一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的方法
一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋生物工程技术领域，具体涉及利用一株来自海洋的海带高效降解 菌株发酵生产海带酒精饮料的方法。
【背景技术】
[0002] 海带养殖是西北太平洋海域的特色海水养殖产业,其中，我国的海带养殖在总产 量及养殖规模方面均居世界首位。国家农业部渔业局发布的海洋渔业统计资料显示，目前 的养殖面积已达到4. 1万公顷以上，至2008年已达到近540万吨。而根据世界粮农组织的 统计数据，2002年，我国的海带养殖产量就已占全球海带总产量的89%。
[0003] 海带作为常见经济作物，在我国拥有悠久的食用历史，但是长久以来的低廉身价 及其特殊的物化性质埋没了其珍贵的食用及药用价值。一方面，由于海带属于大型藻类，藻 体结构坚固，而且富含的碳水化合物多为海洋多糖，人体消化系统以及肠道微生物均不具 备相应的降解酶类，简单食用海带无法有效的消化吸收。另一方面，海带的藻腥味也是其被 许多人拒绝的重要因素。
[0004] 同时，海带在我国也拥有悠久的药用历史，在《本草纲目》、《本草经疏》中均有记 载，是一种传统的海洋中药。而在现代医药学的研究方面，自1881年由Stanford首次从海 带中发现褐藻胶以来，其生物活性研究一直持续至今，目前比较确定的褐藻胶（alginate) 生物功能包括抗肿瘤、增强免疫、促进细胞生长、抗凝血、调节血脂、抗病毒等。同时，褐藻胶 寡糖由于分子量低，具有更强的水溶性和稳定性，其生物活性在制药、食品、农业领域的应 用潜力也逐渐受到关注，包括抗氧化活性、抗肿瘤、抗凝血、免疫调节、神经保护、调节肠道 微生态、重金属吸附、抗菌活性、植物生长促进及生理调节等。
[0005] 本发明所述的该株来自海洋的海带高效降解菌株，经长时间改良及优化后，该 菌株现可以有效实现单菌完全降解海带，对于降解产物进行分析，发现降解液中褐藻胶 (alginate)寡糖成分（多为二糖，三糖，四糖）明显升高，同时对于海带特有的腥味也有明 显的去除效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的新方法。
[0007] 本发明提供的菌株，分类学命名为Microbulbifer elongates,保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 6242,保藏日期2012年06月19日。
[0008] 本发明所述的菌株CGMCC No. 6242特性如下：
[0009] (1)细胞形态：革兰氏阴性菌，细胞形态生长前期为杆状，生长后期为球状，在显 微镜下呈现运动性；
[0010] (2)生理生化特征：好氧生长；在25-50°C、pH6. 0-9. 5、盐度0-6. 0% (w / V)范围 内均能生长，最佳生长条件在37°C、pH7. 5、盐度1.0%左右；可以在4天时间内完全降解海 带块；
[0011] (3)酶学特征：氧化酶阳性；触媒阳性；高效表达包括海藻酸钠裂解酶、海带淀粉 酶及纤维素酶在内的海带降解所需酶；
[0012] ⑷API试剂条检测结果：碱性磷酸盐酶、酯酶（C4)、类脂酯酶（C8)、白氨酸芳胺 酶、缬氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α -葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡 萄糖胺酶以及硝酸还原酶、葡萄糖苷酶、明胶水解酶、半乳糖苷酶为阳性；类脂酶（C14)、胱 氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、 β -葡萄糖苷酶、α -甘露糖苷酶、β -岩藻糖苷酶以及精氨酸水解酶、脲酶、吲哚反应、葡萄 糖酸化反应为阴性。
[0013] 利用通用引物对菌株CGMCC No. 6242的16S rRNA基因进行扩增和序列测定，得到 长度为1409bp的基因片段（Seq ID No. 1)，其序列具体见序列表。将其与细菌16S rRNA基 因序列数据库进行比对，得到其与已知的标准菌株M. elongates的相似性为99. 43%，并且 菌株CGMCC No. 6242的生长限制因子、细胞形态和酶谱都与其对应特征保持一致，因此，这 两株菌为同种不同菌株。
[0014] 本发明利用菌株Microbulbifer elongates CGMCC No. 6242生产含大量海带寡糖 的酒精饮料的方法，该海带寡糖具有较好生物活性，含有该海带寡糖的酒精饮料在行业内 属于空白领域。本方法经种子液发酵、酶发酵、酶处理以及酒精发酵得到海带酒精饮料，包 括以下具体步骤：
[0015] (1)将菌株CGMCC No. 6242接种至种子液培养基，培养之后的菌液作为种子液；
[0016] (2)将种子液转接至酶发酵培养基中进行发酵培养，得到具有海带降解酶活性的 酶发酵液；
[0017] (3)将酶发酵液完全除菌处理后转接至含海带粉的酶解培养基中进行酶解处理， 得到具有大量海带寡糖的发酵液；
[0018] (4)将酿酒酵母接种至种子培养基，培养之后的菌液作为种子液；
[0019] (5)将酿酒酵母种子液转接至补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液进行发 酵培养，依次经过好氧发酵、厌氧发酵、离心除去海带藻体及酵母菌体后取上清，得到具有 大量海带寡糖的酒精饮料。
[0020] 上述方法步骤（1)中的种子液培养基以及所述方法步骤（2)中的酶发酵培养基的 配方为1 / 3浓度的天然海水中加入0-0. 5%的酵母提取物以及1%的海带。
[0021] 上述方法步骤（3)中的酶解培养基的配方为1 / 3浓度的天然海水中加入6-8% 的海带。
[0022] 上述方法步骤（4)中的种子培养基的配方为酵母抽提物1%、蛋白胨1%以及葡萄 糖2%。
[0023] 上述方法步骤（5)中的补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液中的葡萄糖 含量为5%。
[0024] 上述方法步骤（1)中菌株CGMCC No. 6242的接种量为10%，培养条件为振荡140 转/分、28°C，培养时间为24小时。
[0025] 上述方法步骤（2)中种子液的接种量为1%，培养条件为搅拌300转/分、28°C、通 气3. 0升/分，培养时间为104小时。
[0026] 上述方法步骤（3)中的处理条件为搅拌50转/分、28°C、不通气，处理时间为24 小时。
[0027] 上述方法步骤（4)中酿酒酵母的接种量为10%，振荡140转/分、35°C，培养时间 为48小时。
[0028] 上述方法步骤（5)中酿酒酵母种子液的接种量为10%，好氧培养条件为搅拌300 转/分、30°C、通气3. 0升/分，培养时间为48小时，厌氧培养条件为28°C、不搅拌、不通气， 培养时间为48小时。
[0029] 上述方法步骤（3)中的酶发酵液的除菌处理过程包括如下步骤：
[0030] (1)酶发酵液经12000转/分，20分钟离心后取上清液；
[0031] (2)上清液通过滤纸过滤后取滤出液；
[0032] (3)上一步得到的滤出液通过0. 45微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后取滤出液；
[0033] (4)上一步得到的滤出液通过0. 22微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后得到完全 除菌处理的酶发酵液。
[0034] 上述方法步骤（5)中离心除去海带藻体及酵母菌体的方法：12000转/分，20分钟 离心后取上清。
[0035] 根据上述方法步骤，可以得到的酶发酵液、具有大量海带寡糖的发酵液以及具有 大量海带寡糖的酒精饮料如下：
[0036] (1)所述方法步骤（2)获得酶发酵液中的海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活 以及纤维素酶活分别为 300-1200U / ml、30-300U / ml 及 30-300U / ml ;
[0037] (2)所述方法步骤（3)获得具有大量海带寡糖的发酵液中总糖含量以及还原糖含 量分别为 10_30g / Ul-IOg / 1 ;
[0038] (3)所述方法步骤（5)获得具有大量海带寡糖的酒精饮料中酒精含量为 0· 1-10%。
[0039] 根据需要，可任意选取方法对具有海带降解酶活力的酶发酵液以及具有大量海带 寡糖的发酵液进行后续处理，从中分离纯化得到酶制品以及海带寡糖制品。
【附图说明】
[0040] 图1为DNS-分光光度法中的标准曲线。
[0041] 图2为实施例3中的各种酶活数据。
[0042] 图3为实施例3中的还原糖、总糖以及酒精度数据。
[0043] 图4为实施例3中的海藻酸钠寡糖组成。
【具体实施方式】
[0044] 实施例 IMicrobulbifer elongates CGMCC No. 6242 的酶活力测定。
[0045] 海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活以及纤维素酶活采用DNS-分光光度法测 量，利用了底物在经酶处理后会释放还原糖的原理，通过测定处理前后反应体系内还原 糖含量的变化来衡量酶活性高低，而反应体系中还原糖含量的测定是利用二硝基水杨酸 (DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕 红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原 糖含量的。
[0046] 具体操作步骤如下：
[0047] (1)试剂准备：
[0048] (a)DNS配制：将6. 3克DNS和262ml2mol / L氢氧化钠，加到500ml含有182克 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容 到1000ml，即制成3, 5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。
[0049] (b)0. 8%底物溶液配制：分别称取0. 8g各种酶相对应的底物（海藻酸钠裂解 酶--海藻酸钠；海带淀粉酶--海带淀粉；纤维素酶一一羧甲基纤维素钠）溶于一定量 的热水中，加入IOmllO倍浓度的I / 15mol / lNa2HP04 / KH2P04缓冲液（pH=7. 38)，冷却 后用100mL容量瓶定容即可。
[0050] ⑵标准曲线测定：
[0051] (a)葡萄 糖标准溶液配制：称取Ig葡萄糖溶于一定量水中，用100mL容量瓶定容 即得Ig / 1的葡萄糖标准溶液。
[0052] (b)标准曲线：见附图1。
[0053] (3)酶活测定：
[0054] (a)取Iml粗酶液置于沸水浴中灭活15min，取出后冷却作为阴性对照。
[0055] (b)取3支20ml比色管，加入1ml粗酶液和ImlO. 8%底物溶液混合均匀；另取1 支20ml比色管加入1ml阴性对照酶液和ImlO. 8 %底物溶液混合均匀。
[0056] (c)将上述比色管置于30°C水浴锅水浴IOmin,取出后冷却。
[0057] (d)向冷却后的比色管中加入I. 5ml DNS，置于沸水浴中IOmin显色，取出后冷却。
[0058] (e)在冷却后的比色管中加入适量水定容至20ml，混合均匀。
[0059] (f)将分光光度计调至540nm，以阴性对照为空白对照，测定液体的光吸收值 (OD)。
[0060] (g)将测得的光吸收值（OD)代入标准曲线得到还原糖含量。（4)酶活定义与计 算：
[0061] 酶活定义：在一定温度和pH下，每分钟催化底物生成Iug还原糖（标
[0062] 准为葡萄糖）的酶量为1单位（U ;unit)。
[0063] 酶活计算：酶活=还原糖含量（g / 1) *1000 / 10 U
[0064] 实施例2海带酒精饮料的酒精度测定
[0065] 海带酒精饮料中的酒精度是通过重铬酸钾氧化分光光度法测定，重铬酸钾作为常 见的氧化剂，本方法利用了在硫酸介质中，乙醇可定量被重铬酸钾氧化，生成绿色的三价 铬，三价铬在600nm处有最好吸收峰，其光吸收值与乙醇含量成正比，通过标准曲线比对可 以间接测定出溶液中的乙醇浓度即酒精度。
[0066] 具体操作步骤如下：
[0067] 乙醇标准溶液：称取无水乙醇0. 2000g于100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液每 毫升相当于2. Omg乙醇。
[0068] 5%重铬酸钾溶液：称取5g重铬酸钾溶于50ml水中，加 IOml浓硫酸，放冷，加水至 100mLo
[0069] 取两支刻度一致的IOml比色管，一支加入适量乙醇标准工作液，一支不加，分别 加入重铬酸钾溶液2. Oml，加水至刻度。在100°C水浴中加热lOmin，取出用流水冷却5min， 以零管作参比，用Icm比色皿，于波长600nm处测定吸光度，以乙醇浓度与对应的吸光度A 的作工作曲线。
[0070] 根据样品溶液的吸光值，查工作曲线得样品含量M，换算成20°C酒精度X按下式计 算
[0071] 酒精度（度）X=MX KT3X 100 / (VOXV / 100X0. 79)
[0072] 式中X :100ml溶液中所含乙醇的体积数（度）；M:由标准曲线所查得样品含量 (mg) ;V0 :取酒样体积（ml) ;V:所取样品稀释液的体积（ml) ;0. 79 :20°C时乙醇密度（g / ml)。
[0073] 实施例3利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的小试实验结果
[0074] 按照
【发明内容】
所述的方法，将菌株Microbulbifer elongates CGMCC No. 6242甘 油保存管接入种子培养基50ml，140转/分、28°C、培养24小时后按1 %接种量接入51酶发 酵培养基（置于7. 51发酵罐），搅拌300转/分、28°C、通气3. 0升/分，培养104小时得到 具有海带降解酶活性的酶发酵液，将酶发酵液经经12000转/分，20分钟离心后取上清液， 将上清液依次通过滤纸、〇. 45微米孔径的醋酸纤维素滤膜、0. 22微米孔径的醋酸纤维素滤 膜过滤后（所涉器材及操作环境需保持无菌），得到完全除菌处理的酶发酵液约4. 51，将已 事先灭菌的270g海带粉出％ )加入已完全除菌的4. 51酶发酵液，得到具有大量海带寡糖 的发酵液，补加250g已灭菌葡萄糖溶液500ml作为下一步酵母发酵培养基。
[0075] 将酿酒酵母甘油保存管接入种子培养基500ml，140转/分、35°C、培养48小时后 按10 %接种量接入51酵母发酵培养基（置于7. 51发酵罐），搅拌300转/分、30°C、通气 3. 0升/分、培养48小时后转为厌氧培养，28°C、不搅拌、不通气，培养48小时后经12000 转/分，20分钟离心除去海带藻体及酵母菌体，得到具有大量海带寡糖的酒精饮料（约 51)。
[0076] 所得具有海带降解酶活力的酶发酵液、具有大量海带寡糖的发酵液以及具有大量 海带寡糖的酒精饮料的相关结果见附图2、附图3及附图4。
【主权项】
L一株具有高效降解海带能力的菌株（Microbulbiferelongates)及其突变菌株，已 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为=CGMCCNo. 6242。
2. 根据权利要求1所述的海带高效降解菌，其特征在于： (1) 细胞形态：革兰氏阴性菌，细胞形态生长前期为杆状，生长后期为球状，在显微镜 下呈现运动性； (2) 生理生化特征：好氧生长；在25-50°C、pH6. 0-9. 5、盐度0-6. 0%(w/V)范围内 均能生长，最佳生长条件在37°C、pH7. 5、盐度1. 0%左右；可以在4天时间内完全降解海带 块； (3) 酶学特征：氧化酶阳性；触媒阳性；高效表达包括海藻酸钠裂解酶、海带淀粉酶及 纤维素酶在内的海带降解所需酶。
3. 根据权利要求1所述的海带高效降解菌，其特征在于：所述菌株的16s核糖体亚基 基因（16srRNA)序列包含如SeqIDNo. 1所示的核苷酸序列。
4. 根据权利要求1所述的突变菌株，其特征在于：所述突变菌株为对菌株CGMCC No. 6242原代进行诱变、驯化、基因重组等操作或者经自然突变而获得的突变菌株。
5. -种利用权利要求1所述的海带高效降解菌生产海带酒精饮料的方法，包括以下步 骤： (1) 将菌株CGMCCNo. 6242接种至种子液培养基，培养之后的菌液作为种子液； (2) 将种子液转接至酶发酵培养基中进行发酵培养，得到具有海带降解酶活性的酶发 酵液； (3) 将酶发酵液完全除菌处理后转接至含海带粉的酶解培养基中进行酶解处理，得到 具有大量海带寡糖的发酵液； (4) 将酿酒酵母接种至种子培养基，培养之后的菌液作为种子液； (5) 将酿酒酵母种子液转接至补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液进行发酵培 养，依次经过好氧发酵、厌氧发酵、离心除去海带藻体及酵母菌体后取上清，得到具有大量 海带寡糖的酒精饮料。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1)中的种子液培养基以 及所述方法步骤（2)中的酶发酵培养基的配方为1 / 3浓度的天然海水中加入0-0. 5%的 酵母提取物以及1 %的海带。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3)中的酶发酵液的除菌 处理过程包括如下步骤： (1) 酶发酵液经12000转/分，20分钟离心后取上清液； (2) 上清液通过滤纸过滤后取滤出液； (3) 上一步得到的滤出液通过0. 45微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后取滤出液； (4) 上一步得到的滤出液通过0. 22微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后得到完全除菌 处理的酶发酵液。
8. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于： (1) 所述方法步骤⑴中菌株CGMCCNo. 6242的接种量为10%，培养条件为振荡140 转/分、28°C，培养时间为24小时。 (2) 所述方法步骤（2)中种子液的接种量为1 %，培养条件为搅拌300转/分、28°C、通 气3.O升/分，培养时间为104小时。 (3) 所述方法步骤（3)中的处理条件为搅拌50转/分、28°C、不通气，处理时间为24小 时。 (4) 所述方法步骤（4)中酿酒酵母的接种量为10 %，振荡140转/分、35°C，培养时间 为48小时。 (5) 所述方法步骤（5)中酿酒酵母种子液的接种量为10%，好氧培养条件为搅拌300 转/分、30°C、通气3. 0升/分，培养时间为48小时，厌氧培养条件为28°C、不搅拌、不通气， 培养时间为48小时。
9. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于： (1) 所述方法步骤（2)获得酶发酵液中的海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活以及 纤维素酶活分别为 300-1200U/ml、30-300U/ml及 30-300U/ml; (2) 所述方法步骤（3)获得具有大量海带寡糖的发酵液中总糖含量以及还原糖含量分 别为 10-30g/Ul-IOg/ 1 ; (3) 所述方法步骤（5)获得具有大量海带寡糖的酒精饮料中酒精含量为0. 1-10%。
10. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于：根据需要，可任意选取方法对 具有海带降解酶活力的酶发酵液以及具有大量海带寡糖的发酵液进行后续处理，从中分离 纯化得到酶制品以及海带寡糖制品。
【专利摘要】本发明提供一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的新方法。本发明所使用的菌株分类学命名为Microbulbifer elonga tes，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.6242，保藏日期2012年06月19日。以该菌作为出发菌种，经种子液、酶发酵、酶解处理以及酵母发酵等步骤，可以得到一种新型的具有大量海带寡糖的酒精饮料，该海带寡糖具有较好生物活性，含有该海带寡糖的酒精饮料在行业内属于空白领域。另外在酒精饮料处理过程中包括具有海带降解酶活力的酶发酵液以及具有大量海带寡糖的发酵液等中间产物也具有极大的生物应用前景。CGMCC No624220120619
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/865, C12R1/01, C12G3/02
【公开号】CN104893996
【申请号】CN201410076559
【发明人】孙聪, 吴敏, 张心齐, 霍颖异, 许学伟
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋生物工程技术领域，具体涉及利用一株来自海洋的海带高效降解 菌株发酵生产海带酒精饮料的方法。
【背景技术】
[0002] 海带养殖是西北太平洋海域的特色海水养殖产业,其中，我国的海带养殖在总产 量及养殖规模方面均居世界首位。国家农业部渔业局发布的海洋渔业统计资料显示，目前 的养殖面积已达到4. 1万公顷以上，至2008年已达到近540万吨。而根据世界粮农组织的 统计数据，2002年，我国的海带养殖产量就已占全球海带总产量的89%。
[0003] 海带作为常见经济作物，在我国拥有悠久的食用历史，但是长久以来的低廉身价 及其特殊的物化性质埋没了其珍贵的食用及药用价值。一方面，由于海带属于大型藻类，藻 体结构坚固，而且富含的碳水化合物多为海洋多糖，人体消化系统以及肠道微生物均不具 备相应的降解酶类，简单食用海带无法有效的消化吸收。另一方面，海带的藻腥味也是其被 许多人拒绝的重要因素。
[0004] 同时，海带在我国也拥有悠久的药用历史，在《本草纲目》、《本草经疏》中均有记 载，是一种传统的海洋中药。而在现代医药学的研究方面，自1881年由Stanford首次从海 带中发现褐藻胶以来，其生物活性研究一直持续至今，目前比较确定的褐藻胶（alginate) 生物功能包括抗肿瘤、增强免疫、促进细胞生长、抗凝血、调节血脂、抗病毒等。同时，褐藻胶 寡糖由于分子量低，具有更强的水溶性和稳定性，其生物活性在制药、食品、农业领域的应 用潜力也逐渐受到关注，包括抗氧化活性、抗肿瘤、抗凝血、免疫调节、神经保护、调节肠道 微生态、重金属吸附、抗菌活性、植物生长促进及生理调节等。
[0005] 本发明所述的该株来自海洋的海带高效降解菌株，经长时间改良及优化后，该 菌株现可以有效实现单菌完全降解海带，对于降解产物进行分析，发现降解液中褐藻胶 (alginate)寡糖成分（多为二糖，三糖，四糖）明显升高，同时对于海带特有的腥味也有明 显的去除效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的新方法。
[0007] 本发明提供的菌株，分类学命名为Microbulbifer elongates,保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 6242,保藏日期2012年06月19日。
[0008] 本发明所述的菌株CGMCC No. 6242特性如下：
[0009] (1)细胞形态：革兰氏阴性菌，细胞形态生长前期为杆状，生长后期为球状，在显 微镜下呈现运动性；
[0010] (2)生理生化特征：好氧生长；在25-50°C、pH6. 0-9. 5、盐度0-6. 0% (w / V)范围 内均能生长，最佳生长条件在37°C、pH7. 5、盐度1.0%左右；可以在4天时间内完全降解海 带块；
[0011] (3)酶学特征：氧化酶阳性；触媒阳性；高效表达包括海藻酸钠裂解酶、海带淀粉 酶及纤维素酶在内的海带降解所需酶；
[0012] ⑷API试剂条检测结果：碱性磷酸盐酶、酯酶（C4)、类脂酯酶（C8)、白氨酸芳胺 酶、缬氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α -葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡 萄糖胺酶以及硝酸还原酶、葡萄糖苷酶、明胶水解酶、半乳糖苷酶为阳性；类脂酶（C14)、胱 氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、 β -葡萄糖苷酶、α -甘露糖苷酶、β -岩藻糖苷酶以及精氨酸水解酶、脲酶、吲哚反应、葡萄 糖酸化反应为阴性。
[0013] 利用通用引物对菌株CGMCC No. 6242的16S rRNA基因进行扩增和序列测定，得到 长度为1409bp的基因片段（Seq ID No. 1)，其序列具体见序列表。将其与细菌16S rRNA基 因序列数据库进行比对，得到其与已知的标准菌株M. elongates的相似性为99. 43%，并且 菌株CGMCC No. 6242的生长限制因子、细胞形态和酶谱都与其对应特征保持一致，因此，这 两株菌为同种不同菌株。
[0014] 本发明利用菌株Microbulbifer elongates CGMCC No. 6242生产含大量海带寡糖 的酒精饮料的方法，该海带寡糖具有较好生物活性，含有该海带寡糖的酒精饮料在行业内 属于空白领域。本方法经种子液发酵、酶发酵、酶处理以及酒精发酵得到海带酒精饮料，包 括以下具体步骤：
[0015] (1)将菌株CGMCC No. 6242接种至种子液培养基，培养之后的菌液作为种子液；
[0016] (2)将种子液转接至酶发酵培养基中进行发酵培养，得到具有海带降解酶活性的 酶发酵液；
[0017] (3)将酶发酵液完全除菌处理后转接至含海带粉的酶解培养基中进行酶解处理， 得到具有大量海带寡糖的发酵液；
[0018] (4)将酿酒酵母接种至种子培养基，培养之后的菌液作为种子液；
[0019] (5)将酿酒酵母种子液转接至补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液进行发 酵培养，依次经过好氧发酵、厌氧发酵、离心除去海带藻体及酵母菌体后取上清，得到具有 大量海带寡糖的酒精饮料。
[0020] 上述方法步骤（1)中的种子液培养基以及所述方法步骤（2)中的酶发酵培养基的 配方为1 / 3浓度的天然海水中加入0-0. 5%的酵母提取物以及1%的海带。
[0021] 上述方法步骤（3)中的酶解培养基的配方为1 / 3浓度的天然海水中加入6-8% 的海带。
[0022] 上述方法步骤（4)中的种子培养基的配方为酵母抽提物1%、蛋白胨1%以及葡萄 糖2%。
[0023] 上述方法步骤（5)中的补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液中的葡萄糖 含量为5%。
[0024] 上述方法步骤（1)中菌株CGMCC No. 6242的接种量为10%，培养条件为振荡140 转/分、28°C，培养时间为24小时。
[0025] 上述方法步骤（2)中种子液的接种量为1%，培养条件为搅拌300转/分、28°C、通 气3. 0升/分，培养时间为104小时。
[0026] 上述方法步骤（3)中的处理条件为搅拌50转/分、28°C、不通气，处理时间为24 小时。
[0027] 上述方法步骤（4)中酿酒酵母的接种量为10%，振荡140转/分、35°C，培养时间 为48小时。
[0028] 上述方法步骤（5)中酿酒酵母种子液的接种量为10%，好氧培养条件为搅拌300 转/分、30°C、通气3. 0升/分，培养时间为48小时，厌氧培养条件为28°C、不搅拌、不通气， 培养时间为48小时。
[0029] 上述方法步骤（3)中的酶发酵液的除菌处理过程包括如下步骤：
[0030] (1)酶发酵液经12000转/分，20分钟离心后取上清液；
[0031] (2)上清液通过滤纸过滤后取滤出液；
[0032] (3)上一步得到的滤出液通过0. 45微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后取滤出液；
[0033] (4)上一步得到的滤出液通过0. 22微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后得到完全 除菌处理的酶发酵液。
[0034] 上述方法步骤（5)中离心除去海带藻体及酵母菌体的方法：12000转/分，20分钟 离心后取上清。
[0035] 根据上述方法步骤，可以得到的酶发酵液、具有大量海带寡糖的发酵液以及具有 大量海带寡糖的酒精饮料如下：
[0036] (1)所述方法步骤（2)获得酶发酵液中的海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活 以及纤维素酶活分别为 300-1200U / ml、30-300U / ml 及 30-300U / ml ;
[0037] (2)所述方法步骤（3)获得具有大量海带寡糖的发酵液中总糖含量以及还原糖含 量分别为 10_30g / Ul-IOg / 1 ;
[0038] (3)所述方法步骤（5)获得具有大量海带寡糖的酒精饮料中酒精含量为 0· 1-10%。
[0039] 根据需要，可任意选取方法对具有海带降解酶活力的酶发酵液以及具有大量海带 寡糖的发酵液进行后续处理，从中分离纯化得到酶制品以及海带寡糖制品。
【附图说明】
[0040] 图1为DNS-分光光度法中的标准曲线。
[0041] 图2为实施例3中的各种酶活数据。
[0042] 图3为实施例3中的还原糖、总糖以及酒精度数据。
[0043] 图4为实施例3中的海藻酸钠寡糖组成。
【具体实施方式】
[0044] 实施例 IMicrobulbifer elongates CGMCC No. 6242 的酶活力测定。
[0045] 海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活以及纤维素酶活采用DNS-分光光度法测 量，利用了底物在经酶处理后会释放还原糖的原理，通过测定处理前后反应体系内还原 糖含量的变化来衡量酶活性高低，而反应体系中还原糖含量的测定是利用二硝基水杨酸 (DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕 红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原 糖含量的。
[0046] 具体操作步骤如下：
[0047] (1)试剂准备：
[0048] (a)DNS配制：将6. 3克DNS和262ml2mol / L氢氧化钠，加到500ml含有182克 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容 到1000ml，即制成3, 5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。
[0049] (b)0. 8%底物溶液配制：分别称取0. 8g各种酶相对应的底物（海藻酸钠裂解 酶--海藻酸钠；海带淀粉酶--海带淀粉；纤维素酶一一羧甲基纤维素钠）溶于一定量 的热水中，加入IOmllO倍浓度的I / 15mol / lNa2HP04 / KH2P04缓冲液（pH=7. 38)，冷却 后用100mL容量瓶定容即可。
[0050] ⑵标准曲线测定：
[0051] (a)葡萄 糖标准溶液配制：称取Ig葡萄糖溶于一定量水中，用100mL容量瓶定容 即得Ig / 1的葡萄糖标准溶液。
[0052] (b)标准曲线：见附图1。
[0053] (3)酶活测定：
[0054] (a)取Iml粗酶液置于沸水浴中灭活15min，取出后冷却作为阴性对照。
[0055] (b)取3支20ml比色管，加入1ml粗酶液和ImlO. 8%底物溶液混合均匀；另取1 支20ml比色管加入1ml阴性对照酶液和ImlO. 8 %底物溶液混合均匀。
[0056] (c)将上述比色管置于30°C水浴锅水浴IOmin,取出后冷却。
[0057] (d)向冷却后的比色管中加入I. 5ml DNS，置于沸水浴中IOmin显色，取出后冷却。
[0058] (e)在冷却后的比色管中加入适量水定容至20ml，混合均匀。
[0059] (f)将分光光度计调至540nm，以阴性对照为空白对照，测定液体的光吸收值 (OD)。
[0060] (g)将测得的光吸收值（OD)代入标准曲线得到还原糖含量。（4)酶活定义与计 算：
[0061] 酶活定义：在一定温度和pH下，每分钟催化底物生成Iug还原糖（标
[0062] 准为葡萄糖）的酶量为1单位（U ;unit)。
[0063] 酶活计算：酶活=还原糖含量（g / 1) *1000 / 10 U
[0064] 实施例2海带酒精饮料的酒精度测定
[0065] 海带酒精饮料中的酒精度是通过重铬酸钾氧化分光光度法测定，重铬酸钾作为常 见的氧化剂，本方法利用了在硫酸介质中，乙醇可定量被重铬酸钾氧化，生成绿色的三价 铬，三价铬在600nm处有最好吸收峰，其光吸收值与乙醇含量成正比，通过标准曲线比对可 以间接测定出溶液中的乙醇浓度即酒精度。
[0066] 具体操作步骤如下：
[0067] 乙醇标准溶液：称取无水乙醇0. 2000g于100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液每 毫升相当于2. Omg乙醇。
[0068] 5%重铬酸钾溶液：称取5g重铬酸钾溶于50ml水中，加 IOml浓硫酸，放冷，加水至 100mLo
[0069] 取两支刻度一致的IOml比色管，一支加入适量乙醇标准工作液，一支不加，分别 加入重铬酸钾溶液2. Oml，加水至刻度。在100°C水浴中加热lOmin，取出用流水冷却5min， 以零管作参比，用Icm比色皿，于波长600nm处测定吸光度，以乙醇浓度与对应的吸光度A 的作工作曲线。
[0070] 根据样品溶液的吸光值，查工作曲线得样品含量M，换算成20°C酒精度X按下式计 算
[0071] 酒精度（度）X=MX KT3X 100 / (VOXV / 100X0. 79)
[0072] 式中X :100ml溶液中所含乙醇的体积数（度）；M:由标准曲线所查得样品含量 (mg) ;V0 :取酒样体积（ml) ;V:所取样品稀释液的体积（ml) ;0. 79 :20°C时乙醇密度（g / ml)。
[0073] 实施例3利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的小试实验结果
[0074] 按照
【发明内容】
所述的方法，将菌株Microbulbifer elongates CGMCC No. 6242甘 油保存管接入种子培养基50ml，140转/分、28°C、培养24小时后按1 %接种量接入51酶发 酵培养基（置于7. 51发酵罐），搅拌300转/分、28°C、通气3. 0升/分，培养104小时得到 具有海带降解酶活性的酶发酵液，将酶发酵液经经12000转/分，20分钟离心后取上清液， 将上清液依次通过滤纸、〇. 45微米孔径的醋酸纤维素滤膜、0. 22微米孔径的醋酸纤维素滤 膜过滤后（所涉器材及操作环境需保持无菌），得到完全除菌处理的酶发酵液约4. 51，将已 事先灭菌的270g海带粉出％ )加入已完全除菌的4. 51酶发酵液，得到具有大量海带寡糖 的发酵液，补加250g已灭菌葡萄糖溶液500ml作为下一步酵母发酵培养基。
[0075] 将酿酒酵母甘油保存管接入种子培养基500ml，140转/分、35°C、培养48小时后 按10 %接种量接入51酵母发酵培养基（置于7. 51发酵罐），搅拌300转/分、30°C、通气 3. 0升/分、培养48小时后转为厌氧培养，28°C、不搅拌、不通气，培养48小时后经12000 转/分，20分钟离心除去海带藻体及酵母菌体，得到具有大量海带寡糖的酒精饮料（约 51)。
[0076] 所得具有海带降解酶活力的酶发酵液、具有大量海带寡糖的发酵液以及具有大量 海带寡糖的酒精饮料的相关结果见附图2、附图3及附图4。
【主权项】
L一株具有高效降解海带能力的菌株（Microbulbiferelongates)及其突变菌株，已 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为=CGMCCNo. 6242。
2. 根据权利要求1所述的海带高效降解菌，其特征在于： (1) 细胞形态：革兰氏阴性菌，细胞形态生长前期为杆状，生长后期为球状，在显微镜 下呈现运动性； (2) 生理生化特征：好氧生长；在25-50°C、pH6. 0-9. 5、盐度0-6. 0%(w/V)范围内 均能生长，最佳生长条件在37°C、pH7. 5、盐度1. 0%左右；可以在4天时间内完全降解海带 块； (3) 酶学特征：氧化酶阳性；触媒阳性；高效表达包括海藻酸钠裂解酶、海带淀粉酶及 纤维素酶在内的海带降解所需酶。
3. 根据权利要求1所述的海带高效降解菌，其特征在于：所述菌株的16s核糖体亚基 基因（16srRNA)序列包含如SeqIDNo. 1所示的核苷酸序列。
4. 根据权利要求1所述的突变菌株，其特征在于：所述突变菌株为对菌株CGMCC No. 6242原代进行诱变、驯化、基因重组等操作或者经自然突变而获得的突变菌株。
5. -种利用权利要求1所述的海带高效降解菌生产海带酒精饮料的方法，包括以下步 骤： (1) 将菌株CGMCCNo. 6242接种至种子液培养基，培养之后的菌液作为种子液； (2) 将种子液转接至酶发酵培养基中进行发酵培养，得到具有海带降解酶活性的酶发 酵液； (3) 将酶发酵液完全除菌处理后转接至含海带粉的酶解培养基中进行酶解处理，得到 具有大量海带寡糖的发酵液； (4) 将酿酒酵母接种至种子培养基，培养之后的菌液作为种子液； (5) 将酿酒酵母种子液转接至补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液进行发酵培 养，依次经过好氧发酵、厌氧发酵、离心除去海带藻体及酵母菌体后取上清，得到具有大量 海带寡糖的酒精饮料。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1)中的种子液培养基以 及所述方法步骤（2)中的酶发酵培养基的配方为1 / 3浓度的天然海水中加入0-0. 5%的 酵母提取物以及1 %的海带。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3)中的酶发酵液的除菌 处理过程包括如下步骤： (1) 酶发酵液经12000转/分，20分钟离心后取上清液； (2) 上清液通过滤纸过滤后取滤出液； (3) 上一步得到的滤出液通过0. 45微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后取滤出液； (4) 上一步得到的滤出液通过0. 22微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后得到完全除菌 处理的酶发酵液。
8. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于： (1) 所述方法步骤⑴中菌株CGMCCNo. 6242的接种量为10%，培养条件为振荡140 转/分、28°C，培养时间为24小时。 (2) 所述方法步骤（2)中种子液的接种量为1 %，培养条件为搅拌300转/分、28°C、通 气3.O升/分，培养时间为104小时。 (3) 所述方法步骤（3)中的处理条件为搅拌50转/分、28°C、不通气，处理时间为24小 时。 (4) 所述方法步骤（4)中酿酒酵母的接种量为10 %，振荡140转/分、35°C，培养时间 为48小时。 (5) 所述方法步骤（5)中酿酒酵母种子液的接种量为10%，好氧培养条件为搅拌300 转/分、30°C、通气3. 0升/分，培养时间为48小时，厌氧培养条件为28°C、不搅拌、不通气， 培养时间为48小时。
9. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于： (1) 所述方法步骤（2)获得酶发酵液中的海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活以及 纤维素酶活分别为 300-1200U/ml、30-300U/ml及 30-300U/ml; (2) 所述方法步骤（3)获得具有大量海带寡糖的发酵液中总糖含量以及还原糖含量分 别为 10-30g/Ul-IOg/ 1 ; (3) 所述方法步骤（5)获得具有大量海带寡糖的酒精饮料中酒精含量为0. 1-10%。
10. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于：根据需要，可任意选取方法对 具有海带降解酶活力的酶发酵液以及具有大量海带寡糖的发酵液进行后续处理，从中分离 纯化得到酶制品以及海带寡糖制品。
【专利摘要】本发明提供一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的新方法。本发明所使用的菌株分类学命名为Microbulbifer elonga tes，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.6242，保藏日期2012年06月19日。以该菌作为出发菌种，经种子液、酶发酵、酶解处理以及酵母发酵等步骤，可以得到一种新型的具有大量海带寡糖的酒精饮料，该海带寡糖具有较好生物活性，含有该海带寡糖的酒精饮料在行业内属于空白领域。另外在酒精饮料处理过程中包括具有海带降解酶活力的酶发酵液以及具有大量海带寡糖的发酵液等中间产物也具有极大的生物应用前景。CGMCC No624220120619
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/865, C12R1/01, C12G3/02
【公开号】CN104893996
【申请号】CN201410076559
【发明人】孙聪, 吴敏, 张心齐, 霍颖异, 许学伟
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
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