一株猪肺炎支原体菌种及其应用
一株猪肺炎支原体菌种及其应用
【专利说明】
[0001]
技术领域本发明涉及一株猪肺炎支原体菌种及其应用，属于兽医微生物学领域。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae， Mhp)引起的一种猪的接触性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。据资料报道，世界各地 分离的猪肺炎支原体均属于同一血清型，但不同分离株之间基因组间有较大差异。1992 年 Frey 等(Frey, J. , Haldimann, A. &Nicolet, J. (1992). Chromosomal heterogeneity of various Mycoplasma hyopneumoniae field strains. Int J Syst Bacteriol 42, 275-280)首次证实了猪肺炎支原体不同分离株间基因组的差异，Artiushin和 Minion (1996^) (Artiushin, S. Minion, F. C. (1996). Arbitrarily primed PCR analysis of Mycoplasma hyopneumoniae field isolates demonstrates genetic heterogeneity. Int J Syst Bacteriol 46, 324-328.)进一步证实了 Frey 的观点，Kokotovic 等（1999 年)(Kokotovic, B. , Friis, N. F. , Jensen, J. S. Mhrens, P. (1999). Amplif ied-fragment length polymorphism fingerprinting of Mycoplasma species. J Clin Microbiol 37, 3300-3307.)的研宄结果也得出了同样的结论。
[0003] 支原体是可以自我复制的最小原核生物，生长缓慢，对培养基的要求较高。与其他 普通支原体相比，Mhp生长更为缓慢，对体外培养的要求显得更苛刻，被称为"挑剔的微生 物"。国内外专家学者通过长期研宄，研制了多种类型的营养培养基用于Mhp的分离、培养， 如A26支原体体形培养基、KM2培养基、Friis培养基和牛心汤培养基等。不过，这些培养依 然存在或多或少的不足，培养效果仍然不能令人满意。因此分离出抗原性、免疫原性好的疫 苗株具有十分重要的意义。
[0004] 猪肺炎支原体基因组含有稀有密码子，至今被鉴定的抗原蛋白只有少数几种。目 前认为猪肺炎支原体的主要抗原蛋白有P97、P65、P46、P36等，其中P46是Mhp具有很强种 属特异性的膜蛋白，其能够引起机体早期免疫反应。1995年，Futo等（Futo, S.，Seto, Y.，Mi tsuse, S. , Mori, Y., Suzuki, Τ. &Kawai, Κ. (1995). Molecular cloning of a 46-kilodalton surface antigen(P46)gene from Mycoplasma hyopneumoniae: direct evidence of CGG codon usage for arginine. J Bacteriol 177,1915-1917·)发现 P46 基因（1257bp)，在其 ORF中包含I个CGG(在Mhp中编码精氨酸，在其他支原体中为无义密码子）和3个TGA密 码子（在支原体中编码色氨酸，在通用密码子中为终止密码子）。P97是Mhp的主要粘附因 子，不同的毒株其Rl区包含不同个数的AAKPV/E基元（Hsu, T.，Artiushin, S.&Minion，F. C. (1997). Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesin gene of Mycoplasma hyopneumoniae. J Bacteriol 179,1317-1323)。因此 P46 蛋白和 P97 蛋白 基因组的序列测定，可作为猪肺炎支原体不同毒株鉴定的分子生物学标记。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株猪肺炎支原体菌种，该菌株在无细胞培养基上生长良 好，而且免疫原性强。经猪肺炎支原体16s RNA特异性引物鉴定为猪肺炎支原体菌株，将其 命名为猪肺炎支原体S株，经猪肺炎支原体P46引物和M7 Rl引物特异性扩增后也再次鉴 定为猪肺炎支原体，其碱基和氨基酸序列与其他猪肺炎支原体菌株如232株和JN F65株在 某些位置不同，可为该菌株的分子生物学鉴定做分子标记；该菌株可用于制备猪支原体灭 活疫苗。
[0006] 本发明的技术方案
[0007] 1. 一种猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S株，该菌株已于2014年12 月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。
[0008] 2.本发明所述猪肺炎支原体疫苗株S株，其P46基因的部分碱基序列为：
[0009] AGTAATGATT CTATTCGAAT AGCACTAACC GATCCGGATA ATCCTCGATG AATTAGTGCC 60 CAAAAAGATA TTATTTCTTA TGTTGATGAA ACAGAGGCAG CAACTTCAAC AATTACAAAA 120 AACCAGGATG CACAGAATAA CTGACTCACT CAGCAAGCTA MtTTAAGCCC AGCGCCAAAA 180 GGATTTATTA TTGCGCCTGA AAATGGAAGT GGAGTTGGAA CTGCTGTTAA TACAATTGCT 240 GATAAAGGAA TTCCGATTGT TGCCTATGAT CGACTAATTA CTGGATCTGA TAAATATGAT 300 TGGTATGTTT CTTTTGATAA TGAAAAAGTT GGCGAATTAC AAGGTCTTTC ACTTGCGGCG 360 GGTCTATTAG GAAAAGAAGA TGGTGCTTTT GATTCAATTG ATCAAATGAA TGAATATCTA 420 AAATCACATA TGCCCCAAGA GACAATTTCT TTTTATACAA TCGCGGGTTC CCAAGATGAT 480 AATAATTCCC AATATTTTTA TAATGGTGCA ATGAAAGTAC TTAAAGAATT AATGAAAAAT 540 TCGGGAAATA AAATAATTGA TTTATCTCCT GAAGGCGAAA ATGCTGTTTA TGTCCCAGGA 600 TGAAATTATG GGACTGCCGG TCAAAGAATC CAATCTTTTC TAACAATTAA CAAAGATCCT 660 CAAGGCGGTA ATAAAATCAA AGCTGTTGGT TCAAAACCAG CTTCTATTTT CAAAGGATTT 720 CTTGCCCCAA ATGATGGAAT GGCCGAACAA GCAATCACCA AATTAAAACT TGAAGGATTT 780 GATACCCAAA AAATCTTTGT AACTGGTCAA GATTATAATG ATAAAGCCAA AACTTTTATC 840
[0010] AAAGACGGCG ATCAAAATAT GACAATTTAT AAACCTGATA AAGTTTTAGG AAAAGTTGCT 900 GTTGAAGTTC TTCGGGTTTT AATTGCAAAG AAAAATAAAG CATCTAGATC AGAAGTCGAA 960 AACGAACTAA AAGCAAAGCT ACCAAATATT TCATTTAAAT ATGATAATCA AACATATAAA 1020 GTGCAAGGTA AAAATATTAA TACAATTTTA GTAAGTCCAG TAAT 1064
[0011] 对应的氨基酸序列为：
[0012]
[0013]
)
[0018] 4.本发明所述猪肺炎支原体疫苗株S株的应用，其特征在该菌株可作为疫苗生产 菌株用于制备猪肺炎支原体灭活疫苗。
[0019] 本发明的详细描述
[0020] -、猪肺炎支原体的分离及鉴定
[0021] 1.病料来源：
[0022] 菌株分离自吉林松原某猪场发病猪的肺组织，经PCR检测该病料无蓝耳病、猪瘟、 伪狂犬、传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌等病原感染，病料经匀浆处理后，按（V/ V) 1 : 10接种到本公司自制的LPS培养基（LPS培养基成分：PPLO 5g、酵母粉10g，葡萄糖 5g，Hanks液1000ml，猪血清10 %~20% ;适宜pH值：7. 4~7. 8,培养温度为37 °C )，37 °C 培养7~10日，连续传代3~5代，分离物可在LPS培养基上37°C培养72~96小时，培养 基pH值由L 6降至6. 8~6. 9。
[0023] 2.培养条件
[0024] 取以上液体培养物，按10% (V/V)接种LPS培养基，37°C培养72~96小时，培养 基pH值由7. 6降至6. 6~6. 8,培养物呈均一稍浑池的棕红色，无沉淀。培养物经无菌检 验，应无菌生长。
[0025] 3.血清学鉴定
[0026] 取以上培养物，将培养物稀释至KT4~l(T5(XU/mL，分别用猪肺炎支原体阳性血清 进行代谢抑制试验，结果显示猪肺炎支 原体阳性血清可抑制培养物的生长，表明分离到的 该培养物为猪肺炎支原体。
[0027] 4.分子生物学鉴定
[0028] 该以上培养物进行1000倍稀释，用热裂解法（沈青春，覃青松，王琴等（2006). PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数.中国预防兽医学报，55-57.))提取DNA作为模板， 分别用猪肺炎支原体和猪鼻支原体16s RNA特异性引物分别进行PCR扩增，结果显示待检 样品泳道出现649bp的猪肺炎支原体特异性条带（见图1)，而使用猪鼻支原体P37蛋白特 异性引物未能扩增出任何条带（见图2)。由此可见，分离物为猪肺炎支原体，而且不含有猪 鼻支原体。
[0029] 通过以上血清学鉴定和16s RNA PCR引物鉴定结果表明该菌株为猪肺炎支原体， 将其命名猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)S株，该菌株已于2014年12月1日 送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。
[0030] 5.序列分析
[0031] 取猪肺炎支原体S株菌液用热裂解法提取DNA作为模板，用分别使用猪肺炎支原 体P46 PCR引物和P97R1区PCR引物进行特异性扩增，得到特异性条带，将其克隆到T载体 后，进行序列分析。
[0032] 6.免疫原性检验
[0033] 用活菌滴度达IO9CXUAiL的S株菌液灭活后，与适宜佐剂制备灭活疫苗，分别接种 家兔和7日龄健康仔猪，通过测定家兔抗体水平和仔猪的攻毒保护力对其进行免疫原性评 价。
[0034] 二、猪肺炎支原体灭活疫苗的制备
[0035] (1)疫苗制造用抗原的制备：将二级种子按1:20接种Lps-5培养基，在37°C培养 3~6日，当pH值达到6. 9左右，收获培养物，再按1:50比例以同样的方法传代培养，直到 收获菌液制造疫苗；
[0036] (2)灭活：培养后菌液经β -丙内酯置灭活处理，加入硫柳汞作为防腐剂；
[0037] (3)配苗：将灭活后菌液与佐剂（法国赛比克公司的油佐剂或水佐剂）按（V/ V) 1:1的比例混合，制备成猪肺炎支原体灭活疫苗。
[0038] 本发明涉及的微生物资源信息
[0039] 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)，S株，该菌株已于2014年12月1日 送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。
【附图说明】
[0040] 图1 :猪肺炎支原体16s RNA特异性引物扩增电泳图。
[0041] 图2 :猪鼻支原体P37蛋白特异性引物扩增电泳图。
[0042] 图3 :猪肺炎支原体S株P46基因扩增片段电泳图。
[0043] 图4:猪肺炎支原体S株P97基因 Rl区扩增片段电泳图。
[0044] 本发明的积极效果
[0045] 本发明涉及一株猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S株，有典型猪肺炎 支原体感染同时无明显其他病原感染的猪肺脏，通过适宜培养基连续传代所得。通过分子 生物学和血清学鉴定，证实该菌株为猪肺炎支原体新分离株，可在无细胞培养基上稳定生 长，生长滴度可达到IO 9~10 kiCXUAiL,经家兔和仔猪免疫试验证实其免疫原性良好，可做 为猪肺炎支原体灭活疫苗的生产用菌种。经与其他猪肺炎支原体菌株，如232株和JNF65株 进行比较，其P46基因碱基序列和氨基酸序列有部分不同，但同源性较高，而P97基因碱基 序列和氨基酸序列均区别较大，且P97基因氨基酸含有11个AAPKE/V的连续氨基酸序列， 可作为其独特的分子生物学标记；该株猪肺炎支原体菌株可用于制备猪肺炎支原体灭活疫 苗。 实施例
[0046] 以下为进一步说明本发明，并不对本发明作出限定。
[0047] 实施例1
[0048] --猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S 株的培养
[0049] 将S株菌种10 %接种猪肺炎支原体LPS培养基，37°C培养72~96小时，当溶液 pH至6. 6~6. 8时，成黄色或橙黄色，均匀浑浊无沉淀，收获菌液，传代2次后，稀释菌液进 行 CCU 计数（colour change unit，CCU)，活菌数可达 IO9~10 lclCCU/mL。
[0050] 实施例2
[0051] --猪肺炎支原体S株菌液的猪肺炎支原体16s RNA特异性引物PCR测定
[0052] 1.引物设计
[0053] 根据genebank上公布的猪肺炎支原体的16s RNA的基因序列，参照沈青春等 (2006年）（沈青春，覃青松，王琴等（2006). PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数.中 国预防兽医学报，55-57.)合成引物。
[0054] 上游引物 Pl 序列为：5' -GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3'（序列 1)
[0055] 下游引物 P2 序列为：5' -TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC-3'（序列 2)
[0056] 预计扩增片段全长为649bp。
[0057] 2.模板提取
[0058] 取培养好的菌液ImL进行12000r/min离心15min，弃上清。沉淀用100 μ I I XTEN 溶液悬浮，沸水浴l〇min，室温静置3min。12000r/min离心2min，上清为模板DNA。
[0059] 3. PCR 扩增
[0060] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCR SuperMix 10 μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。反应条件为94°C预变性 5min，95°C变性 50s，60°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环，72°C终延伸 5min。
[0061] 4.电泳凝胶成像
[0062] PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，扩增片段649bp见图1。
[0063] 5.结论分离物经PCR鉴定为含有猪肺炎支原体。
[0064] 实施例3
[0065] --猪鼻支原体P37蛋白特异性引物PCR测定
[0066] 1.引物设计
[0067] 根据genebank上公布的猪鼻支原体的P37的基因序列设计并合成引物。
[0068] 上游引物 Pl 序列为：5 '-GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-3'（序列 3)
[0069] 下游引物P2序列为：5' -GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3'（序列4)，扩增片段全长为 346bp〇
[0070] 2.模板提取
[0071] 取培养好的菌液ImL进行12000r/min离心15min，弃上清。沉淀用100 μ I I XTEN 溶液悬浮，沸水浴l〇min，室温静置3min。12000r/min离心2min，上清为模板DNA。
[0072] 3. PCR 扩增
[0073] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCRSuperMix 10 μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。PCR反应条件：94°C预 变性5min，95°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸50s，35个循环，72°C终延伸5min。
[0074] 4.电泳凝胶成像
[0075] PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，猪鼻支原体BTS-7株（购自中国兽医药品监 察所）扩增片段346bp，S株无特异性扩增片段，见图2。
[0076] 5.结论分离物经PCR鉴定为不含有猪鼻支原体（注：由于猪肺炎支原体分离时很 容易受到猪鼻支原体的污染，导致分离物不纯而影响随后的研宄工作）。
[0077] 实施例4
[0078] --S菌液的P46基因测序
[0079] 1.引物设计：
[0080] 根据genebank上公布的猪肺炎支原体的P46的基因序列和张峰钢等《猪肺炎支原 体的分离及PCR鉴定》上发表的引物序列合成引物，扩增片段全长为1162bp。其引物：
[0081] 上游引物 Pl 序列为：5' -CGGGATCCACTTCAGATTCTAAACCACAA-3'（序列 5)，
[0082] 下游引物 P2 序列为：5' -CCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTATCAAC-3'（序列 6)。
[0083] 2.模板提取
[0084] 取S菌液、232株菌液和JNF65株菌液各lmL，进行12000r/min离心15min，弃上清。 沉淀用100μllXTEN溶液悬浮，沸水浴10min，室温静置3min。12000r/min离心2min，上 清为模板DNA。
[0085] 3. PCR 扩增
[0086] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCR SuperMixlO μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。PCR反应条件：94°C预变性 4min，94°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环，72°C终延伸 lOmin。
[0087] 4.电泳凝胶成像
[0088] PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，扩增片段1162bp，与Mhp232扩增片段大小一 致，见图4。
[0089] 5. S株P46基因部分测序及序列结果
[0090] S株P46的PCR产物进行测序，双向测通测序碱基序列为（序列7):
[0091]
[0094]
[0095] *序列中黑体部分的氨基酸为：由TGA编码的色氨酸，在通用密码子中TGA为终止 密码子。
[0096] 通过NCBI网站上的BLAST软件在线分析，结果表明以上核酸序列与猪肺炎支原体 国际标准菌株232株（12个碱基有差别）、J株（10个碱基有差别）、7448株（14个碱基有 差别）等的相应区域的同源性均达99% ;氨基酸序列上同源性更高，与7448株仅相差一个 氨基酸（221位Q-A)，与232株相差两个氨基酸（182位G-Q和221位Q-A)。
[0097] 6.结论
[0098] 通过猪肺炎支原体S株P46部分基因测序结果看，与其他菌株的相应序列同源性 较高，核苷酸序列和氨基酸序列均达到99%的同源性，这与P46基因的高度保守性特点相 符。
[0099] 实施例5
[0100] --S株的P97基因 Rl区测序
[0101] 1.引物设计：
[0102] 根据genebank上公布的猪肺炎支原体232株的P97基因 Rl区的核苷酸序列，设 计合成1对引物，扩增片段包含了 Rl区的全长，232株扩增产物预计大小约为320bp，不同 菌株扩展片段长度有差异。
[0103] 上游引物 P1 序列为：5' -CAAAAGAAGG TAAAAGAGAA-3'（序列 9)
[0104] 下游引物 P2 序列为：5' -AAGCCAGTAT TAGTAGCAAC-3'（序列 10)。
[0105] 2.模板提取
[0106] 取S株菌液lmL，进行12000rpm离心15min，弃上清。沉淀用100 μ I IXTEN溶液 悬浮，沸水浴lOmin，室温静置3min。12000r/min离心2min，上清为模板DNA。
[0107] 3. PCR 扩增
[0108] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCR SuperMixlO μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。PCR反应条件：94°C预变性 4min，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环，72°C终延伸 lOmin。
[0109] 4.电泳凝胶成像
[0110] 扩增产物经I. 〇%琼脂糖凝胶电泳，结果表明S株的扩增片段大小约为180bp，见 图4。
[0111] 5. P97基因的部分测序及序列结果
（序列11)
[0115] *序列中有下划线的氨基酸为重复序列，共计11个Ala Ala(ValZThr)Lys Pro Glu(Val)重复，简写为 AA (V/T)PKE/V。
[0116] 猪肺炎支原体S株的P97基因的Rl区共计包含11个AA(V/T)PKE/V的氨基酸序 列重复，区别于其他菌株，与168株重复数相同，但其中有多达7个氨基酸的差别，如下表1。
[0117] 表1四株猪肺炎支原体P97基因的Rl区氨基酸序列的差异
[0118]
[0119] 注表示缺失；下划线表示与S株在该处不同。
[0120] 实施例6
[0121] 一一猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）的制备及检验
[0122] 1.菌液培养
[0123] 将猪肺炎支原体S株冻干菌种用猪肺炎支原体LPS培养基复溶，1:10接种猪肺炎 支原体LPS培养基，37°C培养72~96小时，当溶液颜色呈棕红色（pH至6. 6~6. 8)，均匀 浑浊无沉淀，收获菌液。将S株菌液连续在LPS培养基上传代2代，使活菌数达109(XU/mL， 无菌检验合格后菌液用于制备疫苗。
[0124] 2.制备疫苗
[0125] 将检验合格的S株菌液灭活后，与佐剂（法国赛比克公司的油佐剂或水佐剂）混 合进行乳化制苗，疫苗含菌量可达5 X 108CCU/mL，制备成猪肺炎支原体灭活疫苗疫苗。
[0126] 3.疫苗检验
[0127] 3. 1性状检验疫苗外观应呈乳白色乳剂。
[0128] 剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩 散。
[0129] 稳定性吸取疫苗IOmL加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底吸出的水相应 不多于0. 5mL。
[0130] 粘度按照现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会编。中华人民共和国兽药典2010 年版三部中国农业出版社，2011年，本发明以下称《中国兽药典》）进行，应符合规定。
[0131] 3.2无菌检验按照现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。
[0132] 3. 3安全检验
[0133] 小鼠每批疫苗腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只，0. 5mL/只，观察10日，观察小 鼠存活情况。
[0134] 仔猪每批疫苗肌肉注射7日龄仔猪5头，2mL/头，首免后14日，再次肌肉注射2mL， 观察30日，观察仔猪存活情况及有无副反应，并分别于免疫0日、7日和二免后7日连续测 体温，观测体温情况。
[0135] 3.4效力检验
[0136] 仔猪抽取1批猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）和1批国外进口疫苗分别肌肉注射 7日龄健康易感SPF仔猪5头，ImL/头，14日后再肌肉注射疫苗lmL。首次免疫后21日，连 同对照猪5头，各用猪肺炎支原体ZS株组织强毒气管注射，每头5mL (含40~200个最小 发病剂量）。攻毒28日后，剖检，观察猪肺部病变情况，使用55计分法进行判定
[0137] 家兔将3批猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）肌肉注射1.5~2kg家兔5只，0.1 mL/ 只，14日后再次肌肉注射疫苗0. lmL，另设5只对照。在首免后21日采血，测定血清IHA抗 体效价，对照兔IHA效价不高于1:10,免疫兔的IHA效价至少4只不低于1:40。
[0138] 4.结果
[0139] 4. 1性状检验
[0140] 外观乳白色乳剂。
[0141] 剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，呈云雾状扩散。
[0142] 稳定性吸取疫苗IOmL加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底吸出的水相不 多于0. 5mL。
[0143] 粘度按照现行《中国兽药典》，使用粘度仪进行测定，粘度值（CP)分别为26,均符 合规定。
[0144] 4.2无菌检验抽取2瓶进行无菌检验，观察7日，均无菌生长。
[0145] 4. 3安全性检验结果
[0146] 3批疫苗分别腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只，观察10日，小鼠均健活；超剂 量肌肉注射仔猪，观察30日，仔猪均健活，除注射部位出现轻微红肿，无其他副反应；
[0147] 首次注射疫苗后4~5日每组各猪体温略有升高，持续1~3日后均恢复正常，二 免后体温反应集中在注射后第1日，随及恢复正常。
[0148] 4.4效力检验结果
[0149] 4. 4. 1家兔效力检验结果
[0150] 表2家兔免疫后抗体IHA效价测定结果的比较
[0151]
[0152] 从上表可以看出，猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）免疫家兔后，IHA抗体效价可达 到1:40以上，与对照组差异显著，综合抗体水平略高于同类进口疫苗抗体水平。
[0153] 4. 4. 2仔猪免疫攻毒效力检验结果
[0154] 表3仔猪攻毒后肺部病变情况的比较
[0155]
[0156] 免疫攻毒试验结果表明猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）具有较强的免疫保护力，达 80%以上的水平，与进口同类疫苗差别不明显。
【主权项】
1. 一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该株猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)命名为S株，已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏号 CGMCC No. 10095。2. 权利要求1所述一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该菌株的P46基因的部分碱基 序列为：3.权利要求1所述猪一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该菌株P97基因的Rl区碱基 序列为：对应的氨基酸序列为：4.权利要求1所述一株猪肺炎支原体菌种的应用，其特征在该菌株可作为疫苗生产菌 株用于制备猪肺炎支原体疫苗。
【专利摘要】本发明涉及一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)菌种，S株，该菌株为猪肺炎支原体新分离株，可在无细胞培养基上稳定生长，生长滴度可达到109～1010CCU/mL，经家兔和仔猪免疫试验证实其免疫原性良好；该菌株P97基因的R1区氨基酸含有11个AA(V/T)PKE/V的连续氨基酸序列，可作为其独特的分子生物学标记，该株猪肺炎支原体菌种可用于制备猪肺炎支原体灭活疫苗。CGMCC No.1009520141201
【IPC分类】A61K39/02, A61P31/04, C12N1/20
【公开号】CN104894009
【申请号】CN201510249939
【发明人】沈青春, 冯忠泽, 吴金, 孙晔, 李秋菊, 李聪研, 魏晶晶, 宋潇婷, 孙亚波, 史文艳
【申请人】北京中海生物科技有限公司, 吉林和元生物工程有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
【专利说明】
[0001]
技术领域本发明涉及一株猪肺炎支原体菌种及其应用，属于兽医微生物学领域。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae， Mhp)引起的一种猪的接触性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。据资料报道，世界各地 分离的猪肺炎支原体均属于同一血清型，但不同分离株之间基因组间有较大差异。1992 年 Frey 等(Frey, J. , Haldimann, A. &Nicolet, J. (1992). Chromosomal heterogeneity of various Mycoplasma hyopneumoniae field strains. Int J Syst Bacteriol 42, 275-280)首次证实了猪肺炎支原体不同分离株间基因组的差异，Artiushin和 Minion (1996^) (Artiushin, S. Minion, F. C. (1996). Arbitrarily primed PCR analysis of Mycoplasma hyopneumoniae field isolates demonstrates genetic heterogeneity. Int J Syst Bacteriol 46, 324-328.)进一步证实了 Frey 的观点，Kokotovic 等（1999 年)(Kokotovic, B. , Friis, N. F. , Jensen, J. S. Mhrens, P. (1999). Amplif ied-fragment length polymorphism fingerprinting of Mycoplasma species. J Clin Microbiol 37, 3300-3307.)的研宄结果也得出了同样的结论。
[0003] 支原体是可以自我复制的最小原核生物，生长缓慢，对培养基的要求较高。与其他 普通支原体相比，Mhp生长更为缓慢，对体外培养的要求显得更苛刻，被称为"挑剔的微生 物"。国内外专家学者通过长期研宄，研制了多种类型的营养培养基用于Mhp的分离、培养， 如A26支原体体形培养基、KM2培养基、Friis培养基和牛心汤培养基等。不过，这些培养依 然存在或多或少的不足，培养效果仍然不能令人满意。因此分离出抗原性、免疫原性好的疫 苗株具有十分重要的意义。
[0004] 猪肺炎支原体基因组含有稀有密码子，至今被鉴定的抗原蛋白只有少数几种。目 前认为猪肺炎支原体的主要抗原蛋白有P97、P65、P46、P36等，其中P46是Mhp具有很强种 属特异性的膜蛋白，其能够引起机体早期免疫反应。1995年，Futo等（Futo, S.，Seto, Y.，Mi tsuse, S. , Mori, Y., Suzuki, Τ. &Kawai, Κ. (1995). Molecular cloning of a 46-kilodalton surface antigen(P46)gene from Mycoplasma hyopneumoniae: direct evidence of CGG codon usage for arginine. J Bacteriol 177,1915-1917·)发现 P46 基因（1257bp)，在其 ORF中包含I个CGG(在Mhp中编码精氨酸，在其他支原体中为无义密码子）和3个TGA密 码子（在支原体中编码色氨酸，在通用密码子中为终止密码子）。P97是Mhp的主要粘附因 子，不同的毒株其Rl区包含不同个数的AAKPV/E基元（Hsu, T.，Artiushin, S.&Minion，F. C. (1997). Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesin gene of Mycoplasma hyopneumoniae. J Bacteriol 179,1317-1323)。因此 P46 蛋白和 P97 蛋白 基因组的序列测定，可作为猪肺炎支原体不同毒株鉴定的分子生物学标记。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株猪肺炎支原体菌种，该菌株在无细胞培养基上生长良 好，而且免疫原性强。经猪肺炎支原体16s RNA特异性引物鉴定为猪肺炎支原体菌株，将其 命名为猪肺炎支原体S株，经猪肺炎支原体P46引物和M7 Rl引物特异性扩增后也再次鉴 定为猪肺炎支原体，其碱基和氨基酸序列与其他猪肺炎支原体菌株如232株和JN F65株在 某些位置不同，可为该菌株的分子生物学鉴定做分子标记；该菌株可用于制备猪支原体灭 活疫苗。
[0006] 本发明的技术方案
[0007] 1. 一种猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S株，该菌株已于2014年12 月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。
[0008] 2.本发明所述猪肺炎支原体疫苗株S株，其P46基因的部分碱基序列为：
[0009] AGTAATGATT CTATTCGAAT AGCACTAACC GATCCGGATA ATCCTCGATG AATTAGTGCC 60 CAAAAAGATA TTATTTCTTA TGTTGATGAA ACAGAGGCAG CAACTTCAAC AATTACAAAA 120 AACCAGGATG CACAGAATAA CTGACTCACT CAGCAAGCTA MtTTAAGCCC AGCGCCAAAA 180 GGATTTATTA TTGCGCCTGA AAATGGAAGT GGAGTTGGAA CTGCTGTTAA TACAATTGCT 240 GATAAAGGAA TTCCGATTGT TGCCTATGAT CGACTAATTA CTGGATCTGA TAAATATGAT 300 TGGTATGTTT CTTTTGATAA TGAAAAAGTT GGCGAATTAC AAGGTCTTTC ACTTGCGGCG 360 GGTCTATTAG GAAAAGAAGA TGGTGCTTTT GATTCAATTG ATCAAATGAA TGAATATCTA 420 AAATCACATA TGCCCCAAGA GACAATTTCT TTTTATACAA TCGCGGGTTC CCAAGATGAT 480 AATAATTCCC AATATTTTTA TAATGGTGCA ATGAAAGTAC TTAAAGAATT AATGAAAAAT 540 TCGGGAAATA AAATAATTGA TTTATCTCCT GAAGGCGAAA ATGCTGTTTA TGTCCCAGGA 600 TGAAATTATG GGACTGCCGG TCAAAGAATC CAATCTTTTC TAACAATTAA CAAAGATCCT 660 CAAGGCGGTA ATAAAATCAA AGCTGTTGGT TCAAAACCAG CTTCTATTTT CAAAGGATTT 720 CTTGCCCCAA ATGATGGAAT GGCCGAACAA GCAATCACCA AATTAAAACT TGAAGGATTT 780 GATACCCAAA AAATCTTTGT AACTGGTCAA GATTATAATG ATAAAGCCAA AACTTTTATC 840
[0010] AAAGACGGCG ATCAAAATAT GACAATTTAT AAACCTGATA AAGTTTTAGG AAAAGTTGCT 900 GTTGAAGTTC TTCGGGTTTT AATTGCAAAG AAAAATAAAG CATCTAGATC AGAAGTCGAA 960 AACGAACTAA AAGCAAAGCT ACCAAATATT TCATTTAAAT ATGATAATCA AACATATAAA 1020 GTGCAAGGTA AAAATATTAA TACAATTTTA GTAAGTCCAG TAAT 1064
[0011] 对应的氨基酸序列为：
[0012]
[0013]
)
[0018] 4.本发明所述猪肺炎支原体疫苗株S株的应用，其特征在该菌株可作为疫苗生产 菌株用于制备猪肺炎支原体灭活疫苗。
[0019] 本发明的详细描述
[0020] -、猪肺炎支原体的分离及鉴定
[0021] 1.病料来源：
[0022] 菌株分离自吉林松原某猪场发病猪的肺组织，经PCR检测该病料无蓝耳病、猪瘟、 伪狂犬、传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌等病原感染，病料经匀浆处理后，按（V/ V) 1 : 10接种到本公司自制的LPS培养基（LPS培养基成分：PPLO 5g、酵母粉10g，葡萄糖 5g，Hanks液1000ml，猪血清10 %~20% ;适宜pH值：7. 4~7. 8,培养温度为37 °C )，37 °C 培养7~10日，连续传代3~5代，分离物可在LPS培养基上37°C培养72~96小时，培养 基pH值由L 6降至6. 8~6. 9。
[0023] 2.培养条件
[0024] 取以上液体培养物，按10% (V/V)接种LPS培养基，37°C培养72~96小时，培养 基pH值由7. 6降至6. 6~6. 8,培养物呈均一稍浑池的棕红色，无沉淀。培养物经无菌检 验，应无菌生长。
[0025] 3.血清学鉴定
[0026] 取以上培养物，将培养物稀释至KT4~l(T5(XU/mL，分别用猪肺炎支原体阳性血清 进行代谢抑制试验，结果显示猪肺炎支 原体阳性血清可抑制培养物的生长，表明分离到的 该培养物为猪肺炎支原体。
[0027] 4.分子生物学鉴定
[0028] 该以上培养物进行1000倍稀释，用热裂解法（沈青春，覃青松，王琴等（2006). PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数.中国预防兽医学报，55-57.))提取DNA作为模板， 分别用猪肺炎支原体和猪鼻支原体16s RNA特异性引物分别进行PCR扩增，结果显示待检 样品泳道出现649bp的猪肺炎支原体特异性条带（见图1)，而使用猪鼻支原体P37蛋白特 异性引物未能扩增出任何条带（见图2)。由此可见，分离物为猪肺炎支原体，而且不含有猪 鼻支原体。
[0029] 通过以上血清学鉴定和16s RNA PCR引物鉴定结果表明该菌株为猪肺炎支原体， 将其命名猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)S株，该菌株已于2014年12月1日 送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。
[0030] 5.序列分析
[0031] 取猪肺炎支原体S株菌液用热裂解法提取DNA作为模板，用分别使用猪肺炎支原 体P46 PCR引物和P97R1区PCR引物进行特异性扩增，得到特异性条带，将其克隆到T载体 后，进行序列分析。
[0032] 6.免疫原性检验
[0033] 用活菌滴度达IO9CXUAiL的S株菌液灭活后，与适宜佐剂制备灭活疫苗，分别接种 家兔和7日龄健康仔猪，通过测定家兔抗体水平和仔猪的攻毒保护力对其进行免疫原性评 价。
[0034] 二、猪肺炎支原体灭活疫苗的制备
[0035] (1)疫苗制造用抗原的制备：将二级种子按1:20接种Lps-5培养基，在37°C培养 3~6日，当pH值达到6. 9左右，收获培养物，再按1:50比例以同样的方法传代培养，直到 收获菌液制造疫苗；
[0036] (2)灭活：培养后菌液经β -丙内酯置灭活处理，加入硫柳汞作为防腐剂；
[0037] (3)配苗：将灭活后菌液与佐剂（法国赛比克公司的油佐剂或水佐剂）按（V/ V) 1:1的比例混合，制备成猪肺炎支原体灭活疫苗。
[0038] 本发明涉及的微生物资源信息
[0039] 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)，S株，该菌株已于2014年12月1日 送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。
【附图说明】
[0040] 图1 :猪肺炎支原体16s RNA特异性引物扩增电泳图。
[0041] 图2 :猪鼻支原体P37蛋白特异性引物扩增电泳图。
[0042] 图3 :猪肺炎支原体S株P46基因扩增片段电泳图。
[0043] 图4:猪肺炎支原体S株P97基因 Rl区扩增片段电泳图。
[0044] 本发明的积极效果
[0045] 本发明涉及一株猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S株，有典型猪肺炎 支原体感染同时无明显其他病原感染的猪肺脏，通过适宜培养基连续传代所得。通过分子 生物学和血清学鉴定，证实该菌株为猪肺炎支原体新分离株，可在无细胞培养基上稳定生 长，生长滴度可达到IO 9~10 kiCXUAiL,经家兔和仔猪免疫试验证实其免疫原性良好，可做 为猪肺炎支原体灭活疫苗的生产用菌种。经与其他猪肺炎支原体菌株，如232株和JNF65株 进行比较，其P46基因碱基序列和氨基酸序列有部分不同，但同源性较高，而P97基因碱基 序列和氨基酸序列均区别较大，且P97基因氨基酸含有11个AAPKE/V的连续氨基酸序列， 可作为其独特的分子生物学标记；该株猪肺炎支原体菌株可用于制备猪肺炎支原体灭活疫 苗。 实施例
[0046] 以下为进一步说明本发明，并不对本发明作出限定。
[0047] 实施例1
[0048] --猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S 株的培养
[0049] 将S株菌种10 %接种猪肺炎支原体LPS培养基，37°C培养72~96小时，当溶液 pH至6. 6~6. 8时，成黄色或橙黄色，均匀浑浊无沉淀，收获菌液，传代2次后，稀释菌液进 行 CCU 计数（colour change unit，CCU)，活菌数可达 IO9~10 lclCCU/mL。
[0050] 实施例2
[0051] --猪肺炎支原体S株菌液的猪肺炎支原体16s RNA特异性引物PCR测定
[0052] 1.引物设计
[0053] 根据genebank上公布的猪肺炎支原体的16s RNA的基因序列，参照沈青春等 (2006年）（沈青春，覃青松，王琴等（2006). PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数.中 国预防兽医学报，55-57.)合成引物。
[0054] 上游引物 Pl 序列为：5' -GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3'（序列 1)
[0055] 下游引物 P2 序列为：5' -TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC-3'（序列 2)
[0056] 预计扩增片段全长为649bp。
[0057] 2.模板提取
[0058] 取培养好的菌液ImL进行12000r/min离心15min，弃上清。沉淀用100 μ I I XTEN 溶液悬浮，沸水浴l〇min，室温静置3min。12000r/min离心2min，上清为模板DNA。
[0059] 3. PCR 扩增
[0060] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCR SuperMix 10 μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。反应条件为94°C预变性 5min，95°C变性 50s，60°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环，72°C终延伸 5min。
[0061] 4.电泳凝胶成像
[0062] PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，扩增片段649bp见图1。
[0063] 5.结论分离物经PCR鉴定为含有猪肺炎支原体。
[0064] 实施例3
[0065] --猪鼻支原体P37蛋白特异性引物PCR测定
[0066] 1.引物设计
[0067] 根据genebank上公布的猪鼻支原体的P37的基因序列设计并合成引物。
[0068] 上游引物 Pl 序列为：5 '-GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-3'（序列 3)
[0069] 下游引物P2序列为：5' -GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3'（序列4)，扩增片段全长为 346bp〇
[0070] 2.模板提取
[0071] 取培养好的菌液ImL进行12000r/min离心15min，弃上清。沉淀用100 μ I I XTEN 溶液悬浮，沸水浴l〇min，室温静置3min。12000r/min离心2min，上清为模板DNA。
[0072] 3. PCR 扩增
[0073] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCRSuperMix 10 μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。PCR反应条件：94°C预 变性5min，95°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸50s，35个循环，72°C终延伸5min。
[0074] 4.电泳凝胶成像
[0075] PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，猪鼻支原体BTS-7株（购自中国兽医药品监 察所）扩增片段346bp，S株无特异性扩增片段，见图2。
[0076] 5.结论分离物经PCR鉴定为不含有猪鼻支原体（注：由于猪肺炎支原体分离时很 容易受到猪鼻支原体的污染，导致分离物不纯而影响随后的研宄工作）。
[0077] 实施例4
[0078] --S菌液的P46基因测序
[0079] 1.引物设计：
[0080] 根据genebank上公布的猪肺炎支原体的P46的基因序列和张峰钢等《猪肺炎支原 体的分离及PCR鉴定》上发表的引物序列合成引物，扩增片段全长为1162bp。其引物：
[0081] 上游引物 Pl 序列为：5' -CGGGATCCACTTCAGATTCTAAACCACAA-3'（序列 5)，
[0082] 下游引物 P2 序列为：5' -CCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTATCAAC-3'（序列 6)。
[0083] 2.模板提取
[0084] 取S菌液、232株菌液和JNF65株菌液各lmL，进行12000r/min离心15min，弃上清。 沉淀用100μllXTEN溶液悬浮，沸水浴10min，室温静置3min。12000r/min离心2min，上 清为模板DNA。
[0085] 3. PCR 扩增
[0086] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCR SuperMixlO μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。PCR反应条件：94°C预变性 4min，94°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环，72°C终延伸 lOmin。
[0087] 4.电泳凝胶成像
[0088] PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，扩增片段1162bp，与Mhp232扩增片段大小一 致，见图4。
[0089] 5. S株P46基因部分测序及序列结果
[0090] S株P46的PCR产物进行测序，双向测通测序碱基序列为（序列7):
[0091]
[0094]
[0095] *序列中黑体部分的氨基酸为：由TGA编码的色氨酸，在通用密码子中TGA为终止 密码子。
[0096] 通过NCBI网站上的BLAST软件在线分析，结果表明以上核酸序列与猪肺炎支原体 国际标准菌株232株（12个碱基有差别）、J株（10个碱基有差别）、7448株（14个碱基有 差别）等的相应区域的同源性均达99% ;氨基酸序列上同源性更高，与7448株仅相差一个 氨基酸（221位Q-A)，与232株相差两个氨基酸（182位G-Q和221位Q-A)。
[0097] 6.结论
[0098] 通过猪肺炎支原体S株P46部分基因测序结果看，与其他菌株的相应序列同源性 较高，核苷酸序列和氨基酸序列均达到99%的同源性，这与P46基因的高度保守性特点相 符。
[0099] 实施例5
[0100] --S株的P97基因 Rl区测序
[0101] 1.引物设计：
[0102] 根据genebank上公布的猪肺炎支原体232株的P97基因 Rl区的核苷酸序列，设 计合成1对引物，扩增片段包含了 Rl区的全长，232株扩增产物预计大小约为320bp，不同 菌株扩展片段长度有差异。
[0103] 上游引物 P1 序列为：5' -CAAAAGAAGG TAAAAGAGAA-3'（序列 9)
[0104] 下游引物 P2 序列为：5' -AAGCCAGTAT TAGTAGCAAC-3'（序列 10)。
[0105] 2.模板提取
[0106] 取S株菌液lmL，进行12000rpm离心15min，弃上清。沉淀用100 μ I IXTEN溶液 悬浮，沸水浴lOmin，室温静置3min。12000r/min离心2min，上清为模板DNA。
[0107] 3. PCR 扩增
[0108] PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应体系：2XEasyTaq PCR SuperMixlO μ L，上下游引物各1 μ L，模板2 μ L，补水至20 μ L。PCR反应条件：94°C预变性 4min，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环，72°C终延伸 lOmin。
[0109] 4.电泳凝胶成像
[0110] 扩增产物经I. 〇%琼脂糖凝胶电泳，结果表明S株的扩增片段大小约为180bp，见 图4。
[0111] 5. P97基因的部分测序及序列结果
（序列11)
[0115] *序列中有下划线的氨基酸为重复序列，共计11个Ala Ala(ValZThr)Lys Pro Glu(Val)重复，简写为 AA (V/T)PKE/V。
[0116] 猪肺炎支原体S株的P97基因的Rl区共计包含11个AA(V/T)PKE/V的氨基酸序 列重复，区别于其他菌株，与168株重复数相同，但其中有多达7个氨基酸的差别，如下表1。
[0117] 表1四株猪肺炎支原体P97基因的Rl区氨基酸序列的差异
[0118]
[0119] 注表示缺失；下划线表示与S株在该处不同。
[0120] 实施例6
[0121] 一一猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）的制备及检验
[0122] 1.菌液培养
[0123] 将猪肺炎支原体S株冻干菌种用猪肺炎支原体LPS培养基复溶，1:10接种猪肺炎 支原体LPS培养基，37°C培养72~96小时，当溶液颜色呈棕红色（pH至6. 6~6. 8)，均匀 浑浊无沉淀，收获菌液。将S株菌液连续在LPS培养基上传代2代，使活菌数达109(XU/mL， 无菌检验合格后菌液用于制备疫苗。
[0124] 2.制备疫苗
[0125] 将检验合格的S株菌液灭活后，与佐剂（法国赛比克公司的油佐剂或水佐剂）混 合进行乳化制苗，疫苗含菌量可达5 X 108CCU/mL，制备成猪肺炎支原体灭活疫苗疫苗。
[0126] 3.疫苗检验
[0127] 3. 1性状检验疫苗外观应呈乳白色乳剂。
[0128] 剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩 散。
[0129] 稳定性吸取疫苗IOmL加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底吸出的水相应 不多于0. 5mL。
[0130] 粘度按照现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会编。中华人民共和国兽药典2010 年版三部中国农业出版社，2011年，本发明以下称《中国兽药典》）进行，应符合规定。
[0131] 3.2无菌检验按照现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。
[0132] 3. 3安全检验
[0133] 小鼠每批疫苗腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只，0. 5mL/只，观察10日，观察小 鼠存活情况。
[0134] 仔猪每批疫苗肌肉注射7日龄仔猪5头，2mL/头，首免后14日，再次肌肉注射2mL， 观察30日，观察仔猪存活情况及有无副反应，并分别于免疫0日、7日和二免后7日连续测 体温，观测体温情况。
[0135] 3.4效力检验
[0136] 仔猪抽取1批猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）和1批国外进口疫苗分别肌肉注射 7日龄健康易感SPF仔猪5头，ImL/头，14日后再肌肉注射疫苗lmL。首次免疫后21日，连 同对照猪5头，各用猪肺炎支原体ZS株组织强毒气管注射，每头5mL (含40~200个最小 发病剂量）。攻毒28日后，剖检，观察猪肺部病变情况，使用55计分法进行判定
[0137] 家兔将3批猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）肌肉注射1.5~2kg家兔5只，0.1 mL/ 只，14日后再次肌肉注射疫苗0. lmL，另设5只对照。在首免后21日采血，测定血清IHA抗 体效价，对照兔IHA效价不高于1:10,免疫兔的IHA效价至少4只不低于1:40。
[0138] 4.结果
[0139] 4. 1性状检验
[0140] 外观乳白色乳剂。
[0141] 剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，呈云雾状扩散。
[0142] 稳定性吸取疫苗IOmL加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底吸出的水相不 多于0. 5mL。
[0143] 粘度按照现行《中国兽药典》，使用粘度仪进行测定，粘度值（CP)分别为26,均符 合规定。
[0144] 4.2无菌检验抽取2瓶进行无菌检验，观察7日，均无菌生长。
[0145] 4. 3安全性检验结果
[0146] 3批疫苗分别腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只，观察10日，小鼠均健活；超剂 量肌肉注射仔猪，观察30日，仔猪均健活，除注射部位出现轻微红肿，无其他副反应；
[0147] 首次注射疫苗后4~5日每组各猪体温略有升高，持续1~3日后均恢复正常，二 免后体温反应集中在注射后第1日，随及恢复正常。
[0148] 4.4效力检验结果
[0149] 4. 4. 1家兔效力检验结果
[0150] 表2家兔免疫后抗体IHA效价测定结果的比较
[0151]
[0152] 从上表可以看出，猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）免疫家兔后，IHA抗体效价可达 到1:40以上，与对照组差异显著，综合抗体水平略高于同类进口疫苗抗体水平。
[0153] 4. 4. 2仔猪免疫攻毒效力检验结果
[0154] 表3仔猪攻毒后肺部病变情况的比较
[0155]
[0156] 免疫攻毒试验结果表明猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）具有较强的免疫保护力，达 80%以上的水平，与进口同类疫苗差别不明显。
【主权项】
1. 一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该株猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)命名为S株，已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏号 CGMCC No. 10095。2. 权利要求1所述一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该菌株的P46基因的部分碱基 序列为：3.权利要求1所述猪一株猪肺炎支原体菌种，其特征在于该菌株P97基因的Rl区碱基 序列为：对应的氨基酸序列为：4.权利要求1所述一株猪肺炎支原体菌种的应用，其特征在该菌株可作为疫苗生产菌 株用于制备猪肺炎支原体疫苗。
【专利摘要】本发明涉及一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)菌种，S株，该菌株为猪肺炎支原体新分离株，可在无细胞培养基上稳定生长，生长滴度可达到109～1010CCU/mL，经家兔和仔猪免疫试验证实其免疫原性良好；该菌株P97基因的R1区氨基酸含有11个AA(V/T)PKE/V的连续氨基酸序列，可作为其独特的分子生物学标记，该株猪肺炎支原体菌种可用于制备猪肺炎支原体灭活疫苗。CGMCC No.1009520141201
【IPC分类】A61K39/02, A61P31/04, C12N1/20
【公开号】CN104894009
【申请号】CN201510249939
【发明人】沈青春, 冯忠泽, 吴金, 孙晔, 李秋菊, 李聪研, 魏晶晶, 宋潇婷, 孙亚波, 史文艳
【申请人】北京中海生物科技有限公司, 吉林和元生物工程有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
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