一种高产胞外多糖的乳酸菌bl21及制备方法和应用
一种高产胞外多糖的乳酸菌bl21及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产胞外多糖的乳酸菌BL21，以及所产生 的胞外多糖及其用途。
【背景技术】
[0002] 皮肤由外向内分为表皮和真皮两部分，肤色的深浅取决于表皮层中黑色素（也称 黑素）含量的多少。
[0003] 黑色素是以酪氨酸为前体经酪氨酸酶系催化，发生氧化聚合过程而形成的一组复 杂的色素成分，可分为不溶性的黑色5,6-二羟基吲哚型黑色素和可溶性较高的5,6-二羟 基吲哚羧酸型黑色素。黑色素在由表皮基底层中的黑色素细胞产生的黑色素小体中合成并 迀移到周围的角质形成细胞中，随角质层细胞的更新不断迀移到皮肤表面，构成肤色，并随 角质层细胞的更新而脱落。
[0004] 皮肤上特定区域内色素过度沉着，使该区域肤色与周围区域更深，则形成色斑，常 见色斑种类有黄褐斑、雀斑、炎症性色素沉着等。其中，黄褐斑是一种常见于中年女性的色 素沉着现象，表现为面颊部对称性片状浅褐色或深褐色的色素沉着斑，其发病机制尚不完 全清楚，目前研宄表明，日晒、性激素水平是主要因素，皮肤屏障功能失调、某些药物、慢性 疾病、遗传因素、皮肤微生态失衡、接触重金属等也可能导致发生黄褐斑。
[0005] 使肤色更白皙，去除色斑以提高肤色均匀度是消费者对化妆品和护肤品的主要功 能需求之一。常用的肤色改善成分包括抗坏血酸及其衍生物、甘草提取物（光甘草定、甘草 黄酮、甘草酸等）、熊果苷、氢醌、曲酸及其衍生物、阿魏酸及其衍生物、维A酸类、壬二酸类、 氨甲环酸、N-乙酰葡萄糖胺、烟酰胺、带有烷烃侧链的间苯二酚类、4-甲氧基水杨酸钾、促 进角质细胞脱落的有机酸（乳酸、果酸）等。以上各类成分在功效、安全性上各有差异。开 发具有抑制黑色素形成、减少色斑、高度安全的成分对护肤品制造商和消费者都十分重要。
[0006] 嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)是常用于酸奶及发酵乳制品生产的乳酸菌，安全性高，被列入卫生部公布的《可用 于食品的菌种名单》（卫办监督发[2010]65号）。一些嗜热链球菌菌株和长双歧杆菌菌株 在发酵过程中可产生胞外多糖。嗜热链球菌和长双歧杆菌产生的胞外多糖在单糖和结构上 具有菌株特异性，且受培养条件的影响；胞外多糖产量与菌株和培养条件有关。
[0007] 作为一种大分子聚合物，胞外多糖具有一定的粘性和持水性，该性质在酸奶生产 中具有积极意义，因此传统产业中会专门筛选产胞外多糖的嗜热链球菌和长双歧杆菌菌株 用于酸奶生产。
[0008] 近年来，关于乳酸菌胞外多糖的应用研宄日益增加，利用以乳酸乳球菌等产生的 磷酸化多糖作为保湿剂和美白剂利用的方法（日本特开平9-249524号公报、日本特开 平10-251140号公报），以乳杆菌属菌株产生的多糖成分作为消炎剂利用的方法（日本 特开平7-70209号公报），含有胞外多糖的乳酸菌培养上清作为皱纹抑制剂的方法（CN 101505721A);但尚未有将长双歧杆菌和嗜热链球菌产生的胞外多糖作为肤色改善成分使 用的报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种能高产胞外多糖的乳酸菌及所产生的胞外多糖及其 用途。该胞外多糖能抑制黑色素的合成，具有改善肤色的作用。
[0010] 本发明的技术方案如下：
[0011] -种高产胞外多糖的乳酸菌，名称为BL21，属于长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 10452,保藏日期为2015年1月27日。
[0012] 本发明还提供了一种由上述的乳酸菌发酵生产的胞外多糖。
[0013] 本发明还提供了一种上述乳酸菌发酵生产所述胞外多糖的方法，包含以下步骤： (1)将BL21菌株接种于培养基内进行，培养温度为20~50°C，培养时间为1~60小时，获 得培养液；（2)从所述培养液中提取胞外多糖。
[0014] 进一步，所述培养基包括以下重量百分比的组分：0.5%的果糖、1.2%的蔗糖、 0. 5%低聚果糖、0. 5%低聚半乳糖和余量的水。
[0015] 更进一步，所述步骤1)中，培养过程具体为，先于37-45°C静置培养12-14小时，再 降温至20-35°C，培养36-48小时。
[0016] 更进一步地，所述步骤（2)包含如下步骤：a、采用压滤或离心的方法从所述培养 液中分离出第一上清液；b、在所述第一上清液中加入为其体积1/10~1/5的氯仿或三氯 乙酸，混合后离心或静置分层并抽取第二上清液，所述步骤b可根据需要重复多次；c、将步 骤b获得的所述第二上清液与为其体积1~3倍的浓度不低于85 %的乙醇水溶液混合并搅 拌，过滤分离获得析出物；d、用乙醇水溶液对所述析出物进行反复洗脱并干燥，获得胞外多 糖。
[0017] 更进一步，所述步骤b中，在加入氯仿或三氯乙酸之前，先加入灭菌溶解后的重量 含量为0. 2%的卡拉胶的水溶液，添加量为第一上清液重量的2-2. 1%。
[0018] 更进一步地，所述步骤d中的干燥温度为50~80°C，干燥时间为1~24小时。
[0019] 本发明还提供了含有上述胞外多糖的外用制剂，所述外用制剂用于改善肤色。 [0020] 进一步地，所述外用制剂为化妆水、乳液、膏霜、面膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕 霜、防晒霜或外用药。
[0021] 在制备皮肤外用制剂和护肤品时，除添加胞外多糖作为有效成分外，还可根据常 规加入油脂、表面活性剂、多元醇类、保湿剂、消泡剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、酸碱调节 剂、香精香料、色素、紫外线吸收剂、各类功效成分、粉体、水等。可采取的制造工艺为常规的 化妆品、护肤品或外用医药品的制造工艺。
[0022] 更进一步地，所述胞外多糖在所述外用制剂中的含量为0. 1~99. 9%。
[0023] 更进一步地，所述胞外多糖在所述外用制剂中的含量为0. 1~5%。
[0024] 本发明提供的乳酸菌可高产具有抑制细胞中黑色素的合成并减少皮肤色斑数量 的胞外多糖，并且由于长双歧杆菌属于益生菌，利用其发酵生产的胞外多糖对人体完全无 害甚至有益，安全性优异，因此能够用于制造化妆品、护肤品以及各种皮肤外用剂组合物。
【附图说明】
[0025] 图1是为实施例3的B16细胞产黑色素情况，图Ia :对照组，图Ib :胞外多糖组 (3. 3mg/ml)；
[0026] 图2为不同浓度胞外多糖对B16细胞活力和黑色素形成的影响。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0028] 实施例1 :菌株的分离、筛选及鉴定
[0029] 采集了健康婴幼儿粪便样品，用无菌水溶解，梯度稀释，加入到灭菌的平板中，倾 入到55°C左右的MRS培养基中，MRS培养基配方为：蛋白胨10. 0g，牛肉膏8. 0g，酵母膏 4. 0g，乳糖20. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，乙酸钠5. 0g，硫酸镁0. 2g，硫酸锰0. 05g，L-半胱氨酸 盐酸盐I. 〇g，柠檬酸三铵2. 0g，吐温801. 0g，琼脂20. 0g，ρΗ6· 0~6. 5之间，加蒸馏水至 1000mL，121°C灭菌20min。在厌氧条件下，37°C培养72h。挑选溶钙圈大活力强的菌落进行 划线纯化培养，进一步以1%~3%体积比接种到10% (W/V)固形物的牛乳中，43°C静置培 养6小时，搅拌凝乳并观察状态。
[0030] 挑选凝乳有拉丝现象、凝乳外观细腻的菌株，此类菌株多为胞外多糖产率较高的 菌株。凝乳成颗粒外观、不细腻的菌株，不产生胞外多糖或胞外多糖产率很低。
[0031] 经分离得到的一株命名为BL21，该菌株的在显微镜下观察呈棒槌状，锥型状， 短小，较细，能发酵乳糖、葡萄糖等，产生乳酸和乙酸，一种厌氧的革兰氏阳性杆菌。同 时将该菌16S rDNA序列与模式菌株进行比对，鉴定为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌 BL21 (Bifidobacterium longum BL21),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCC No. 10452,保藏日期为2015年1月27日。
[0032] 实施例2 :发酵和多糖提取
[0033] 将筛选所得的长双歧杆菌BL21接种到胞外多糖培养基中，胞外多糖培养基中各 组分重量百分比：〇. 5%的果糖、1. 2%的蔗糖、0. 5%低聚果糖、0. 5%低聚半乳糖作为碳源 和余量的水，先于37°C下静置培养12小时，再降低温度至30°C培养36小时。
[0034] 培养液使用角转子离心机处理，6000rpm离心20分钟，收集第一上清液。然后向第 一上清液中加入第一上清液重量2%的卡拉胶水溶液，所述卡拉胶水溶液是经灭菌后的卡 拉胶溶解于水中获得，其中卡拉胶含量为0. 2wt %，充分混匀后，加入1/10体积的氯仿，震 荡使混合均匀后6000rpm离心15分钟，使其分层，液体分为3层，上层为第二上清液，中层 为析出的蛋白质层，底层为氯仿。
[0035] 收集第二上清液，加入2倍体积的95%酒精，搅拌，胞外多糖呈絮状析出，用200目 网过滤进行收集。
[0036] 将收集的胞外多糖放置在1倍体积的80%酒精溶液中浸泡4小时，取出并挤去酒 精，放置在60°C烘箱中干燥处理4小时，获得块状的胞外多糖。用研钵粉碎后用于测试。
[0037] 长双歧杆菌BL21胞外多糖发酵液多糖浓度达5%。
[0038] 实施例3 :长双歧杆菌BL21胞外多糖对B16细胞黑色素形成的影响
[0039] 用含5%胎牛血清的DMEM培养液培养B16黑素瘤细胞，培养条件为37°C、5% CO2 恒温培养。取对数期的B16黑素瘤细胞，弃去培养液，用PBS液清洗2次，加入培养液吹打， 调节细胞悬液浓度为5 X 104-10 X 104个/ml，加入96孔板中，每孔加入100 μ 1。培养12-16 小时使细胞贴壁，吸去培养液。
[0040] 将实施例2获得的胞外多糖配置为不同浓度的培养液，同时加入10 μ 1的CCK-8 试剂（CCK-8Cel I Counting Kit, Yeasen)并根据试剂盒指明的方法测试细胞活力。设置 对照组（细胞+培养液），胞外多糖每个浓度组设置5个复孔。
[0041] 培养56小时后，用0. 25%胰酶消化，以500rpm离心5min弃上清液，每个处理因 素下的细胞加入200ul含10%二甲基亚砜的NaOH(ImoVL)溶液，于65°C水浴2小时完全 溶解黑色素颗粒，分光光度计测量490nm处吸光度A值。黑色素形成率=A实验组/A对照 组 X 100% 〇
[0042] 试验结果显示，长双歧杆菌BL21产生的胞外多糖在特定浓度下可显著减少B16细 胞黑色素的形成，例如其在3. 3mg/ml浓度下可降低黑色素形成率达50%。
[0043] B16细胞产黑色素情况的照片见附图1。细胞活力和黑色素产量统计图见附图2。
[0044] 实施例4 :乳液的配制
[0045] 将长双歧杆菌BL21菌株产生的胞外多糖按下表1配方配制为乳液。
[0046] 表 1
[0047]
[0049] 配置方法为：将全部原料在容器中混合后，水浴加热至70°C，300rpm搅拌40分钟。 用于人体测试时，空白对照组所用乳液不加入胞外多糖。
[0050] 实施例5 :人体测试
[0051] 志愿者为40名年龄在35-52岁的女性。测试组、对照组，各20名。
[0052] 使用实施例4中配制的乳液，测试组所用乳液中含1% W/W的胞外多糖，对照组所 用乳液中不含胞外多糖。
[0053] 在测试开始前使用VISIA Complexion Analys is面部分析系统获得面部特定区 域内色斑、黄褐斑数量，使用Cutometer MPA 580皮肤测试仪获得面部皮肤的黑色素数值。
[0054] 志愿者每天早晚使用乳液各一次，使用8周后对色斑数量和黑色素数值进行测 量。统计结果表明，胞外多糖可显著减少色斑、黄褐斑数量，降低皮肤黑色素数值，具体结果 见下表2 :
[0055] 表 2
[0056]
【主权项】
1. 一种高产胞外多糖的乳酸菌，其特征在于，名称为BL21，属于长双歧杆菌 (BifidobacteriumIongum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为CGMCCNo. 10452,保藏日期为2015年1月27日。2. -种胞外多糖，其特征在于，由权利要求1所述高产胞外多糖的乳酸菌经BL21发酵 生产获得。3. -种如权利要求2所述胞外多糖的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：（1)将所 述BL21菌株接种于胞外多糖培养基内进行，培养温度为20~50°C，培养时间为1~60小 时，获得培养液；（2)从所述培养液中提取获得胞外多糖。4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述胞外多糖培养基包括如下重量百 分比的组分：〇. 5%的果糖、1. 2%的蔗糖、0. 5%低聚果糖、0. 5%低聚半乳糖和余量的水。5. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，培养过程具体为，先于 37-45°C静置培养12-14小时，再降温至20-35°C，培养36-48小时。6. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2)包含如下步骤：a、采用压 滤或离心的方法从所述培养液中分离出第一上清液；b、在所述第一上清液中加入为其体积 1/10~1/5的氯仿或三氯乙酸，混合后离心或静置分层并抽取第二上清液，所述步骤b可 根据需要重复多次；c、将步骤b获得的所述第二上清液与为其体积1~3倍的浓度不低于 85%的乙醇水溶液混合并搅拌，过滤分离获得析出物；d、用乙醇水溶液对所述析出物进行 反复洗脱并干燥，获得胞外多糖。7. 根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤b中，在加入氯仿或三氯乙酸 之前，先加入灭菌溶解后的重量含量为0. 2%的卡拉胶的水溶液，添加量为第一上清液重量 的 2-2. 1 %。8. -种外用制剂，其特征在于，包括权利要求2所述胞外多糖。9. 根据权利要求8所述外用制剂，其特征在于，所述外用制剂为化妆水、乳液、膏霜、面 膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕霜、防晒霜或外用药。10. 根据权利要求8所述外用制剂，其特征在于，所述胞外多糖在所述外用制剂中的含 量为0? 1~99. 9%。
【专利摘要】本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产胞外多糖的乳酸菌，其产胞外多糖的最佳条件及制备方法、以及所产生的胞外多糖及其用途。本发明提供了长双歧杆菌BL21，BL21通过培养和提取获得胞外多糖。所述胞外多糖可用于制备出用于改善肤色的外用制剂。本发明提供的乳酸菌可高产具有抑制细胞中黑色素的合成并减少皮肤色斑数量的胞外多糖，并且由于长双歧杆菌属于益生菌，利用其发酵生产的胞外多糖对人体完全无害甚至有益，安全性优异，因此能够用于制造化妆品、护肤品以及各种皮肤外用剂组合物。CGMCC No.1045220150127
【IPC分类】C12R1/01, A61Q17/04, C12N1/20, A61P17/00, A61K8/73, A61Q19/02, C12P19/04, A61K31/715
【公开号】CN104894005
【申请号】CN201510217639
【发明人】方曙光, 马凯, 姜甜, 夏九学
【申请人】江苏紫石微康生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产胞外多糖的乳酸菌BL21，以及所产生 的胞外多糖及其用途。
【背景技术】
[0002] 皮肤由外向内分为表皮和真皮两部分，肤色的深浅取决于表皮层中黑色素（也称 黑素）含量的多少。
[0003] 黑色素是以酪氨酸为前体经酪氨酸酶系催化，发生氧化聚合过程而形成的一组复 杂的色素成分，可分为不溶性的黑色5,6-二羟基吲哚型黑色素和可溶性较高的5,6-二羟 基吲哚羧酸型黑色素。黑色素在由表皮基底层中的黑色素细胞产生的黑色素小体中合成并 迀移到周围的角质形成细胞中，随角质层细胞的更新不断迀移到皮肤表面，构成肤色，并随 角质层细胞的更新而脱落。
[0004] 皮肤上特定区域内色素过度沉着，使该区域肤色与周围区域更深，则形成色斑，常 见色斑种类有黄褐斑、雀斑、炎症性色素沉着等。其中，黄褐斑是一种常见于中年女性的色 素沉着现象，表现为面颊部对称性片状浅褐色或深褐色的色素沉着斑，其发病机制尚不完 全清楚，目前研宄表明，日晒、性激素水平是主要因素，皮肤屏障功能失调、某些药物、慢性 疾病、遗传因素、皮肤微生态失衡、接触重金属等也可能导致发生黄褐斑。
[0005] 使肤色更白皙，去除色斑以提高肤色均匀度是消费者对化妆品和护肤品的主要功 能需求之一。常用的肤色改善成分包括抗坏血酸及其衍生物、甘草提取物（光甘草定、甘草 黄酮、甘草酸等）、熊果苷、氢醌、曲酸及其衍生物、阿魏酸及其衍生物、维A酸类、壬二酸类、 氨甲环酸、N-乙酰葡萄糖胺、烟酰胺、带有烷烃侧链的间苯二酚类、4-甲氧基水杨酸钾、促 进角质细胞脱落的有机酸（乳酸、果酸）等。以上各类成分在功效、安全性上各有差异。开 发具有抑制黑色素形成、减少色斑、高度安全的成分对护肤品制造商和消费者都十分重要。
[0006] 嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)是常用于酸奶及发酵乳制品生产的乳酸菌，安全性高，被列入卫生部公布的《可用 于食品的菌种名单》（卫办监督发[2010]65号）。一些嗜热链球菌菌株和长双歧杆菌菌株 在发酵过程中可产生胞外多糖。嗜热链球菌和长双歧杆菌产生的胞外多糖在单糖和结构上 具有菌株特异性，且受培养条件的影响；胞外多糖产量与菌株和培养条件有关。
[0007] 作为一种大分子聚合物，胞外多糖具有一定的粘性和持水性，该性质在酸奶生产 中具有积极意义，因此传统产业中会专门筛选产胞外多糖的嗜热链球菌和长双歧杆菌菌株 用于酸奶生产。
[0008] 近年来，关于乳酸菌胞外多糖的应用研宄日益增加，利用以乳酸乳球菌等产生的 磷酸化多糖作为保湿剂和美白剂利用的方法（日本特开平9-249524号公报、日本特开 平10-251140号公报），以乳杆菌属菌株产生的多糖成分作为消炎剂利用的方法（日本 特开平7-70209号公报），含有胞外多糖的乳酸菌培养上清作为皱纹抑制剂的方法（CN 101505721A);但尚未有将长双歧杆菌和嗜热链球菌产生的胞外多糖作为肤色改善成分使 用的报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种能高产胞外多糖的乳酸菌及所产生的胞外多糖及其 用途。该胞外多糖能抑制黑色素的合成，具有改善肤色的作用。
[0010] 本发明的技术方案如下：
[0011] -种高产胞外多糖的乳酸菌，名称为BL21，属于长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 10452,保藏日期为2015年1月27日。
[0012] 本发明还提供了一种由上述的乳酸菌发酵生产的胞外多糖。
[0013] 本发明还提供了一种上述乳酸菌发酵生产所述胞外多糖的方法，包含以下步骤： (1)将BL21菌株接种于培养基内进行，培养温度为20~50°C，培养时间为1~60小时，获 得培养液；（2)从所述培养液中提取胞外多糖。
[0014] 进一步，所述培养基包括以下重量百分比的组分：0.5%的果糖、1.2%的蔗糖、 0. 5%低聚果糖、0. 5%低聚半乳糖和余量的水。
[0015] 更进一步，所述步骤1)中，培养过程具体为，先于37-45°C静置培养12-14小时，再 降温至20-35°C，培养36-48小时。
[0016] 更进一步地，所述步骤（2)包含如下步骤：a、采用压滤或离心的方法从所述培养 液中分离出第一上清液；b、在所述第一上清液中加入为其体积1/10~1/5的氯仿或三氯 乙酸，混合后离心或静置分层并抽取第二上清液，所述步骤b可根据需要重复多次；c、将步 骤b获得的所述第二上清液与为其体积1~3倍的浓度不低于85 %的乙醇水溶液混合并搅 拌，过滤分离获得析出物；d、用乙醇水溶液对所述析出物进行反复洗脱并干燥，获得胞外多 糖。
[0017] 更进一步，所述步骤b中，在加入氯仿或三氯乙酸之前，先加入灭菌溶解后的重量 含量为0. 2%的卡拉胶的水溶液，添加量为第一上清液重量的2-2. 1%。
[0018] 更进一步地，所述步骤d中的干燥温度为50~80°C，干燥时间为1~24小时。
[0019] 本发明还提供了含有上述胞外多糖的外用制剂，所述外用制剂用于改善肤色。 [0020] 进一步地，所述外用制剂为化妆水、乳液、膏霜、面膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕 霜、防晒霜或外用药。
[0021] 在制备皮肤外用制剂和护肤品时，除添加胞外多糖作为有效成分外，还可根据常 规加入油脂、表面活性剂、多元醇类、保湿剂、消泡剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、酸碱调节 剂、香精香料、色素、紫外线吸收剂、各类功效成分、粉体、水等。可采取的制造工艺为常规的 化妆品、护肤品或外用医药品的制造工艺。
[0022] 更进一步地，所述胞外多糖在所述外用制剂中的含量为0. 1~99. 9%。
[0023] 更进一步地，所述胞外多糖在所述外用制剂中的含量为0. 1~5%。
[0024] 本发明提供的乳酸菌可高产具有抑制细胞中黑色素的合成并减少皮肤色斑数量 的胞外多糖，并且由于长双歧杆菌属于益生菌，利用其发酵生产的胞外多糖对人体完全无 害甚至有益，安全性优异，因此能够用于制造化妆品、护肤品以及各种皮肤外用剂组合物。
【附图说明】
[0025] 图1是为实施例3的B16细胞产黑色素情况，图Ia :对照组，图Ib :胞外多糖组 (3. 3mg/ml)；
[0026] 图2为不同浓度胞外多糖对B16细胞活力和黑色素形成的影响。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0028] 实施例1 :菌株的分离、筛选及鉴定
[0029] 采集了健康婴幼儿粪便样品，用无菌水溶解，梯度稀释，加入到灭菌的平板中，倾 入到55°C左右的MRS培养基中，MRS培养基配方为：蛋白胨10. 0g，牛肉膏8. 0g，酵母膏 4. 0g，乳糖20. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，乙酸钠5. 0g，硫酸镁0. 2g，硫酸锰0. 05g，L-半胱氨酸 盐酸盐I. 〇g，柠檬酸三铵2. 0g，吐温801. 0g，琼脂20. 0g，ρΗ6· 0~6. 5之间，加蒸馏水至 1000mL，121°C灭菌20min。在厌氧条件下，37°C培养72h。挑选溶钙圈大活力强的菌落进行 划线纯化培养，进一步以1%~3%体积比接种到10% (W/V)固形物的牛乳中，43°C静置培 养6小时，搅拌凝乳并观察状态。
[0030] 挑选凝乳有拉丝现象、凝乳外观细腻的菌株，此类菌株多为胞外多糖产率较高的 菌株。凝乳成颗粒外观、不细腻的菌株，不产生胞外多糖或胞外多糖产率很低。
[0031] 经分离得到的一株命名为BL21，该菌株的在显微镜下观察呈棒槌状，锥型状， 短小，较细，能发酵乳糖、葡萄糖等，产生乳酸和乙酸，一种厌氧的革兰氏阳性杆菌。同 时将该菌16S rDNA序列与模式菌株进行比对，鉴定为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌 BL21 (Bifidobacterium longum BL21),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCC No. 10452,保藏日期为2015年1月27日。
[0032] 实施例2 :发酵和多糖提取
[0033] 将筛选所得的长双歧杆菌BL21接种到胞外多糖培养基中，胞外多糖培养基中各 组分重量百分比：〇. 5%的果糖、1. 2%的蔗糖、0. 5%低聚果糖、0. 5%低聚半乳糖作为碳源 和余量的水，先于37°C下静置培养12小时，再降低温度至30°C培养36小时。
[0034] 培养液使用角转子离心机处理，6000rpm离心20分钟，收集第一上清液。然后向第 一上清液中加入第一上清液重量2%的卡拉胶水溶液，所述卡拉胶水溶液是经灭菌后的卡 拉胶溶解于水中获得，其中卡拉胶含量为0. 2wt %，充分混匀后，加入1/10体积的氯仿，震 荡使混合均匀后6000rpm离心15分钟，使其分层，液体分为3层，上层为第二上清液，中层 为析出的蛋白质层，底层为氯仿。
[0035] 收集第二上清液，加入2倍体积的95%酒精，搅拌，胞外多糖呈絮状析出，用200目 网过滤进行收集。
[0036] 将收集的胞外多糖放置在1倍体积的80%酒精溶液中浸泡4小时，取出并挤去酒 精，放置在60°C烘箱中干燥处理4小时，获得块状的胞外多糖。用研钵粉碎后用于测试。
[0037] 长双歧杆菌BL21胞外多糖发酵液多糖浓度达5%。
[0038] 实施例3 :长双歧杆菌BL21胞外多糖对B16细胞黑色素形成的影响
[0039] 用含5%胎牛血清的DMEM培养液培养B16黑素瘤细胞，培养条件为37°C、5% CO2 恒温培养。取对数期的B16黑素瘤细胞，弃去培养液，用PBS液清洗2次，加入培养液吹打， 调节细胞悬液浓度为5 X 104-10 X 104个/ml，加入96孔板中，每孔加入100 μ 1。培养12-16 小时使细胞贴壁，吸去培养液。
[0040] 将实施例2获得的胞外多糖配置为不同浓度的培养液，同时加入10 μ 1的CCK-8 试剂（CCK-8Cel I Counting Kit, Yeasen)并根据试剂盒指明的方法测试细胞活力。设置 对照组（细胞+培养液），胞外多糖每个浓度组设置5个复孔。
[0041] 培养56小时后，用0. 25%胰酶消化，以500rpm离心5min弃上清液，每个处理因 素下的细胞加入200ul含10%二甲基亚砜的NaOH(ImoVL)溶液，于65°C水浴2小时完全 溶解黑色素颗粒，分光光度计测量490nm处吸光度A值。黑色素形成率=A实验组/A对照 组 X 100% 〇
[0042] 试验结果显示，长双歧杆菌BL21产生的胞外多糖在特定浓度下可显著减少B16细 胞黑色素的形成，例如其在3. 3mg/ml浓度下可降低黑色素形成率达50%。
[0043] B16细胞产黑色素情况的照片见附图1。细胞活力和黑色素产量统计图见附图2。
[0044] 实施例4 :乳液的配制
[0045] 将长双歧杆菌BL21菌株产生的胞外多糖按下表1配方配制为乳液。
[0046] 表 1
[0047]
[0049] 配置方法为：将全部原料在容器中混合后，水浴加热至70°C，300rpm搅拌40分钟。 用于人体测试时，空白对照组所用乳液不加入胞外多糖。
[0050] 实施例5 :人体测试
[0051] 志愿者为40名年龄在35-52岁的女性。测试组、对照组，各20名。
[0052] 使用实施例4中配制的乳液，测试组所用乳液中含1% W/W的胞外多糖，对照组所 用乳液中不含胞外多糖。
[0053] 在测试开始前使用VISIA Complexion Analys is面部分析系统获得面部特定区 域内色斑、黄褐斑数量，使用Cutometer MPA 580皮肤测试仪获得面部皮肤的黑色素数值。
[0054] 志愿者每天早晚使用乳液各一次，使用8周后对色斑数量和黑色素数值进行测 量。统计结果表明，胞外多糖可显著减少色斑、黄褐斑数量，降低皮肤黑色素数值，具体结果 见下表2 :
[0055] 表 2
[0056]
【主权项】
1. 一种高产胞外多糖的乳酸菌，其特征在于，名称为BL21，属于长双歧杆菌 (BifidobacteriumIongum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为CGMCCNo. 10452,保藏日期为2015年1月27日。2. -种胞外多糖，其特征在于，由权利要求1所述高产胞外多糖的乳酸菌经BL21发酵 生产获得。3. -种如权利要求2所述胞外多糖的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：（1)将所 述BL21菌株接种于胞外多糖培养基内进行，培养温度为20~50°C，培养时间为1~60小 时，获得培养液；（2)从所述培养液中提取获得胞外多糖。4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述胞外多糖培养基包括如下重量百 分比的组分：〇. 5%的果糖、1. 2%的蔗糖、0. 5%低聚果糖、0. 5%低聚半乳糖和余量的水。5. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，培养过程具体为，先于 37-45°C静置培养12-14小时，再降温至20-35°C，培养36-48小时。6. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2)包含如下步骤：a、采用压 滤或离心的方法从所述培养液中分离出第一上清液；b、在所述第一上清液中加入为其体积 1/10~1/5的氯仿或三氯乙酸，混合后离心或静置分层并抽取第二上清液，所述步骤b可 根据需要重复多次；c、将步骤b获得的所述第二上清液与为其体积1~3倍的浓度不低于 85%的乙醇水溶液混合并搅拌，过滤分离获得析出物；d、用乙醇水溶液对所述析出物进行 反复洗脱并干燥，获得胞外多糖。7. 根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤b中，在加入氯仿或三氯乙酸 之前，先加入灭菌溶解后的重量含量为0. 2%的卡拉胶的水溶液，添加量为第一上清液重量 的 2-2. 1 %。8. -种外用制剂，其特征在于，包括权利要求2所述胞外多糖。9. 根据权利要求8所述外用制剂，其特征在于，所述外用制剂为化妆水、乳液、膏霜、面 膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕霜、防晒霜或外用药。10. 根据权利要求8所述外用制剂，其特征在于，所述胞外多糖在所述外用制剂中的含 量为0? 1~99. 9%。
【专利摘要】本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产胞外多糖的乳酸菌，其产胞外多糖的最佳条件及制备方法、以及所产生的胞外多糖及其用途。本发明提供了长双歧杆菌BL21，BL21通过培养和提取获得胞外多糖。所述胞外多糖可用于制备出用于改善肤色的外用制剂。本发明提供的乳酸菌可高产具有抑制细胞中黑色素的合成并减少皮肤色斑数量的胞外多糖，并且由于长双歧杆菌属于益生菌，利用其发酵生产的胞外多糖对人体完全无害甚至有益，安全性优异，因此能够用于制造化妆品、护肤品以及各种皮肤外用剂组合物。CGMCC No.1045220150127
【IPC分类】C12R1/01, A61Q17/04, C12N1/20, A61P17/00, A61K8/73, A61Q19/02, C12P19/04, A61K31/715
【公开号】CN104894005
【申请号】CN201510217639
【发明人】方曙光, 马凯, 姜甜, 夏九学
【申请人】江苏紫石微康生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
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