轴向海山盐单胞菌及其在降解十溴联苯醚中的应用
轴向海山盐单胞菌及其在降解十溴联苯醚中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物应用领域，具体是涉及轴向海山盐单胞菌及其在降解十溴联苯 醚中的应用。
【背景技术】
[0002] 多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一系列含溴原子的芳 香族化合物。根据苯环上溴原子的个数和位置的不同，多溴联苯醚总共有209种同分异 构体，其最大的用途是作为阻燃剂被添加到复合材料中以提高防火特性。目前，PBDEs已 被广泛用于电子电器设备、自动控制设备、建筑材料和纺织品等商品化产品。商业上主要 使用3种含溴阻燃剂：五溴联苯醚（penta-BDE)、八溴联苯醚（octa-BDE)和十溴联苯醚 (deca-BDE)。五溴联苯醚（penta-BDE)和八溴联苯醚八溴联苯醚（octa-BDE)持久且广泛 地存在于环境、生物机体甚至人体血液和乳汁中，对生态环境和人体健康构成潜在的危害， 在欧州及美国的某些地区已经停止对二者的使用。
[0003] 十溴联苯醚（deca-BDE)由于其具有阻燃性能好、制造工艺成熟、热稳定性好、 价格适中以及低毒性等优点，仍然是市场上需求量较大的一类阻燃剂。十溴联苯醚 (deca-BDE)作为一种添加型阻燃剂，是以物理方式结合在产品上的，因此在生产、使用、处 置过程中易释放到环境中。目前在空气、土壤、水体和沉积物以及生物圈都有检测到十溴联 苯醚（deca-BDE)，分布范围遍及全球，甚至在远在北极地区的北极熊体内也有检测到。而且 其在环境中的浓度在过去的几十年内迅速增长。
[0004] 十溴联苯醚（deca-BDE)与持久性有机物类似，具有难降解、高脂溶性、生物放大 作用等特征，可通过食物网转移，使处于高营养级的生物受到严重的毒害，最终危害人体健 康。近年来有动物实验研宄结果显示十溴联苯醚（deca-BDE)可对内分泌系统和免疫调节 过程产生影响：新生小鼠暴露于十溴联苯醚（deca-BDE)可影响其成年期自主行为和类胆 碱系统敏感性，在非生物环境中和部分生物体内，十溴联苯醚（deca-BDE)可发生脱溴反应 生成低溴代联苯醚（Tetra-NonaBDEs)，或转化成羟基PBDEs和甲氧基PBDEs，低溴代联苯醚 生物利用度更高毒性更大，会引起一系列由于激素失调和肝功能紊乱的慢性病。十溴联苯 醚（deca-BDE)已经被美国环保局（EPA)归类为潜在致癌物质，其造成的潜在健康影响不容 忽视。
[0005] 目前关于十溴联苯醚好氧降解的研宄较少。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71。
[0007] 本发明的另一目的在于提供轴轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71在降解十溴联苯醚中的应用。
[0008] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71，已于 2015 年 4 月 8 日保 藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072,保藏中心保藏编 号为 CCTCC NO. M 2015211。
[0009] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71是由采集于西南 印度洋的大洋表层沉积物（E70. 04°，S25. 32 ° )中分离筛选的，属于盐单胞菌科 (Halomonadaceae);该菌株的富集筛选采用等浓度添加污染物作为其生长的唯一碳源，在 人工海水培养基 MMC (NaCl 24g/L，NH4NO3 lg/L，KCl 0.7g/L，KH2PO4 2. Og/L，Na2HPO4 3. Og/ L，pH 7.4，MgS04 7g/L)中加入十溴联苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素 （CaCl 2mg/L， FeCl3 · 6H20 50mg/L，CuSO4 0· 5mg/L，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg/L，ZnSO4 ·· 7H20 10mg/L)，十溴联 苯醚浓度为100mg/L，pH7. 4。该菌落为圆形，边缘规则整齐，乳白色，光滑，湿润，凸起；菌体 呈微杆状，革兰氏染色阴性。
[0010] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71可在降解十溴联苯酿中应 用。
[0011] 降解十溴联苯醚的方法可为：将轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71接种于十溴联苯醚为唯一碳源的液体培养基中，避光条件下置于摇床中富集培 养。
[0012] 十溴联苯醚降解培养基DM(Degradation Medium)是人工海水培养基MMC(NaCl 24g/L，NH4NO3 lg/L，KCl 0.7g/L，KH2PO4 2. Og/L，Na2HPO4 3. Og/L，pH 7. 4,MgSO4 7g/L)中加 入十溴联苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素 （CaCl 2mg/L，FeCl3*6H20 50mg/L，CuS04 0.5mg/ L，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg/L，ZnSO4 ·· 7H20 10mg/L)，十溴联苯醚浓度为 50mg/L，ρΗ7· 4。
[0013] 所述降解的条件为pH7. 4,温度为28°C，摇床的转动速率为160rpm。
[0014] 所述十溴联苯醚降解培养基中十溴联苯醚为唯一碳源。
[0015] 培养物经GC-MSD测定，可分析轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71对十溴联苯醚的降解效果，在以十溴联苯醚为唯一碳源的情况下，轴向海山盐单 胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71对十溴联苯酿具有一定的降解作用。
[0016] 本发明的有益效果如下：
[0017] 本发明的轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71 在 ρΗ7· 4, 28°C， 摇床的转动频率为160rpm，在以十溴联苯醚为唯一碳源的降解培养基中培养8天，该菌对 十溴联苯醚的降解率达到87%。
[0018] 本发明以大洋深海底泥为富集样品，筛选、分离高效的十溴联苯醚好氧降解菌，并 应用于十溴联苯醚降解的研宄。本发明对于拓宽BDE-209的降解途径具有重要的科学意义 和应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1为基于SWIR-CL71菌株的16S rRNA序列所构建的系统发育树。
[0020] 图2为BDE-209甲苯-异辛烷混合溶液（v/v = 1 : 9)标准溶液总离子流色谱图。
[0021] 图 3 为 BDE-209 特征图谱（m/z)。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0023] 实施例一
[0024] 一、轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71的分离和鉴定
[0025] 1、轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71的富集、分离和纯化 [0026] 培养基：
[0027] 人工海水培养基（MMC):每升培养基中含有NaCl 24g，NH4N03 lg，KCl 0. 7g，KH2P04 2. 0g，Na2HPO4 3. 0g，pH 7· 4, MgSO4 7g (灭菌后加入）。
[0028] 微量元素盐溶液：每升微量元素盐溶液中含有CaCl 2mg，FeCl3 · 6H20 50mg，CuSO4 0· 5mg，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg，ZnSO4 ·· 7H20 10mg。
[0029] 海生菌琼脂2216培养基和海生菌肉汤2216培养基购买于碧迪医疗器械（上海） 有限公司。
[0030] 十溴联苯醚母液：有机溶剂为二氯甲烷，十溴联苯醚浓度为lg/L。
[0031] 本发明的轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71是从西南印度洋 的表层沉积物经富集、分离、纯化而得。
[0032] 样品富集及单菌株分离纯化方法：取3~5g沉积物样品添加于含有IOOmL培养 基（人工海水培养基+微量元素盐溶液）的250mL的三角烧瓶中，加入十溴联苯醚作为菌 株生长所需要的唯一碳源，浓度为l〇〇mg/L。把三角烧瓶用锡箔纸做避光处理，置于28°C、 160rpm摇床中震荡培养。震荡培养分4个阶段，每阶段的时间为4w，4个阶段的不同之处 为在第一阶段的富集培养基中加入5mL海生菌肉汤2216培养基，为菌体生长提供丰富的营 养物质，而第二、三、四阶段未添加该培养基。取ImL上一阶段的富集培养液作为下一阶段 的菌种来源接种到新的培养基中。待第四阶段富集培养结束后，取ImL第四阶段的富集培 养液，用无菌超纯水进性10倍梯度稀释，然后取1〇_ 5~10 _7倍的稀释液涂布于海生菌琼脂 2216平板培养基上。涂布后的平板置于28°C恒温培养箱中避光培养5天，从平板上挑出不 同形态的单菌落，在海生菌琼脂22 16十溴联苯醚平板培养基上划线纯化，收集部分菌体用 于提取DNA，同时保藏菌种。
[0033] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71的获得：100mL培养基（人 工海水培养基+微量元素盐溶液），以十溴联苯醚（50mg/L)为唯一碳源的培养基作为实验 组，不加十溴联苯醚的培养基作为对照组，实验组和对照组设立三个重复组。接入纯化后 的单菌株，使培养基的0D600值在0. 23~0. 25范围内。将接种后的实验组和对照组置于 28°C、160rpm的摇床中震荡培养（培养基做避光处理）。培养5d后，取富集培养液，0D600 条件下测得吸光值。且通过肉眼观察最终获得的十溴联苯醚降解菌株，实验中的编号为 SWIR-CL71。
[0034] 2、菌株的鉴定
[0035] (1)菌体及菌落的形态特征：
[0036] 采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis) SWIR-CL71的细胞为革兰氏阴性，在2216E固体平板培养基上培 养48h，菌落形态为圆形，边缘整齐，乳白色，光滑，湿润，凸起，菌落直径为1~I. 5mm。
[0037] (2)菌体的遗传特征：
[0038] 通过对轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71 的 16S rRNA 序列 测定和在Ez-biocloud网站上进行同源性分析，该序列与模式菌株Halomonas axialensis 八1七1^1(1^?212206的163冰隱序列的同源性达到99.79 %。根据菌株命名法则，菌 株SWIR-CL71被命名为轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR-CL71。基于 SWIR-CL71菌株的16S rRNA序列所构建的系统发育树（如图1)。轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis)SWIR_CL71 的 16S rRNA 序列如下：
[0039] I GCATTTGCGG GCGGCTACAC ATGCAGTCGA GCGGTACAGG TCCAGCTTGC 51 TGGATGCTGA CGAGCGGCGG ACGGGTGAGT AATGCATAGG AATCTGCCCG
[0040]
[0041] 综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列比对结果，本发明中的轴向海山盐 单胞菌属于赤杆菌属，命名为轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71〇
[0042] 实施例二
[0043] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71对十溴联苯醚的降解分 析：
[0044] 人工海水培养基（MMC):每升培养基中含有NaCl 24g，NH4NO3 lg，KCl 0· 7g，KH2PO4 2. 0g，Na2HPO4 3. 0g，pH 7· 4, MgSO4 7g (灭菌后加入）。
[0045] 微量元素盐溶液：每升微量元素盐溶液中含有CaCl 2mg，FeCl3 · 6H20 50mg，CuSO4 0· 5mg，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg，ZnSO4 ·· 7H20 10mg。
[0046] 富集培养基EM(Enrichment Medium):海生菌肉汤2216培养基。
[0047] 十溴联苯醚降解培养基：IOOmL MMC培养基+微量元素。
[0048] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71增殖培养：在无菌的条件 下，将轴向海山盐单胞菌菌株接种到装有500mL海水肉汤培养（2216)的IL的灭菌锥形瓶 中，置于恒温摇床内，28°C、160rpm，培养48h。
[0049] 取富集培养的菌液于500mL的灭菌离心瓶中，在以6000r/min的转速离心10min。 之后用无菌生理盐水反复洗涤并离心2~3次，配成一定浓度的菌悬液，将菌悬液接种到十 溴联苯醚降解培养基中，十溴联苯醚的浓度为50mg/L。锥形瓶用锡纸包裹，避免光照对实验 影响。样品经GC-MS测定，分析轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71对 十溴联苯醚的降解效果。
[0050] GC-MS型号及参数设置：
[0051] 型号：GC-MSD。
[0052] 色谱柱：超高惰性GC毛细管柱，DB-5MS Π (15mX 0. 250_X 0. 25 μ m)、货号 122-5512UI，美国安捷伦公司。
[0053] 仪器工作条件：进样口温度：290°C ;进样方式：脉冲不分流进样；进样体积：I UL ; 流量及模式：lmL/min、恒流模式；四级杆温度：150°C ;离子源温度：250°C ;程序升温：初始 温度 120°C、保持 2min，40°C /min 升到 250°C，10°C /min 升到 310°C，保留 lOmin。
[0054] 十溴联苯醚出峰时间：浓度为50mg/L的十溴联苯醚标准品（购买于中国计量科学 研宄院，标物编号GBW 08709)上机检测，得到十溴联苯醚总离子流图（如图2)，其保留时 间为17. 834。十溴联苯醚的特征离子的质荷比有207、398、797、959等（如图3)，其中选定 398作为定量离子。
[0055] 十溴联苯醚工作曲线制作：配制浓度为30、40、50、60、80mg/L的十溴联苯醚-二 氯甲烷标准溶液，绘制十溴联苯醚浓度-峰面积标准曲线，此标准曲线为7 = 4109.^_ 69881，R2= 0. 9991。
[0056] 轴向海山盐单胞菌对十溴联苯醚的降解率：以不接种轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis)SWIR-CL71的培养基作为对照组，以接种轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis) SWIR-CL71 (接菌量约为3g/L)的培养基作为实验组，实验组和对 照组均设置3个平行样。置于恒温摇床中，28°C、160r/min震荡培养8d。利用GC-MS检测 实验组和对照组中十溴联苯醚并通过十溴联苯醚工作曲线计算出十溴联苯醚的残留量。轴 向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71对十溴联苯酿的8天降解率为87%。
【主权项】
1?轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71，已于2015年4月8日保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCCNO.M2015211。2. 如权利要求1所述轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71的富集 筛选方法，其特征在于采用等浓度添加污染物作为其生长的唯一碳源，在人工海水培养基 MMC中加入十溴联苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素，十溴联苯醚浓度为100mg/L，pH7. 4 ; 该菌落为圆形，边缘规则整齐，乳白色，光滑，湿润，凸起；菌体呈微杆状，革兰氏染色阴性； 所述人工海水培养基MMC的组成为NaCl24g/L，NH4N03lg/L，KCl0? 7g/L，KH2P042.Og/L， Na2HP043.Og/L，pH7. 4,MgS047g/L;所述微量元素包括CaCl2mg/L，FeCl3 ? 6H20 50mg/L， CuSO4O. 5mg/L，MnCl2 ??H2O0? 5mg/L，ZnSO4 ?? 7H20 10mg/L。3. 如权利要求I所述轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71在降解十 溴联苯醚中应用。4. 如权利要求3所述应用，其特征在于所述降解十溴联苯醚的方法为：降解十溴联苯 醚的方法可为：将轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71接种于十溴联苯 醚为唯一碳源的液体培养基中，避光条件下置于摇床中富集培养；降解的条件为PH7. 4,温 度为28°C，摇床的转动速率为160rpm。
【专利摘要】轴向海山盐单胞菌及其在降解十溴联苯醚中的应用，涉及微生物应用领域。轴向海山盐单胞菌(Halomonas axialensis)SWIR-CL71，保藏编号为CCTCC NO.M2015211。轴向海山盐单胞菌(Halomonas axialensis)SWIR-CL71可在降解十溴联苯醚中应用。轴向海山盐单胞菌(Halomonas axialensis)SWIR-CL71在pH7.4，28℃，摇床的转动频率为160rpm，在以十溴联苯醚为唯一碳源的降解培养基中培养8天，该菌对十溴联苯醚的降解率达到87％。CCTCC NO. M201521120150408
【IPC分类】A62D3/02, C12N1/20
【公开号】CN104894016
【申请号】CN201510266347
【发明人】邵宗泽, 王万鹏, 蔡庆涛
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物应用领域，具体是涉及轴向海山盐单胞菌及其在降解十溴联苯 醚中的应用。
【背景技术】
[0002] 多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一系列含溴原子的芳 香族化合物。根据苯环上溴原子的个数和位置的不同，多溴联苯醚总共有209种同分异 构体，其最大的用途是作为阻燃剂被添加到复合材料中以提高防火特性。目前，PBDEs已 被广泛用于电子电器设备、自动控制设备、建筑材料和纺织品等商品化产品。商业上主要 使用3种含溴阻燃剂：五溴联苯醚（penta-BDE)、八溴联苯醚（octa-BDE)和十溴联苯醚 (deca-BDE)。五溴联苯醚（penta-BDE)和八溴联苯醚八溴联苯醚（octa-BDE)持久且广泛 地存在于环境、生物机体甚至人体血液和乳汁中，对生态环境和人体健康构成潜在的危害， 在欧州及美国的某些地区已经停止对二者的使用。
[0003] 十溴联苯醚（deca-BDE)由于其具有阻燃性能好、制造工艺成熟、热稳定性好、 价格适中以及低毒性等优点，仍然是市场上需求量较大的一类阻燃剂。十溴联苯醚 (deca-BDE)作为一种添加型阻燃剂，是以物理方式结合在产品上的，因此在生产、使用、处 置过程中易释放到环境中。目前在空气、土壤、水体和沉积物以及生物圈都有检测到十溴联 苯醚（deca-BDE)，分布范围遍及全球，甚至在远在北极地区的北极熊体内也有检测到。而且 其在环境中的浓度在过去的几十年内迅速增长。
[0004] 十溴联苯醚（deca-BDE)与持久性有机物类似，具有难降解、高脂溶性、生物放大 作用等特征，可通过食物网转移，使处于高营养级的生物受到严重的毒害，最终危害人体健 康。近年来有动物实验研宄结果显示十溴联苯醚（deca-BDE)可对内分泌系统和免疫调节 过程产生影响：新生小鼠暴露于十溴联苯醚（deca-BDE)可影响其成年期自主行为和类胆 碱系统敏感性，在非生物环境中和部分生物体内，十溴联苯醚（deca-BDE)可发生脱溴反应 生成低溴代联苯醚（Tetra-NonaBDEs)，或转化成羟基PBDEs和甲氧基PBDEs，低溴代联苯醚 生物利用度更高毒性更大，会引起一系列由于激素失调和肝功能紊乱的慢性病。十溴联苯 醚（deca-BDE)已经被美国环保局（EPA)归类为潜在致癌物质，其造成的潜在健康影响不容 忽视。
[0005] 目前关于十溴联苯醚好氧降解的研宄较少。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71。
[0007] 本发明的另一目的在于提供轴轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71在降解十溴联苯醚中的应用。
[0008] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71，已于 2015 年 4 月 8 日保 藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072,保藏中心保藏编 号为 CCTCC NO. M 2015211。
[0009] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71是由采集于西南 印度洋的大洋表层沉积物（E70. 04°，S25. 32 ° )中分离筛选的，属于盐单胞菌科 (Halomonadaceae);该菌株的富集筛选采用等浓度添加污染物作为其生长的唯一碳源，在 人工海水培养基 MMC (NaCl 24g/L，NH4NO3 lg/L，KCl 0.7g/L，KH2PO4 2. Og/L，Na2HPO4 3. Og/ L，pH 7.4，MgS04 7g/L)中加入十溴联苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素 （CaCl 2mg/L， FeCl3 · 6H20 50mg/L，CuSO4 0· 5mg/L，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg/L，ZnSO4 ·· 7H20 10mg/L)，十溴联 苯醚浓度为100mg/L，pH7. 4。该菌落为圆形，边缘规则整齐，乳白色，光滑，湿润，凸起；菌体 呈微杆状，革兰氏染色阴性。
[0010] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71可在降解十溴联苯酿中应 用。
[0011] 降解十溴联苯醚的方法可为：将轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71接种于十溴联苯醚为唯一碳源的液体培养基中，避光条件下置于摇床中富集培 养。
[0012] 十溴联苯醚降解培养基DM(Degradation Medium)是人工海水培养基MMC(NaCl 24g/L，NH4NO3 lg/L，KCl 0.7g/L，KH2PO4 2. Og/L，Na2HPO4 3. Og/L，pH 7. 4,MgSO4 7g/L)中加 入十溴联苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素 （CaCl 2mg/L，FeCl3*6H20 50mg/L，CuS04 0.5mg/ L，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg/L，ZnSO4 ·· 7H20 10mg/L)，十溴联苯醚浓度为 50mg/L，ρΗ7· 4。
[0013] 所述降解的条件为pH7. 4,温度为28°C，摇床的转动速率为160rpm。
[0014] 所述十溴联苯醚降解培养基中十溴联苯醚为唯一碳源。
[0015] 培养物经GC-MSD测定，可分析轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71对十溴联苯醚的降解效果，在以十溴联苯醚为唯一碳源的情况下，轴向海山盐单 胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71对十溴联苯酿具有一定的降解作用。
[0016] 本发明的有益效果如下：
[0017] 本发明的轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71 在 ρΗ7· 4, 28°C， 摇床的转动频率为160rpm，在以十溴联苯醚为唯一碳源的降解培养基中培养8天，该菌对 十溴联苯醚的降解率达到87%。
[0018] 本发明以大洋深海底泥为富集样品，筛选、分离高效的十溴联苯醚好氧降解菌，并 应用于十溴联苯醚降解的研宄。本发明对于拓宽BDE-209的降解途径具有重要的科学意义 和应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1为基于SWIR-CL71菌株的16S rRNA序列所构建的系统发育树。
[0020] 图2为BDE-209甲苯-异辛烷混合溶液（v/v = 1 : 9)标准溶液总离子流色谱图。
[0021] 图 3 为 BDE-209 特征图谱（m/z)。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0023] 实施例一
[0024] 一、轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71的分离和鉴定
[0025] 1、轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71的富集、分离和纯化 [0026] 培养基：
[0027] 人工海水培养基（MMC):每升培养基中含有NaCl 24g，NH4N03 lg，KCl 0. 7g，KH2P04 2. 0g，Na2HPO4 3. 0g，pH 7· 4, MgSO4 7g (灭菌后加入）。
[0028] 微量元素盐溶液：每升微量元素盐溶液中含有CaCl 2mg，FeCl3 · 6H20 50mg，CuSO4 0· 5mg，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg，ZnSO4 ·· 7H20 10mg。
[0029] 海生菌琼脂2216培养基和海生菌肉汤2216培养基购买于碧迪医疗器械（上海） 有限公司。
[0030] 十溴联苯醚母液：有机溶剂为二氯甲烷，十溴联苯醚浓度为lg/L。
[0031] 本发明的轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71是从西南印度洋 的表层沉积物经富集、分离、纯化而得。
[0032] 样品富集及单菌株分离纯化方法：取3~5g沉积物样品添加于含有IOOmL培养 基（人工海水培养基+微量元素盐溶液）的250mL的三角烧瓶中，加入十溴联苯醚作为菌 株生长所需要的唯一碳源，浓度为l〇〇mg/L。把三角烧瓶用锡箔纸做避光处理，置于28°C、 160rpm摇床中震荡培养。震荡培养分4个阶段，每阶段的时间为4w，4个阶段的不同之处 为在第一阶段的富集培养基中加入5mL海生菌肉汤2216培养基，为菌体生长提供丰富的营 养物质，而第二、三、四阶段未添加该培养基。取ImL上一阶段的富集培养液作为下一阶段 的菌种来源接种到新的培养基中。待第四阶段富集培养结束后，取ImL第四阶段的富集培 养液，用无菌超纯水进性10倍梯度稀释，然后取1〇_ 5~10 _7倍的稀释液涂布于海生菌琼脂 2216平板培养基上。涂布后的平板置于28°C恒温培养箱中避光培养5天，从平板上挑出不 同形态的单菌落，在海生菌琼脂22 16十溴联苯醚平板培养基上划线纯化，收集部分菌体用 于提取DNA，同时保藏菌种。
[0033] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71的获得：100mL培养基（人 工海水培养基+微量元素盐溶液），以十溴联苯醚（50mg/L)为唯一碳源的培养基作为实验 组，不加十溴联苯醚的培养基作为对照组，实验组和对照组设立三个重复组。接入纯化后 的单菌株，使培养基的0D600值在0. 23~0. 25范围内。将接种后的实验组和对照组置于 28°C、160rpm的摇床中震荡培养（培养基做避光处理）。培养5d后，取富集培养液，0D600 条件下测得吸光值。且通过肉眼观察最终获得的十溴联苯醚降解菌株，实验中的编号为 SWIR-CL71。
[0034] 2、菌株的鉴定
[0035] (1)菌体及菌落的形态特征：
[0036] 采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis) SWIR-CL71的细胞为革兰氏阴性，在2216E固体平板培养基上培 养48h，菌落形态为圆形，边缘整齐，乳白色，光滑，湿润，凸起，菌落直径为1~I. 5mm。
[0037] (2)菌体的遗传特征：
[0038] 通过对轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71 的 16S rRNA 序列 测定和在Ez-biocloud网站上进行同源性分析，该序列与模式菌株Halomonas axialensis 八1七1^1(1^?212206的163冰隱序列的同源性达到99.79 %。根据菌株命名法则，菌 株SWIR-CL71被命名为轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR-CL71。基于 SWIR-CL71菌株的16S rRNA序列所构建的系统发育树（如图1)。轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis)SWIR_CL71 的 16S rRNA 序列如下：
[0039] I GCATTTGCGG GCGGCTACAC ATGCAGTCGA GCGGTACAGG TCCAGCTTGC 51 TGGATGCTGA CGAGCGGCGG ACGGGTGAGT AATGCATAGG AATCTGCCCG
[0040]
[0041] 综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列比对结果，本发明中的轴向海山盐 单胞菌属于赤杆菌属，命名为轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71〇
[0042] 实施例二
[0043] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71对十溴联苯醚的降解分 析：
[0044] 人工海水培养基（MMC):每升培养基中含有NaCl 24g，NH4NO3 lg，KCl 0· 7g，KH2PO4 2. 0g，Na2HPO4 3. 0g，pH 7· 4, MgSO4 7g (灭菌后加入）。
[0045] 微量元素盐溶液：每升微量元素盐溶液中含有CaCl 2mg，FeCl3 · 6H20 50mg，CuSO4 0· 5mg，MnCl2 ·· H2O 0· 5mg，ZnSO4 ·· 7H20 10mg。
[0046] 富集培养基EM(Enrichment Medium):海生菌肉汤2216培养基。
[0047] 十溴联苯醚降解培养基：IOOmL MMC培养基+微量元素。
[0048] 轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis) SWIR-CL71增殖培养：在无菌的条件 下，将轴向海山盐单胞菌菌株接种到装有500mL海水肉汤培养（2216)的IL的灭菌锥形瓶 中，置于恒温摇床内，28°C、160rpm，培养48h。
[0049] 取富集培养的菌液于500mL的灭菌离心瓶中，在以6000r/min的转速离心10min。 之后用无菌生理盐水反复洗涤并离心2~3次，配成一定浓度的菌悬液，将菌悬液接种到十 溴联苯醚降解培养基中，十溴联苯醚的浓度为50mg/L。锥形瓶用锡纸包裹，避免光照对实验 影响。样品经GC-MS测定，分析轴向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71对 十溴联苯醚的降解效果。
[0050] GC-MS型号及参数设置：
[0051] 型号：GC-MSD。
[0052] 色谱柱：超高惰性GC毛细管柱，DB-5MS Π (15mX 0. 250_X 0. 25 μ m)、货号 122-5512UI，美国安捷伦公司。
[0053] 仪器工作条件：进样口温度：290°C ;进样方式：脉冲不分流进样；进样体积：I UL ; 流量及模式：lmL/min、恒流模式；四级杆温度：150°C ;离子源温度：250°C ;程序升温：初始 温度 120°C、保持 2min，40°C /min 升到 250°C，10°C /min 升到 310°C，保留 lOmin。
[0054] 十溴联苯醚出峰时间：浓度为50mg/L的十溴联苯醚标准品（购买于中国计量科学 研宄院，标物编号GBW 08709)上机检测，得到十溴联苯醚总离子流图（如图2)，其保留时 间为17. 834。十溴联苯醚的特征离子的质荷比有207、398、797、959等（如图3)，其中选定 398作为定量离子。
[0055] 十溴联苯醚工作曲线制作：配制浓度为30、40、50、60、80mg/L的十溴联苯醚-二 氯甲烷标准溶液，绘制十溴联苯醚浓度-峰面积标准曲线，此标准曲线为7 = 4109.^_ 69881，R2= 0. 9991。
[0056] 轴向海山盐单胞菌对十溴联苯醚的降解率：以不接种轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis)SWIR-CL71的培养基作为对照组，以接种轴向海山盐单胞菌 (Halomonas axialensis) SWIR-CL71 (接菌量约为3g/L)的培养基作为实验组，实验组和对 照组均设置3个平行样。置于恒温摇床中，28°C、160r/min震荡培养8d。利用GC-MS检测 实验组和对照组中十溴联苯醚并通过十溴联苯醚工作曲线计算出十溴联苯醚的残留量。轴 向海山盐单胞菌（Halomonas axialensis)SWIR_CL71对十溴联苯酿的8天降解率为87%。
【主权项】
1?轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71，已于2015年4月8日保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCCNO.M2015211。2. 如权利要求1所述轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71的富集 筛选方法，其特征在于采用等浓度添加污染物作为其生长的唯一碳源，在人工海水培养基 MMC中加入十溴联苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素，十溴联苯醚浓度为100mg/L，pH7. 4 ; 该菌落为圆形，边缘规则整齐，乳白色，光滑，湿润，凸起；菌体呈微杆状，革兰氏染色阴性； 所述人工海水培养基MMC的组成为NaCl24g/L，NH4N03lg/L，KCl0? 7g/L，KH2P042.Og/L， Na2HP043.Og/L，pH7. 4,MgS047g/L;所述微量元素包括CaCl2mg/L，FeCl3 ? 6H20 50mg/L， CuSO4O. 5mg/L，MnCl2 ??H2O0? 5mg/L，ZnSO4 ?? 7H20 10mg/L。3. 如权利要求I所述轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71在降解十 溴联苯醚中应用。4. 如权利要求3所述应用，其特征在于所述降解十溴联苯醚的方法为：降解十溴联苯 醚的方法可为：将轴向海山盐单胞菌（Halomonasaxialensis)SWIR_CL71接种于十溴联苯 醚为唯一碳源的液体培养基中，避光条件下置于摇床中富集培养；降解的条件为PH7. 4,温 度为28°C，摇床的转动速率为160rpm。
【专利摘要】轴向海山盐单胞菌及其在降解十溴联苯醚中的应用，涉及微生物应用领域。轴向海山盐单胞菌(Halomonas axialensis)SWIR-CL71，保藏编号为CCTCC NO.M2015211。轴向海山盐单胞菌(Halomonas axialensis)SWIR-CL71可在降解十溴联苯醚中应用。轴向海山盐单胞菌(Halomonas axialensis)SWIR-CL71在pH7.4，28℃，摇床的转动频率为160rpm，在以十溴联苯醚为唯一碳源的降解培养基中培养8天，该菌对十溴联苯醚的降解率达到87％。CCTCC NO. M201521120150408
【IPC分类】A62D3/02, C12N1/20
【公开号】CN104894016
【申请号】CN201510266347
【发明人】邵宗泽, 王万鹏, 蔡庆涛
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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