一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术技术，涉及一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株 及其应用。
【背景技术】
[0002] 瓜类细菌性果斑病属典型的种传细菌性病害，病原菌为Acidovorax citrulli。 该菌可侵染多种萌芦科作物，如甜瓜、西瓜、打瓜、南瓜、黄瓜等等，人工接种也可侵染萎叶 等植物。该病害最初于20世纪60年代中期被发现，当时被美国农业部（United States Department of Agriculture，USDA)认为是一种苗期枯萎病，该病很快发展成为美国西甜 瓜产区的重要病害。1989年该病害在美国种子商业生产基地大量发生，给美国西甜瓜产业 带来了毁灭性的损害。该病害在西瓜和甜瓜的各个阶段都有侵染，其中叶片和果实发病最 为普遍。自1998年我国首次报道西瓜细菌性果斑病在海南省发生后，该病害在我国内蒙 古、台湾、河南、吉林、广东、湖北、福建、新疆、甘肃、黑龙江、辽宁等地陆续被报道，且病害发 生呈逐年上升趋势。
[0003] 目前，田间防治该病害的方法主要是喷施农用硫酸链霉素和铜制剂。长期的使用 该类农药，使得对环境的抗生素污染、人类健康的危害和植物病原菌抗性的产生等问题日 益严重，因此，寻找到广谱、高效、低毒的生物农药已成为必然。Johnson等于1945年首次报 道了枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，各种微生物产生的抗菌物质得到广泛的关注。芽孢杆 菌是一种广泛存在于自然界中的非致病性细菌，能产生多种抗菌多肽物，能够抑制真菌和 细菌。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘关系很近的细菌，近年来报道其自身产 生的代谢物能够抑制细菌和真菌的活性。果斑病为种子带菌传播的病害，目前主要用盐酸、 福尔马林等化学药剂处理种子，容易产生药害，影响种子发芽。到目前为止，尚未见有用解 淀粉芽孢杆菌处理种子防治瓜类细菌性果斑病的生防菌菌株的报道。
【发明内容】
[0004] 针对上述领域的缺陷，本发明提供了一株瓜类细菌性果斑病生防菌菌株，用于瓜 类细菌性果斑病的生物防治，为瓜类细菌性果斑病的防治提供了新的微生物资源。
[0005] 本发明提供的瓜类细菌性果斑病生防菌菌株JDOOl CGMCC No. 10421是本实验 室从西瓜产区的土样中分离，对多种植物病原细菌有较好的抑菌作用，具有很好的应用 前景。本研宄通过生理生化特性测定和16SrDNA序列分析，对该菌株进行了鉴定。并对 JD001CGMCC No. 10421对瓜类细菌性果斑病菌的防治效果进行了研宄。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌 株JD001，其特征在于，其生物保藏号为：CGMCC No. 10421。
[0008] 所述解淀粉芽孢杆菌菌株的16SrDNA全序列如SEQ IDNo. 3所示。
[0009] 上述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌接种到液体LB 培养基，30°C、200r/min 恒温培养 24h，0D600 ~ 0· 3 (108cfu/mL)。
[0010] 所述液体LB培养基的成分为：胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L，酵母提取物（Yeast extract) 5g/L，氯化钠（NaCl) 5g/L。 toon] 上述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在防治瓜类细菌性果斑病中的 应用。
[0012] 上述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在抑制西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli)中的应用。
[0013] 所述应用指防治瓜类细菌性果斑病中用所述解淀粉芽孢杆菌株处理种子。
[0014] 所述应用指对生长期的西瓜、甜瓜及其他萌芦科作物进行喷雾。
[0015] 本发明针对瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli以下简称Ac)，通过室内 抑菌圈法和温室活体防效测定，筛选出在室温条件下对Ac具有良好防病作用的拮抗菌株 JDOOl，测定其16srDNA全序列见附录。应用BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，JDOOl菌 株的序列与芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌16srDNA部分序列相同，同源性100%，并结合生 理生化测定（菌株能够利用接触酶、D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖；淀粉水解、明胶液化和卵 磷脂降解试验阳性；不能利用柠檬酸铵、Tween80和7% NaCl ;能够在2% NaCl、5% NaCl 上生长）因此鉴定JDOOl菌株为枯草芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。该菌株的培养条件为 30-35°C，NA培养基或LB培养基，pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属（Bacillus)、解淀粉芽孢杆 菌（amyloliquefaciens)，并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏日期为2015年1月22日，保藏编号为：CGMCC No. 10421。室内抑菌圈测定表明，在NA平 板上能够抑制西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli)的生长（图1)，温室防治实验表明防效 为 100%〇
[0016] 本发明通过室内平板抑菌圈法，获得了平板拮抗能力强的JDOOl菌株（抑菌抑菌 圈直径24. 5mm)，拮抗菌JDOOl菌液处理人工接种细菌性果斑病菌甜瓜种子表明，经拮抗菌 菌液处理带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5. 2mm。拮抗菌JD001处理后的 种子，出苗整齐，叶色浓绿且肥厚，长势好。
[0017] 本发明获得的拮抗瓜类细菌性果斑病菌的生防解淀粉芽孢杆菌菌株JD001可应 用与对瓜类细菌性果斑病的防治，生物学测定表明，在LB培养基上能够抑制瓜类细菌性果 斑病菌（Acidovorax citrulli)的生长（图1)，人工接菌种子经诘抗菌JD001菌液处理后 温室防治效果为100% (图5)。具有较好的实际应用价值。
[0018] 本发明通过室内平板抑菌圈发筛选到拮抗瓜类细菌性果斑病菌株JD001，经过生 理生化测定及16srDNA测定，确定该拮抗菌为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。人工接种果斑 病菌甜瓜种子经拮抗菌JD001菌液处理12h后温室防治效果为100%，并促进了根的生长。
[0019] 本发明菌株JD001具有如下优点：
[0020] 1)拮抗细菌JD001菌株对果斑病菌有很好的抑菌效果，平板抑菌圈直径24. 5mm ;
[0021] 2)菌株JD001菌液处理人工接菌甜瓜种子，温室播种后防效效果达100%，植株生 长健壮，叶色浓郁；
[0022] 3)拮抗菌JD001具有较好的实际应用价值，为缓解乃至解决生产上使用化学药剂 防治瓜类细菌性果斑病造成的抗生素污染及药害现象提供了新的微生物资源。
[0023] 菌种保藏信息：
[0024] 生物材料名称：JDOOI
[0025] 菌株分类：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)
[0026] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027] 保藏日期：2015年1月22日
[0028] 保藏编号：CGMCC No. 10421
[0029] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)
[0030] 保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0031] 图 1 菌株 JD001 对 Acidovorax citrulli 抑菌效果；
[0032] 图2菌株JD001在LB培养基上菌落形态特征；
[0033] 图3菌株JD001的生理生化特征；
[0034] 图 4 JD001 的 16SrDNA 电泳结果；
[0035] 图5拮抗菌JD001处理人工接菌种子后对果斑病防治效果；
[0036] 图6拮抗菌JD001菌液处理带菌种子对种子根长的影响；
[0037] 图7为JD001PCR产物序列在G enbank数据库中搜索比对的结果。
【具体实施方式】
[0038] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方 式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其 他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本 发明的保护范围之内。
[0039] 菌种名称：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) JD001，菌株分类：芽 孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，保藏机构：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年1月22日，保藏编号：CGMCC No. 10421， 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，保藏地址为：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0040] 本发明实验材料的来源：
[0041] 生物材料：
[0042] JD001菌株来自西瓜产区的土样中分离，进行筛选并保藏到中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心。
[0043] 试剂的来源及规格：
[0044]
[0045] 实施例1、
[0046] I. 1防治瓜类细菌性果斑病拮抗细菌JD001的鉴定
[0047] 1.1.1拮抗菌的筛选
[0048] 挑取果斑病菌单菌落接种于液体LB培养基（胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L,酵 母提取物（Yeast extract) 5g/L,氯化钠（NaCl) 5g/L)，30 °C、200r/min 恒温培养 24h， 0D600 ~ 0. 3 (108cfu/mL)。将菌液加入培养基内（菌液与培养基的比例是1:40)，制成混菌 平板。灭菌牙签挑取拮抗菌单菌落，点接在混菌平板上。30°C恒温培养，24h、49h观察抑菌 效果，测量抑菌圈大小及有无。从平板抑菌效果看，JD001菌株的室内平板抑菌效果好，平 均抑菌圈直径24. 5mm,诘抗效果显著（表1)。
[0049] 表1 JD001菌株对瓜类细菌性果斑病的抑制作用
[0050]
[0051] 混有（Acidovorax citrulli)的平板检测菌株JD001抑菌活性（图1)。
[0052] 1.1. 2拮抗菌的鉴定
[0053] 用接种环挑取少量菌体，在LB培养基平板上划线，30°C培养24h后观察单菌落表 面形态、菌落近圆形，边缘不规则，表面褶皱粗糙，不透明，菌落淡黄色（图2);液体LB培养 基培养静止时有明显的菌膜生成。显微镜下油镜观察菌体杆状，产芽孢，芽孢椭圆形。革兰 氏染色阳性（G+)等。生理生化特性测定，具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰 氏细菌鉴定手册》（表2和图3)。16S rDNA序列测定以细菌菌液为模板，细菌16SrDNA通 用引物：上游引物（SEQ IDNo. 1)
[0054] 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和下游引物（SEQ IDNo. 2)
[0055] 5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳获得 16SrDNA 的序 列约I. 5kb (图4)。华大基因公司测序。获得测序结果NCBI上进行BLAST比对分析，JDOOl 菌株的序列与解淀粉芽孢杆菌16SrDNA部分序列相同，同源性100% )(图7)。
[0056] 表2拮抗菌JDOOl生理生化特征
[0057]
[0058] 实施例2桔抗菌TD001种子处理淵宰盆栽棹病实骀及宰内促牛作用。
[0059] 将Aac-5菌液调至108cfu/mL，以甜瓜种子Ig菌液2mL比例混合，浸泡lh，在超净 工作台内吹干种子。
[0060] 接种果斑病菌的甜瓜种子在JD001菌液（108cfu/mL)中浸泡12h，每皿50粒种子， 3次重复。于28°C催芽，24h后调查种子的发芽率，48h后测定根长，以此来判断药剂处理对 种子发芽的影响。将相同处理剩余的种子播种在灭过菌的土壤中，每个处理3次重复。清 水作对照。出苗后1周调查，经解淀粉芽孢杆菌菌液处理后的带菌甜瓜种子出苗后均未发 病，且植株叶色浓绿肥大。对照（清水）发病率84%。（表3和图5)。相对防治效果达到 100%〇
[0061] 表3种子处理防治效果
[0062]
[0063]
[0064] 菌株JD001处理人工接菌甜瓜种子对种子活性的影响见表2。拮抗菌JD001处理 带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5. 2_ ;提高出苗整齐度，促进植株生长 (表4和图6)。
[0065] 表4拮抗菌JD001菌液处理带菌种子对种子根长的影响
[0066]
[0067] 综上，本发明获得拮抗瓜类细菌性果斑病菌株JD001，经生理生化测定结合分子生 物学方法，鉴定拮抗细菌为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。菌株JD001具有如下特性：1)拮 抗细菌JD001菌株对果斑病菌有很好的抑菌效果，平板抑菌圈直径24. 5mm。2)菌株JD001 菌液处理人工接菌甜瓜种子，温室播种后防效效果达100%，植株生长健壮，叶色浓郁。3) 拮抗菌JD001处理带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5. 2mm。拮抗菌JD001 具有较好的实际应用价值，为缓解乃至解决生产上使用化学药剂防治瓜类细菌性果斑病造 成的抗生素污染及药害现象提供了新的微生物资源。
[0068] 本发明实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。试剂的浓度、温度和其他变量的 值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。
【主权项】
1. 一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)菌株 JD001，其特征在于，其生物保藏号为：CGMCCNo. 10421。2. 根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：16SrDNA全序列如SEQID No. 3所示。3. 解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌接种到接种于液体LB 培养基，30°C、200r/min恒温培养 24h，0D600 ~ 0? 3 (108cfu/mL)。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液体LB培养基的成分为：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L，酵母提取物（Yeastextract) 5g/L，氯化钠（NaCl) 5g/L。5. 权利要求1所述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在防治瓜类细菌性果 斑病中的应用。6. 权利要求1所述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在抑制西瓜嗜酸菌 (AcidovoraxcitrulIi)中的应用。7. 根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述应用指防治瓜类细菌性果斑病中用 所述解淀粉芽孢杆菌株处理种子。8. 根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述应用指对生长期的西瓜、甜瓜及其 他萌芦科作物进行喷雾。
【专利摘要】本发明提供了一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用，本发明获得的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株JD001的生物保藏号是CGMCC No.10421。本发明的菌株JD001为从西瓜产区的土样中分离并保藏的，其对多种植物病原细菌有较好的抑菌作用，可用于瓜类细菌性果斑病的生物防治，为瓜类细菌性果斑病的防治提供了新的微生物资源，具有很好的应用前景。CGMCC No.1042120150122
【IPC分类】A01P1/00, C12R1/07, A01N63/00, A01C1/00, A01G7/06, C12N1/20
【公开号】CN104894008
【申请号】CN201510243206
【发明人】赵廷昌, 孙柏欣, 杨玉文, 关巍, 王铁霖, 董春玲
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月13日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术技术，涉及一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株 及其应用。
【背景技术】
[0002] 瓜类细菌性果斑病属典型的种传细菌性病害，病原菌为Acidovorax citrulli。 该菌可侵染多种萌芦科作物，如甜瓜、西瓜、打瓜、南瓜、黄瓜等等，人工接种也可侵染萎叶 等植物。该病害最初于20世纪60年代中期被发现，当时被美国农业部（United States Department of Agriculture，USDA)认为是一种苗期枯萎病，该病很快发展成为美国西甜 瓜产区的重要病害。1989年该病害在美国种子商业生产基地大量发生，给美国西甜瓜产业 带来了毁灭性的损害。该病害在西瓜和甜瓜的各个阶段都有侵染，其中叶片和果实发病最 为普遍。自1998年我国首次报道西瓜细菌性果斑病在海南省发生后，该病害在我国内蒙 古、台湾、河南、吉林、广东、湖北、福建、新疆、甘肃、黑龙江、辽宁等地陆续被报道，且病害发 生呈逐年上升趋势。
[0003] 目前，田间防治该病害的方法主要是喷施农用硫酸链霉素和铜制剂。长期的使用 该类农药，使得对环境的抗生素污染、人类健康的危害和植物病原菌抗性的产生等问题日 益严重，因此，寻找到广谱、高效、低毒的生物农药已成为必然。Johnson等于1945年首次报 道了枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，各种微生物产生的抗菌物质得到广泛的关注。芽孢杆 菌是一种广泛存在于自然界中的非致病性细菌，能产生多种抗菌多肽物，能够抑制真菌和 细菌。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘关系很近的细菌，近年来报道其自身产 生的代谢物能够抑制细菌和真菌的活性。果斑病为种子带菌传播的病害，目前主要用盐酸、 福尔马林等化学药剂处理种子，容易产生药害，影响种子发芽。到目前为止，尚未见有用解 淀粉芽孢杆菌处理种子防治瓜类细菌性果斑病的生防菌菌株的报道。
【发明内容】
[0004] 针对上述领域的缺陷，本发明提供了一株瓜类细菌性果斑病生防菌菌株，用于瓜 类细菌性果斑病的生物防治，为瓜类细菌性果斑病的防治提供了新的微生物资源。
[0005] 本发明提供的瓜类细菌性果斑病生防菌菌株JDOOl CGMCC No. 10421是本实验 室从西瓜产区的土样中分离，对多种植物病原细菌有较好的抑菌作用，具有很好的应用 前景。本研宄通过生理生化特性测定和16SrDNA序列分析，对该菌株进行了鉴定。并对 JD001CGMCC No. 10421对瓜类细菌性果斑病菌的防治效果进行了研宄。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌 株JD001，其特征在于，其生物保藏号为：CGMCC No. 10421。
[0008] 所述解淀粉芽孢杆菌菌株的16SrDNA全序列如SEQ IDNo. 3所示。
[0009] 上述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌接种到液体LB 培养基，30°C、200r/min 恒温培养 24h，0D600 ~ 0· 3 (108cfu/mL)。
[0010] 所述液体LB培养基的成分为：胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L，酵母提取物（Yeast extract) 5g/L，氯化钠（NaCl) 5g/L。 toon] 上述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在防治瓜类细菌性果斑病中的 应用。
[0012] 上述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在抑制西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli)中的应用。
[0013] 所述应用指防治瓜类细菌性果斑病中用所述解淀粉芽孢杆菌株处理种子。
[0014] 所述应用指对生长期的西瓜、甜瓜及其他萌芦科作物进行喷雾。
[0015] 本发明针对瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli以下简称Ac)，通过室内 抑菌圈法和温室活体防效测定，筛选出在室温条件下对Ac具有良好防病作用的拮抗菌株 JDOOl，测定其16srDNA全序列见附录。应用BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，JDOOl菌 株的序列与芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌16srDNA部分序列相同，同源性100%，并结合生 理生化测定（菌株能够利用接触酶、D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖；淀粉水解、明胶液化和卵 磷脂降解试验阳性；不能利用柠檬酸铵、Tween80和7% NaCl ;能够在2% NaCl、5% NaCl 上生长）因此鉴定JDOOl菌株为枯草芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。该菌株的培养条件为 30-35°C，NA培养基或LB培养基，pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属（Bacillus)、解淀粉芽孢杆 菌（amyloliquefaciens)，并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏日期为2015年1月22日，保藏编号为：CGMCC No. 10421。室内抑菌圈测定表明，在NA平 板上能够抑制西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli)的生长（图1)，温室防治实验表明防效 为 100%〇
[0016] 本发明通过室内平板抑菌圈法，获得了平板拮抗能力强的JDOOl菌株（抑菌抑菌 圈直径24. 5mm)，拮抗菌JDOOl菌液处理人工接种细菌性果斑病菌甜瓜种子表明，经拮抗菌 菌液处理带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5. 2mm。拮抗菌JD001处理后的 种子，出苗整齐，叶色浓绿且肥厚，长势好。
[0017] 本发明获得的拮抗瓜类细菌性果斑病菌的生防解淀粉芽孢杆菌菌株JD001可应 用与对瓜类细菌性果斑病的防治，生物学测定表明，在LB培养基上能够抑制瓜类细菌性果 斑病菌（Acidovorax citrulli)的生长（图1)，人工接菌种子经诘抗菌JD001菌液处理后 温室防治效果为100% (图5)。具有较好的实际应用价值。
[0018] 本发明通过室内平板抑菌圈发筛选到拮抗瓜类细菌性果斑病菌株JD001，经过生 理生化测定及16srDNA测定，确定该拮抗菌为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。人工接种果斑 病菌甜瓜种子经拮抗菌JD001菌液处理12h后温室防治效果为100%，并促进了根的生长。
[0019] 本发明菌株JD001具有如下优点：
[0020] 1)拮抗细菌JD001菌株对果斑病菌有很好的抑菌效果，平板抑菌圈直径24. 5mm ;
[0021] 2)菌株JD001菌液处理人工接菌甜瓜种子，温室播种后防效效果达100%，植株生 长健壮，叶色浓郁；
[0022] 3)拮抗菌JD001具有较好的实际应用价值，为缓解乃至解决生产上使用化学药剂 防治瓜类细菌性果斑病造成的抗生素污染及药害现象提供了新的微生物资源。
[0023] 菌种保藏信息：
[0024] 生物材料名称：JDOOI
[0025] 菌株分类：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)
[0026] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027] 保藏日期：2015年1月22日
[0028] 保藏编号：CGMCC No. 10421
[0029] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)
[0030] 保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0031] 图 1 菌株 JD001 对 Acidovorax citrulli 抑菌效果；
[0032] 图2菌株JD001在LB培养基上菌落形态特征；
[0033] 图3菌株JD001的生理生化特征；
[0034] 图 4 JD001 的 16SrDNA 电泳结果；
[0035] 图5拮抗菌JD001处理人工接菌种子后对果斑病防治效果；
[0036] 图6拮抗菌JD001菌液处理带菌种子对种子根长的影响；
[0037] 图7为JD001PCR产物序列在G enbank数据库中搜索比对的结果。
【具体实施方式】
[0038] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方 式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其 他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本 发明的保护范围之内。
[0039] 菌种名称：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) JD001，菌株分类：芽 孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，保藏机构：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年1月22日，保藏编号：CGMCC No. 10421， 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，保藏地址为：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0040] 本发明实验材料的来源：
[0041] 生物材料：
[0042] JD001菌株来自西瓜产区的土样中分离，进行筛选并保藏到中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心。
[0043] 试剂的来源及规格：
[0044]
[0045] 实施例1、
[0046] I. 1防治瓜类细菌性果斑病拮抗细菌JD001的鉴定
[0047] 1.1.1拮抗菌的筛选
[0048] 挑取果斑病菌单菌落接种于液体LB培养基（胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L,酵 母提取物（Yeast extract) 5g/L,氯化钠（NaCl) 5g/L)，30 °C、200r/min 恒温培养 24h， 0D600 ~ 0. 3 (108cfu/mL)。将菌液加入培养基内（菌液与培养基的比例是1:40)，制成混菌 平板。灭菌牙签挑取拮抗菌单菌落，点接在混菌平板上。30°C恒温培养，24h、49h观察抑菌 效果，测量抑菌圈大小及有无。从平板抑菌效果看，JD001菌株的室内平板抑菌效果好，平 均抑菌圈直径24. 5mm,诘抗效果显著（表1)。
[0049] 表1 JD001菌株对瓜类细菌性果斑病的抑制作用
[0050]
[0051] 混有（Acidovorax citrulli)的平板检测菌株JD001抑菌活性（图1)。
[0052] 1.1. 2拮抗菌的鉴定
[0053] 用接种环挑取少量菌体，在LB培养基平板上划线，30°C培养24h后观察单菌落表 面形态、菌落近圆形，边缘不规则，表面褶皱粗糙，不透明，菌落淡黄色（图2);液体LB培养 基培养静止时有明显的菌膜生成。显微镜下油镜观察菌体杆状，产芽孢，芽孢椭圆形。革兰 氏染色阳性（G+)等。生理生化特性测定，具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰 氏细菌鉴定手册》（表2和图3)。16S rDNA序列测定以细菌菌液为模板，细菌16SrDNA通 用引物：上游引物（SEQ IDNo. 1)
[0054] 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和下游引物（SEQ IDNo. 2)
[0055] 5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳获得 16SrDNA 的序 列约I. 5kb (图4)。华大基因公司测序。获得测序结果NCBI上进行BLAST比对分析，JDOOl 菌株的序列与解淀粉芽孢杆菌16SrDNA部分序列相同，同源性100% )(图7)。
[0056] 表2拮抗菌JDOOl生理生化特征
[0057]
[0058] 实施例2桔抗菌TD001种子处理淵宰盆栽棹病实骀及宰内促牛作用。
[0059] 将Aac-5菌液调至108cfu/mL，以甜瓜种子Ig菌液2mL比例混合，浸泡lh，在超净 工作台内吹干种子。
[0060] 接种果斑病菌的甜瓜种子在JD001菌液（108cfu/mL)中浸泡12h，每皿50粒种子， 3次重复。于28°C催芽，24h后调查种子的发芽率，48h后测定根长，以此来判断药剂处理对 种子发芽的影响。将相同处理剩余的种子播种在灭过菌的土壤中，每个处理3次重复。清 水作对照。出苗后1周调查，经解淀粉芽孢杆菌菌液处理后的带菌甜瓜种子出苗后均未发 病，且植株叶色浓绿肥大。对照（清水）发病率84%。（表3和图5)。相对防治效果达到 100%〇
[0061] 表3种子处理防治效果
[0062]
[0063]
[0064] 菌株JD001处理人工接菌甜瓜种子对种子活性的影响见表2。拮抗菌JD001处理 带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5. 2_ ;提高出苗整齐度，促进植株生长 (表4和图6)。
[0065] 表4拮抗菌JD001菌液处理带菌种子对种子根长的影响
[0066]
[0067] 综上，本发明获得拮抗瓜类细菌性果斑病菌株JD001，经生理生化测定结合分子生 物学方法，鉴定拮抗细菌为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。菌株JD001具有如下特性：1)拮 抗细菌JD001菌株对果斑病菌有很好的抑菌效果，平板抑菌圈直径24. 5mm。2)菌株JD001 菌液处理人工接菌甜瓜种子，温室播种后防效效果达100%，植株生长健壮，叶色浓郁。3) 拮抗菌JD001处理带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5. 2mm。拮抗菌JD001 具有较好的实际应用价值，为缓解乃至解决生产上使用化学药剂防治瓜类细菌性果斑病造 成的抗生素污染及药害现象提供了新的微生物资源。
[0068] 本发明实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。试剂的浓度、温度和其他变量的 值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。
【主权项】
1. 一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)菌株 JD001，其特征在于，其生物保藏号为：CGMCCNo. 10421。2. 根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：16SrDNA全序列如SEQID No. 3所示。3. 解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌接种到接种于液体LB 培养基，30°C、200r/min恒温培养 24h，0D600 ~ 0? 3 (108cfu/mL)。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液体LB培养基的成分为：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L，酵母提取物（Yeastextract) 5g/L，氯化钠（NaCl) 5g/L。5. 权利要求1所述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在防治瓜类细菌性果 斑病中的应用。6. 权利要求1所述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在抑制西瓜嗜酸菌 (AcidovoraxcitrulIi)中的应用。7. 根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述应用指防治瓜类细菌性果斑病中用 所述解淀粉芽孢杆菌株处理种子。8. 根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述应用指对生长期的西瓜、甜瓜及其 他萌芦科作物进行喷雾。
【专利摘要】本发明提供了一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用，本发明获得的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株JD001的生物保藏号是CGMCC No.10421。本发明的菌株JD001为从西瓜产区的土样中分离并保藏的，其对多种植物病原细菌有较好的抑菌作用，可用于瓜类细菌性果斑病的生物防治，为瓜类细菌性果斑病的防治提供了新的微生物资源，具有很好的应用前景。CGMCC No.1042120150122
【IPC分类】A01P1/00, C12R1/07, A01N63/00, A01C1/00, A01G7/06, C12N1/20
【公开号】CN104894008
【申请号】CN201510243206
【发明人】赵廷昌, 孙柏欣, 杨玉文, 关巍, 王铁霖, 董春玲
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月13日
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