50 %，50 % )，方式4 :对数生长期（6h，9h，12h)三次添加（25 %，25 %，50 % )，以及方式 5 :稳定期（20h) -次性添加。按3%接种量接种，用装液量为50mL的250mL摇瓶，30°C振 荡培养（190rpm) 30h，测定SCLEOl生物量及菌体硒含量，考察硒添加方式对SCLEOl的生长 及富硒过程的影响，初步确定最适加硒方式。实验结果参见图1。
[0070] 由图1可看出，在对数生长期（6、8、12h)分3次加硒的方式，SCLEOl的生物量最 高，同时菌体硒含量也最高，达到700 μ g/g以上，因此，确定长孢娄徳酵母SCLEOl的加硒方 式为对数生长期^、8、12h)3次添加。
[0071] 2. 4接种量的选择
[0072] 根据SCLEOl菌株耐硒性能及硒添加方式的初步确定，以体积百分比为1%、2%、 4%、5%、8%、10%的接种量接种，30°0振荡培养（190印111)3011，测定30^01生物量及菌体 硒含量，考察接种量对SCLEOl的生长及富硒过程的影响，初步确定最适接种量。实验结果 参见图2。
[0073] 由图2可看出，接种量为1%时，生物量较低，不利于酵母对硒的吸收与转化，所以 硒含量也较低。与前面两个因素相比，接种量对SCLEOl的硒含量影响较小，2%-10%的接 种量硒含量都在600 μ g/g以上，其中5 %、8%和10%的接种量SCLEOl的生物量较高，因 此，长孢娄徳酵母SCLEOl的接种量适宜范围是5% -10%。
[0074] 2. 5培养时间的选择
[0075] 根据初步确定的加硒浓度、加硒方式、接种量，将SCLEOl菌株分别培养24h、36h、 48h、60h，测定SCLEOl生物量及菌体硒含量，考察培养时间对SCLEOl的生长及富硒过程的 影响，初步确定最适培养时间。实验结果参见图3。
[0076] 由图3可知，随着培养时间的增加，SCLEOl的生物量和富硒量都逐渐升高。培养 至36h时酵母的硒含量和生物量最高，随后继续培养开始降低。因此，长孢娄徳酵母SCLEOl 的培养时间范围确定为24-48h。
[0077] 2. 6富硒最优组合验证试验
[0078] 根据上述实验确定的长孢娄徳酵母SCLEOl最优发酵条件进行验证试验。
[0079] 根据单因素试验对SCLEOl菌株的富硒培养条件进行优化，用优化后的条件 (50mL/250mL装液量，30°C，190rpm振荡频率，10%接种量，加硒浓度20 μ g/mL，于对数期分 3次出11，911，1211时）添加，每次添加量为25%，25%，50%，培养3611)进行发酵培养，结果 见表4。
[0080] 表2-2 SCLEOl最优组合验证试验结果（均值土标准误，η = 3)
[0081]
[0082] 实施例3
[0083] 3· 1试验材料
[0084] 本试验所用酵母菌为已经分离、鉴定的淡水鱼类肠道源菌株：长孢娄徳酵母 (SCLE01，保藏号CCTCC NO. M 2015301)。日本鳗麵幼鱼及全价饲料（作为基础饲料）购自 东莞市银华鳗鱼养殖有限公司。溶菌酶（LZM)购自南京建成生物工程研宄所。
[0085] 3. 2试验方法
[0086] 3. 2. 1富硒酵母制备
[0087] 根据前期试验结果制备富硒酵母，具体条件如下：10%接种量，加硒浓度20yg/ mL(在培养基中的终浓度），于对数期分3次（6h，9h，12h时）加入，依次加入的量为25%， 25%，50%，30°0，190印111振荡培养3611，得到富硒长孢娄徳酵母。然后测定富硒酵母的生物 量及菌体硒含量，并计算转化率。生物量测定方法为：培养完成后取培养液，6000rpm离心 5min，菌体沉淀用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，90°C干燥至恒重后称量。硒含量的测定根据 Se(IV)能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮染料，生 成的红色偶氮染料的吸光度与一定含量范围的硒成正比的原理利用紫外-可见分光光度 计在520波长下测定其吸光度，用标准曲线法便可求得的硒酵母中的硒含量。
[0088] 3. 2. 2养殖试验设计
[0089] 240尾鳗麵，随机分为4个试验组，分别为低硒酵母组、高硒酵母组、空白组和酵母 对照组，每组3个平行，每平行20尾。其中低硒酵母组投喂添加富硒酵母，使最终有机硒含 量为0. 21mg/kg的基础饲料；高硒酵母组投喂添加富硒酵母，使最终有机硒含量为0. 42mg/ kg的基础饲料；空白组仅投喂基础饲料；酵母对照组投喂 添加终浓度为109cfu/g普通长孢 娄德酵母的基础饲料。每日投喂2次（9:00和17:00)，日投喂量控制在体重的2~4%，根 据上次摄食情况进行调整。试验持续60天，试验期间，每天换水一次，换水量1/6,水温在 20~22°C，全天充气，溶氧含量在5. 00mg/L以上，pH 7. 5-8. 5之间，总氨氮小于0. 5mg/L。
[0090] 3. 2. 3生长性能分析
[0091] 分别于试验开始时和第60天称量鳗麵体重，计算增重率计算公式如下：
[0092] 增重率（WGR，％ ) = (Wt- Wtl) X 100/W0
[0093] 式中，Wt为终末体质量（g)，W。为初始体质量（g)，。
[0094] 3. 2. 4溶菌酶活性检测
[0095] 于试验的第60天随机抽取3尾饅麵，采集血液，室温放置lh，1500Xg 4°C离心 IOmin分离血清，-80°C保存。采用南京建成生物工程研宄所试剂盒检测上述样品的溶菌酶 活性水平。
[0096] 3. 2. 6数据处理
[0097] 试验数据采用SPSS 13.0软件分析，方差齐性时进行Duncan多重比较，方差非齐 性则采用Tamhane' S T2法进行方差分析。
[0098] 3. 2 结果
[0099] 3. 2. 1富硒酵母发酵结果
[0100] 本实施例制备的富硒酵母的生物量为7. 02±0. 18g/L，菌体硒含量为1632 μ g/g， 其中有机硒含量为1566 μ g/g，有机硒转化率为95. 96 ±0. 22%。
[0101] 3. 2. 2长孢娄德酵母、富硒酵母对饅麵生长性能的影响
[0102] 饲料中添加较高硒含量的富硒长孢娄德酵母会显著提价鳗麵的增重率，提高百分 比为134. 88%，但是，饲料中添加较低硒含量的娄德酵母和无硒的娄德酵母喂养鳗麵，在 60天的试验期内，不会显著影响鳗麵的增重率。（表3. 1)。
[0103] 表3. 1富硒益生菌对鳗鱼生长性能的影响
[0104]
[0105] 注：数据为平均值土标准误，同列比较，上标字母不同表示有显著差异，（P < 0· 05) 〇
[0106] 3. 3. 3娄德酵母、富硒娄德酵母对鳗麵血清溶菌酶水平的影响
[0107] 投喂高硒含量富硒酵母60天后鳗麵血清溶菌酶活性提高了 129. 63%，与低硒酵 母组和空白组，无硒酵母对照组相比，具有统计学上的显著性，而饲料添加低硒含量酵母和 无硒酵母则对鳗麵血清溶菌酶活性无显著影响。（表3. 2)。
[0108] 表 3. 2
[0109]
[0110] 注：数据为平均值土标准误，同行比较，上标字母不同表示有显著差异，（P < 0· 05) 〇
[0111] 实施例4
[0112] 4.1试验材料
[0113] 本试验所用酵母菌为淡水鱼类肠道源菌株：长孢娄徳酵母（SCLE01，保藏号CCTCC NO :M 2015301)。吉富罗非鱼幼鱼购自罗非鱼良种场，基础饲料配方见表4.1。
[0114] 表4-1基础饲料组成（风干基础）
[0115]
[0117] 每千克基础饲粮中硒的实测值Measured value of selenium content of per kg basal diets :0·250mg〇
[0118] 4. 2试验方法
[0119] 4. 2. I富硒酵母制备
[0120] 同实施例3。
[0121] 4. 2. 2养殖试验设计
[0122] 吉富罗非鱼600尾，平均体重11. 8±0. 22g，暂养7d后开始饲养实验，实验共70d。 按照硒添加量不同，试验分5组，分别为0. 0mg/kg(0)、酵母菌（A)、0. 4mg/kg(B)、0. 6mg/ kg(C)、0. 8mg/kg(D)，每组3个重复，每个重复40尾鱼。其中，O组饲喂基础饲料，A、B、C、 D各组饲喂基础饲料中添加总菌数相同，但娄德酵母和富硒娄德酵母比例不同的饲料。试 验在ImXO. 6mX0.8m网箱中进行，每组网箱置于2mX2mX Im的室外水泥池，总水体量为 3.5m3。每日投喂2次（9:00和17:00)，，饱饲量投喂。试验期隔日每池换水1/10,用电加 热棒控温，保持水温25°C左右，24h气泵充气，使溶氧含量在5. 00mg/L以上，pH 7. 5-8. 5之 间，总氨氮小于〇. 5mg/L。
[0123] 4. 2. 3生长性能分析
[0124] 分别于试验开始时和第70天称量罗非鱼体重，计算特定生长率公式如下：
[0125] 特定生长率（SGR, % ) = (InWt - InWO) X 100/t
[0126] 式中，Wt为终末体质量（g)，WO为初始体质量（g)，t为饲养天数。
[0127] 4. 2. 4数据处理
[0128] 试验数据采用SPSS 13.0软件分析，方差齐性时进行Duncan多重比较，方差非齐 性则采用Tamhane' S T2法进行方差分析。
[0129] 4. 3试验结果
[0130] 由表4-2可知：饲养70d后，添加酵母、0. 4mg/kg、0. 6mg/kg组的特定生长率均显 著高于〇. 〇mg/kg和0. 8mg/kg组（P〈0. 05)，其中以0. 6mg/kg组最高，表明在饲养罗非鱼时 使用〇. 6mg/kg硒的添加量较适合，只添加娄德酵母对罗非鱼的生长也有一定的促进作用。
[0131] 表4-2罗非鱼特定生长率
[0132]
[0133] 注：同列中数值中无相同字母表示存在显著差异（P〈0. 05)。
[0134] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0135] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)，其特征在于，其保藏编号为 CCTCCNO：M2015301〇2. -种长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)的富硒培养方法，其特征在于， 包括以下步骤： 将权利要求1所述的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)接种于所述YEF1D培养基中培养，体积百分比5% -10%的接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量 分别为 20-30 %，20-30 %，40-60 %，使硒在YEPD培养基中终浓度为 10-20yg/mL，28-37°C 振荡培养24h_48h，得到富硒的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)。3. 根据权利要求2所述的富硒培养方法，其特征在于，接种量为10%，培养时间为36h。4. 根据权利要求2或3所述的富硒培养方法，其特征在于，于对数期6h，9h，12h时分3 次加硒，添加量分别为25 %，25 %，50 %，使硒在YEH)培养基中终浓度为20yg/mL。5. 由权利要求2-4任一项所述富硒培养方法得到的富硒的长孢娄徳酵母 (Lodderomyceselongisporus)〇6. 权利要求1所述的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)或权利要求5所述 的富硒的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)在制备水产动物有机硒饲料添加剂 中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水产动物为鳗麵或罗非鱼。8. -种水产动物有机硒饲料添加剂，其特征在于，其活性物质含有权利要求书1所述 的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)或权利要求5所述的富硒的长孢娄徳酵母 (Lodderomyceselongisporus)〇9. 根据权利要求8所述的水产动物有机硒饲料添加剂，其特征在于，所述水产动物为 鳗麵或罗非鱼。
【专利摘要】本发明涉及一种长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015301。该长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，包括以下步骤：将上述的长孢娄徳酵母接种于所述YEPD培养基中培养，5％-10％接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，硒在培养基中的终浓度为10-20μg/mL，培养24h-48h。本发明所述的长孢娄徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生产有机硒的可行性，可作为富硒酵母菌株，在有机硒动物饲料添加剂的产品开发中具有良好应用前景。CCTCC NO:M 201530120150515
【IPC分类】C12N1/16, A23K1/16, A23K1/18
【公开号】CN104893994
【申请号】CN201510314111
【发明人】郝乐, 柯浩, 刘振兴, 马艳平, 梁志凌, 马江耀
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月9日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 硒是水产动物的必需微量元素之一，具有抗氧化，增强机体免疫能力，调节机体代 谢，增强繁殖能力，降低某些重金属中毒等功能。硒缺乏会造成鱼的谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)活性降低，机体抗氧化能力减弱，致使机体自由基堆积，防病抗病能力下降。硒能 显著提高水产动物的生长，增强水产动物的抵抗力，并且有机硒的效果要优于无机硒。
[0003] 酵母因为其生长速度快，培养方便，含有高达50 %以上的蛋白质，更富含丰富的B 族维生素（尤其是B1，B2)和众多对人体有益的矿物质，而成为了应用最广泛最安全的营养 微生物。对于一些微量营养元素，酵母还具有很强的富集作用，更能将有毒无机硒转化为被 无毒易吸收的有机硒，与其他的一些无机硒相比，富硒酵母存在以下几点优势：1.利用率 高；2.毒性低；3.营养价值高；4.硒含量高；5.生理活性高。因此利用酵母来富集硒是一 个安全又高效的办法，所以富硒酵母渐渐成为了目前科研中的研宄热点之一，目前实验室 应用较多的有：假丝酵母、裂殖酵母和一些酿酒酵母。而针对宿主动物筛选的内源益生菌可 以更好地竞争宿主肠道中的黏附位点，成为优势菌群并在停止摄入后具有持续定植功能。
[0004] 作为富硒酵母，富硒效率是评价其富硒性能的基本指标，包括酵母的生物量及有 机硒的转化率，而从原料利用与转化上来看，富硒条件是直接影响酵母富硒效率的重要因 素，因此确定富硒的最优发酵条件，可以有效地提高酵母的生物量及有机硒的转化率，综合 提高富硒效率，对富硒酵母的产品开发及生产应用具有实际指导意义。
[0005] 目前国内外常见的富硒酵母有酿酒酵母、汉逊酵母、假丝酵母等，细胞含硒量在 650~2050 μ g/g之间。未见有关长孢娄徳酵母作为富硒酵母的相关研宄的公开报导。
【发明内容】
[0006] 基于此，本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的富硒长孢娄徳酵母。
[0007] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0008] 一种长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)，其保藏编号为 CCTCC NO :M 2015301。
[0009] 本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法。
[0010] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0011] 长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，包括以下步骤：
[0012] 将长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)接种于所述YEF1D培养基中培 养，体积比百分比5% -10%的接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量分别为 20-30 %，20-30 %，40-60 %，使硒在 YEPD 培养基中终浓度为 10-20 μ g/mL，28-37 °C 振荡培 养24h_48h，得到富硒的长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)。
[0013] 在其中一个实施例中，接种量为10 %，培养时间为36h。
[0014] 在其中一个实施例中，于对数期6h，9h，12h时分3次梯度加硒，添加量分别为 25 %，25 %，50 %，使硒在YEH)培养基中终浓度为20 μ g/mL。
[0015] 本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的应用。
[0016] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0017] 上述保藏编号为CCTCC NO :M 2015301的长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)或者富硒的长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)在制备水产动物 有机硒饲料添加剂中的应用。
[0018] 在其中一个实施例中，所述水产动物为日本鳗麵。
[0019] 一种水产动物有机硒饲料添加剂，其活性物质含有上述长孢娄徳酵母 (Lodderomyces elongisporus)〇
[0020] 本发明所述的长抱类徳酵母（Lodderomyces elongisporus)已于2015年5月15 日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection,简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学），保藏日期 2015 年 5 月 15 日，保藏编号 CCTCC NO :M 2015301。
[0021] 本发明提供了一种新的长孢娄徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生产有机 硒的可行性，可作为富硒酵母菌株，在有机硒动物饲料添加剂的产品开发中具有良好应用 前景。
【附图说明】
[0022] 图1加硒方式对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
[0023] 图2为接种量对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
[0024] 图3为培养时间对SCLE01富集硒的影响结果示意图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0026] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0027] 实施例1
[0028] 实材料与方法
[0029] I. 1试验材料
[0030] I. I. 1 菌种
[0031] 本发明由发明人利用选择性培养基筛选分离自淡水鱼类肠道的长孢娄徳酵母，对 其进行ITS序列和hsp78基因分析，鉴定结果表明该菌属于长孢娄德酵母，是一株新的长孢 娄德酵母，其分类命名为Lodderomyces elongisporus，编号为SCLE01，并已于2015年5月 15日保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号为CCTCC NO :M 2015301。
[0032] 本发明所述的长孢洛德酵母SCLEOl (L. elongisporus SCLE01，保藏号为CCTCC NO :M 2015301)菌株的形态学特征为：菌落呈乳白色，略粗糙，固体培养基过夜培养后，菌 落小0. 5-lmm，表面比较光滑，边缘整齐，菌落隆起，致密度较高；在液体培养基中静置培养 后，培养液澄清且有沉淀，并有菌蹼出现；显微镜观察显示菌体呈椭圆形。
[0033] 以下保藏号为CCTCC NO :M 2015301的长孢娄徳酵母简称为SCLE01。
[0034] I. 1. 2 培养基
[0035] YEro :酵母粉（YE)1%，蛋白胨（P)2%，葡萄糖（D)2%。固体培养基添加1. 5% 的琼脂粉。
[0036] 麦芽汁培养基（ME):购自环凯微生物有限公司，固体培养基添加1. 5%的琼脂粉。
[0037] I. 1. 3试剂与设备
[0038] 亚硒酸钠、变色酸、盐酸苯肼、高氯酸、氯化钾、盐酸、EDTA_2Na均为分析纯。
[0039] 紫外-可见分光光度计（上海精科，UV 759)，洁净工作台（苏州安泰，SW-CJ)，台 式高速离心机（德国Sigma，3-18K)，恒温鼓风干燥箱（上海齐欣，DHG-9070A)，调温电热板 (常州澳华，DB-3C)，振荡培养箱（哈尔滨东联，HZQ-F160)。
[0040] 1. 2试验方法
[0041] 1.2.1菌种活化
[0042] SCLE01菌株保种菌液2%接种量接种于YEH)液体培养基中，30°C，190rpm，24h，活 化3次后备用。
[0043] 1. 2. 2菌株鉴定
[0044] 将SCLE01菌株纯化后富集，用生理盐水洗去培养基，加入小钢珠，用新芝高通量 组织研磨机进行研磨破碎后利用天根细菌基因组试剂盒进行DNA提取，将提取的DNA进行 ITS序列及hsp78序列扩增，并对扩增产物进行检测，将扩增成功的PCR产物送往生工生物 工程（上海）股份有限公司测序。测序结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据中进行同 源性检索。对测序结果进行分析。
[0045] ITS PCR扩增引物序列如下：
[0046] ITSl :5' 一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（SEQ ID NO. 1)
[0047] ITS4 :5' 一TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'（SEQ ID NO. 2)
[0048] Hsp78PCR扩增引物序列如下：
[0049] LEhsp78-F :5' 一TTGCTCCTCCAAGTGCT- 3,（SEQ ID NO. 3)
[0050] LEhsp78-R :5' 一CAACCCAAACATCTCCC-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0051] 长孢娄德酵母SCLE01经ITSl和ITS4引物扩增、测序、鉴定后获得了 495bp的扩 增产物，序列结果为 （SEQ ID NO. 5):
[0052] CTTACTGCACTTTTCTTATCTACACACGTGTTTTTGTTTTATTCTTAAAACTTGCTTTGGCAGTGGCTG CTTAATTGCTCTGCTGCCAGAGGATAAACTCAACCTAAATTTTTTATTTTAAACTAGTCAACTGATTATATTTATTA ATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATG AATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTT GAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGATGAGCAATACGCCAGGTTTGCTTGAAAGTTAGGAGGAGTA TTTATAACAATGTATTAGGTCTAACCACTCCATTGTGCTTAATAAAAAGCTCCAATCTATATTTCAAACTTCGACCT CAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAo
[0053] 长孢娄德酵母SCLEOl经LEhsp78-F和LEhsp78-R引物扩增、测序、鉴定后获得了 453bp的扩增产物，序列结果为（SEQ ID N0.6)
[0054] ACAAGATTGATTTCAAAAACACAATTATTGTTCTTACATCGAATTTGGGACA ACAAATATTGTTTGAT GATCCAAATGCTAGAGAAGACGGCAAAATTAATAAAGAGGTTAAAGACGCGGTATTGGAAAATCTCAAAAACCATT ACCCACCCGAATTTCTCAATCGTTTAGACGAATGCCTTGTCTTTAACAGGTTATCTAAGCATTCACTTCGTGAGATT CTTGCCATCAAGTTAAGAGAGATTGACGATAGATTATCACTGAAACGTATTGTACTCGATGTTTCCGAAAAAGCAAA GAAGATTCTTACTCAAAAGGGTTATGATCCAGCGTATGGTGCAAGACCATTGAATCGTGTATTGGCCAAGGAGGTGT TGAACCCATTGGCCAGAATGTTGATTAGTGGACAAATCCAAGAAGGTGAAACAGCAAAAATTGTAGATAAAAGGGG AG 0
[0055] 实施例2
[0056] 本实施例通过研宄淡水鱼源长孢娄徳酵母的耐硒能力、富硒发酵条件以评价其富 硒性能，通过单因素试验得出培养基加硒浓度、加硒方式、接种量和培养时间4因素的水平 范围，为评价淡水鱼源长孢娄徳酵母作为富硒酵母菌株的可行性提供依据。
[0057] 2. 1生物量及硒含量测定方法
[0058] 2. I. 1生物量测定
[0059] 振荡培养完成后取培养液，6000rpm离心5min，菌体沉淀用蒸馏水洗绦3次，收集 菌体，90°C干燥至恒重后称量。
[0060] 2. 1. 2硒含量的测定
[0061] Se ( IV )能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮 染料，生成的红色偶氮染料的吸光度与一定含量范围的硒成正比，利用紫外-可见分光光 度计在520波长下测定其吸光度，用标准曲线法便可求得的硒酵母中的硒含量。
[0062] 2. 2耐硒性能的确定
[0063] 向YEH)液体培养基中加入已灭菌的浓度为lmg/mL的Na2SeO3溶液，使培养基中的 Na2SeO3浓度分别为0、10、20、30、40、50、90 μ g/mL。将实施例1所述活化好的SCLEOl菌种 按3%接种量接种，用装液量为501^的2501^摇瓶，30°〇振荡培养（190印111)3011，观察菌体 颜色，并测定SCLEOl生物量及菌体硒含量，考察SCLEOl的耐硒性能，初步确定最适加硒浓 度。结果请参见表2-1
[0064] 表2-1 SCLEOl菌株的耐硒性能
[0065]
[0066] 注：+为红色，代表有红色单质硒出现；一为白色，代表无红色单质硒出现。
[0067] 从表2-1可以看出，随着硒浓度的升高，SCLEOl的生物量逐渐减少，当培养基硒浓 度达到30 μ g/mL生物量只有2. 51g/L，并且开始出现单质硒，因此，长孢娄徳酵母SCLEO1的 最大耐硒浓度为20 μ g/mL，为保证其生长不受抑制，同时获得较高的菌体硒含量，确定培养 基中硒的终浓度在10-20 μ g/mL为适宜。
[0068] 2· 3硒添加方式的选择
[0069] 根据初步确定的加硒浓度，设计5种硒添加方式，分别是方式1 :培养初期（Oh) - 次性添加，方式2 :对数生长期^h) -次性添加，方式3 :对数生长期^h，12h)两次等量添 加（50 %，50 % )，方式4 :对数生长期（6h，9h，12h)三次添加（25 %，25 %，50 % )，以及方式 5 :稳定期（20h) -次性添加。按3%接种量接种，用装液量为50mL的250mL摇瓶，30°C振 荡培养（190rpm) 30h，测定SCLEOl生物量及菌体硒含量，考察硒添加方式对SCLEOl的生长 及富硒过程的影响，初步确定最适加硒方式。实验结果参见图1。
[0070] 由图1可看出，在对数生长期（6、8、12h)分3次加硒的方式，SCLEOl的生物量最 高，同时菌体硒含量也最高，达到700 μ g/g以上，因此，确定长孢娄徳酵母SCLEOl的加硒方 式为对数生长期^、8、12h)3次添加。
[0071] 2. 4接种量的选择
[0072] 根据SCLEOl菌株耐硒性能及硒添加方式的初步确定，以体积百分比为1%、2%、 4%、5%、8%、10%的接种量接种，30°0振荡培养（190印111)3011，测定30^01生物量及菌体 硒含量，考察接种量对SCLEOl的生长及富硒过程的影响，初步确定最适接种量。实验结果 参见图2。
[0073] 由图2可看出，接种量为1%时，生物量较低，不利于酵母对硒的吸收与转化，所以 硒含量也较低。与前面两个因素相比，接种量对SCLEOl的硒含量影响较小，2%-10%的接 种量硒含量都在600 μ g/g以上，其中5 %、8%和10%的接种量SCLEOl的生物量较高，因 此，长孢娄徳酵母SCLEOl的接种量适宜范围是5% -10%。
[0074] 2. 5培养时间的选择
[0075] 根据初步确定的加硒浓度、加硒方式、接种量，将SCLEOl菌株分别培养24h、36h、 48h、60h，测定SCLEOl生物量及菌体硒含量，考察培养时间对SCLEOl的生长及富硒过程的 影响，初步确定最适培养时间。实验结果参见图3。
[0076] 由图3可知，随着培养时间的增加，SCLEOl的生物量和富硒量都逐渐升高。培养 至36h时酵母的硒含量和生物量最高，随后继续培养开始降低。因此，长孢娄徳酵母SCLEOl 的培养时间范围确定为24-48h。
[0077] 2. 6富硒最优组合验证试验
[0078] 根据上述实验确定的长孢娄徳酵母SCLEOl最优发酵条件进行验证试验。
[0079] 根据单因素试验对SCLEOl菌株的富硒培养条件进行优化，用优化后的条件 (50mL/250mL装液量，30°C，190rpm振荡频率，10%接种量，加硒浓度20 μ g/mL，于对数期分 3次出11，911，1211时）添加，每次添加量为25%，25%，50%，培养3611)进行发酵培养，结果 见表4。
[0080] 表2-2 SCLEOl最优组合验证试验结果（均值土标准误，η = 3)
[0081]
[0082] 实施例3
[0083] 3· 1试验材料
[0084] 本试验所用酵母菌为已经分离、鉴定的淡水鱼类肠道源菌株：长孢娄徳酵母 (SCLE01，保藏号CCTCC NO. M 2015301)。日本鳗麵幼鱼及全价饲料（作为基础饲料）购自 东莞市银华鳗鱼养殖有限公司。溶菌酶（LZM)购自南京建成生物工程研宄所。
[0085] 3. 2试验方法
[0086] 3. 2. 1富硒酵母制备
[0087] 根据前期试验结果制备富硒酵母，具体条件如下：10%接种量，加硒浓度20yg/ mL(在培养基中的终浓度），于对数期分3次（6h，9h，12h时）加入，依次加入的量为25%， 25%，50%，30°0，190印111振荡培养3611，得到富硒长孢娄徳酵母。然后测定富硒酵母的生物 量及菌体硒含量，并计算转化率。生物量测定方法为：培养完成后取培养液，6000rpm离心 5min，菌体沉淀用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，90°C干燥至恒重后称量。硒含量的测定根据 Se(IV)能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮染料，生 成的红色偶氮染料的吸光度与一定含量范围的硒成正比的原理利用紫外-可见分光光度 计在520波长下测定其吸光度，用标准曲线法便可求得的硒酵母中的硒含量。
[0088] 3. 2. 2养殖试验设计
[0089] 240尾鳗麵，随机分为4个试验组，分别为低硒酵母组、高硒酵母组、空白组和酵母 对照组，每组3个平行，每平行20尾。其中低硒酵母组投喂添加富硒酵母，使最终有机硒含 量为0. 21mg/kg的基础饲料；高硒酵母组投喂添加富硒酵母，使最终有机硒含量为0. 42mg/ kg的基础饲料；空白组仅投喂基础饲料；酵母对照组投喂 添加终浓度为109cfu/g普通长孢 娄德酵母的基础饲料。每日投喂2次（9:00和17:00)，日投喂量控制在体重的2~4%，根 据上次摄食情况进行调整。试验持续60天，试验期间，每天换水一次，换水量1/6,水温在 20~22°C，全天充气，溶氧含量在5. 00mg/L以上，pH 7. 5-8. 5之间，总氨氮小于0. 5mg/L。
[0090] 3. 2. 3生长性能分析
[0091] 分别于试验开始时和第60天称量鳗麵体重，计算增重率计算公式如下：
[0092] 增重率（WGR，％ ) = (Wt- Wtl) X 100/W0
[0093] 式中，Wt为终末体质量（g)，W。为初始体质量（g)，。
[0094] 3. 2. 4溶菌酶活性检测
[0095] 于试验的第60天随机抽取3尾饅麵，采集血液，室温放置lh，1500Xg 4°C离心 IOmin分离血清，-80°C保存。采用南京建成生物工程研宄所试剂盒检测上述样品的溶菌酶 活性水平。
[0096] 3. 2. 6数据处理
[0097] 试验数据采用SPSS 13.0软件分析，方差齐性时进行Duncan多重比较，方差非齐 性则采用Tamhane' S T2法进行方差分析。
[0098] 3. 2 结果
[0099] 3. 2. 1富硒酵母发酵结果
[0100] 本实施例制备的富硒酵母的生物量为7. 02±0. 18g/L，菌体硒含量为1632 μ g/g， 其中有机硒含量为1566 μ g/g，有机硒转化率为95. 96 ±0. 22%。
[0101] 3. 2. 2长孢娄德酵母、富硒酵母对饅麵生长性能的影响
[0102] 饲料中添加较高硒含量的富硒长孢娄德酵母会显著提价鳗麵的增重率，提高百分 比为134. 88%，但是，饲料中添加较低硒含量的娄德酵母和无硒的娄德酵母喂养鳗麵，在 60天的试验期内，不会显著影响鳗麵的增重率。（表3. 1)。
[0103] 表3. 1富硒益生菌对鳗鱼生长性能的影响
[0104]
[0105] 注：数据为平均值土标准误，同列比较，上标字母不同表示有显著差异，（P < 0· 05) 〇
[0106] 3. 3. 3娄德酵母、富硒娄德酵母对鳗麵血清溶菌酶水平的影响
[0107] 投喂高硒含量富硒酵母60天后鳗麵血清溶菌酶活性提高了 129. 63%，与低硒酵 母组和空白组，无硒酵母对照组相比，具有统计学上的显著性，而饲料添加低硒含量酵母和 无硒酵母则对鳗麵血清溶菌酶活性无显著影响。（表3. 2)。
[0108] 表 3. 2
[0109]
[0110] 注：数据为平均值土标准误，同行比较，上标字母不同表示有显著差异，（P < 0· 05) 〇
[0111] 实施例4
[0112] 4.1试验材料
[0113] 本试验所用酵母菌为淡水鱼类肠道源菌株：长孢娄徳酵母（SCLE01，保藏号CCTCC NO :M 2015301)。吉富罗非鱼幼鱼购自罗非鱼良种场，基础饲料配方见表4.1。
[0114] 表4-1基础饲料组成（风干基础）
[0115]
[0117] 每千克基础饲粮中硒的实测值Measured value of selenium content of per kg basal diets :0·250mg〇
[0118] 4. 2试验方法
[0119] 4. 2. I富硒酵母制备
[0120] 同实施例3。
[0121] 4. 2. 2养殖试验设计
[0122] 吉富罗非鱼600尾，平均体重11. 8±0. 22g，暂养7d后开始饲养实验，实验共70d。 按照硒添加量不同，试验分5组，分别为0. 0mg/kg(0)、酵母菌（A)、0. 4mg/kg(B)、0. 6mg/ kg(C)、0. 8mg/kg(D)，每组3个重复，每个重复40尾鱼。其中，O组饲喂基础饲料，A、B、C、 D各组饲喂基础饲料中添加总菌数相同，但娄德酵母和富硒娄德酵母比例不同的饲料。试 验在ImXO. 6mX0.8m网箱中进行，每组网箱置于2mX2mX Im的室外水泥池，总水体量为 3.5m3。每日投喂2次（9:00和17:00)，，饱饲量投喂。试验期隔日每池换水1/10,用电加 热棒控温，保持水温25°C左右，24h气泵充气，使溶氧含量在5. 00mg/L以上，pH 7. 5-8. 5之 间，总氨氮小于〇. 5mg/L。
[0123] 4. 2. 3生长性能分析
[0124] 分别于试验开始时和第70天称量罗非鱼体重，计算特定生长率公式如下：
[0125] 特定生长率（SGR, % ) = (InWt - InWO) X 100/t
[0126] 式中，Wt为终末体质量（g)，WO为初始体质量（g)，t为饲养天数。
[0127] 4. 2. 4数据处理
[0128] 试验数据采用SPSS 13.0软件分析，方差齐性时进行Duncan多重比较，方差非齐 性则采用Tamhane' S T2法进行方差分析。
[0129] 4. 3试验结果
[0130] 由表4-2可知：饲养70d后，添加酵母、0. 4mg/kg、0. 6mg/kg组的特定生长率均显 著高于〇. 〇mg/kg和0. 8mg/kg组（P〈0. 05)，其中以0. 6mg/kg组最高，表明在饲养罗非鱼时 使用〇. 6mg/kg硒的添加量较适合，只添加娄德酵母对罗非鱼的生长也有一定的促进作用。
[0131] 表4-2罗非鱼特定生长率
[0132]
[0133] 注：同列中数值中无相同字母表示存在显著差异（P〈0. 05)。
[0134] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0135] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)，其特征在于，其保藏编号为 CCTCCNO：M2015301〇2. -种长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)的富硒培养方法，其特征在于， 包括以下步骤： 将权利要求1所述的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)接种于所述YEF1D培养基中培养，体积百分比5% -10%的接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量 分别为 20-30 %，20-30 %，40-60 %，使硒在YEPD培养基中终浓度为 10-20yg/mL，28-37°C 振荡培养24h_48h，得到富硒的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)。3. 根据权利要求2所述的富硒培养方法，其特征在于，接种量为10%，培养时间为36h。4. 根据权利要求2或3所述的富硒培养方法，其特征在于，于对数期6h，9h，12h时分3 次加硒，添加量分别为25 %，25 %，50 %，使硒在YEH)培养基中终浓度为20yg/mL。5. 由权利要求2-4任一项所述富硒培养方法得到的富硒的长孢娄徳酵母 (Lodderomyceselongisporus)〇6. 权利要求1所述的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)或权利要求5所述 的富硒的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)在制备水产动物有机硒饲料添加剂 中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水产动物为鳗麵或罗非鱼。8. -种水产动物有机硒饲料添加剂，其特征在于，其活性物质含有权利要求书1所述 的长孢娄徳酵母（Lodderomyceselongisporus)或权利要求5所述的富硒的长孢娄徳酵母 (Lodderomyceselongisporus)〇9. 根据权利要求8所述的水产动物有机硒饲料添加剂，其特征在于，所述水产动物为 鳗麵或罗非鱼。
【专利摘要】本发明涉及一种长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015301。该长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，包括以下步骤：将上述的长孢娄徳酵母接种于所述YEPD培养基中培养，5％-10％接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，硒在培养基中的终浓度为10-20μg/mL，培养24h-48h。本发明所述的长孢娄徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生产有机硒的可行性，可作为富硒酵母菌株，在有机硒动物饲料添加剂的产品开发中具有良好应用前景。CCTCC NO:M 201530120150515
【IPC分类】C12N1/16, A23K1/16, A23K1/18
【公开号】CN104893994
【申请号】CN201510314111
【发明人】郝乐, 柯浩, 刘振兴, 马艳平, 梁志凌, 马江耀
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月9日
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