一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用
一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及 其应用。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植 物中的一种酚酸。具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸， 必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体 阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的 强度。但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。
[0003] 阿魏酸酯酶（EC 3. I. 1. 73, feruloyl esterase)又称肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖 酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的 应用潜能。
[0004] 自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且 它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以 及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发 酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌 及其应用，该菌株不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲 料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力 基本不变。
[0006] 一种产阿魏酸醋酶的地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)DBM12,已于2014 年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(地址为：中国北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No. 8672。
[0007] 本发明所述的地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1，土样采集及处理
[0009] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0010] 取5-10g 土样放入装有20-40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0011] 步骤2,富集培养
[0012] 取l_2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-1801·/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0013] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0014] 富集培养基二：ΝΗ4Ν030 · 5g，尿素 0· lg，KH2PO4O. lg，NaCl 0· lg，阿魏酸乙酯 lg，去 离子水100mL，调节ρΗ3· 0。
[0015] 微量元素 ：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 · 6H20 0· 8g，ZnSO4 · 7H20 0· 7g，CuCl2 · 2H20 0· 3g，H3BO3 0· 3g，（NH4)6Mo7O2 · 4H20 0. 25g，去离子水 1000mL。
[0016] 步骤3,初筛
[0017] 对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10' 10' 10' 10' KT6的稀释 液150-250 μ L涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封 口，将培养皿置于40-45°C培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20°C培养箱中继续 培养6-12h。
[0018] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60°C恒温培养24-48h。挑选出 在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化 培养基，于45-50°C培养l-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连 续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜 面保藏培养基中4°C保存，接着进一步复筛。
[0019] 初筛培养基一：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0· lg，NaNO3 0.3g，K2HPO4 0· lg，KCl 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 025g，FeSO4 · 7H20 0· 001g，琼脂 2· 5,去离子水 100mL，调节 ρΗ4· 5。
[0020] 初筛培养基二！KH2PO4 0· 2g，（NH4)2SO4O. 4g，MgSO4 · 7Η20 0· 03g，FeSO4 · 7Η20 0· 001g，MnSO4 (λ 001g，ZnCl2 (λ 001g，琼脂 2· 5g，去离子水 100mL，ρΗ4· 0。培养基 121°C、 15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。
[0021] 阿魏酸乙酯溶液：0. 2g阿魏酸乙酯加到I. 5mL无菌离心管中，再加入500 yLN、 N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0022] 步骤4,复筛
[0023] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45 °C恒温培养箱培养 16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45°C，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10%的接种量接种 到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床 震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50°C，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
[0024] 复筛种子培养基：蛋白胨lg、牛肉膏0· 5g、酵母粉0· 5g、NaCl 0· 5g、K2HP04 0· 02g、 加去离子水至100mL，ρΗ4· 5,121°C，灭菌15min。
[0025] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0. 5g、蛋白胨lg、牛肉膏0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0· lg、MgS04 · 7H20 0· 04g、去离子水 100mL，ρΗ4· 5,121°C，灭菌 15min。
[0026] 所述的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis)DBM12在发酵产阿魏酸醋酶并 制备阿魏酸中的应用，包括以下步骤：
[0027] 步骤1，将地衣芽孢杆菌DBM12菌株进行发酵，发酵周期2-3d，发酵温度35-40°C， 接种量4-10%，摇床转速160-2001·/!^!!;
[0028] 步骤2,将步骤1的发酵液8000r/min离心20min，上清用0. 22 μπι过滤，收集滤 液；
[0029] 步骤3,按硫酸铵饱和度为75%，向步骤2所得滤液中添加硫酸铵，4°C静置12h， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲溶液溶解，上样Sephedex G25分子筛凝胶柱脱盐，以pH6. 5的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗 酶液；
[0030] 步骤4,将步骤3所得粗酶液加到麸皮粉中，再加水，调节pH6. 5,摇床上震荡频率 120r/min，50°C酶解12h，沸水灭酶，离心取上清，即为阿魏酸。
[0031] 作为上述发明的进一步改进，步骤1所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨2g、葡 萄糖0. 5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉lg、酵母提取物0. 5g、NaCl 0. 4g、 KH2PO4O. lg、MgSO4 0· 05g，蒸馏水 100mL，ρΗ7· 0-7. 5。
[0032] 作为上述发明的进一步改进，步骤4中粗酶液用量为5mL，麸皮粉用量为10g，水用 量为150mL。
[0033] 本发明的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis)DBM12不仅对碳源和氮源要 求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作 简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力基本不变；该菌株所产阿魏酸酯酶耐热 耐酸，在饲料加工中具有重要应用。
【附图说明】
[0034] 图1为实施例1中的复筛平板图；
[0035] 图2为实施例3中阿魏酸酯酶的最适作用pH及酸碱稳定性曲线图；
[0036] 图3为实施例3中阿魏酸酯酶最适作用温度曲线图；
[0037] 图4为实施例3中阿魏酸酯酶的热稳定性曲线图。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1
[0039] 地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis)DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0040] 步骤1，土样采集及处理
[0041] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0042] 取5-10g 土样放入装有20_40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0043] 步骤2,富集培养
[0044] 取l-2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0045] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0046] 富集培养基二！NH4NO3O. 5g，尿素 0· lg，KH2PO4O. lg，NaCl 0· lg，阿魏酸乙酯 lg，去 离子水100mL，调节ρΗ3· 0。
[0047] 微量元素 ：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 ·6Η20 0· 8g，ZnSO4 ·7Η20 0· 7g，CuCl2 ·2Η20 0· 3g，H3BO3O. 3g，（NH4)6Mo7O2 ·4Η20 0· 25g， 去离子水1000 mL。
[0048] 步骤3,初筛
[0049] 对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10' 10' 10' 10' KT6的稀释 液150-250 μ L涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封 口，将培养皿置于40-45°C培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20°C培养箱中继续 培养6-12h。
[0050] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60°C恒温培养24-48h。挑选出 在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化 培养基，于45-50°C培养l-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连 续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜 面保藏培养基中4°C保存，接着进一步复筛。初筛结果如表1所示。
[0051] 初筛培养基一：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0· lg，NaNO3 0.3g，K2HPO4 0· lg，KCl 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 025g，FeSO4 · 7H20 0· 001g，琼脂 2· 5,去离子水 100mL，调节 ρΗ4· 5。
[0052] 初筛培养基二！KH2PO4 0· 2g，（NH4)2SO4 0· 4g，MgSO4 · 7Η20 0· 03g，FeSO4 · 7Η20 0· 001g，MnSO4 (λ 001g，ZnCl2 (λ 001g，琼脂 2· 5g，去离子水 100mL，ρΗ4· 0。培养基 121°C、 15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。
[0053] 阿魏酸乙酯溶液：0. 2g阿魏酸乙酯加到I. 5mL无菌离心管中，再加入500 yLN、 N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0054] 步骤4,复筛
[0055] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45 °C恒温培养箱培养 16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45°C，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10%的接种量接种 到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床 震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50°C，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
[0056] 复筛种子培养基：蛋白胨lg、牛肉膏0· 5g、酵母粉0· 5g、NaCl 0· 5g、K2HP04 0· 02g、 加去离子水至100mL，ρΗ4· 5,121°C灭菌15min。
[0057] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0. 5g、蛋白胨lg、牛肉膏0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0· lg、MgS04 · 7H20 0· 04g、去离子水 lOOmL，ρΗ4· 5,121°C灭菌 15min。
[0058] 酶活平板检测方法：0. 02mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH4. 5) 100mL， 琼脂粉2. 5g，121°C、15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀 后，平均倒至3个直径90_的培养皿中。琼脂充分凝固后用直径6_的打孔器均匀打孔约 3-10个。将发酵液离心后取上清IOOyL加到孔中，45°C过夜，查看透明圈情况。结果如图 1所示。
[0059] 步骤5,菌种保藏
[0060] 将将筛选地得到的菌种在牛肉膏蛋白胨上划线，分离到单菌落后在LB斜面培养 基上划线，40°C培养1-2天，置于4°C冰箱内保存。
[0061] LB斜面培养基配方为：蛋白胨lg，NaCl 0. 5g，酵母粉0. 5g，琼脂1.5g，pH值5.0， 121°C 灭菌 15min。
[0062] 表1初筛平板筛选结果
[0063]
[0064] 所得菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，菌落圆形，直径2. 4-3. 2mm ;菌 落为白色，不透明，表面较平且干燥，牢固附着培养基，难以挑取。在牛肉膏蛋白胨液体培养 基中静止培养，无沉淀，液体清亮，培养基表面形成白色皱皮膜，表面有颗粒，膜较薄。观察 菌体形态，革兰氏染色阳性，生长过程产生芽孢，孢囊无膨大，无伴孢晶体，菌体杆状，具有 运动性。菌株DBM12具体的形态学及生理生化特征见下表2。菌落、染色特征和生理生化特 征与《伯杰细菌鉴手册》（第八版）中的地衣芽孢杆菌比较接近，初步确定菌株DBM12为地 衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis) 〇
[0065] 表2菌株DBM12形态学及生理生化特性
[0066]
[0067] 提取本申请菌株DBM12基因组，依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，其 中正向引物为F:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（如SEQ ID NO. 2所示）；反向引物为R : 5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）。PCR 反应体系为（20 μ L) : CldH2O 12.7yL，10XPCR buffer 2.0yL，dNTP mix(2.5mmol/L)2.0yL，正向引物（ΙΟμ mol/ L) 1.0 μ L，反向引物（10 μ mol/L) 1.0 μ L，Taq FlexiPolymerase (5U/ μ L) 0· 3 μ L，模板 I. 0 μ L。热循环参数94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，循环30 次，72°C延伸lOmin。用pGM-T载体克隆测序。测得序列如SEQ ID NO. I所示，与从NCBI中 比对获得的相近细菌的16S rDNA序列采 用ClustalXl. 83进行多序列比对，显示菌株DBM12 的 16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis(EU162839)的 16S rDNA核苷酸序列同 源性最高，最大相似性（maxident)达到99. 2%。综合DBM12菌株的形态学特征、生理生化 特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株DBM12鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis0
[0068] 实施例2应用地衣芽孢杆菌DBM12发酵生产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸 [0069] 将筛选得到的地衣芽孢杆菌DBM12菌株进行发酵，发酵培养基配方为：蛋白胨2g， 葡萄糖0. 5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉lg，酵母提取物0. 5g、NaCl 0. 4g、 KH2PO4 (λ lg、MgS04 (λ 05g，蒸馏水100ml、pH7. 0-7. 5。发酵条件为：发酵周期2-3d，发酵温 度 35-40°C，接种量 4-10%，摇床转速 160-200r/min。
[0070] 发酵结束后，将发酵液8000r/min离心20min去除菌体，并用0. 22 μηι滤除去残余 菌体和不溶物质，收集滤出液。按照硫酸铵饱和度75%，向以上发酵滤出液中添加硫酸铵， 充分溶解后，4°C静置过夜，8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲 溶液溶解，上样S印hedex G25分子筛凝胶柱脱盐，层析柱以ρΗ6. 5的磷酸缓冲液平衡后以 相同缓冲溶液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗酶液。本发明所述回收方法其回 收率达95%以上，将获得的粗酶低温保存。
[0071] 在500mL三角瓶中加入去淀粉麸皮粉10g，加入本发明地衣芽孢杆菌DBM12发酵 制得的阿魏酸酯酶5mL，水150mL，调节pH6. 5,温度为50°C，摇床上震荡频率120r/min， 酶解时间12h。沸水灭酶，离心取上清测定阿魏酸浓度。在此条件下阿魏酸释放量最高为 8. 24mg/g麦麸，阿魏酸释放率达到80%以上。利用本发明菌株发酵所产阿魏酸酯生产阿 魏酸效率高，转化快，无污染，适用于工业生产阿魏酸。
[0072] 实施例3阿魏酸酯酶的酶活及酶学特性测定
[0073] 本实施例中以实施例2所得发酵液为样品进行测定。
[0074] 1.发酵液的阿魏酸酯酶活力测定
[0075] 向2mL离心管中加入0. 5mL酶液，再加入0. 5mL阿魏酸甲酯溶液，充分混勾，50°C 保温20min，然后加入ImL体积分数为10%的冰乙酸以终止反应。样品于12000r/min离心 lOmin，保留上清液，适当稀释后，用高效液相色谱（HPLC)法测定样品中的阿魏酸含量。空 白样品为煮沸灭活的酶液，处理方法同上。阿魏酸酯酶的酶活定义：在50°C，pH值为6. 5的 条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯，生成I ymol阿魏酸所需的酶量。阿魏酸采用高效液相色 谱法测定。
[0076] 2.发酵液的阿魏酸酯酶酶学特性
[0077] 1)最适作用pH值
[0078] 选择的pH范围及体系如下（50mmol/L):(柠檬酸缓冲溶液2. 0~4. 5 ;醋酸缓冲 溶液4~5. 5 ;磷酸缓冲溶液6~8 Jris-HCl缓冲溶液7~9 ;甘氨酸缓冲溶液8~12)。 通过比较缓冲体系下酶活力差异，得出酶反应的最适pH。以最高酶活力为100%，其它酶活 力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，结 果见图2。该酶的最适pH值为pH5. 0-8. 0,当pH处于4. O~9. O之间时，该酶均有较高的 相对酶活。故阿魏酸酯酶酸碱适应性较好，在较广的PH范围内，都可以发挥高的催化活力。 [0079] 2) pH 耐受性
[0080] 酶液与不同pH值的缓冲液（柠檬酸缓冲溶液2. 0~4. 5 ;醋酸缓冲溶液4~5. 5 ; 磷酸缓冲溶液6~8 Jris-HCl缓冲溶液7~9 ;甘氨酸缓冲溶液8~12)于37°C保温12h 后，再用缓冲液将其稀释，使pH值均达到pH6. 5,测定酶活力。以最高酶活力为100%，其它 酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作 图，结果见图2。结果表明酶在所检测的pH范围内均具有较强的稳定性，相对酶活均在90% 以上。说明该酶在较宽的PH范围具有很好的酸碱稳定性。
[0081] 3)最适作用温度
[0082] 将酶液用pH6. 5的磷酸缓冲液适当稀释后，在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、 50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C和80°C下分别测定阿魏酸酯酶酶活力。以最高酶活力为 100%，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以酶活测定温度为横坐标，相对酶 活力为纵坐标作图，结果如图3所示，酶的最适反应温度为50°C，在35~65°C之间均具有 较高的活力，剩余酶活力在85%以上，高于65°C酶活力下降显著，在80°C时，剩余酶活力为 40%。故酶在催化反应时温度设定在35~65 °C之间较为合适。
[0083] 4)温度耐受性
[0084] 将酶液用？册.5的磷酸缓冲液适当稀释后，分别在40°0、50°0、60°0、70°0及80°〇 中保温不同时间，再在50°C下测定其残存酶活力。由图4可见，该酶具有较强的热稳定性， 40°C~70°C保温lOOmin，酶活力几乎没有损失，80°C保温60min仍保留80%的酶活力。以最 高酶活力为100%，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标， 相对酶活力为纵坐标作图，结果如图3所示。该阿魏酸酯酶在40~70°C范围内稳定性较 好，在70°C、60min时酶活力几乎不受影响，因此该酶属于耐热阿魏酸酯酶。该酶在pH4. 0、 30°C条件下放置240小时即10天依然能保留较高的酶活力。
【主权项】
1. 一种产阿魏酸醋酶的地衣芽抱杆菌/icAefli/brffiis)DBM12,已于2014 年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.8672〇2. 权利要求1所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌（ifeciJ7W1SJrYcAeflifbrffii1S) DBM12通过发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用。3. 根据权利要求2所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌/icAefli/brffiis)DBM12通过发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用，其特征在于：包括以下步骤： 步骤1，将地衣芽孢杆菌DBM12菌株接种到发酵培养基进行发酵，发酵周期2-3d，发酵 温度35-40°C，接种量4-10%，摇床转速160-200r/min; 步骤2,将步骤1的发酵液8000r/min离心20min，上清用0. 22ym过滤，收集滤液； 步骤3,按硫酸铵饱和度为75%，向步骤2所得滤液中添加硫酸铵，4°C静置12h，8000r/ min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲溶液溶解，上样SephedexG25分子 筛凝胶柱脱盐，以PH6. 5的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗酶液； 步骤4,将步骤3所得粗酶液加到麸皮粉中，再加水，调节pH6. 5,摇床上震荡频率120r/ min，50°C酶解12h，沸水灭酶，离心取上清，即为阿魏酸。4. 根据权利要求3所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌 DBM12通过发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用，其特征在于：步骤1所述的发酵培养 基的配方为：蛋白胨2g、葡萄糖0.5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉lg、酵母提 取物 0? 5g、NaCl0? 4g、KH2PO4 0?lg、MgSO4 0? 05g，蒸馏水 100mL，pH7. 0-7. 5。5. 根据权利要求3所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌 DBM12在发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用，其特征在于：步骤4中粗酶液用量为 5mL，麸皮粉用量为10g，水用量为150mL。
【专利摘要】本发明公开了一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用，该株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DBM12，保藏编号：CGMCC No.8672。本发明的地衣芽孢杆菌不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力基本不变。CGMCC No.867220140102
【IPC分类】C12R1/10, C12P7/42, C12N1/20, C12N9/18
【公开号】CN104894017
【申请号】CN201510268046
【发明人】高兆建, 王东星, 侯进慧, 唐仕荣, 孙会刚, 徐大伟, 郑义, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及 其应用。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植 物中的一种酚酸。具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸， 必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体 阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的 强度。但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。
[0003] 阿魏酸酯酶（EC 3. I. 1. 73, feruloyl esterase)又称肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖 酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的 应用潜能。
[0004] 自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且 它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以 及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发 酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌 及其应用，该菌株不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲 料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力 基本不变。
[0006] 一种产阿魏酸醋酶的地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)DBM12,已于2014 年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(地址为：中国北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No. 8672。
[0007] 本发明所述的地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1，土样采集及处理
[0009] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0010] 取5-10g 土样放入装有20-40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0011] 步骤2,富集培养
[0012] 取l_2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-1801·/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0013] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0014] 富集培养基二：ΝΗ4Ν030 · 5g，尿素 0· lg，KH2PO4O. lg，NaCl 0· lg，阿魏酸乙酯 lg，去 离子水100mL，调节ρΗ3· 0。
[0015] 微量元素 ：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 · 6H20 0· 8g，ZnSO4 · 7H20 0· 7g，CuCl2 · 2H20 0· 3g，H3BO3 0· 3g，（NH4)6Mo7O2 · 4H20 0. 25g，去离子水 1000mL。
[0016] 步骤3,初筛
[0017] 对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10' 10' 10' 10' KT6的稀释 液150-250 μ L涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封 口，将培养皿置于40-45°C培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20°C培养箱中继续 培养6-12h。
[0018] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60°C恒温培养24-48h。挑选出 在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化 培养基，于45-50°C培养l-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连 续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜 面保藏培养基中4°C保存，接着进一步复筛。
[0019] 初筛培养基一：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0· lg，NaNO3 0.3g，K2HPO4 0· lg，KCl 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 025g，FeSO4 · 7H20 0· 001g，琼脂 2· 5,去离子水 100mL，调节 ρΗ4· 5。
[0020] 初筛培养基二！KH2PO4 0· 2g，（NH4)2SO4O. 4g，MgSO4 · 7Η20 0· 03g，FeSO4 · 7Η20 0· 001g，MnSO4 (λ 001g，ZnCl2 (λ 001g，琼脂 2· 5g，去离子水 100mL，ρΗ4· 0。培养基 121°C、 15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。
[0021] 阿魏酸乙酯溶液：0. 2g阿魏酸乙酯加到I. 5mL无菌离心管中，再加入500 yLN、 N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0022] 步骤4,复筛
[0023] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45 °C恒温培养箱培养 16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45°C，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10%的接种量接种 到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床 震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50°C，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
[0024] 复筛种子培养基：蛋白胨lg、牛肉膏0· 5g、酵母粉0· 5g、NaCl 0· 5g、K2HP04 0· 02g、 加去离子水至100mL，ρΗ4· 5,121°C，灭菌15min。
[0025] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0. 5g、蛋白胨lg、牛肉膏0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0· lg、MgS04 · 7H20 0· 04g、去离子水 100mL，ρΗ4· 5,121°C，灭菌 15min。
[0026] 所述的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis)DBM12在发酵产阿魏酸醋酶并 制备阿魏酸中的应用，包括以下步骤：
[0027] 步骤1，将地衣芽孢杆菌DBM12菌株进行发酵，发酵周期2-3d，发酵温度35-40°C， 接种量4-10%，摇床转速160-2001·/!^!!;
[0028] 步骤2,将步骤1的发酵液8000r/min离心20min，上清用0. 22 μπι过滤，收集滤 液；
[0029] 步骤3,按硫酸铵饱和度为75%，向步骤2所得滤液中添加硫酸铵，4°C静置12h， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲溶液溶解，上样Sephedex G25分子筛凝胶柱脱盐，以pH6. 5的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗 酶液；
[0030] 步骤4,将步骤3所得粗酶液加到麸皮粉中，再加水，调节pH6. 5,摇床上震荡频率 120r/min，50°C酶解12h，沸水灭酶，离心取上清，即为阿魏酸。
[0031] 作为上述发明的进一步改进，步骤1所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨2g、葡 萄糖0. 5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉lg、酵母提取物0. 5g、NaCl 0. 4g、 KH2PO4O. lg、MgSO4 0· 05g，蒸馏水 100mL，ρΗ7· 0-7. 5。
[0032] 作为上述发明的进一步改进，步骤4中粗酶液用量为5mL，麸皮粉用量为10g，水用 量为150mL。
[0033] 本发明的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis)DBM12不仅对碳源和氮源要 求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作 简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力基本不变；该菌株所产阿魏酸酯酶耐热 耐酸，在饲料加工中具有重要应用。
【附图说明】
[0034] 图1为实施例1中的复筛平板图；
[0035] 图2为实施例3中阿魏酸酯酶的最适作用pH及酸碱稳定性曲线图；
[0036] 图3为实施例3中阿魏酸酯酶最适作用温度曲线图；
[0037] 图4为实施例3中阿魏酸酯酶的热稳定性曲线图。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1
[0039] 地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis)DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0040] 步骤1，土样采集及处理
[0041] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0042] 取5-10g 土样放入装有20_40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0043] 步骤2,富集培养
[0044] 取l-2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0045] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0046] 富集培养基二！NH4NO3O. 5g，尿素 0· lg，KH2PO4O. lg，NaCl 0· lg，阿魏酸乙酯 lg，去 离子水100mL，调节ρΗ3· 0。
[0047] 微量元素 ：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 ·6Η20 0· 8g，ZnSO4 ·7Η20 0· 7g，CuCl2 ·2Η20 0· 3g，H3BO3O. 3g，（NH4)6Mo7O2 ·4Η20 0· 25g， 去离子水1000 mL。
[0048] 步骤3,初筛
[0049] 对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10' 10' 10' 10' KT6的稀释 液150-250 μ L涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封 口，将培养皿置于40-45°C培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20°C培养箱中继续 培养6-12h。
[0050] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60°C恒温培养24-48h。挑选出 在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化 培养基，于45-50°C培养l-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连 续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜 面保藏培养基中4°C保存，接着进一步复筛。初筛结果如表1所示。
[0051] 初筛培养基一：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0· lg，NaNO3 0.3g，K2HPO4 0· lg，KCl 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 025g，FeSO4 · 7H20 0· 001g，琼脂 2· 5,去离子水 100mL，调节 ρΗ4· 5。
[0052] 初筛培养基二！KH2PO4 0· 2g，（NH4)2SO4 0· 4g，MgSO4 · 7Η20 0· 03g，FeSO4 · 7Η20 0· 001g，MnSO4 (λ 001g，ZnCl2 (λ 001g，琼脂 2· 5g，去离子水 100mL，ρΗ4· 0。培养基 121°C、 15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。
[0053] 阿魏酸乙酯溶液：0. 2g阿魏酸乙酯加到I. 5mL无菌离心管中，再加入500 yLN、 N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0054] 步骤4,复筛
[0055] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45 °C恒温培养箱培养 16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45°C，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10%的接种量接种 到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床 震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50°C，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
[0056] 复筛种子培养基：蛋白胨lg、牛肉膏0· 5g、酵母粉0· 5g、NaCl 0· 5g、K2HP04 0· 02g、 加去离子水至100mL，ρΗ4· 5,121°C灭菌15min。
[0057] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0. 5g、蛋白胨lg、牛肉膏0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0· lg、MgS04 · 7H20 0· 04g、去离子水 lOOmL，ρΗ4· 5,121°C灭菌 15min。
[0058] 酶活平板检测方法：0. 02mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH4. 5) 100mL， 琼脂粉2. 5g，121°C、15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀 后，平均倒至3个直径90_的培养皿中。琼脂充分凝固后用直径6_的打孔器均匀打孔约 3-10个。将发酵液离心后取上清IOOyL加到孔中，45°C过夜，查看透明圈情况。结果如图 1所示。
[0059] 步骤5,菌种保藏
[0060] 将将筛选地得到的菌种在牛肉膏蛋白胨上划线，分离到单菌落后在LB斜面培养 基上划线，40°C培养1-2天，置于4°C冰箱内保存。
[0061] LB斜面培养基配方为：蛋白胨lg，NaCl 0. 5g，酵母粉0. 5g，琼脂1.5g，pH值5.0， 121°C 灭菌 15min。
[0062] 表1初筛平板筛选结果
[0063]
[0064] 所得菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，菌落圆形，直径2. 4-3. 2mm ;菌 落为白色，不透明，表面较平且干燥，牢固附着培养基，难以挑取。在牛肉膏蛋白胨液体培养 基中静止培养，无沉淀，液体清亮，培养基表面形成白色皱皮膜，表面有颗粒，膜较薄。观察 菌体形态，革兰氏染色阳性，生长过程产生芽孢，孢囊无膨大，无伴孢晶体，菌体杆状，具有 运动性。菌株DBM12具体的形态学及生理生化特征见下表2。菌落、染色特征和生理生化特 征与《伯杰细菌鉴手册》（第八版）中的地衣芽孢杆菌比较接近，初步确定菌株DBM12为地 衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis) 〇
[0065] 表2菌株DBM12形态学及生理生化特性
[0066]
[0067] 提取本申请菌株DBM12基因组，依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，其 中正向引物为F:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（如SEQ ID NO. 2所示）；反向引物为R : 5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）。PCR 反应体系为（20 μ L) : CldH2O 12.7yL，10XPCR buffer 2.0yL，dNTP mix(2.5mmol/L)2.0yL，正向引物（ΙΟμ mol/ L) 1.0 μ L，反向引物（10 μ mol/L) 1.0 μ L，Taq FlexiPolymerase (5U/ μ L) 0· 3 μ L，模板 I. 0 μ L。热循环参数94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，循环30 次，72°C延伸lOmin。用pGM-T载体克隆测序。测得序列如SEQ ID NO. I所示，与从NCBI中 比对获得的相近细菌的16S rDNA序列采 用ClustalXl. 83进行多序列比对，显示菌株DBM12 的 16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis(EU162839)的 16S rDNA核苷酸序列同 源性最高，最大相似性（maxident)达到99. 2%。综合DBM12菌株的形态学特征、生理生化 特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株DBM12鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis0
[0068] 实施例2应用地衣芽孢杆菌DBM12发酵生产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸 [0069] 将筛选得到的地衣芽孢杆菌DBM12菌株进行发酵，发酵培养基配方为：蛋白胨2g， 葡萄糖0. 5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉lg，酵母提取物0. 5g、NaCl 0. 4g、 KH2PO4 (λ lg、MgS04 (λ 05g，蒸馏水100ml、pH7. 0-7. 5。发酵条件为：发酵周期2-3d，发酵温 度 35-40°C，接种量 4-10%，摇床转速 160-200r/min。
[0070] 发酵结束后，将发酵液8000r/min离心20min去除菌体，并用0. 22 μηι滤除去残余 菌体和不溶物质，收集滤出液。按照硫酸铵饱和度75%，向以上发酵滤出液中添加硫酸铵， 充分溶解后，4°C静置过夜，8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲 溶液溶解，上样S印hedex G25分子筛凝胶柱脱盐，层析柱以ρΗ6. 5的磷酸缓冲液平衡后以 相同缓冲溶液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗酶液。本发明所述回收方法其回 收率达95%以上，将获得的粗酶低温保存。
[0071] 在500mL三角瓶中加入去淀粉麸皮粉10g，加入本发明地衣芽孢杆菌DBM12发酵 制得的阿魏酸酯酶5mL，水150mL，调节pH6. 5,温度为50°C，摇床上震荡频率120r/min， 酶解时间12h。沸水灭酶，离心取上清测定阿魏酸浓度。在此条件下阿魏酸释放量最高为 8. 24mg/g麦麸，阿魏酸释放率达到80%以上。利用本发明菌株发酵所产阿魏酸酯生产阿 魏酸效率高，转化快，无污染，适用于工业生产阿魏酸。
[0072] 实施例3阿魏酸酯酶的酶活及酶学特性测定
[0073] 本实施例中以实施例2所得发酵液为样品进行测定。
[0074] 1.发酵液的阿魏酸酯酶活力测定
[0075] 向2mL离心管中加入0. 5mL酶液，再加入0. 5mL阿魏酸甲酯溶液，充分混勾，50°C 保温20min，然后加入ImL体积分数为10%的冰乙酸以终止反应。样品于12000r/min离心 lOmin，保留上清液，适当稀释后，用高效液相色谱（HPLC)法测定样品中的阿魏酸含量。空 白样品为煮沸灭活的酶液，处理方法同上。阿魏酸酯酶的酶活定义：在50°C，pH值为6. 5的 条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯，生成I ymol阿魏酸所需的酶量。阿魏酸采用高效液相色 谱法测定。
[0076] 2.发酵液的阿魏酸酯酶酶学特性
[0077] 1)最适作用pH值
[0078] 选择的pH范围及体系如下（50mmol/L):(柠檬酸缓冲溶液2. 0~4. 5 ;醋酸缓冲 溶液4~5. 5 ;磷酸缓冲溶液6~8 Jris-HCl缓冲溶液7~9 ;甘氨酸缓冲溶液8~12)。 通过比较缓冲体系下酶活力差异，得出酶反应的最适pH。以最高酶活力为100%，其它酶活 力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，结 果见图2。该酶的最适pH值为pH5. 0-8. 0,当pH处于4. O~9. O之间时，该酶均有较高的 相对酶活。故阿魏酸酯酶酸碱适应性较好，在较广的PH范围内，都可以发挥高的催化活力。 [0079] 2) pH 耐受性
[0080] 酶液与不同pH值的缓冲液（柠檬酸缓冲溶液2. 0~4. 5 ;醋酸缓冲溶液4~5. 5 ; 磷酸缓冲溶液6~8 Jris-HCl缓冲溶液7~9 ;甘氨酸缓冲溶液8~12)于37°C保温12h 后，再用缓冲液将其稀释，使pH值均达到pH6. 5,测定酶活力。以最高酶活力为100%，其它 酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作 图，结果见图2。结果表明酶在所检测的pH范围内均具有较强的稳定性，相对酶活均在90% 以上。说明该酶在较宽的PH范围具有很好的酸碱稳定性。
[0081] 3)最适作用温度
[0082] 将酶液用pH6. 5的磷酸缓冲液适当稀释后，在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、 50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C和80°C下分别测定阿魏酸酯酶酶活力。以最高酶活力为 100%，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以酶活测定温度为横坐标，相对酶 活力为纵坐标作图，结果如图3所示，酶的最适反应温度为50°C，在35~65°C之间均具有 较高的活力，剩余酶活力在85%以上，高于65°C酶活力下降显著，在80°C时，剩余酶活力为 40%。故酶在催化反应时温度设定在35~65 °C之间较为合适。
[0083] 4)温度耐受性
[0084] 将酶液用？册.5的磷酸缓冲液适当稀释后，分别在40°0、50°0、60°0、70°0及80°〇 中保温不同时间，再在50°C下测定其残存酶活力。由图4可见，该酶具有较强的热稳定性， 40°C~70°C保温lOOmin，酶活力几乎没有损失，80°C保温60min仍保留80%的酶活力。以最 高酶活力为100%，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标， 相对酶活力为纵坐标作图，结果如图3所示。该阿魏酸酯酶在40~70°C范围内稳定性较 好，在70°C、60min时酶活力几乎不受影响，因此该酶属于耐热阿魏酸酯酶。该酶在pH4. 0、 30°C条件下放置240小时即10天依然能保留较高的酶活力。
【主权项】
1. 一种产阿魏酸醋酶的地衣芽抱杆菌/icAefli/brffiis)DBM12,已于2014 年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.8672〇2. 权利要求1所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌（ifeciJ7W1SJrYcAeflifbrffii1S) DBM12通过发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用。3. 根据权利要求2所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌/icAefli/brffiis)DBM12通过发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用，其特征在于：包括以下步骤： 步骤1，将地衣芽孢杆菌DBM12菌株接种到发酵培养基进行发酵，发酵周期2-3d，发酵 温度35-40°C，接种量4-10%，摇床转速160-200r/min; 步骤2,将步骤1的发酵液8000r/min离心20min，上清用0. 22ym过滤，收集滤液； 步骤3,按硫酸铵饱和度为75%，向步骤2所得滤液中添加硫酸铵，4°C静置12h，8000r/ min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲溶液溶解，上样SephedexG25分子 筛凝胶柱脱盐，以PH6. 5的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗酶液； 步骤4,将步骤3所得粗酶液加到麸皮粉中，再加水，调节pH6. 5,摇床上震荡频率120r/ min，50°C酶解12h，沸水灭酶，离心取上清，即为阿魏酸。4. 根据权利要求3所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌 DBM12通过发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用，其特征在于：步骤1所述的发酵培养 基的配方为：蛋白胨2g、葡萄糖0.5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉lg、酵母提 取物 0? 5g、NaCl0? 4g、KH2PO4 0?lg、MgSO4 0? 05g，蒸馏水 100mL，pH7. 0-7. 5。5. 根据权利要求3所述的产阿魏酸醋酶的地衣芽孢杆菌 DBM12在发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用，其特征在于：步骤4中粗酶液用量为 5mL，麸皮粉用量为10g，水用量为150mL。
【专利摘要】本发明公开了一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用，该株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DBM12，保藏编号：CGMCC No.8672。本发明的地衣芽孢杆菌不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力基本不变。CGMCC No.867220140102
【IPC分类】C12R1/10, C12P7/42, C12N1/20, C12N9/18
【公开号】CN104894017
【申请号】CN201510268046
【发明人】高兆建, 王东星, 侯进慧, 唐仕荣, 孙会刚, 徐大伟, 郑义, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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