一种发酵中草药渣的微生物菌剂的制作方法
一种发酵中草药渣的微生物菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种含有链霉菌BYl (Streptomyces)和曲霉菌 BM13 (Aspergillus versicolor)的发酵中草药澄的微生物复合菌剂。
【背景技术】
[0002] 随着中医药事业的快速发展和人们健康意识的增强，中药的生产与应用也日益广 泛，但同时也伴随着一个不容忽视的问题，那就是生产过程中产生的"废物" 一一药渣的 处理问题。在早期中药渣处理的形式主要包括填埋、焚烧、固定区域堆放等，不仅耗去大量 资金，而且造成了严重的资源浪费和环境污染。如果对其加以合理处理利用，如提取有效 成分、栽培食用菌、作饲料及饲料添加剂、制成花肥、作絮凝剂用于废水处理等，不仅能避 免环境污染，还可以给企业带来良好的经济效益。中药主要由植物、动物和部分矿物类药 材组成，其药渣富含一定量的活性成分和大量的粗纤维、粗脂肪、淀粉、粗多糖、氨基酸，质 轻，极易腐败，通气性好，是一种优质的有机肥和羟基质原料。王引权（王引权，吴小琴et al. 2008)等以90%中药固渣与10%油渣饼配比，联合堆制35d后，即可获得环境友好、腐 熟稳定并富含作物所需营养的优质有机肥或土壤改良剂。因此很有必要对其展开综合的利 用与研宄。
[0003] 传统堆肥发酵周期长，难以满足现代工业化生产需要。有研宄表明添加外源微生 物接种剂可以延长堆肥高温持续时间，缩短堆肥进程（Fang, Wong et al. 2001，del Carmen Vargas-Garcia, Francisca Sudirez-Estrella et al. 2006，胡菊，秦莉 et al. 2006)。梁卫 驱等（梁卫驱，郑芝波et al. 2009)采用中草药渣作为堆肥原料，添加复合菌剂进行高温 好氧堆肥试验，发现与未添加菌剂的处理相比，添加复合菌剂能迅速使堆肥温度超过60°C， 加快中草药渣的分解速度，全氮含量增加13. 2%，速效磷、速效钾含量分别增加29. 1%、 27. 2%，促进了堆肥的腐熟、稳定，说明复合菌剂可加快中草药渣的发酵腐熟、提高堆肥肥 力。徐秀银（徐秀银，陈学祥et al. 2010)等接入含高温纤维分解菌的菌种发酵中药渣生 产有机基质，能迅速启动发酵，整个发酵过程比常规发酵缩短约1/3的时间。说明接入微生 物菌剂对堆肥的启动、腐熟、品质等都有一定的有利作用。
[0004] 中草药渣中含有大量的木质素和纤维素，与腐殖质产生有密切关系，而这类 物质结构坚硬，分解困难，一直被认为是快速堆肥的限速有机物（席北斗，刘鸿亮et al. 2002, Deng, Wang et al. 2013)。微生物是木质纤维素转化的主要执行者，因此选育和利 用高效降解微生物菌株，研发高效降解菌剂，开发中草药渣快速腐熟技术，是目前国内外发 展的重要趋势之一。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种发酵中草药渣的微生物菌剂。
[0006] 为了实现本发明的目的，，本发明的高效快速腐熟中草药渣的微生物复合菌剂，该 复合菌剂包含保藏号为CGMCC NO :10185的链霉菌BYl (Str印tomyces sp.)和保藏号为 CGMCC NO :10184 的曲霉菌 BM13 (Aspergillus sp.) ο
[0007] 其中涉及的相关保藏信息为：
[0008] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院，中国科学院微生物研宄所；保藏日期：2014年12月15日；保藏编号： BYl (CGMCC NO :10185)和 BM13(CGMCC NO :10184);分类名：BY1 为链霉菌（Sti^ptomyces sp.)，BM13 为曲霉菌（Aspergillus sp.) 〇
[0009] 本发明的高效快速腐熟中草药渣的微生物菌剂，其包括如下质量份的组分：
[0010] 链霉菌BYl 5份；添加剂 2-5份； 曲霉菌BM13 5份；添加剂 2-5份； 优选为： 链霉菌BYl 5份；添加剂 3-4份； 曲霉菌BM13 5份；添加剂 3-4份；
[0011] 其中，链霉菌BYl含量达到2X108cfu/ml以上，曲霉菌BM13含量为2X IO8Cfu/ ml以上，所述的添加剂为麦麸、草炭、硅藻土或轻质碳酸钙，同时可加入适量的微量元素。
[0012] 上述微量元素溶液（g I71)为：CoCl2 · 6H20 0· 1，MnCl2 · 4H20 0· 425, ZnCl20.0 5， NiCl2 · 6H20 0· 01，CuSO4 · 5H20 0· 015, Na2MoO4 · 2H20 0· 01，Na2SeO4 · 2H20 0· 01。
[0013] 本发明还提供上述微生物菌剂在降解中草药渣纤维素中的应用。
[0014] 本发明还提供上述微生物菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备有机肥中的应用。
[0015] 本发明还提供上述微生物菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备栽培基质中的应用。
[0016] 本发明还提供上述微生物菌剂在利用秸杆生产有机肥中的应用。
[0017] 本发明采用的药渣应为无毒、重金属含量达标的中草药渣。
[0018] 本发明的链霉菌BYl和曲霉菌BM13菌株，是从我国四川省成都市某中药厂排放的 药渣和腐木中分离到的纤维素降解菌。
[0019] 本发明的链霉菌BYl的微生物学特征为：在羧甲基纤维素钠刚果红培养基上， 55°C培养，菌落淡绿色，圆形，无光泽，干燥，边缘整齐，如图1所示。在羧甲基纤维素钠刚果 红培养基上菌落周围产生透明圈。将该菌的16SrDNA序列测序后提交Genbank，序列号为 KJ567465。BIOLOG碳源利用分析可知，其对包括D-葡萄糖、D-纤维二糖等在内常见的72 种碳源都能较好地利用，主要的碳源利用状况见表1。
[0020] 表1菌株BYl主要碳源利用状况
[0021]
[0022] 注：A: D-果糖；B: D-麦芽糖；C: D-纤维二糖；D: D-甘露醇；E: L-阿拉伯糖；F: D-半 乳糖；G:D-葡萄糖；H:蔗糖；I:棉子糖；J:L-鼠李糖；K:肌醇；L:甘油；M:柠檬酸；N:苹果 酸。" + "表示可利用该碳源，""表示不可利用该碳源。
[0023] 本发明的曲霉菌BM13的微生物学特征为：在羧甲基纤维素钠刚果红培养基上， 30-35?培养，菌落深绿色，圆形，隆起，边缘整齐，气生菌丝，如图2所示。在羧甲基纤维素 钠刚果红培养基上菌落周围产生透明圈。将该菌的ITS序列测序后提交Genbank，序列号为 KJ567464。BIOLOG实验结果，除了 D-甘露醇、松三糖等少数外，其他碳源都能较好地利用， 主要的碳源利用状况见表2。
[0024] 表2菌株BM13主要碳源利用状况
[0025]
[0026] 注：A:D_阿拉伯糖；B:L_山梨糖；C:纤维二糖；D:赤藻糖醇；E:海藻糖；F:半乳 糖；G:葡萄糖；H:D-乳糖；I:麦芽糖；J:D-甘露醇；K:松三糖；L:D-果糖；M:L-鼠李糖；N: 蔗糖；〇:琥珀酸；P:乙醇；Q:核糖；R:山梨醇。"+"表示可利用该碳源，表示不可利用 该碳源。
[0027] 本发明提供的链霉菌BYl (Streptomyces)和曲霉菌BM13 (Aspergillus versicolor)，它们在中草药渣好氧堆肥中具有促进纤维素降解的能力。与传统堆肥工艺相 比，堆肥腐熟时间可缩短到30d以内。
[0028] 本发明的微生物菌剂，可以提高堆肥温度，加快水分挥发，快速启动纤维素的降 解，提高纤维素降解率。接种组比对照组的纤维素百分比降低速率提高20. 16%，纤维素降 解量提高13. 39%。与不接种菌剂的对照相比，可促进中草药渣堆肥的纤维素转化和堆肥腐 熟。
[0029] 本发明的含有链霉菌BYl (Streptomyces)和曲霉菌BM13 (Aspergillus versicolor)的微生物菌剂具有降解纤维素、快速腐熟中草药渣的能力，适合好氧堆肥发酵 中草药渣生产有机肥和栽培基质等应用。
【附图说明】
[0030] 图1是链霉菌BYl (Streptomyces)的菌落形态
[0031] 图 2 是曲霉菌 BM13 (Aspergillus versicolor)的菌落形态
[0032] 图3是堆肥过程中温度变化
[0033] 图4是堆肥过程中含水率的变化
[0034] 图5是堆肥过程中pH变化
[0035] 图6是堆肥过程中C/N和T值的变化
[0036] 图7是堆肥过程中纤维素百分比变化
[0037] 图8是堆肥过程中木质素百分比变化
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039] 实施例1微生物菌剂制备
[0040] 1.菌种制备培养基：
[0041] 真菌、放线菌：羧甲基纤维素钠培养基
[0042] 菌种活化扩大培养基：
[0043] 真菌：PDA培养基；放线菌：高氏一号培养基。
[0044] I. 1羧甲基纤维素钠培养基：
[0045] CMC-NalOg，（NH4) 2S042. 0g，MgSO4. 7Η200· 5g，K2HPO4L 0g，NaCIO. 5g，刚果红 0· 05g， 琼脂 20g，去离子水 lOOOmL，pH 7. 0,121°C 灭菌 30min。
[0046] I. 2马铃薯葡萄糖培养基：
[0047] 马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000ml，自然pH
[0048] 具体做法：将马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，煮沸20~ 30min，用八层纱布过滤，加入葡萄糖，加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装 试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121°C)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却 后贮存备用。
[0049] 1. 3高氏一号培养基：
[0050] 可溶性淀粉 20g，NaCIO. 5g，KNO3Ig, K2HPO4 · 3H200. 5g，MgSO4 · 7Η200· 5g， FeSO4 · 7Η200· 01g，水 1000ml，pH 7· 4 ~7· 6
[0051] 2.菌株制备与活化、扩大
[0052] 制备灭菌羧甲基纤维素钠培养基固体斜面若干，接入保藏的母菌，放线菌 28-32 °C、真菌 25-28 °C 培养，培养 5-7d。
[0053] 3.菌株扩大培养
[0054] 制备液体PDA培养基、高氏一号培养基，分装入250ml摇瓶，每瓶约100ml。灭菌 冷却后，于斜面上挑 取生长良好菌体接入，放线菌28-32°C、真菌25-28°C，转速180rpm培养 5-7d。制作如上培养基，按5%-10%的接种量转入IL摇瓶，在前期相同条件下进一步扩大， 每瓶菌量约600ml。菌液分别保存待用。
[0055] 4.菌剂制备
[0056] 检测微生物菌株培养液，调整含菌量为108CFU/mL，每升菌液加入灭菌麦麸0. 6kg， 并添加适量微量元素液混匀而成。
[0057] 实施例2中草药渣好氧堆肥试验
[0058] 对总量It多的新鲜中草药渣进行好氧堆肥处理，药渣性质见表3。通过接入微 生物菌剂，比较了接种组（JZ)与对照组（CK)的堆肥效果。堆肥接种组和对照组各设两 个平行。堆肥初期各堆药渣总重约275kg，含水率为72. 11-74. 22%。堆体长宽高各为 2mX0. 8mX0. 5m。
[0059] (1)高温菌剂投加：高温菌剂BYl在药渣堆肥第一天即开始接入，接种量约0. 2% (质量比）。将培养好的BYl离心浓缩。中片麸皮灭菌后，按菌液、麸皮5 :3混合（质量比）， 搅拌均匀后分别用于接入两组平行接种组。对照组药渣利用等量蒸馏水代替菌液按同样方 式处理。
[0060] (2)中温菌剂投加：中温菌剂BM13在堆肥药渣温度下降至45°C以下后接入，接种 量约0. 2%，菌剂处理与投加方式与高温菌剂投加相同。
[0061] 堆肥结束，经过简单风干，堆肥含水率可达到30%以下，^1、^2、0(1、0(2干重分 别减少 41. 73kg、41. 39kg、35. 054kg、37. 93kg。
[0062] 表3堆肥原料的性质（干基计）
[0063]
[0064] 1.堆肥温度
[0065] 根据图3可知：
[0066] 1)堆肥整个周期为30d，堆肥3d进入高温期，接种组高温期持续12d，对照组持续 15d〇
[0067] 2)接种组在升温期和高温期温度高于对照组，说明接入的高温菌剂作用促进了堆 肥温度的升高。第15d开始，接种组开始降温，而对照组到18d才开始进入降温期，这是由 于对照组基质降解较接种组慢，出现了降温滞后现象。
[0068] 3)降温期温度出现较大波动，因为接种组在第18d，对照组在第20d时分别接入中 温菌剂带入了水分和麸皮，促使次日温度突然升高，同时在第21d、23d间歇通过人工翻堆 散热，温度又迅速下降造成。
[0069] 2.含水率
[0070] 根据图4可知：
[0071] 1)初始药渣含水率为72. 11-74. 22%。堆肥初期含水率略有上升，而后开始迅速 下降，特别是15d开始，温度高，同时基质变得疏松，空隙变大，水分散失快。堆肥30d时接 种组和对照组分别为63. 23%和66. 01%。
[0072] 2)堆肥开始含水率略有上升，一是由于堆肥初期主要是药渣基质结合水转化为自 由水，总水量无太大变化，二是堆肥的第Od和第18d接入菌剂带入的水分，也使得这两点含 水率略有升高。
[0073] 3)接种组含水率降低速率明显快于对照组，说明接种菌剂促进堆体温度升高，有 利于加快堆体的水分散失。
[0074] 4)堆肥30d结束后，通过迅速自然风干，最终接种组和对照组含水率分别为 29.81%和26.16%，均达到30%以下，符合有机肥料标准（附525-2012)。
[0075] 3. pH 值
[0076] 根据图5可知：
[0077] 1)堆肥过程中pH值先出现略微下降，而后迅速上升，达到8左右趋于稳定。这是 由于堆肥初期，由于药渣中易利用物质较多，微生物繁殖很快，其分解大分子物质产生的有 机酸会使药渣的PH值略为下降，而后随着温度升高，乙酸、丁酸等的挥发和含氮有机物产 生的氨使得pH值迅速上升，最后稳定在7. 7左右，符合有机肥料标准（NY525-2012)。
[0078] 2)高温期开始，接种组pH值高于对照组，且变化明显快于对照组。说明接种组基 质转化速率明显快于对照组，微生物代谢活动更强烈。而腐熟后接种组pH值低于对照组， 可能后期腐熟较长时间后氨挥发较多所致。
[0079] 4. C/N 和 T 值
[0080] 根据图6可知：
[0081] 1)堆肥过程中C/N和T值下降呈对数曲线趋势，特别在升温期和高温期下降迅速。
[0082] 2) -般来说，T值到达0. 6堆肥即已经腐熟，堆肥30d时，接种组和对照组的T值 分别为〇. 52±0. 002、0. 53±0. 015。结合T值变化趋势看，接种组在第16d、对照组在第17d 左右就进入了腐熟期。这与堆肥过程中温度变化大致相吻合。
[0083] 3)根据两组实验C/N变化曲线，在高温期，C/N降低最大速率接种组为0. 695CT1， 大于对照组0.548CT1，接种组比对照组提高26. 82%，表明接种组C/N下降明显快于对照组。 表明接种的高温菌剂明显加速了基质中物质的降解，促进腐熟，加速了堆肥进程。
[0084] 5.纤维素、木质素
[0085] 根据图7和图8可以看出：
[0086] 1)堆肥过程中纤维素百分含量降低明显，在升温期和高温前期降低较快，高温后 期变化趋于短暂的稳定后，降低速率又开始加快。接种组和对照组O-IOd纤维素百分比降 低速率分别为0. 766(1'0. 656CT1，接种组比对照组提高了 16. 73%;16-30d纤维素百分比降 低速率分别为0. 403(1'0. 331CT1，接种组比对照组提高了 21. 75%。接种组平均降低斜率 0. 453CT1大于对照组的0. 377CT1，接种组比对照组的纤维素百分比降低速率提高20. 16%， 表明接种组菌剂促进了纤维素降解。
[0087] 2)堆肥30d时，接种组和对照组纤维素分别从最初的41. 4%降低到最后27. 82% 和30. 09%。与干基质减少量相结合可以计算出，整个堆肥过程中接种组纤维素平均降解了 21. 94kg，对照组平均降解了 19. 35kg，纤维素总量分别减量了 69. 31%和64. 26%。接种组 比对照组纤维素降解量提高13. 39%，接种组降解效果优于对照组，说明接种菌剂促进了纤 维素降解。
[0088] 3)从木质素百分含量变化来看，由于堆肥初期易降解的有机物首先降解，木质素 不易降解，所以接种组和对照组在堆肥中的相对含量由最初的11. 26%分别升高至最终 的23. 99%和22. 67%。堆肥后期物质降解比较缓慢，木质素含量变化趋势变缓，堆肥趋于 稳定。与干基质减少量相结合可以看出，整个堆肥过程中接种组木质素降解了 0. 24kg，对 照组降解了 0. 11kg，接种组比对照组提高了 118. 18%。木质素总量分别减量了 2. 72%和 1. 23%，表明接种菌剂对木质素降解也有一定的促进作用。
[0089] 6.堆肥总有机质及总养分
[0090] 表4堆肥过程中总有机质和总养分的变化（干基计）
[0091]
[0092] 由表4可知，堆肥结束时接种组和对照组的总有机质和总养分都达到了有机肥料 标准（NY525-2012)。但接种组的堆肥总养分高于对照组。
[0093] 7.堆肥中重金属
[0094] 表5药渣原料和堆肥中重金属含量（干基计）
[0095]
[0096] 由表5可以看出，堆肥结束时接种组和对照组样品的重金属含量均符合有机肥料 标准（NY525-2012)的要求。
[0097] 8.种子发芽系数
[0098] 种子发芽指数可以指示堆肥是否具有植物毒性，也是检测堆肥腐熟的一个重要指 标。采用黑麦草种子做种子发芽系数实验，第30d堆肥样品的种子发芽指数均达到了 80% 以上，JZ组和CK组分别为90. 8%和82. 6%，说明第30d时堆肥已经没有植物毒性，达到腐 熟。接种菌剂提高了堆肥的种子发芽系数和腐熟度。
[0099] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上所作一些修改或改进，对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离 本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种发酵中草药渣的微生物菌剂，其有效成分包括： 链霉菌BYl(Str印tomycessp.)，保藏号CGMCCNO. 10185 ; 曲霉菌BM13(Aspergillussp.)，保藏号CGMCCNO. 10184 ; 其包括如下质量份的组分： 链霉菌BYl 5份；添加剂 2-5份； 曲霉菌BMl3 5份；添加剂 2-5份； 链霉菌BYl含量达到2X108cfu/ml以上，曲霉菌BM13含量为2X108cfu/ml以上。2. 如权利要求1所述的菌剂，其特征包括如下质量份的组分： 链霉菌BYl5份；添加剂3-4份； 曲霉菌BM13 5份；添加剂3-4份。3. 如权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于，所述的添加剂可为麦麸、草炭、硅藻土或 轻质碳酸钙。4. 如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，还进一步添加微量元素溶液（gL4): CoCl2 ? 6H20 0? 1，MnCl2 ? 4H20 0? 425, ZnCl20.0 5, NiCl2 ? 6H20 0? 01，CuSO4 ? 5H200. 015， Na2MoO4 ? 2H20 0? 01，Na2SeO4 ? 2H20 0? Ol05. 权利要求1-4任一所述的菌剂在降解中草药渣纤维素中的应用。6. 权利要求1-4任一所述的菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备有机肥中的应用。7. 权利要求1-4任一所述的菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备栽培基质中的应用。8. 权利要求1-4任一所述的菌剂在利用秸杆类废弃物生产有机肥中的应用。9. 如权利要求5-7所述的应用，所述中草药渣为无毒、重金属含量达标的中草药渣。
【专利摘要】本发明提供了一种发酵中草药渣的微生物菌剂，其由链霉菌BY1(Streptomyces)、曲霉菌BM13(Aspergillus versicolor)2种菌株组成。本发明的菌剂具有在不调节中草药渣pH、C/N和高含水率(大于70％)的条件下，接入微生物菌剂能提高堆肥的温度，加快水分挥发，快速启动纤维素和木质素的降解，提高纤维素降解率，促进堆肥腐熟。CGMCC No.1018420141215CGMCC No.1018520141215
【IPC分类】C05F11/08, C05F17/00, C12R1/465, C12N1/20, C12R1/66, C12N1/14
【公开号】CN104894001
【申请号】CN201510078990
【发明人】黄钧, 毕京芳, 何京钟
【申请人】中国科学院成都生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年2月13日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种含有链霉菌BYl (Streptomyces)和曲霉菌 BM13 (Aspergillus versicolor)的发酵中草药澄的微生物复合菌剂。
【背景技术】
[0002] 随着中医药事业的快速发展和人们健康意识的增强，中药的生产与应用也日益广 泛，但同时也伴随着一个不容忽视的问题，那就是生产过程中产生的"废物" 一一药渣的 处理问题。在早期中药渣处理的形式主要包括填埋、焚烧、固定区域堆放等，不仅耗去大量 资金，而且造成了严重的资源浪费和环境污染。如果对其加以合理处理利用，如提取有效 成分、栽培食用菌、作饲料及饲料添加剂、制成花肥、作絮凝剂用于废水处理等，不仅能避 免环境污染，还可以给企业带来良好的经济效益。中药主要由植物、动物和部分矿物类药 材组成，其药渣富含一定量的活性成分和大量的粗纤维、粗脂肪、淀粉、粗多糖、氨基酸，质 轻，极易腐败，通气性好，是一种优质的有机肥和羟基质原料。王引权（王引权，吴小琴et al. 2008)等以90%中药固渣与10%油渣饼配比，联合堆制35d后，即可获得环境友好、腐 熟稳定并富含作物所需营养的优质有机肥或土壤改良剂。因此很有必要对其展开综合的利 用与研宄。
[0003] 传统堆肥发酵周期长，难以满足现代工业化生产需要。有研宄表明添加外源微生 物接种剂可以延长堆肥高温持续时间，缩短堆肥进程（Fang, Wong et al. 2001，del Carmen Vargas-Garcia, Francisca Sudirez-Estrella et al. 2006，胡菊，秦莉 et al. 2006)。梁卫 驱等（梁卫驱，郑芝波et al. 2009)采用中草药渣作为堆肥原料，添加复合菌剂进行高温 好氧堆肥试验，发现与未添加菌剂的处理相比，添加复合菌剂能迅速使堆肥温度超过60°C， 加快中草药渣的分解速度，全氮含量增加13. 2%，速效磷、速效钾含量分别增加29. 1%、 27. 2%，促进了堆肥的腐熟、稳定，说明复合菌剂可加快中草药渣的发酵腐熟、提高堆肥肥 力。徐秀银（徐秀银，陈学祥et al. 2010)等接入含高温纤维分解菌的菌种发酵中药渣生 产有机基质，能迅速启动发酵，整个发酵过程比常规发酵缩短约1/3的时间。说明接入微生 物菌剂对堆肥的启动、腐熟、品质等都有一定的有利作用。
[0004] 中草药渣中含有大量的木质素和纤维素，与腐殖质产生有密切关系，而这类 物质结构坚硬，分解困难，一直被认为是快速堆肥的限速有机物（席北斗，刘鸿亮et al. 2002, Deng, Wang et al. 2013)。微生物是木质纤维素转化的主要执行者，因此选育和利 用高效降解微生物菌株，研发高效降解菌剂，开发中草药渣快速腐熟技术，是目前国内外发 展的重要趋势之一。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种发酵中草药渣的微生物菌剂。
[0006] 为了实现本发明的目的，，本发明的高效快速腐熟中草药渣的微生物复合菌剂，该 复合菌剂包含保藏号为CGMCC NO :10185的链霉菌BYl (Str印tomyces sp.)和保藏号为 CGMCC NO :10184 的曲霉菌 BM13 (Aspergillus sp.) ο
[0007] 其中涉及的相关保藏信息为：
[0008] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院，中国科学院微生物研宄所；保藏日期：2014年12月15日；保藏编号： BYl (CGMCC NO :10185)和 BM13(CGMCC NO :10184);分类名：BY1 为链霉菌（Sti^ptomyces sp.)，BM13 为曲霉菌（Aspergillus sp.) 〇
[0009] 本发明的高效快速腐熟中草药渣的微生物菌剂，其包括如下质量份的组分：
[0010] 链霉菌BYl 5份；添加剂 2-5份； 曲霉菌BM13 5份；添加剂 2-5份； 优选为： 链霉菌BYl 5份；添加剂 3-4份； 曲霉菌BM13 5份；添加剂 3-4份；
[0011] 其中，链霉菌BYl含量达到2X108cfu/ml以上，曲霉菌BM13含量为2X IO8Cfu/ ml以上，所述的添加剂为麦麸、草炭、硅藻土或轻质碳酸钙，同时可加入适量的微量元素。
[0012] 上述微量元素溶液（g I71)为：CoCl2 · 6H20 0· 1，MnCl2 · 4H20 0· 425, ZnCl20.0 5， NiCl2 · 6H20 0· 01，CuSO4 · 5H20 0· 015, Na2MoO4 · 2H20 0· 01，Na2SeO4 · 2H20 0· 01。
[0013] 本发明还提供上述微生物菌剂在降解中草药渣纤维素中的应用。
[0014] 本发明还提供上述微生物菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备有机肥中的应用。
[0015] 本发明还提供上述微生物菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备栽培基质中的应用。
[0016] 本发明还提供上述微生物菌剂在利用秸杆生产有机肥中的应用。
[0017] 本发明采用的药渣应为无毒、重金属含量达标的中草药渣。
[0018] 本发明的链霉菌BYl和曲霉菌BM13菌株，是从我国四川省成都市某中药厂排放的 药渣和腐木中分离到的纤维素降解菌。
[0019] 本发明的链霉菌BYl的微生物学特征为：在羧甲基纤维素钠刚果红培养基上， 55°C培养，菌落淡绿色，圆形，无光泽，干燥，边缘整齐，如图1所示。在羧甲基纤维素钠刚果 红培养基上菌落周围产生透明圈。将该菌的16SrDNA序列测序后提交Genbank，序列号为 KJ567465。BIOLOG碳源利用分析可知，其对包括D-葡萄糖、D-纤维二糖等在内常见的72 种碳源都能较好地利用，主要的碳源利用状况见表1。
[0020] 表1菌株BYl主要碳源利用状况
[0021]
[0022] 注：A: D-果糖；B: D-麦芽糖；C: D-纤维二糖；D: D-甘露醇；E: L-阿拉伯糖；F: D-半 乳糖；G:D-葡萄糖；H:蔗糖；I:棉子糖；J:L-鼠李糖；K:肌醇；L:甘油；M:柠檬酸；N:苹果 酸。" + "表示可利用该碳源，""表示不可利用该碳源。
[0023] 本发明的曲霉菌BM13的微生物学特征为：在羧甲基纤维素钠刚果红培养基上， 30-35?培养，菌落深绿色，圆形，隆起，边缘整齐，气生菌丝，如图2所示。在羧甲基纤维素 钠刚果红培养基上菌落周围产生透明圈。将该菌的ITS序列测序后提交Genbank，序列号为 KJ567464。BIOLOG实验结果，除了 D-甘露醇、松三糖等少数外，其他碳源都能较好地利用， 主要的碳源利用状况见表2。
[0024] 表2菌株BM13主要碳源利用状况
[0025]
[0026] 注：A:D_阿拉伯糖；B:L_山梨糖；C:纤维二糖；D:赤藻糖醇；E:海藻糖；F:半乳 糖；G:葡萄糖；H:D-乳糖；I:麦芽糖；J:D-甘露醇；K:松三糖；L:D-果糖；M:L-鼠李糖；N: 蔗糖；〇:琥珀酸；P:乙醇；Q:核糖；R:山梨醇。"+"表示可利用该碳源，表示不可利用 该碳源。
[0027] 本发明提供的链霉菌BYl (Streptomyces)和曲霉菌BM13 (Aspergillus versicolor)，它们在中草药渣好氧堆肥中具有促进纤维素降解的能力。与传统堆肥工艺相 比，堆肥腐熟时间可缩短到30d以内。
[0028] 本发明的微生物菌剂，可以提高堆肥温度，加快水分挥发，快速启动纤维素的降 解，提高纤维素降解率。接种组比对照组的纤维素百分比降低速率提高20. 16%，纤维素降 解量提高13. 39%。与不接种菌剂的对照相比，可促进中草药渣堆肥的纤维素转化和堆肥腐 熟。
[0029] 本发明的含有链霉菌BYl (Streptomyces)和曲霉菌BM13 (Aspergillus versicolor)的微生物菌剂具有降解纤维素、快速腐熟中草药渣的能力，适合好氧堆肥发酵 中草药渣生产有机肥和栽培基质等应用。
【附图说明】
[0030] 图1是链霉菌BYl (Streptomyces)的菌落形态
[0031] 图 2 是曲霉菌 BM13 (Aspergillus versicolor)的菌落形态
[0032] 图3是堆肥过程中温度变化
[0033] 图4是堆肥过程中含水率的变化
[0034] 图5是堆肥过程中pH变化
[0035] 图6是堆肥过程中C/N和T值的变化
[0036] 图7是堆肥过程中纤维素百分比变化
[0037] 图8是堆肥过程中木质素百分比变化
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039] 实施例1微生物菌剂制备
[0040] 1.菌种制备培养基：
[0041] 真菌、放线菌：羧甲基纤维素钠培养基
[0042] 菌种活化扩大培养基：
[0043] 真菌：PDA培养基；放线菌：高氏一号培养基。
[0044] I. 1羧甲基纤维素钠培养基：
[0045] CMC-NalOg，（NH4) 2S042. 0g，MgSO4. 7Η200· 5g，K2HPO4L 0g，NaCIO. 5g，刚果红 0· 05g， 琼脂 20g，去离子水 lOOOmL，pH 7. 0,121°C 灭菌 30min。
[0046] I. 2马铃薯葡萄糖培养基：
[0047] 马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000ml，自然pH
[0048] 具体做法：将马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，煮沸20~ 30min，用八层纱布过滤，加入葡萄糖，加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装 试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121°C)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却 后贮存备用。
[0049] 1. 3高氏一号培养基：
[0050] 可溶性淀粉 20g，NaCIO. 5g，KNO3Ig, K2HPO4 · 3H200. 5g，MgSO4 · 7Η200· 5g， FeSO4 · 7Η200· 01g，水 1000ml，pH 7· 4 ~7· 6
[0051] 2.菌株制备与活化、扩大
[0052] 制备灭菌羧甲基纤维素钠培养基固体斜面若干，接入保藏的母菌，放线菌 28-32 °C、真菌 25-28 °C 培养，培养 5-7d。
[0053] 3.菌株扩大培养
[0054] 制备液体PDA培养基、高氏一号培养基，分装入250ml摇瓶，每瓶约100ml。灭菌 冷却后，于斜面上挑 取生长良好菌体接入，放线菌28-32°C、真菌25-28°C，转速180rpm培养 5-7d。制作如上培养基，按5%-10%的接种量转入IL摇瓶，在前期相同条件下进一步扩大， 每瓶菌量约600ml。菌液分别保存待用。
[0055] 4.菌剂制备
[0056] 检测微生物菌株培养液，调整含菌量为108CFU/mL，每升菌液加入灭菌麦麸0. 6kg， 并添加适量微量元素液混匀而成。
[0057] 实施例2中草药渣好氧堆肥试验
[0058] 对总量It多的新鲜中草药渣进行好氧堆肥处理，药渣性质见表3。通过接入微 生物菌剂，比较了接种组（JZ)与对照组（CK)的堆肥效果。堆肥接种组和对照组各设两 个平行。堆肥初期各堆药渣总重约275kg，含水率为72. 11-74. 22%。堆体长宽高各为 2mX0. 8mX0. 5m。
[0059] (1)高温菌剂投加：高温菌剂BYl在药渣堆肥第一天即开始接入，接种量约0. 2% (质量比）。将培养好的BYl离心浓缩。中片麸皮灭菌后，按菌液、麸皮5 :3混合（质量比）， 搅拌均匀后分别用于接入两组平行接种组。对照组药渣利用等量蒸馏水代替菌液按同样方 式处理。
[0060] (2)中温菌剂投加：中温菌剂BM13在堆肥药渣温度下降至45°C以下后接入，接种 量约0. 2%，菌剂处理与投加方式与高温菌剂投加相同。
[0061] 堆肥结束，经过简单风干，堆肥含水率可达到30%以下，^1、^2、0(1、0(2干重分 别减少 41. 73kg、41. 39kg、35. 054kg、37. 93kg。
[0062] 表3堆肥原料的性质（干基计）
[0063]
[0064] 1.堆肥温度
[0065] 根据图3可知：
[0066] 1)堆肥整个周期为30d，堆肥3d进入高温期，接种组高温期持续12d，对照组持续 15d〇
[0067] 2)接种组在升温期和高温期温度高于对照组，说明接入的高温菌剂作用促进了堆 肥温度的升高。第15d开始，接种组开始降温，而对照组到18d才开始进入降温期，这是由 于对照组基质降解较接种组慢，出现了降温滞后现象。
[0068] 3)降温期温度出现较大波动，因为接种组在第18d，对照组在第20d时分别接入中 温菌剂带入了水分和麸皮，促使次日温度突然升高，同时在第21d、23d间歇通过人工翻堆 散热，温度又迅速下降造成。
[0069] 2.含水率
[0070] 根据图4可知：
[0071] 1)初始药渣含水率为72. 11-74. 22%。堆肥初期含水率略有上升，而后开始迅速 下降，特别是15d开始，温度高，同时基质变得疏松，空隙变大，水分散失快。堆肥30d时接 种组和对照组分别为63. 23%和66. 01%。
[0072] 2)堆肥开始含水率略有上升，一是由于堆肥初期主要是药渣基质结合水转化为自 由水，总水量无太大变化，二是堆肥的第Od和第18d接入菌剂带入的水分，也使得这两点含 水率略有升高。
[0073] 3)接种组含水率降低速率明显快于对照组，说明接种菌剂促进堆体温度升高，有 利于加快堆体的水分散失。
[0074] 4)堆肥30d结束后，通过迅速自然风干，最终接种组和对照组含水率分别为 29.81%和26.16%，均达到30%以下，符合有机肥料标准（附525-2012)。
[0075] 3. pH 值
[0076] 根据图5可知：
[0077] 1)堆肥过程中pH值先出现略微下降，而后迅速上升，达到8左右趋于稳定。这是 由于堆肥初期，由于药渣中易利用物质较多，微生物繁殖很快，其分解大分子物质产生的有 机酸会使药渣的PH值略为下降，而后随着温度升高，乙酸、丁酸等的挥发和含氮有机物产 生的氨使得pH值迅速上升，最后稳定在7. 7左右，符合有机肥料标准（NY525-2012)。
[0078] 2)高温期开始，接种组pH值高于对照组，且变化明显快于对照组。说明接种组基 质转化速率明显快于对照组，微生物代谢活动更强烈。而腐熟后接种组pH值低于对照组， 可能后期腐熟较长时间后氨挥发较多所致。
[0079] 4. C/N 和 T 值
[0080] 根据图6可知：
[0081] 1)堆肥过程中C/N和T值下降呈对数曲线趋势，特别在升温期和高温期下降迅速。
[0082] 2) -般来说，T值到达0. 6堆肥即已经腐熟，堆肥30d时，接种组和对照组的T值 分别为〇. 52±0. 002、0. 53±0. 015。结合T值变化趋势看，接种组在第16d、对照组在第17d 左右就进入了腐熟期。这与堆肥过程中温度变化大致相吻合。
[0083] 3)根据两组实验C/N变化曲线，在高温期，C/N降低最大速率接种组为0. 695CT1， 大于对照组0.548CT1，接种组比对照组提高26. 82%，表明接种组C/N下降明显快于对照组。 表明接种的高温菌剂明显加速了基质中物质的降解，促进腐熟，加速了堆肥进程。
[0084] 5.纤维素、木质素
[0085] 根据图7和图8可以看出：
[0086] 1)堆肥过程中纤维素百分含量降低明显，在升温期和高温前期降低较快，高温后 期变化趋于短暂的稳定后，降低速率又开始加快。接种组和对照组O-IOd纤维素百分比降 低速率分别为0. 766(1'0. 656CT1，接种组比对照组提高了 16. 73%;16-30d纤维素百分比降 低速率分别为0. 403(1'0. 331CT1，接种组比对照组提高了 21. 75%。接种组平均降低斜率 0. 453CT1大于对照组的0. 377CT1，接种组比对照组的纤维素百分比降低速率提高20. 16%， 表明接种组菌剂促进了纤维素降解。
[0087] 2)堆肥30d时，接种组和对照组纤维素分别从最初的41. 4%降低到最后27. 82% 和30. 09%。与干基质减少量相结合可以计算出，整个堆肥过程中接种组纤维素平均降解了 21. 94kg，对照组平均降解了 19. 35kg，纤维素总量分别减量了 69. 31%和64. 26%。接种组 比对照组纤维素降解量提高13. 39%，接种组降解效果优于对照组，说明接种菌剂促进了纤 维素降解。
[0088] 3)从木质素百分含量变化来看，由于堆肥初期易降解的有机物首先降解，木质素 不易降解，所以接种组和对照组在堆肥中的相对含量由最初的11. 26%分别升高至最终 的23. 99%和22. 67%。堆肥后期物质降解比较缓慢，木质素含量变化趋势变缓，堆肥趋于 稳定。与干基质减少量相结合可以看出，整个堆肥过程中接种组木质素降解了 0. 24kg，对 照组降解了 0. 11kg，接种组比对照组提高了 118. 18%。木质素总量分别减量了 2. 72%和 1. 23%，表明接种菌剂对木质素降解也有一定的促进作用。
[0089] 6.堆肥总有机质及总养分
[0090] 表4堆肥过程中总有机质和总养分的变化（干基计）
[0091]
[0092] 由表4可知，堆肥结束时接种组和对照组的总有机质和总养分都达到了有机肥料 标准（NY525-2012)。但接种组的堆肥总养分高于对照组。
[0093] 7.堆肥中重金属
[0094] 表5药渣原料和堆肥中重金属含量（干基计）
[0095]
[0096] 由表5可以看出，堆肥结束时接种组和对照组样品的重金属含量均符合有机肥料 标准（NY525-2012)的要求。
[0097] 8.种子发芽系数
[0098] 种子发芽指数可以指示堆肥是否具有植物毒性，也是检测堆肥腐熟的一个重要指 标。采用黑麦草种子做种子发芽系数实验，第30d堆肥样品的种子发芽指数均达到了 80% 以上，JZ组和CK组分别为90. 8%和82. 6%，说明第30d时堆肥已经没有植物毒性，达到腐 熟。接种菌剂提高了堆肥的种子发芽系数和腐熟度。
[0099] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上所作一些修改或改进，对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离 本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种发酵中草药渣的微生物菌剂，其有效成分包括： 链霉菌BYl(Str印tomycessp.)，保藏号CGMCCNO. 10185 ; 曲霉菌BM13(Aspergillussp.)，保藏号CGMCCNO. 10184 ; 其包括如下质量份的组分： 链霉菌BYl 5份；添加剂 2-5份； 曲霉菌BMl3 5份；添加剂 2-5份； 链霉菌BYl含量达到2X108cfu/ml以上，曲霉菌BM13含量为2X108cfu/ml以上。2. 如权利要求1所述的菌剂，其特征包括如下质量份的组分： 链霉菌BYl5份；添加剂3-4份； 曲霉菌BM13 5份；添加剂3-4份。3. 如权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于，所述的添加剂可为麦麸、草炭、硅藻土或 轻质碳酸钙。4. 如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，还进一步添加微量元素溶液（gL4): CoCl2 ? 6H20 0? 1，MnCl2 ? 4H20 0? 425, ZnCl20.0 5, NiCl2 ? 6H20 0? 01，CuSO4 ? 5H200. 015， Na2MoO4 ? 2H20 0? 01，Na2SeO4 ? 2H20 0? Ol05. 权利要求1-4任一所述的菌剂在降解中草药渣纤维素中的应用。6. 权利要求1-4任一所述的菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备有机肥中的应用。7. 权利要求1-4任一所述的菌剂在好氧堆肥发酵中草药渣制备栽培基质中的应用。8. 权利要求1-4任一所述的菌剂在利用秸杆类废弃物生产有机肥中的应用。9. 如权利要求5-7所述的应用，所述中草药渣为无毒、重金属含量达标的中草药渣。
【专利摘要】本发明提供了一种发酵中草药渣的微生物菌剂，其由链霉菌BY1(Streptomyces)、曲霉菌BM13(Aspergillus versicolor)2种菌株组成。本发明的菌剂具有在不调节中草药渣pH、C/N和高含水率(大于70％)的条件下，接入微生物菌剂能提高堆肥的温度，加快水分挥发，快速启动纤维素和木质素的降解，提高纤维素降解率，促进堆肥腐熟。CGMCC No.1018420141215CGMCC No.1018520141215
【IPC分类】C05F11/08, C05F17/00, C12R1/465, C12N1/20, C12R1/66, C12N1/14
【公开号】CN104894001
【申请号】CN201510078990
【发明人】黄钧, 毕京芳, 何京钟
【申请人】中国科学院成都生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年2月13日
最新回复(0)