防治番茄根结线虫病的复合微生物菌剂及其应用
防治番茄根结线虫病的复合微生物菌剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农作物防病治病技术领域，特别涉及一种防治番茄根结线虫病的复合 微生物菌剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 根结线虫病是由根结线虫（Meloidogyne spp.)引起的一类世界性的重要植物线 虫病害，是当前保护地蔬菜（番茄、黄瓜、南瓜、青椒等）重要病害之一，广泛分布于世界各 地。目前，国际上报道的根结线虫有90多种，主要寄生在蔬菜、粮食作物、经济作物、果树植 物及杂草等3000多种寄主上，温带、亚热带、热带地区的植物受害尤其严重。据2000年的 统计，全世界每年因线虫为害给粮食和纤维作物造成的损失约为12. 7%，对蔬菜、花生、烟 草和某些果树造成的损失超过20%。线虫已成为植物的一类重要病原物，线虫病害已成为 农林生产上的重要问题。随着保护地蔬菜生产面积的增加，特别是日光温室的大面积推广 以来，复种指数增加，加之重茬严重，导致根结线虫危害日趋严重，一般减产10%左右，严重 的高达75%以上。
[0003] 目前根结线虫病的防治措施主要分为化学农药防治、物理防治和生物防治。对于 根结线虫的防治，其中化学农药防治是目前应用最为普遍的农业措施，通常采用卤代烃类 化合物、异硫氰酸甲酯类、有机磷类和氨基甲酸酯类化合物，这些化合物能够杀死或麻痹根 结线虫，但是其缺点是显而易见的，能导致线虫抗药性增强、虫口密度上升、污染环境、杀伤 天敌、农药残留、病虫菌的抗药性增强、威胁人类健康等。除了化学农药防治方法以外，另 一个应用较广的方法是物理防治，主要有：热力处理、种子淘汰、高频处理、射频处理、高温 闷棚、水肥管理、改良土壤、材料隔离等方法。高温闷棚、热力处理、种子淘汰、高频处理、射 频处理主要是用来处理温室的种子、苗床和苗木，可能需要较长一段休棚期，打乱生产计 划，影响作物生长周期，一般不适用于大田防治线虫。其应用范围有限，防治效果一般，有 些需要特殊的仪器设备，增加生产成本。所以除继续探索一些化学和物理防治根结线虫的 有效方法外，对根结线虫的生物防治应越来越重视。根结线虫生防资源包括食线虫真菌 (Nematophagous fungi)、细菌（bacteria)、放线菌（Actinomycetes)、病毒（Virus)、立克 次氏体（Rickettsia)、原生动物（Protozoa)、水熊（Tardigrade)、扁虫（Turbellarians)、 螨类（Mites)、跳虫（Collembola)、Enchytraids 以及捕食性线虫（Predacious nematodes) 等。其中较常见有淡紫拟青霉素、厚坦孢普奇尼亚霉、阿维菌素、芽孢杆菌等，防治效率在 40%-60%左右，其防治根结线虫的效果较好，但是作用菌株单一，导致生防机制单一，无菌 株间的协同增效作用，不能进一步提高防治效率。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种防治番茄根结线虫病的复合微生物 菌剂及其应用，将番茄共生丛植菌根（AM)真菌与植物根围促生细菌（PGPR)共用，利用二者 的协同增效作用，提高根结线虫的防治效率。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] -种复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉（Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0007] 其中，地表球囊霉G. V为AM真菌的一种，与植物共生，购自青岛农业大学菌根技术 研宄所。
[0008] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, BS)属于芽孢杆菌属，是一种植物根围促生细 菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，购自中国普通微生物菌种保藏管理 中心，菌株编号为BS 1.936。
[0009] 植物根围促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由 生活在土壤或附生于植物根围的一类具有固氮、解磷、产生植物激素或分泌抗生素、促进植 物生长的有益细菌。国内外大量试验表明，接种PGPR于农作物根围能调节土壤微生物区 系平衡状况，同时在植物根围形成一个生物屏障，阻止病原物的定殖和侵入、促进植物生 长。其生防机制概括起来主要集中于以下几个方面：PGPR与病原物竞争水分、养分和定殖 位点；分泌噬铁素，与病原物竞争铁离子；有些微生物产生抗生素；诱导植物产生系统抗性 等。PGPR能在根围发生发展是理想的生防因子之一，在当前和今后植物土传病害生物防治 中具有很大应用潜力。
[0010] AM真菌是一类植物活体营养专性共生菌，存在于陆地各生态环境中，与绝大多数 植物建立互惠共生关系，地球上90 %的维管植物都能形成AM。菌根的有益作用主要体现 在：扩大植物根系的吸收面积；增加植物对磷及其它多种矿质元素的吸收和利用，改善营 养状况；改变植物内源激素的平衡状况，从而促进植物萌发、生根和生长；提高植物抗病性 和抗逆性；促进作物生长、提高产量、改善品质。
[0011] AM真菌和PGPR之间至少存在3种关系：即相互促进、相互竞争和互不影响。而AM 真菌、PGPR和寄主植物的种类、环境条件则决定了这些相互作用的性质。而且，发生相互作 用的AM真菌与PGPR之间具有高度的专一性。AM真菌与PGPR于根围进行着一系列有利于 植物生长和健康以及土壤肥力的相互作用，尤其是它们之间的协同作用对植物和土壤具有 十分重要的生理和生态效应。
[0012] 采用上述的复合微生物菌剂制备的防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0013] 所述生防菌剂产品在防治番茄根结线虫方面的应用。
[0014] 采用上述生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中 接种地表球囊霉G. V ;再次，移栽期、苗期以及开花坐果期分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS。
[0015] 在以上方案的基础上，所述G. V的接种剂量为1000-5000IPU/株；所述BS接种剂 量为发酵液 109cfu/ml，200-500ml/ 株?次。
[0016] 优选的，所述G. V的接种剂量为2000IPU/株；所述BS接种剂量为发酵液IO9Cfu/ ml，200ml/ 株?次。
[0017] 其中，所述移栽期为番茄发育至3-4叶时可定植时期；苗期为番茄定植后发育至 4-5叶阶段；开花坐果期为番茄发育至一花一果期。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 1、防治效率较高：与一般单一菌剂或菌素的防治效率相比，AM真菌和内生细菌互 作具有明显的协同增效作用，防治率达到60-70%，二者具有更广泛的抑制根结线虫机理， 高于单一菌剂或菌素的防治率。这与两种菌剂协同增效作用及作用机理广泛有密切关系。
[0020] 2、促进番茄根系的发育，提高产量：施用本复合菌剂的番茄植株根系发达，尤其是 须根系较多，这有效增加了番茄的吸收面积。
[0021] 3、本发明的防治方法具有对环境安全、有利于人类健康、不杀伤天敌、无残留、病 虫菌不易产生抗药性、有利于植物根系的发育、不需要特殊设备、无需休棚期、降低化学农 药对番茄根系的损伤和抑制等优点。使用混合菌剂的费用相对较低，远远低于常用土壤熏 蒸剂溴甲烷等，且无须像施用溴甲烷等采用特殊的加热汽化设备，可以节省大量支出。两种 菌剂施于土壤，不会在果实中残留，安全有效。达到既能够防治根结线虫病害、保护并促进 番茄根系生长，又增加产量，减少农药污染等作用。
[0022] 本发明通过盆栽试验和大田试验获得联合接种AM真菌和PGPR对番茄根结线虫病 的抑制效果，得出如下结论：
[0023] 盆栽试验显示：联合接种AM真菌菌株G. V和PGPR菌株BS能有效抑制番茄根结线 虫病。与单接种G. V和BS相比，联合接种处理组根结线虫发病率、病情指数和单株根结数 都远小于单接种处理组，防效达到74% ;且根结线虫繁殖体 数如根内二龄幼虫数、根内雌虫 数、根内线虫总数、卵囊数和单个卵囊含卵量都远低于单接种处理组，可见联合接种G. V和 BS能有效抑制番茄根结线虫病。其部分抑制机理是通过抑制根结线虫二龄幼虫的侵染及提 高番茄自身抗性酶活性来达到抑制根结线虫病的作用，28天时对照组根结线虫侵染率是联 合接种处理组的4. 15倍；联合接种处理组POD、SOD、CAT等抗性酶活性会普遍高于未接种 组和单接种处理组，各种抗性酶活性和活性物质含量呈现一定规律变化，一般根系酶活性 和活性物质含量先发生变化，叶片迟后变化。不同活性物质出现峰值的时间和变化规律不 同。
【具体实施方式】
[0024] 本发明的【具体实施方式】如下：
[0025] 实施例1 :
[0026] 本发明涉及的复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0027] 采用上述复合微生物菌剂制备防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0028] 生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中接种地表 球囊霉G. V，接种剂量为2000IPU/株；再次，在番茄3-4叶时移栽期、苗期以及开花坐果期， 分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS，BS接种剂量为发酵液浓度为10 9cfu/ml，200ml/株。枯 草芽孢杆菌的接种方法为在番茄根围打4个小孔，采用灌根法接种。
[0029] 实施例2 :
[0030] 本发明涉及的复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0031] 采用上述复合微生物菌剂制备防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0032] 生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中接种地表 球囊霉G. V，接种剂量为1000IPU/株；再次，在番茄3-4叶时移栽期、苗期以及开花坐果期， 分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS，BS接种剂量为发酵液浓度为10 9cfu/ml，500ml/株。枯 草芽孢杆菌的接种方法为在番茄根围打4个小孔，采用灌根法接种。
[0033] 实施例3 :
[0034] 本发明涉及的复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0035] 采用上述复合微生物菌剂制备防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0036] 生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中接种地表 球囊霉G. V，接种剂量为5000IPU/株；再次，在番茄3-4叶时移栽期、苗期以及开花坐果期， 分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS，BS接种剂量为发酵液10 9cfu/ml，300ml/株。枯草芽孢 杆菌的接种方法为在番茄根围打4个小孔，采用灌根法接种。
[0037] 实验例：
[0038] (一）盆栽条件下接种G. v+BS对番茄根结线虫病的抑制作用及其作用机理
[0039] 1、试验方法
[0040] (Glomus versiforme，G. V)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)BS、南方根结线 虫（M. incognita Chitwood，Mi)，根结线虫采自番前根结线虫病病株根系，经青岛农业大学 植物病理研宄室鉴定为南方根结线虫。
[0041] 试验分 8 个处理：CK，Mi，G. v，G. v+Mi，BS、BS+Mi，G. v+BS 和 G. v+BS+Mi。播种时接 G. V混合接种物5000IPU，移栽时接BS发酵液109cfu/ml IOml，移栽时接根结线虫二龄幼虫 500条/株。各处理除了接种相应的接种物外，再接等量的其他灭菌接种物，以保持各处理 组的一致性。
[0042] 供试番茄种子2% NaClO灭菌后播种于黑色营养钵内（土壤和沙比例为2:1)，待 番茄苗长至3叶期时，移栽入花盆内。每盆2株，每处理20盆作为一个试验小区，每小区随 机取5株进行各指标测定。
[0043] G. v、BS和Mi接种方法、BS发酵液的制备方法及番茄苗管理方法等见下。
[0044] 接种AM真菌：于黑色营养钵内装入栽培土（土壤和沙比例为2:1)中混入5000接 种势单位（IPU)的AM真菌菌剂，对照则加入等量的灭菌混合接种物，以保持相同的其它根 围微生物区系。每钵栽入2株番茄幼苗（1叶期）。正常管理。
[0045] 根结线虫卵悬液的制备：从感染根结线虫的番茄根部挑取新鲜卵块，用2% NaClO 溶液剧烈震荡2min，500目筛回收卵，无菌水冲洗几遍，用无菌水稀释成600卵/ml。
[0046] PGPR发酵液的制备：将10 μ 1菌种接到装有50ml液体培养基250ml三角瓶中， 30°C、130rpm/min震荡培养48h。以比池法分别稀释至10 9cfu/ml。
[0047] 接种Mi及PGPR :番茄3-4叶期移栽到直径20cm的花盆中，每盆2株，重复6次。 同时在番茄根围打4个小孔，采用灌根法（表层和深层结合）接种Mi 5ml和PGPR 10ml。 根据培养基质肥力水平和植株生长需要可在中后期适当补充30%的Hoagland营养液。其 他常规管理。
[0048] 2、测定指标和方法
[0049] 分别于移栽后0、2、4、7、14、21、28天随机取番茄苗根系和叶样品，置于液氮中冷 冻，再置于-80 °C保存备用。
[0050] 根结线虫发病情况：防效（％) = (单接种Mi的病情指数一接种G. V及BS的病 情指数）/单接种Mi的病情指数*100%
[0051] 病情指数测定：其病情情况采用0-6级分级标准。0级，无根节形成；0. 5级，形成 根结的根系数量占根系总数的10%以下，根结较小，根系发育几乎没有影响；1级，形成根 结的根系数量占根系总数的10%以下，根结较大，有根须团形成；2级，形成根结的根系数 量占根系总数的10%至20%，根结中等，又较明显的根须团；3级，形成根结的根系数量占 根系总数的20%至50%，部分根结会聚形成明显的根系膨大；4级，形成根结的根系数量占 根系总数的50%至70%，大部分根结会聚形成明显的根系膨大；5级，形成根结的根系数量 占根系总数的70%至90%，只有少数的须根系，其余均为根结会聚形成明显的根系膨大；6 级，形成根结的根系数量占根系总数的100 %，无须根系，根系有明显的腐烂症状。分别以以 下公式计算病情指数，发病率和防效：
[0052] 病情指数（％ ) =Σ (各病级X各级株数）X100%八最高病级X总调查株数）
[0053] 根内线虫数量：次氯酸钠一酸性品红染色，将根组织加入适量5. 25% NaClO液，不 断搅拌4min，取出后流水冲洗45S，浸泡于蒸馏水中15min，再将根组织移至另一烧杯，加入 Iml酸性品红溶液，煮沸30S，待冷却用流水冲洗，最后将根组织加入25ml酸性甘油液，褪色 进行镜检。
[0054] 卵囊数：将番茄的根系均匀地切成Icm根段，随机称取lg，记卵囊数。
[0055] 单个卵囊卵数：将大约10个卵囊在5%的次氯酸钠中溶解3min，然后计每个卵囊 的卵数。
[0056] 单株根结数测定：取番茄全部根系，以计数器统计根结数。
[0057] 3、试验结果
[0058] (I) G. V及BS对番茄根结线虫病发病情况的影响
[0059] 表1G. V及BS对番茄根结线虫病发病情况的影响
[0060]
[0061] 表1显示G. V和BS能有效缓解番茄根结线虫病，发病率分别下降23%和50%，病 情指数下降30. 3%和47%，防效达到37. 76%和58. 51%，二者比较，在本试验条件下，BS的 抗病效果更佳；而G. v+BS混合处理组表现出较好的协同作用优势，发病率、病情指数防效 均高于单接种处理组。
[0062] ⑵G. V及BS对根结线虫繁殖体的影响
[0063] G. V和BS能有效缓解番茄根结线虫病，而且根内线虫总数、卵囊数和单个卵囊含 卵量等根结线虫繁殖体指标也有所下降（表2)，显著低于Mi处理组。G. v+BS混合处理组 与单接种处理组比能更有效降低根内二龄幼虫数（22. 2个/g)、根内雌虫数（50. 6个/g)、 根内线虫总数（72. 8个/g)、卵囊数（20. 0个/g)和单个卵囊含卵量（333. 2个），减少根结 线虫二龄幼虫侵染率，降低其有效繁殖率。
[0064] 表2G. v及BS对南方根结线虫繁殖体的影响
[0065]
[0066] 注：表中不同字母表示不同处理在p = 0. 01水平上差异显著。
[0067] (3)不同处理南方根结线虫侵染速率
[0068] 从表3可以看出，随着时间的推移G. v、BS单接种处理组和混合接种组根结线虫侵 染速率逐渐下降，移栽后14天时下降明显，而Mi处理组相反，在移栽后14天根结线虫侵染 速率增加很快，接近最大侵染速率，结果表明番茄共生菌G. V和内生菌BS在移栽后14天左 右对根内根结线虫的繁殖活动和侵染过程有明显抑制作用；G. v+BS混合接种组根结线虫 侵染速率在各时段显著低于其他处理组，28天时仅为0. 826, Mi处理组、G. V处理组和BS处 理组分别是其4. 16倍、1. 49倍和1. 85倍。
[0069] 表3不同处理南方根结线虫侵染速率（％ day)
[0070]
[0071] (4)接种G. v+BS对番茄抗性酶的影响
[0072] 植物在逆境条件下会通过提高自身抗性来抵御不良因素，提高抗性酶活性、活性 物质含量，降低有害物质的生成等。根结线虫对番茄根部的侵染同样会引起番茄根和叶的 相应反应，由下表可知，接种根结线虫处理组POD、SOD、CAT等抗性酶活性会普遍高于未接 种组，而单接种Mi处理组会随着根结线虫的侵染，各种抗性酶活性和活性物质含量呈现一 定规律变化，一般根系酶活性和活性物质含量先发生变化，叶片迟后变化。不同活性物质出 现峰值的时间和变化规律不同。
[0073] 1)接种G. v+BS对番茄根和叶过氧化物酶（POD)的影响
[0074] 由表4-5可知，各处理组POD活性随着移栽后天数的增加呈现一定规律变化，接种 Mi处理组要普遍高于相应的未接种Mi处理组；移栽后番茄根系POD活性在第7天出现一 次较明显变化，之后CK处理组POD活性有所增长，但是变化曲线平缓，接种BS处理组在第 7天时高于CK处理组，接种G. V和G. v+BS混合接种组在移栽后4天时即明显高于CK和BS 处理组，14天时达到峰值，分别为66. 29 ( Λ OD47tl .miiT1 · g-1)和57. 25 ;接种Mi后，各处理 组变化趋势与未接种Mi处理组接近，但是前者明显高于后者，而且在第28天时出现第二次 峰值，这可能与根结线虫的二次侵染有一定的关系；番茄叶片POD活性也在第7天出现明显 变化，但是峰值不明显，各种侵染因素对番茄叶片POD活性影响不大，接种Mi处理组也在28 天明显升高。
[0075] 表4不同处理番前根POD活性（Λ OD47tl · mirT1 · g_〇
[0076]
[0077] 表5不同处理番茄叶POD活性（Λ OD47tl · min-1 · g-1)
[0078]
[0080] 2)接种G. v+BS对番茄根和叶过氧化氢酶（CAT)的影响
[0081] 由表6-7可知，番茄根系和叶片CAT活性随着移栽天数的增加变化明显。未接种 Mi处理组中，CK处理组根系CAT活性变化不明显，呈现较平缓的变化曲线，而且在第7天 后略有下降，但是接种BS、G. V和G. v+BS混合接种处理组均能够明显提高根系CAT活性， 其中G. V和G. v+BS混合接种处理组接近，在第7天和第21天出现两个峰，而BS 51-3第 7天以后逐渐下降；接种Mi处理组普遍高于未接种处理组，各组变化趋势接近，也是在第 7天和第21天时出现两个峰值，仍然是G. V和G. v+BS混合接种处理组高于其他处理组， 第7天的峰值分别为3. 868和4. 063 ( Λ OD24tl · mirr1 · g_〇，第21天峰值分别为3. 563和 3. 766 ( Λ OD24tl · HiirT1 · g_〇。番茄叶片CAT活性变化趋势不同于根系，只有一个峰值，出现 在第7天，最高为G. v+BS混合接种处理组，与此不同的是Mi处理组和BS+Mi处理组，峰值 出现在第14天，说明Mi的侵染与G. V和BS的侵染会相互作用，综合侵染结果十分复杂。
[0082] 表6不同处理番茄根CAT活性（Λ OD24tl · miiT1 · g-1)
[0083]
[0084] 表7不同处理番茄叶CAT活性
[0085]
[0087] 3)接种G. v+BS对番茄根和叶超氧化物歧化酶（SOD)的影响
[0088] 由表8-9可知，Mi、G. V和BS的侵染对番茄根系和叶片SOD活性有一定影响。根 系SOD活性变化最明显的是移栽后7天，不接种Mi处理组中，CK变化不明显，BS处理组在 第4天根系SOD活性升高后第7天又下降，之后缓慢上升，与之不同的是G. V和G. v+BS混 合接种处理组第7天出现峰值，分别为977. 86U · g4和1035. 14U · g Λ是对应CK处理组的 1. 26和1. 33倍，之后缓慢下降。叶片SOD活性变化趋势与根系基本相同，叶片SOD活性明 显高于根系SOD活性。接种Mi处理组变化幅度小于不接种处理组。
[0089] 表8不同处理番茄根SOD活性（U · g-1)
[0090]
[0091] 表9不同处理番茄叶SOD活性（U · g_〇
[0092]
[0094] (二）G. V和BS接种剂量和接种时机对番茄根结线虫的抑制作用
[0095] 1、G. V接种剂量对番茄苗定植前AM真菌侵染率的影响
[0096] (1)试验设计
[0097] 共设置4个处理：对照组（CK)、分别接种G. V 500、1000、2000和5000IPU处理组。 各处理组播种时接入G. V菌剂。将灭菌催芽番茄种子两粒播于预混AM菌剂的育苗土中，每 钵2株，每处理6盆，正常管理。待番茄苗长至3-4叶期时取样测定菌根侵染率。
[0098] (2)菌根侵染率测定方法
[0099] 将根段切成0. 5~1.0 cm的小段，加入10% KOH溶液透明，放入90 °C水浴锅中 15-20min。去掉碱液，用自来水冲洗根系3次，再加入2%的HCl溶液酸化5min。去掉酸液 后加入酸性品红（0. 1% )乳酸甘油染色液（乳酸875ml，甘油63ml，蒸馏水63ml，酸性品 红0.1 g)，室温下过夜。加入乳酸分色后即可镜检。
[0100] 菌根侵染率（％ )= Σ (0 % X根段数+10 % X根段数+…+100 % X根段 数）XlOO% /总根段数
[0101] (3)结果
[0102] 表10接种不同剂量G. V番茄苗的菌根侵染率
[0103]
[0104] 2、BS接种剂量、接种时机及接种次数对番茄根结线虫病的抑制作用
[0105] (1)试验设计
[0106] BS接种浓度对番茄根结线虫病的抑制作用：共设置6个处理，分别为CK、BS发 酵原液、2倍稀释液、5倍稀释液、10倍稀释液和20倍稀释液处理组。移栽时每株接菌剂 200ml〇
[0107] BS接种剂量对番茄根结线虫病的抑制作用：AM真菌接种剂量为2000IPU/株，BS 接种发酵原液，接 种剂量分别为（每株）：Oml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml。
[0108] BS接种次数及接种时机对番茄根结线虫病的抑制作用：AM真菌接种剂量为 2000IPU/株，BS接种发酵原液，接种剂量为200ml/株，接种次数及接种时机分为11个处理 组：CK、移栽、苗期、开花坐果期、结果期、移栽+苗期、移栽+开花坐果期、移栽+结果期、移 栽+苗期+开花坐果期、移栽+苗期+结果期、移栽+开花坐果期+苗期。
[0109] (2)试验方法
[0110] 各处理组播种时接入G. V菌剂2000IPU。将灭菌催芽番茄种子两粒播于预混AM菌 剂的育苗土中，每钵2株，重复6次。待番茄苗长至3-4叶期移栽入花盆，同时按照BS接种 浓度、接种剂量和接种次数灌根接种菌剂。其余正常管理。
[0111] 接种后60天，测定各处理组番茄根系根结线虫病发病率病情指数及防效。
[0112] (3)结果
[0113] 表1lBS发酵液浓度对番茄根结线虫病的抑制效果
[0114]
[0115] 表12BS菌剂接种剂量对番茄根结线虫病的抑制效果
[0116]
[0117] 表13BS菌剂接种时机和接种次数对番茄根结线虫病的抑制效果
[0118]
[0119]
[0120] (三）保护地接种G. v+BS对番茄根结线虫病的抑制作用
[0121] 1、试验设计
[0122] 共设置3个处理：对照组（CK)、噻唑膦处理组和G. v+BS处理组。G. v+BS处理组播 种时接入G. V菌剂，移栽时接入BS发酵原液；噻唑膦处理组移栽时施噻唑膦农药（有效成 分10 %，生产厂家为日本石原产业株式会社，药效为4-5个月）。
[0123] 2、番茄保护地选择
[0124] 选取根结线虫发病较重的番茄大棚，位于山东省烟台市海阳市行村镇东村庄村 (东经120° 50,北炜36° 16)，大棚使用年限为13年，重茬连作番茄，一年两茬。试验时间 为2013年8月至2014年1月，上茬番茄根结线虫病发病较重较普遍，最高病级达到5级， 发病率约75%。
[0125] 3、育苗与G. V接种
[0126] 番茄种子经75%乙醇5min、2%NaC10 20min灭菌，催芽后播于5X5黑色穴盘内， 1株/穴。栽培土为土壤和育苗基质（体积比1:1)混合物，G. v+BS处理组接入2000IPU的 G. V菌剂，对照组和噻唑膦处理组接入等量的灭菌混合接种物。正常管理。
[0127] 4、定植
[0128] 将3-4叶期番茄苗移栽入番茄大棚，株距20cm，行距50cm，每个处理100株。 G. v+BS处理组第一次移栽期灌根接入BS发酵原液200ml/株；噻唑膦处理组移栽前以 1500g/亩的剂量土壤撒施噻唑膦农药，与上层土壤混匀后移栽番茄苗。待BS发酵液渗入土 壤后稍干，垄沟灌水。其余正常管理。
[0129] 5、取样
[0130] 定植后15天苗期第一次取样，将番茄根系及根围土壤一起挖出，尽量不损伤根 系。取样后G.v+BS处理组苗期第二次灌根接入，培土后再接入100mL/株。移栽后35天开 花坐果期第二次取样，取样后第三次灌根接入BS发酵原液200ml/株，移栽后75天结果期 第三次取样。
[0131] 6、结果
[0132] 3. 2. 2G. v+BS及噻唑膦对番茄根结线虫病的抑制作用
[0133] G. v+BS及噻唑膦对植物生长发育的影响不同，对番茄根结线虫病的防治效果也不 同。CK对照组根结线虫病发病最严重，发病率最高达84. 38 %，病情指数最高为0. 448, 75天 取样时单株根结数平均为234. 63个/株；噻唑膦农药能够强烈抑制根结线虫病，仅在个别 植株发现少量根结，发病率小于10%，定植35天和75天时病情指数分别为0. 053和0. 038， 3次取样防效分别为100%、85. 24%和91. 52%;G. v+BS混合接种处理组也能有效抑制番茄 根结线虫病，发病率在20-30 %之间，病情指数最低为0. 096,单株根结数小于40个/株，防 效最高为78. 57%。
[0134] 表14不同处理番茄根结线虫病单株根结数（个）
[0135]
[0136] 表15不同处理番茄根结线虫病发病率（％ )
[0137]
[0138] 表16不同处理番茄根结线虫病病情指数（％ )
[0139]
[0140] 表17不同处理番前根结线虫病防效（％ )
[0141]
[0142] 表18不同处理番前根长（cm)
[0143]
[0144] 表19不同处理番前根鲜重（g)
[0145]
[0146] 7、噻唑膦类杀线虫农药的危害
[0147] 噻唑膦是一种国际常用杀线虫药剂，能预防和治疗各类作物根结线虫、根腐（短 体）线虫、胞囊线虫、茎线虫等。其优点是治效率较高，持续时间较长。其危害主要是噻唑 膦通过植物体吸收，除了能够杀灭各种病虫，对植物及人体可能具有一定毒性，研宄表明一 定剂量噻唑膦可能导致根长、根鲜重都明显小于对照，根系活力较低；以大鼠为模型的动物 试验也表明高剂量噻唑膦导致甘油三酯、总蛋白、白蛋白、总胆红素、肌酐、血糖、胆碱酯酶 活性等明显低于对照组。本实验也提出正常剂量根系施用噻唑膦会抑制番茄根系发育，导 致根长、根鲜重等下降，须根发育不良，妨碍植物正常生长等情况。见表18-20。
[0148] 表20不同处理番前侧根鲜重（g)
[0149]
【主权项】
1. 一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomusversiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis,BS)组成。2. 采用权利要求1所述的复合微生物菌剂制备的防治番茄根结线虫病的生防菌剂。3. 权利要求2所述生防菌剂产品在防治番茄根结线虫方面的应用。4. 采用权利要求2所述的生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在于，首先，在 番茄育苗期，在育苗土中接种地表球囊霉G.v;再次，在移栽期、苗期以及开花坐果期，分3 次接种所述枯草芽孢杆菌BS。5. 根据权利要求4所述的复合微生物菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在 于，所述G.V的接种剂量为1000-5000IPU/株；所述BS接种剂量为发酵液109cfu/ml， 200-500ml/株。6. 根据权利要求5所述的复合微生物菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在于， 所述G.V的接种剂量为2000IPU/株；所述BS接种剂量为发酵液109cfu/ml，200ml/株。7. 根据权利要求4所述的的复合微生物菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在 于，所述移栽期为番茄发育至3-4叶时可定植时期；苗期为番茄定植后发育至4-5叶阶段； 开花坐果期为番茄发育至一花一果期。
【专利摘要】本发明涉及农作物防病治病技术领域，特别涉及一种防治番茄根结线虫病的复合微生物菌剂及其应用，本发明将番茄共生AM真菌(地表球囊霉)与植物根围促生细菌PGPR(枯草芽孢杆菌)共用，利用二者的协同增效作用，与一般单一菌剂或菌素的防治效率相比，本发明防治率达到60-70％，高于单一菌剂或菌素的防治率。同时，施用本复合菌剂的番茄植株根系发达，尤其是须根系较多，这有效增加了番茄的吸收面积。
【IPC分类】C12N1/20, C12N1/14, C12R1/645, A01N63/02, A01N63/04, A01P5/00, C12R1/125
【公开号】CN104894011
【申请号】CN201510250255
【发明人】刘润进, 唐超, 李敏
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农作物防病治病技术领域，特别涉及一种防治番茄根结线虫病的复合 微生物菌剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 根结线虫病是由根结线虫（Meloidogyne spp.)引起的一类世界性的重要植物线 虫病害，是当前保护地蔬菜（番茄、黄瓜、南瓜、青椒等）重要病害之一，广泛分布于世界各 地。目前，国际上报道的根结线虫有90多种，主要寄生在蔬菜、粮食作物、经济作物、果树植 物及杂草等3000多种寄主上，温带、亚热带、热带地区的植物受害尤其严重。据2000年的 统计，全世界每年因线虫为害给粮食和纤维作物造成的损失约为12. 7%，对蔬菜、花生、烟 草和某些果树造成的损失超过20%。线虫已成为植物的一类重要病原物，线虫病害已成为 农林生产上的重要问题。随着保护地蔬菜生产面积的增加，特别是日光温室的大面积推广 以来，复种指数增加，加之重茬严重，导致根结线虫危害日趋严重，一般减产10%左右，严重 的高达75%以上。
[0003] 目前根结线虫病的防治措施主要分为化学农药防治、物理防治和生物防治。对于 根结线虫的防治，其中化学农药防治是目前应用最为普遍的农业措施，通常采用卤代烃类 化合物、异硫氰酸甲酯类、有机磷类和氨基甲酸酯类化合物，这些化合物能够杀死或麻痹根 结线虫，但是其缺点是显而易见的，能导致线虫抗药性增强、虫口密度上升、污染环境、杀伤 天敌、农药残留、病虫菌的抗药性增强、威胁人类健康等。除了化学农药防治方法以外，另 一个应用较广的方法是物理防治，主要有：热力处理、种子淘汰、高频处理、射频处理、高温 闷棚、水肥管理、改良土壤、材料隔离等方法。高温闷棚、热力处理、种子淘汰、高频处理、射 频处理主要是用来处理温室的种子、苗床和苗木，可能需要较长一段休棚期，打乱生产计 划，影响作物生长周期，一般不适用于大田防治线虫。其应用范围有限，防治效果一般，有 些需要特殊的仪器设备，增加生产成本。所以除继续探索一些化学和物理防治根结线虫的 有效方法外，对根结线虫的生物防治应越来越重视。根结线虫生防资源包括食线虫真菌 (Nematophagous fungi)、细菌（bacteria)、放线菌（Actinomycetes)、病毒（Virus)、立克 次氏体（Rickettsia)、原生动物（Protozoa)、水熊（Tardigrade)、扁虫（Turbellarians)、 螨类（Mites)、跳虫（Collembola)、Enchytraids 以及捕食性线虫（Predacious nematodes) 等。其中较常见有淡紫拟青霉素、厚坦孢普奇尼亚霉、阿维菌素、芽孢杆菌等，防治效率在 40%-60%左右，其防治根结线虫的效果较好，但是作用菌株单一，导致生防机制单一，无菌 株间的协同增效作用，不能进一步提高防治效率。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种防治番茄根结线虫病的复合微生物 菌剂及其应用，将番茄共生丛植菌根（AM)真菌与植物根围促生细菌（PGPR)共用，利用二者 的协同增效作用，提高根结线虫的防治效率。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] -种复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉（Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0007] 其中，地表球囊霉G. V为AM真菌的一种，与植物共生，购自青岛农业大学菌根技术 研宄所。
[0008] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, BS)属于芽孢杆菌属，是一种植物根围促生细 菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，购自中国普通微生物菌种保藏管理 中心，菌株编号为BS 1.936。
[0009] 植物根围促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由 生活在土壤或附生于植物根围的一类具有固氮、解磷、产生植物激素或分泌抗生素、促进植 物生长的有益细菌。国内外大量试验表明，接种PGPR于农作物根围能调节土壤微生物区 系平衡状况，同时在植物根围形成一个生物屏障，阻止病原物的定殖和侵入、促进植物生 长。其生防机制概括起来主要集中于以下几个方面：PGPR与病原物竞争水分、养分和定殖 位点；分泌噬铁素，与病原物竞争铁离子；有些微生物产生抗生素；诱导植物产生系统抗性 等。PGPR能在根围发生发展是理想的生防因子之一，在当前和今后植物土传病害生物防治 中具有很大应用潜力。
[0010] AM真菌是一类植物活体营养专性共生菌，存在于陆地各生态环境中，与绝大多数 植物建立互惠共生关系，地球上90 %的维管植物都能形成AM。菌根的有益作用主要体现 在：扩大植物根系的吸收面积；增加植物对磷及其它多种矿质元素的吸收和利用，改善营 养状况；改变植物内源激素的平衡状况，从而促进植物萌发、生根和生长；提高植物抗病性 和抗逆性；促进作物生长、提高产量、改善品质。
[0011] AM真菌和PGPR之间至少存在3种关系：即相互促进、相互竞争和互不影响。而AM 真菌、PGPR和寄主植物的种类、环境条件则决定了这些相互作用的性质。而且，发生相互作 用的AM真菌与PGPR之间具有高度的专一性。AM真菌与PGPR于根围进行着一系列有利于 植物生长和健康以及土壤肥力的相互作用，尤其是它们之间的协同作用对植物和土壤具有 十分重要的生理和生态效应。
[0012] 采用上述的复合微生物菌剂制备的防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0013] 所述生防菌剂产品在防治番茄根结线虫方面的应用。
[0014] 采用上述生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中 接种地表球囊霉G. V ;再次，移栽期、苗期以及开花坐果期分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS。
[0015] 在以上方案的基础上，所述G. V的接种剂量为1000-5000IPU/株；所述BS接种剂 量为发酵液 109cfu/ml，200-500ml/ 株?次。
[0016] 优选的，所述G. V的接种剂量为2000IPU/株；所述BS接种剂量为发酵液IO9Cfu/ ml，200ml/ 株?次。
[0017] 其中，所述移栽期为番茄发育至3-4叶时可定植时期；苗期为番茄定植后发育至 4-5叶阶段；开花坐果期为番茄发育至一花一果期。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 1、防治效率较高：与一般单一菌剂或菌素的防治效率相比，AM真菌和内生细菌互 作具有明显的协同增效作用，防治率达到60-70%，二者具有更广泛的抑制根结线虫机理， 高于单一菌剂或菌素的防治率。这与两种菌剂协同增效作用及作用机理广泛有密切关系。
[0020] 2、促进番茄根系的发育，提高产量：施用本复合菌剂的番茄植株根系发达，尤其是 须根系较多，这有效增加了番茄的吸收面积。
[0021] 3、本发明的防治方法具有对环境安全、有利于人类健康、不杀伤天敌、无残留、病 虫菌不易产生抗药性、有利于植物根系的发育、不需要特殊设备、无需休棚期、降低化学农 药对番茄根系的损伤和抑制等优点。使用混合菌剂的费用相对较低，远远低于常用土壤熏 蒸剂溴甲烷等，且无须像施用溴甲烷等采用特殊的加热汽化设备，可以节省大量支出。两种 菌剂施于土壤，不会在果实中残留，安全有效。达到既能够防治根结线虫病害、保护并促进 番茄根系生长，又增加产量，减少农药污染等作用。
[0022] 本发明通过盆栽试验和大田试验获得联合接种AM真菌和PGPR对番茄根结线虫病 的抑制效果，得出如下结论：
[0023] 盆栽试验显示：联合接种AM真菌菌株G. V和PGPR菌株BS能有效抑制番茄根结线 虫病。与单接种G. V和BS相比，联合接种处理组根结线虫发病率、病情指数和单株根结数 都远小于单接种处理组，防效达到74% ;且根结线虫繁殖体 数如根内二龄幼虫数、根内雌虫 数、根内线虫总数、卵囊数和单个卵囊含卵量都远低于单接种处理组，可见联合接种G. V和 BS能有效抑制番茄根结线虫病。其部分抑制机理是通过抑制根结线虫二龄幼虫的侵染及提 高番茄自身抗性酶活性来达到抑制根结线虫病的作用，28天时对照组根结线虫侵染率是联 合接种处理组的4. 15倍；联合接种处理组POD、SOD、CAT等抗性酶活性会普遍高于未接种 组和单接种处理组，各种抗性酶活性和活性物质含量呈现一定规律变化，一般根系酶活性 和活性物质含量先发生变化，叶片迟后变化。不同活性物质出现峰值的时间和变化规律不 同。
【具体实施方式】
[0024] 本发明的【具体实施方式】如下：
[0025] 实施例1 :
[0026] 本发明涉及的复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0027] 采用上述复合微生物菌剂制备防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0028] 生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中接种地表 球囊霉G. V，接种剂量为2000IPU/株；再次，在番茄3-4叶时移栽期、苗期以及开花坐果期， 分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS，BS接种剂量为发酵液浓度为10 9cfu/ml，200ml/株。枯 草芽孢杆菌的接种方法为在番茄根围打4个小孔，采用灌根法接种。
[0029] 实施例2 :
[0030] 本发明涉及的复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0031] 采用上述复合微生物菌剂制备防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0032] 生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中接种地表 球囊霉G. V，接种剂量为1000IPU/株；再次，在番茄3-4叶时移栽期、苗期以及开花坐果期， 分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS，BS接种剂量为发酵液浓度为10 9cfu/ml，500ml/株。枯 草芽孢杆菌的接种方法为在番茄根围打4个小孔，采用灌根法接种。
[0033] 实施例3 :
[0034] 本发明涉及的复合微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomus versiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis, BS)组成。
[0035] 采用上述复合微生物菌剂制备防治番茄根结线虫病的生防菌剂。
[0036] 生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，首先，在番茄育苗期，在育苗土中接种地表 球囊霉G. V，接种剂量为5000IPU/株；再次，在番茄3-4叶时移栽期、苗期以及开花坐果期， 分3次接种所述枯草芽孢杆菌BS，BS接种剂量为发酵液10 9cfu/ml，300ml/株。枯草芽孢 杆菌的接种方法为在番茄根围打4个小孔，采用灌根法接种。
[0037] 实验例：
[0038] (一）盆栽条件下接种G. v+BS对番茄根结线虫病的抑制作用及其作用机理
[0039] 1、试验方法
[0040] (Glomus versiforme，G. V)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)BS、南方根结线 虫（M. incognita Chitwood，Mi)，根结线虫采自番前根结线虫病病株根系，经青岛农业大学 植物病理研宄室鉴定为南方根结线虫。
[0041] 试验分 8 个处理：CK，Mi，G. v，G. v+Mi，BS、BS+Mi，G. v+BS 和 G. v+BS+Mi。播种时接 G. V混合接种物5000IPU，移栽时接BS发酵液109cfu/ml IOml，移栽时接根结线虫二龄幼虫 500条/株。各处理除了接种相应的接种物外，再接等量的其他灭菌接种物，以保持各处理 组的一致性。
[0042] 供试番茄种子2% NaClO灭菌后播种于黑色营养钵内（土壤和沙比例为2:1)，待 番茄苗长至3叶期时，移栽入花盆内。每盆2株，每处理20盆作为一个试验小区，每小区随 机取5株进行各指标测定。
[0043] G. v、BS和Mi接种方法、BS发酵液的制备方法及番茄苗管理方法等见下。
[0044] 接种AM真菌：于黑色营养钵内装入栽培土（土壤和沙比例为2:1)中混入5000接 种势单位（IPU)的AM真菌菌剂，对照则加入等量的灭菌混合接种物，以保持相同的其它根 围微生物区系。每钵栽入2株番茄幼苗（1叶期）。正常管理。
[0045] 根结线虫卵悬液的制备：从感染根结线虫的番茄根部挑取新鲜卵块，用2% NaClO 溶液剧烈震荡2min，500目筛回收卵，无菌水冲洗几遍，用无菌水稀释成600卵/ml。
[0046] PGPR发酵液的制备：将10 μ 1菌种接到装有50ml液体培养基250ml三角瓶中， 30°C、130rpm/min震荡培养48h。以比池法分别稀释至10 9cfu/ml。
[0047] 接种Mi及PGPR :番茄3-4叶期移栽到直径20cm的花盆中，每盆2株，重复6次。 同时在番茄根围打4个小孔，采用灌根法（表层和深层结合）接种Mi 5ml和PGPR 10ml。 根据培养基质肥力水平和植株生长需要可在中后期适当补充30%的Hoagland营养液。其 他常规管理。
[0048] 2、测定指标和方法
[0049] 分别于移栽后0、2、4、7、14、21、28天随机取番茄苗根系和叶样品，置于液氮中冷 冻，再置于-80 °C保存备用。
[0050] 根结线虫发病情况：防效（％) = (单接种Mi的病情指数一接种G. V及BS的病 情指数）/单接种Mi的病情指数*100%
[0051] 病情指数测定：其病情情况采用0-6级分级标准。0级，无根节形成；0. 5级，形成 根结的根系数量占根系总数的10%以下，根结较小，根系发育几乎没有影响；1级，形成根 结的根系数量占根系总数的10%以下，根结较大，有根须团形成；2级，形成根结的根系数 量占根系总数的10%至20%，根结中等，又较明显的根须团；3级，形成根结的根系数量占 根系总数的20%至50%，部分根结会聚形成明显的根系膨大；4级，形成根结的根系数量占 根系总数的50%至70%，大部分根结会聚形成明显的根系膨大；5级，形成根结的根系数量 占根系总数的70%至90%，只有少数的须根系，其余均为根结会聚形成明显的根系膨大；6 级，形成根结的根系数量占根系总数的100 %，无须根系，根系有明显的腐烂症状。分别以以 下公式计算病情指数，发病率和防效：
[0052] 病情指数（％ ) =Σ (各病级X各级株数）X100%八最高病级X总调查株数）
[0053] 根内线虫数量：次氯酸钠一酸性品红染色，将根组织加入适量5. 25% NaClO液，不 断搅拌4min，取出后流水冲洗45S，浸泡于蒸馏水中15min，再将根组织移至另一烧杯，加入 Iml酸性品红溶液，煮沸30S，待冷却用流水冲洗，最后将根组织加入25ml酸性甘油液，褪色 进行镜检。
[0054] 卵囊数：将番茄的根系均匀地切成Icm根段，随机称取lg，记卵囊数。
[0055] 单个卵囊卵数：将大约10个卵囊在5%的次氯酸钠中溶解3min，然后计每个卵囊 的卵数。
[0056] 单株根结数测定：取番茄全部根系，以计数器统计根结数。
[0057] 3、试验结果
[0058] (I) G. V及BS对番茄根结线虫病发病情况的影响
[0059] 表1G. V及BS对番茄根结线虫病发病情况的影响
[0060]
[0061] 表1显示G. V和BS能有效缓解番茄根结线虫病，发病率分别下降23%和50%，病 情指数下降30. 3%和47%，防效达到37. 76%和58. 51%，二者比较，在本试验条件下，BS的 抗病效果更佳；而G. v+BS混合处理组表现出较好的协同作用优势，发病率、病情指数防效 均高于单接种处理组。
[0062] ⑵G. V及BS对根结线虫繁殖体的影响
[0063] G. V和BS能有效缓解番茄根结线虫病，而且根内线虫总数、卵囊数和单个卵囊含 卵量等根结线虫繁殖体指标也有所下降（表2)，显著低于Mi处理组。G. v+BS混合处理组 与单接种处理组比能更有效降低根内二龄幼虫数（22. 2个/g)、根内雌虫数（50. 6个/g)、 根内线虫总数（72. 8个/g)、卵囊数（20. 0个/g)和单个卵囊含卵量（333. 2个），减少根结 线虫二龄幼虫侵染率，降低其有效繁殖率。
[0064] 表2G. v及BS对南方根结线虫繁殖体的影响
[0065]
[0066] 注：表中不同字母表示不同处理在p = 0. 01水平上差异显著。
[0067] (3)不同处理南方根结线虫侵染速率
[0068] 从表3可以看出，随着时间的推移G. v、BS单接种处理组和混合接种组根结线虫侵 染速率逐渐下降，移栽后14天时下降明显，而Mi处理组相反，在移栽后14天根结线虫侵染 速率增加很快，接近最大侵染速率，结果表明番茄共生菌G. V和内生菌BS在移栽后14天左 右对根内根结线虫的繁殖活动和侵染过程有明显抑制作用；G. v+BS混合接种组根结线虫 侵染速率在各时段显著低于其他处理组，28天时仅为0. 826, Mi处理组、G. V处理组和BS处 理组分别是其4. 16倍、1. 49倍和1. 85倍。
[0069] 表3不同处理南方根结线虫侵染速率（％ day)
[0070]
[0071] (4)接种G. v+BS对番茄抗性酶的影响
[0072] 植物在逆境条件下会通过提高自身抗性来抵御不良因素，提高抗性酶活性、活性 物质含量，降低有害物质的生成等。根结线虫对番茄根部的侵染同样会引起番茄根和叶的 相应反应，由下表可知，接种根结线虫处理组POD、SOD、CAT等抗性酶活性会普遍高于未接 种组，而单接种Mi处理组会随着根结线虫的侵染，各种抗性酶活性和活性物质含量呈现一 定规律变化，一般根系酶活性和活性物质含量先发生变化，叶片迟后变化。不同活性物质出 现峰值的时间和变化规律不同。
[0073] 1)接种G. v+BS对番茄根和叶过氧化物酶（POD)的影响
[0074] 由表4-5可知，各处理组POD活性随着移栽后天数的增加呈现一定规律变化，接种 Mi处理组要普遍高于相应的未接种Mi处理组；移栽后番茄根系POD活性在第7天出现一 次较明显变化，之后CK处理组POD活性有所增长，但是变化曲线平缓，接种BS处理组在第 7天时高于CK处理组，接种G. V和G. v+BS混合接种组在移栽后4天时即明显高于CK和BS 处理组，14天时达到峰值，分别为66. 29 ( Λ OD47tl .miiT1 · g-1)和57. 25 ;接种Mi后，各处理 组变化趋势与未接种Mi处理组接近，但是前者明显高于后者，而且在第28天时出现第二次 峰值，这可能与根结线虫的二次侵染有一定的关系；番茄叶片POD活性也在第7天出现明显 变化，但是峰值不明显，各种侵染因素对番茄叶片POD活性影响不大，接种Mi处理组也在28 天明显升高。
[0075] 表4不同处理番前根POD活性（Λ OD47tl · mirT1 · g_〇
[0076]
[0077] 表5不同处理番茄叶POD活性（Λ OD47tl · min-1 · g-1)
[0078]
[0080] 2)接种G. v+BS对番茄根和叶过氧化氢酶（CAT)的影响
[0081] 由表6-7可知，番茄根系和叶片CAT活性随着移栽天数的增加变化明显。未接种 Mi处理组中，CK处理组根系CAT活性变化不明显，呈现较平缓的变化曲线，而且在第7天 后略有下降，但是接种BS、G. V和G. v+BS混合接种处理组均能够明显提高根系CAT活性， 其中G. V和G. v+BS混合接种处理组接近，在第7天和第21天出现两个峰，而BS 51-3第 7天以后逐渐下降；接种Mi处理组普遍高于未接种处理组，各组变化趋势接近，也是在第 7天和第21天时出现两个峰值，仍然是G. V和G. v+BS混合接种处理组高于其他处理组， 第7天的峰值分别为3. 868和4. 063 ( Λ OD24tl · mirr1 · g_〇，第21天峰值分别为3. 563和 3. 766 ( Λ OD24tl · HiirT1 · g_〇。番茄叶片CAT活性变化趋势不同于根系，只有一个峰值，出现 在第7天，最高为G. v+BS混合接种处理组，与此不同的是Mi处理组和BS+Mi处理组，峰值 出现在第14天，说明Mi的侵染与G. V和BS的侵染会相互作用，综合侵染结果十分复杂。
[0082] 表6不同处理番茄根CAT活性（Λ OD24tl · miiT1 · g-1)
[0083]
[0084] 表7不同处理番茄叶CAT活性
[0085]
[0087] 3)接种G. v+BS对番茄根和叶超氧化物歧化酶（SOD)的影响
[0088] 由表8-9可知，Mi、G. V和BS的侵染对番茄根系和叶片SOD活性有一定影响。根 系SOD活性变化最明显的是移栽后7天，不接种Mi处理组中，CK变化不明显，BS处理组在 第4天根系SOD活性升高后第7天又下降，之后缓慢上升，与之不同的是G. V和G. v+BS混 合接种处理组第7天出现峰值，分别为977. 86U · g4和1035. 14U · g Λ是对应CK处理组的 1. 26和1. 33倍，之后缓慢下降。叶片SOD活性变化趋势与根系基本相同，叶片SOD活性明 显高于根系SOD活性。接种Mi处理组变化幅度小于不接种处理组。
[0089] 表8不同处理番茄根SOD活性（U · g-1)
[0090]
[0091] 表9不同处理番茄叶SOD活性（U · g_〇
[0092]
[0094] (二）G. V和BS接种剂量和接种时机对番茄根结线虫的抑制作用
[0095] 1、G. V接种剂量对番茄苗定植前AM真菌侵染率的影响
[0096] (1)试验设计
[0097] 共设置4个处理：对照组（CK)、分别接种G. V 500、1000、2000和5000IPU处理组。 各处理组播种时接入G. V菌剂。将灭菌催芽番茄种子两粒播于预混AM菌剂的育苗土中，每 钵2株，每处理6盆，正常管理。待番茄苗长至3-4叶期时取样测定菌根侵染率。
[0098] (2)菌根侵染率测定方法
[0099] 将根段切成0. 5~1.0 cm的小段，加入10% KOH溶液透明，放入90 °C水浴锅中 15-20min。去掉碱液，用自来水冲洗根系3次，再加入2%的HCl溶液酸化5min。去掉酸液 后加入酸性品红（0. 1% )乳酸甘油染色液（乳酸875ml，甘油63ml，蒸馏水63ml，酸性品 红0.1 g)，室温下过夜。加入乳酸分色后即可镜检。
[0100] 菌根侵染率（％ )= Σ (0 % X根段数+10 % X根段数+…+100 % X根段 数）XlOO% /总根段数
[0101] (3)结果
[0102] 表10接种不同剂量G. V番茄苗的菌根侵染率
[0103]
[0104] 2、BS接种剂量、接种时机及接种次数对番茄根结线虫病的抑制作用
[0105] (1)试验设计
[0106] BS接种浓度对番茄根结线虫病的抑制作用：共设置6个处理，分别为CK、BS发 酵原液、2倍稀释液、5倍稀释液、10倍稀释液和20倍稀释液处理组。移栽时每株接菌剂 200ml〇
[0107] BS接种剂量对番茄根结线虫病的抑制作用：AM真菌接种剂量为2000IPU/株，BS 接种发酵原液，接 种剂量分别为（每株）：Oml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml。
[0108] BS接种次数及接种时机对番茄根结线虫病的抑制作用：AM真菌接种剂量为 2000IPU/株，BS接种发酵原液，接种剂量为200ml/株，接种次数及接种时机分为11个处理 组：CK、移栽、苗期、开花坐果期、结果期、移栽+苗期、移栽+开花坐果期、移栽+结果期、移 栽+苗期+开花坐果期、移栽+苗期+结果期、移栽+开花坐果期+苗期。
[0109] (2)试验方法
[0110] 各处理组播种时接入G. V菌剂2000IPU。将灭菌催芽番茄种子两粒播于预混AM菌 剂的育苗土中，每钵2株，重复6次。待番茄苗长至3-4叶期移栽入花盆，同时按照BS接种 浓度、接种剂量和接种次数灌根接种菌剂。其余正常管理。
[0111] 接种后60天，测定各处理组番茄根系根结线虫病发病率病情指数及防效。
[0112] (3)结果
[0113] 表1lBS发酵液浓度对番茄根结线虫病的抑制效果
[0114]
[0115] 表12BS菌剂接种剂量对番茄根结线虫病的抑制效果
[0116]
[0117] 表13BS菌剂接种时机和接种次数对番茄根结线虫病的抑制效果
[0118]
[0119]
[0120] (三）保护地接种G. v+BS对番茄根结线虫病的抑制作用
[0121] 1、试验设计
[0122] 共设置3个处理：对照组（CK)、噻唑膦处理组和G. v+BS处理组。G. v+BS处理组播 种时接入G. V菌剂，移栽时接入BS发酵原液；噻唑膦处理组移栽时施噻唑膦农药（有效成 分10 %，生产厂家为日本石原产业株式会社，药效为4-5个月）。
[0123] 2、番茄保护地选择
[0124] 选取根结线虫发病较重的番茄大棚，位于山东省烟台市海阳市行村镇东村庄村 (东经120° 50,北炜36° 16)，大棚使用年限为13年，重茬连作番茄，一年两茬。试验时间 为2013年8月至2014年1月，上茬番茄根结线虫病发病较重较普遍，最高病级达到5级， 发病率约75%。
[0125] 3、育苗与G. V接种
[0126] 番茄种子经75%乙醇5min、2%NaC10 20min灭菌，催芽后播于5X5黑色穴盘内， 1株/穴。栽培土为土壤和育苗基质（体积比1:1)混合物，G. v+BS处理组接入2000IPU的 G. V菌剂，对照组和噻唑膦处理组接入等量的灭菌混合接种物。正常管理。
[0127] 4、定植
[0128] 将3-4叶期番茄苗移栽入番茄大棚，株距20cm，行距50cm，每个处理100株。 G. v+BS处理组第一次移栽期灌根接入BS发酵原液200ml/株；噻唑膦处理组移栽前以 1500g/亩的剂量土壤撒施噻唑膦农药，与上层土壤混匀后移栽番茄苗。待BS发酵液渗入土 壤后稍干，垄沟灌水。其余正常管理。
[0129] 5、取样
[0130] 定植后15天苗期第一次取样，将番茄根系及根围土壤一起挖出，尽量不损伤根 系。取样后G.v+BS处理组苗期第二次灌根接入，培土后再接入100mL/株。移栽后35天开 花坐果期第二次取样，取样后第三次灌根接入BS发酵原液200ml/株，移栽后75天结果期 第三次取样。
[0131] 6、结果
[0132] 3. 2. 2G. v+BS及噻唑膦对番茄根结线虫病的抑制作用
[0133] G. v+BS及噻唑膦对植物生长发育的影响不同，对番茄根结线虫病的防治效果也不 同。CK对照组根结线虫病发病最严重，发病率最高达84. 38 %，病情指数最高为0. 448, 75天 取样时单株根结数平均为234. 63个/株；噻唑膦农药能够强烈抑制根结线虫病，仅在个别 植株发现少量根结，发病率小于10%，定植35天和75天时病情指数分别为0. 053和0. 038， 3次取样防效分别为100%、85. 24%和91. 52%;G. v+BS混合接种处理组也能有效抑制番茄 根结线虫病，发病率在20-30 %之间，病情指数最低为0. 096,单株根结数小于40个/株，防 效最高为78. 57%。
[0134] 表14不同处理番茄根结线虫病单株根结数（个）
[0135]
[0136] 表15不同处理番茄根结线虫病发病率（％ )
[0137]
[0138] 表16不同处理番茄根结线虫病病情指数（％ )
[0139]
[0140] 表17不同处理番前根结线虫病防效（％ )
[0141]
[0142] 表18不同处理番前根长（cm)
[0143]
[0144] 表19不同处理番前根鲜重（g)
[0145]
[0146] 7、噻唑膦类杀线虫农药的危害
[0147] 噻唑膦是一种国际常用杀线虫药剂，能预防和治疗各类作物根结线虫、根腐（短 体）线虫、胞囊线虫、茎线虫等。其优点是治效率较高，持续时间较长。其危害主要是噻唑 膦通过植物体吸收，除了能够杀灭各种病虫，对植物及人体可能具有一定毒性，研宄表明一 定剂量噻唑膦可能导致根长、根鲜重都明显小于对照，根系活力较低；以大鼠为模型的动物 试验也表明高剂量噻唑膦导致甘油三酯、总蛋白、白蛋白、总胆红素、肌酐、血糖、胆碱酯酶 活性等明显低于对照组。本实验也提出正常剂量根系施用噻唑膦会抑制番茄根系发育，导 致根长、根鲜重等下降，须根发育不良，妨碍植物正常生长等情况。见表18-20。
[0148] 表20不同处理番前侧根鲜重（g)
[0149]
【主权项】
1. 一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂的活性成分由地表球囊霉 (Glomusversiforme，G.v)和枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis,BS)组成。2. 采用权利要求1所述的复合微生物菌剂制备的防治番茄根结线虫病的生防菌剂。3. 权利要求2所述生防菌剂产品在防治番茄根结线虫方面的应用。4. 采用权利要求2所述的生防菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在于，首先，在 番茄育苗期，在育苗土中接种地表球囊霉G.v;再次，在移栽期、苗期以及开花坐果期，分3 次接种所述枯草芽孢杆菌BS。5. 根据权利要求4所述的复合微生物菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在 于，所述G.V的接种剂量为1000-5000IPU/株；所述BS接种剂量为发酵液109cfu/ml， 200-500ml/株。6. 根据权利要求5所述的复合微生物菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在于， 所述G.V的接种剂量为2000IPU/株；所述BS接种剂量为发酵液109cfu/ml，200ml/株。7. 根据权利要求4所述的的复合微生物菌剂防治番茄根结线虫病的方法，其特征在 于，所述移栽期为番茄发育至3-4叶时可定植时期；苗期为番茄定植后发育至4-5叶阶段； 开花坐果期为番茄发育至一花一果期。
【专利摘要】本发明涉及农作物防病治病技术领域，特别涉及一种防治番茄根结线虫病的复合微生物菌剂及其应用，本发明将番茄共生AM真菌(地表球囊霉)与植物根围促生细菌PGPR(枯草芽孢杆菌)共用，利用二者的协同增效作用，与一般单一菌剂或菌素的防治效率相比，本发明防治率达到60-70％，高于单一菌剂或菌素的防治率。同时，施用本复合菌剂的番茄植株根系发达，尤其是须根系较多，这有效增加了番茄的吸收面积。
【IPC分类】C12N1/20, C12N1/14, C12R1/645, A01N63/02, A01N63/04, A01P5/00, C12R1/125
【公开号】CN104894011
【申请号】CN201510250255
【发明人】刘润进, 唐超, 李敏
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
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