一种副干酪乳杆菌及其应用
一种副干酪乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种副干酪乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前，免疫症状诸如过敏、气喘、慢性鼻炎、异位性皮肤炎（atopic dermatitis)或 是发炎症状在发展中国家或发达国家有越来越普及的趋势。最常使用的治疗方法是口服或 涂抹类固醇，然而其缺点是容易产生副作用例如使病人变胖或增加感染率，甚至有致死的 风险。许多研宄团队正在开发更安全的方法，尽可能在减少副作用的前提下，舒缓或是预防 过敏和免疫疾病。
[0003] 目前普遍已知乳酸杆菌（Lactobacillus spp.)是一群生活在机体内益于宿主健 康的微生物，它维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可。乳酸杆菌属的特定菌 株已被发现能够定殖于肠道粘膜，并协助维持人类和动物的健康，例如抗发炎活性和免疫 调节活性。热灭活的干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei)代田株（strain Shirota) (LcS) 刺激IL-12的分泌，使免疫反应朝向Thl为主状态，藉以抑制IgE之产生。将热致死嗜酸乳 杆菌（Lactobacillus acidophilus)L-55 口服给予经卵清蛋白（简称0VA)致敏的BALB/c 小鼠，结果显示可抑制由OVA诱导之鼻部症状，如打喷嚏及揉鼻。
[0004] 目前的健康产业努力尝试开发新颖可食用且具有特殊功效的乳酸菌种。乳酸杆菌 已有很长的食用历史，属于公认安全（Generally Regarded as Safe, G.R.A.S)的菌属，在 适当条件培养下通常能产生良好的风味，有些菌株甚至能表现出绝佳的产酸能力以及优异 的免疫调节功效，大幅提升产品价值。如干酪乳酸杆菌代田株，其是著名乳酸菌饮料养乐多 中采用的一种乳酸杆菌，虽然其具有一定的产酸能力、免疫调节功能和抗发炎活性等，但是 由于不同菌株的特性与能力，乳酸杆菌的效果是可变且不可预期的。因此，仍有必要发展在 产酸能力、免疫调节功能和抗发炎活性等方面更加优异的乳酸菌。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具 有更加优异的产酸能力。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的消化道存活能力，即提高其抗酸和抗胆盐能力。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的分泌胞外多糖的能力。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的抑制过敏和调节免疫反应的能力。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的抗发炎能力。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供所述副干酪乳杆菌在乳制品制备、保健品制备、药 物制备、食品补充剂制备、食品制备中的应用。
[0011] 为实现本发明目的，本发明提供一种分离自台湾孩童之粪便的副干酪乳杆菌，命 名为菌株为V0151。V0151以MRS培养基于37°C下培养一天后，抽取其基因组DNA，并利用 16s rDNA和pheS引物对于该基因组DNA进行PCR扩增，并利用美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对，经 过比对鉴定为副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)， V0151 的 pheS 序列如 SEQ ID NO: 1 所示。
[0012] V0151于2013年6月27日寄存德国微生物及细胞保存中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，寄存编号为 DSM27448。于 2014 年 03 月 07 日寄 存中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCC No. 8903。
[0013] 作为优选，所述副干酪乳杆菌V0151经热去活化，为灭活菌。
[0014] 相比现有产品养乐多中的干酪乳酸杆菌代田株，本发明所述副干酪乳杆菌V0151 具有更加优异的产酸能力、抗酸和胆盐能力、调节免疫反应能留、抑制过敏和发炎症状的能 力。基于此，本发明提供了所述副干酪乳杆菌V0151在制备食品、保健品、药品、食品补充剂 中的应用，特别是在制备具有抑制过敏、调节免疫反应和抗发炎功效的食品、保健品、药品、 食品补充剂中。其中，所述食品优选为乳制品，更优选为功能性酸奶和乳酸菌饮料。
[0015] 作为优选，所述免疫反应为与 IFN-γ、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、 IL-13、TNF- α、一氧化氮合成酶、环氧合酶-2及其组合相关的免疫反应。
[0016] 作为优选，所述过敏为与IL-4、IL-5、IL-12、IL-13及其组合相关的过敏。进一步 优选地，所述过敏为可以引发如下炎症反应的过敏：
[0017] 气管反应过度、气管反应发炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺 炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。
[0018] 作为优选，所述发炎为与IFN-γ、IL-I β、IL-6、IL-KKTNF-α、一氧化氮合成酶、 环氧合酶-2及其组合相关的发炎。进一步优选地，所述发炎为气管反应过度、气管反应发 炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血 管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。
[0019] 根据上述副干酪乳杆菌V0151的应用，本发明提供一种食品，以保藏编号为CGMCC No. 8903的菌株进行制备。进一步优选地、所述食品为乳制品；更优选地，所述乳制品为功 能性酸奶和乳酸菌饮料。
[0020] 此外，本发明还提供一种乳酸菌组合物，包含保藏编号为CGMCC No. 8903的副干酪 乳杆菌和可接受的辅料。
[0021] 作为优选，所述辅料选自乳糖、干燥淀粉、淀粉糊、糊精、环糊精、羧甲基淀粉钠、羧 基淀粉丙酸酯、微晶性纤维素、羧甲基纤维素、麦芽糊精、硬脂酸镁及其类似物。所述类似物 指代的是尚未在本发明中一一具体列明的本领域中常用的辅料。本发明所述辅料可以为一 种，也可以为多种，这由本领域技术人员根据实际制备情况而调节和选择。
[0022] 作为优选，所述乳酸菌组合物还包括益生菌、益生元、食品添加剂中的一种或两 种，由此配合本发明所述副干酪乳杆菌V0151优异的能力来达到最佳效果。其中，所述益生 元选自聚葡萄糖、低聚木糖、菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖及其类似物，所述类似物指代的是 尚未在本发明中一一具体列明的本领域中常用的益生元，所述益生元可以为一种，也可以 为多种，这由本领域技术人员根据实际制备情况而调节和选择。
[0023] 作为优选，所述食品添加剂选自果粉、木糖醇、柠檬酸、三氯蔗糖、食用香精及其类 似物，所述类似物指代的是尚未在本发明中一一具体列明的本领域中常用的食品添加剂， 所述食品添加剂可以为一种，也可以为多种，这由本领域技术人员根据实际制备情况而调 节和选择。
[0024] 本发明所述乳酸菌组合物可以制备成任意一剂型，作为优选，其为口服制剂。进 一步优选地，所述口服制剂为溶液、悬浮液、乳剂、粉剂、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、口嚼胶或胶 裳。
[0025] 由以上技术方案可知，本发明所述菌株增殖快速且产酸能力优异，具有分泌胞外 多醣以及对抗胆盐和胃酸侵袭的能力，更可调节免疫反应、抑制过敏和发炎现象，十分适合 用于食品、保健品、药品、食品补充剂等广品的制备。
[0026] 生物保藏说明
[0027] 分类命名：副干酪乳杆菌，Lactobacillus paracasei于2014年3月7日保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCC No. 8903。
【附图说明】
[0028] 图1所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌生长过程中环 境酸碱值的变化折线图；
[0029] 图2所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的产酸表现折 线图；
[0030] 图3所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的生长曲线；
[0031] 图4所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的胞外多醣产 量柱形图；
[0032] 图5所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的抗胆盐能力折线图，其中，图 例所示为胆盐1. 〇%、胆盐〇. 5%和胆盐0. 25% ;
[0033] 图6所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的免疫调节能力柱形图，其中 6-A为促进hPBMC分泌IFN- γ的能力柱形图，6-B为促进hPBMC分泌IL-10的能力柱形图；
[0034] 图7所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的抗发炎能力柱形图，其中7-A 为抑制小鼠脾细胞分泌TNF-α的能力柱形图；7-B为抑制小鼠脾细胞分泌IL-6的能力柱 形图；7-C为抑制小鼠脾细胞分泌IL-I β的能力柱形图；
[0035] 图8所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151促进小鼠脾细胞分泌IL-12的 能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20感 染复数组；
[0036] 图9所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抑制小鼠脾细胞分泌IL-4的 能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20感 染复数组；
[0037] 图10所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抑制小鼠脾细胞分泌IL-5的 能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20感 染复数组；
[0038] 图11所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抑制小鼠脾细胞分泌IL-13 的能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20 感染复数组。
【具体实施方式】
[0039] 本发明公开了 一种副干酪乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述副干酪乳杆菌已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法 和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0040] 本发明【具体实施方式】中的试验结果数据皆以平均值土标准差（Means土SD)表示。 统计分析使用单因子变异数分析（One-way analysis of variance (One-way ANOVA))，并以 Tukey多重比较检定（Tukey's Multiple Comparison Test)作为后测比较组间差异，当组 间差异达统计上意义以*(Ρ〈〇·〇5)、**(ρ〈0·01)、*#(ρ〈0·001)或不同英文字母（a，b)表 不O
[0041] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0042] 实施例1 :16s rDNA和pheS序列鉴定
[0043] V0151分离自台湾孩童粪便，以MRS培养基于37°C下培养一天后，抽取其基因组 DNA，并利用16s rDNA和pheS引物（如表1所示）对于该基因组DNA进行聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信 息中心（National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株 比对，结果见表2和表3。
[0044] 表 1、16s rDNA 和 pheS 引物序列
[0045]
[0046] 表2为利用16S rDNA引物进行增殖的序列比对结果，V0151的16S rDNA序列相 同于另两株副干酪乳杆菌副干酪亚种之菌株（AM087710、AM087711)，但和其它几株乳杆菌 属的菌株有些序列上的差异。因此，分离株V0151可以确认为副干酪乳杆菌。
[0047] 由于副干酪乳杆菌种群内16S rDNA相似性在99. 9%以上，种水平分辨率较低， 为进一步辨识V0151的身份，利用pheS引物增殖的序列进行进一步序列比对，pheS序 列可表现出较大的种间差异性。比对结果如表3所示，V0151与副干酪乳杆菌副干酪亚 种（L.paracasei subsp.paracasei)(AM087710)和副干酷乳杆菌坚初亚种（L.paracasei subsp. tolerans) (AM087711)近似度高达91. 8%和91. 4%，但仍非完全相同，且与其它种 类的乳酸菌近似度明显较低，因此可以判定V0151为一种全新的副干酪乳杆菌副干酪亚 种。
[0048] 表2、16S rDNA序列之比对结果
[0049]
[0050] 表3、pheS序列之比对结果
[0051]
[0052] 经过鉴定确认其所属菌种后，副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151根据布达佩斯协 议（Budapest Treaty)分别于2013年6月27日寄存德国微生物及细胞保存中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (Inhoffenstr. 7B, D-38124Braunsc hweig，Germany)，寄存编号为DSM27448,以及2014年03月07日寄存中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No :8903。此生物材料已经存活试验测试并 通过该试验。
[0053] 实施例2 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的发酵能力
[0054] 利用API 50CHL快速鉴定套组（bioMerieux, France)测试副干酪乳杆菌副干酪亚 种V0151对各种不同碳水化合物基质的发酵能力，结果如表4所示。
[0055] 表4、副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151对不同碳水化合物基质的发酵能力
[0056]
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[0057] +:阳性；-:阴性
[0058] 实施例3 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的产酸能力
[0059] 副干酪乳杆菌副干酪亚种VO151培养于MRS培养基中，于第24、36及72小时取出 菌液进行涂布培养并计数。取出二次活化菌液体积的百分之一，以脱脂牛奶为基础的培养 液在37°C下培养24小时、36及72小时，取出发酵后的培养液检测培养液酸碱值并进行酸 滴定试验，同时取分离自养乐多的代田菌作为对照。
[0060] 在酸滴定试验中，每5公克发酵后的培养液系混合于20毫升的纯水，并以浓度 〇. IN的氢氧化钠进行滴定以计算待测菌株的产酸量。滴定终点定为pH值8. 30至8. 32间， 乳酸菌产酸量计算公式如下：
[0061] 产酸量（％)=〇· IN氢氧化钠体积（毫升）XFX0. 009/发酵后的培养液重量（公 克）XlOO
[0062] F表示0· IN氢氧化钠的力价；
[0063] 结果见图1-图3。图1为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌 生长过程中环境酸碱值的变化。图2为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代 田菌的产酸表现。图3为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的生长曲 线。
[0064] 由图1-图3中可看出，副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的生长速率明显优于代田 菌，亦具有较佳的产酸能力，因此，培养副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的菌液酸碱值在培 养48小时后有明显急剧的下降现象。由于进行乳酸菌筛选时，产酸能力是一个相当重要的 观察指标，而副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151相对于养乐多代田菌来说，更展现了较佳的 产酸能力，产酸速率也比代田菌更为快速。
[0065] 实施例4 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151胞外多糖产量
[0066] 乳酸菌所分泌的胞外多醣通常会影响流体特性、性质或是发酵乳制品的风味，并 且会表现出某些生理功能。选用具有分泌胞外多醣能力的乳酸菌来取代现行的发酵添加物 已越来越普遍且渐成趋势。
[0067] 将V0151于分别含有2%果糖或蔗糖的MRS培养液大量培养，以95%酒精将 培养 液中的多醣沉淀下来，以酚硫法测定多醣含量，以分离自养乐多的多田菌为对照，结果见图 4〇
[0068] 由图中可看出，在选用蔗糖和果糖为碳源的状况下，每公升副干酪乳杆菌副干酪 亚种V0151培养液产生的胞外多醣产量分别为0. 432±0. 006和0. 329±0. 008公克，皆远 优于代田菌的〇. 246±0. 005和0. 251 ±0. 009公克。
[0069] 实施例5 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抗酸和抗胆盐能力
[0070] 乳酸菌抗酸能力的测试是探讨乳酸菌在不同酸碱度培养基的培养下，经过一段时 间后乳酸菌的存活比例。所使用的菌数如表5所示，取二次活化的副干酪乳杆菌副干酪亚 种V0151菌液各Iml，分别加至pH值为2. 3、2. 5和3. 0的9ml PBS缓冲液中，菌液与缓冲液 混合均匀后，置于37°C培养箱中，1. 5小时后以MRS平板法测定活菌数，以分离自养乐多的 多田菌为对照。
[0071] 结果如表5所示，表5为副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的抗酸 能力比较表，由表中可以看出，副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151在酸性环境下培养1. 5小 时，存活率高于代田菌，表明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151具有在消化道中稳定存活的 能力。
[0072] 表5、副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的抗酸能力
[0073]
[0074] 乳酸菌抗胆盐的能力测试则是观察乳酸菌在不同胆盐浓度的环境下存活比例。取 二次活化的副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151菌液各200 μ 1，加至9. 8ml MRS培养基（分别 含0.25%、0. 5%胆盐，pH 7.0)中，混合均匀后，置于37°C培养箱中，24小时后以MRS平板 法测定活菌数，以分离自养乐多的多田菌为对照。
[0075] 如第5图所示，其系说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的抗胆盐能力。 胆盐是由肝脏所分泌，并且会抑制消化道中的微生物生长，然而，副干酪乳杆菌副干酪亚种 V0151在0. 25%低胆盐浓度的状态下，其生长并不会受到明显的抑制。
[0076] 实施例6 :热杀死菌V0151的体外免疫调节能力
[0077] 目前已知有两种辅助型T细胞（helper T cell)，分别是Thl细胞和Th2细胞。 Thl细胞可以分泌干扰素 -γ (Interferon- γ，IFN- γ )，并且刺激B细胞分泌免疫球蛋白 G(IgG)，而Th2细胞则可以分泌介白素-4(Interleukin-4, IL-4)、IL-5和刺激B细胞分泌 免疫球蛋白E(IgE)。在正常状况下，Thl细胞和Th2细胞具有相互拮抗的作用，当Thl细胞 增加时，IFN- γ会抑制Th2细胞的过度表现并且降低Th2细胞的免疫反应。此外，由Th2细 胞分泌的细胞素（cytokines)也会抑制Thl细胞的活化以减少Th2细胞的免疫反应。而过 敏原则会增加 Th2细胞的反应与IgE的分泌而引发过敏。
[0078] 此外，调节型T细胞（regulatory T cell，Treg)、辅助型T细胞和B细胞则会分 泌IL-10, IL-10有助于抑制发炎反应并调节免疫反应。
[0079] 因此藉由检测IFN-γ和IL-10的含量可以评估并比较不同组别的免疫调节功 能，以鉴别出具有抗过敏潜力且能适度增加 Thl细胞反应或减少Th2细胞反应的理想乳 酸菌株。人类周边血液单核球细胞包括了多种免疫细胞和少量的自然杀手细胞（natural killer cells)，系广泛应用于刺激免疫反应以评估乳酸菌的免疫调节能力
[0080] 本试验系利用人类周边血液单核球细胞（Human Peripheral Blood Mononuclear Cells，hPBMC)模式来测试本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的免疫调节能力。试验中 的hPBMC系分离自健康捐赠者的静脉血液，方法如后。将静脉血加到肝素抗凝管中后，加入 Ficoll-PaqueTM PLUS单核球细胞分离液混合均匀，并由棕黄层（buffy coat)取得人类周 边血液单核细胞。使用Turk试剂进行细胞计数后，利用RPMI-1640细胞培养液清洗细胞并 将细胞浓度调整至2 X IO6细胞/毫升备用。在24孔细胞培养盘中，每孔加入2 X 10 5hPBMC 细胞，及IO8CFU经热杀处理的副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151或代田菌。将培养盘置于含 10%二氧化碳的培养箱中，以37°C培养48小时后，收集细胞培养上清液，以酵素免疫分析 法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定干扰素 IFN-γ 及介白素 IL-10 的 含量，结果见图6。
[0081] 图6-A为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151对hPBMC分泌IFN-γ能力的影响 图6-B为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151对hPBMC分泌IL-10能力的影响。由图中 可看出，本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种VO151和代田菌类似，具有促进hPBMC分泌IFN- γ 和IL-10的能力，由此可预期，热杀死菌V0151确实具有抑制过敏和调节免疫反应的能力。
[0082] 实施例7 :热杀死菌V0151的体外抗发炎能力
[0083] 脂多醣（Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜成分，是一种 用来诱发发炎反应的重要因子之一。脂多醣经巨噬细胞接受器接受后，会促进转录因子 NF- κ B(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)活化，进 而促进一氧化氮合成酶（NO synthase，iNOS)和环氧酵素-2 (cyclooxygenase-2，C0X-2) 的活化，以产生一氧化氮和前列腺素群（Prostaglandins，PGs)，并引发发炎反应。因此， iNOS和C0X-2的表现量可以作为乳酸菌抗发炎反应的检测指标。基因转殖巨噬细胞株 RAW264. 7iN0S及RAW264. 7C0X2系分别将iNOS与C0X-2基因之操控子区段，接于荧光素酶 (Iuciferase)基因前面，再转殖入巨噬细胞中，所建构成之细胞评估系统。当iNOS和C0X-2 基因受到活化而启动时，荧光素酶即会被表现而产生荧光反应。
[0084] 两细胞株RAW264. 7iN0S及RAW264. 7C0X2分别培养于12孔盘（5父105细胞/孔）24 小时后，以新鲜DMEM细胞培养液前处理一小时，再加入脂多醣（1 μ g/mL)刺激三小时。移 除DMEM细胞培养液后，每一孔槽分别加入悬浮于DMEM细胞培养液，浓度为I X IO7CFU/毫升 (细胞数：菌数=1 :20)的副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)LGG(以下简称LGG)或代田菌之热杀菌体。培养24小时后，移除DMEM细胞培养 液，并且加入细胞裂解液（passive lysis buffer)反应30分钟，收集上清液，进行焚光素 酶冷光分析。
[0085] 表6所示为巨噬细胞受到脂多醣刺激，再与不同乳酸菌株反应后，iNOS和C0X-2的 表现结果比较表。实验结果显示，V0151可降低促发炎因子iNOS和C0X-2的表现，进而减 缓发炎反应。
[0086] 表6、巨噬细胞受到脂多醣刺激后与不同乳酸菌株反应的iNOS和C0X-2的表现
[0087]
[0088] 实施例8 :热杀死菌V0151的体外抗发炎能力（小鼠试验）
[0089] 选用8周龄BALB/c母鼠，每日喂食108与IO7CFU热杀死菌（热杀条件：80°C，20 分钟），总喂食时间为一个月。将小鼠牺牲后，取出脾脏进行初代培养，细胞浓度为lx IO6 细胞/孔，培养于24孔培养皿，添加脂多醣（600ng/mL/孔）处理96小时后，测定其细胞激 素。脂多醣为一促发炎物质，可刺激脾脏细胞分泌促发炎细胞激素 TNF-α、IL_6及IL-I β 等。从图7可知，喂食热杀死菌V0151组的脾脏细胞经脂多醣刺激后之TNF-α (如图7-Α 所示）与IL_6(如图7-Β所示）分泌量显著下降，而IL-Ιβ分泌量亦有下降的趋势（如图 7-C所示），显示小鼠摄取热杀死菌V0151后，重要免疫器官抗发炎能力显著提升。
[0090] 实施例9 :热杀死菌VO151的抑制过敏能力（小鼠试验）
[0091] 选用8周龄BALB/c母鼠于实验第0及第14日腹腔注射20 μ g卵清 蛋白 (ovalbumin, 0VA)/2mg 氢氧化错（aluminum hydroxide)/200 yL PBS 致敏，第21 日牺牲，取 出脾脏进行初代培养，细胞浓度为lx IO6细胞/孔，给予终浓度为100 μ g/mL OVA刺激，仿 真免疫系统处于过敏反应的状况，同时加入热杀死菌V0151，使细胞与菌体比例为1 :20、1 : 10 与 1:1 (感染复数（multiplicity of infection, Μ0Ι) =20、10、1)。于培养 96 小时后 收集上清液，测定细胞激素 IL-4、IL-5、IL-12与IL-13的浓度。
[0092] 体内T细胞分化是受不同细胞激素或抗原刺激所影响，IL-12刺激Thl分化，IL-4 则刺激Th2分化。从图8结果可知，致敏小鼠的脾细胞经OVA刺激后，IL-12并无显著变 化。IL-12是抗原呈现细胞（例如树突细胞或巨噬细胞）所释放的细胞激素，参与Thl型 免疫反应，可促进ThO细胞朝Thl分化。给予热杀死菌V0151的处理后，IL-12浓度显著增 加（如图8所示）。此外，随着感染复数增加，IL-12浓度也显著上升。此结果表示热杀死 菌V0151能显著提高Thl型免疫反应，且随着剂量增加，功效愈强。
[0093] 而在调节Th2型免疫反应方面，热杀死菌V0151也具有明显功效。过敏患者是由于 接触过敏原后，Th2细胞过度反应释放IL-4、IL-5与IL-13等细胞激素，进而使肥大细胞释 放大量发炎介质。由图9至图11可知，热杀死菌VO151可显著的降低脾细胞分泌的IL-4 (如 图9所示）、IL-5(如图10所示）与IL-13(如图11所示）等细胞激素，显示V0151具有减 少Th2细胞过度反应的能力。临床上，治疗气喘药物NuvanceTM为一种水溶性的IL-4受体 a (IL-4Ra)，能与IL-4结合，减少IL-4与初始T细胞（nalfve T cell)上的IL-4R结合，达 到抑制Th2细胞分化的效果。本试验中，热杀死菌V0151显著降低脾细胞分泌的IL-4,进而 降低Th2免疫反应。综合以上实验可知，热杀死菌V0151能显著提高Thl型免疫反应、降低 Th2细胞过度反应，而具有优异的免疫调节能力和抑制过敏能力。
[0094] 实施例10 :V0151作为发酵剂生产乳酸菌饮料
[0095] 脱脂奶粉与葡萄糖以5:1的比例溶于60±5°C水，定容至1L，静止水合30分钟， 95±1°〇杀菌1.5小时，￥0151及1^-802〇^(^(*3(^11118 1161￥6衍(3118)以2.5:1的比例接 种进行发酵，发酵温度37土 1°C，发酵终点乳酸度2. 55±0. 05g/100g，发酵完成后将发酵液 与糖液以1:4的比例混合均匀并进行均质，均质压力4/18MPa，料液加热至92°C时，进行灌 装，即乳酸菌饮料。
[0096] 实施例11 :V0151作为发酵剂生产功能性酸奶
[0097] 全脂奶粉94g加入50±5°C水，溶解后静止水合30分钟，加入炼乳68g升温至 62 ± I °C，与预先以3:1混合均匀的白砂糖和安定剂68g充分搅拌溶解，加入香精搅拌5分 钟，定容至IL并进行均质，均质压力160bar，料液以95 ± 1°C杀菌5分钟后冷却至42 ± I °C， 接种发酵菌（嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌）与V0151-起进行发酵，发酵温度42±1°C， 终点酸度73-75° T，发酵完成后进行破乳至成品粘度为700-1200cp，成品以76± 1°C杀菌 30秒钟，快速冷却以无菌灌装，即功能性酸奶成品。本例中V0151的添加也可于发酵完成 后及无菌装罐前的程序中添加。
[0098] 实施例12 :以V0151生产乳酸菌组合物粉剂
[0099] 一种含有活性益生菌的粉末状食用乳酸菌组合物粉剂产品，该活菌粉原料采用副 干酪乳杆菌V0151菌粉，并搭配植物乳杆菌、乳酸杆菌、双岐乳杆菌菌粉，总活菌数大于等 于每克产品中5X109CFU，意即每袋产品中活菌数含量大于等于IXIO iciCFU;益生元是聚葡 萄糖、低聚木糖、菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖，食品添加剂则包括果粉、木糖醇、柠檬酸、三 氯蔗糖、食用香精。选用益生元与食品添加剂多种按照一定比例混匀，先进行分批预混合后 再行大型混和，而后以隔绝氧气及水气之铝膜袋、纸盒、纸箱进行包装，并进行漏气检查及 异物杂质检查确保密封及产品洁净度，最终存放于25±2°C以下的环境当中。出厂产品控制 水分、大肠杆菌及活菌数，并定期检验重金属等项目。
[0100] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种副干酪乳杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo. 8903。2. 根据权利要求1所述副干酪乳杆菌，其特征在于，pheS序列如SEQIDNO: 1所示。3. 根据权利要求1所述副干酪乳杆菌，其特征在于，其为灭活菌。4. 权利要求1-3任意一项所述副干酪乳杆菌在制备食品、保健品、药品、食品补充剂中 的应用。5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述食品、保健品、药品、食品补充剂、食品 均具有抑制过敏、调节免疫反应和抗发炎功效。6. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述免疫反应为与IFN-Y、IL-I0、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-a、一氧化氮合成酶、环氧合酶-2及其组合相关的免 疫反应。7. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述过敏为与IL-4、IL-5、IL-12、IL-13及 其组合相关的过敏。8. 根据权利要求5或7所述应用，其特征在于，所述过敏为可以引发如下炎症反应的过 敏： 气管反应过度、气管反应发炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、 外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。9. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述发炎为与IFN-y、IL-I0、IL-6、IL-10、 TNF-a、一氧化氮合成酶、环氧合酶-2及其组合相关的发炎。10. 根据权利要求5或9所述应用，其特征在于，所述发炎为气管反应过度、气管反应发 炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血 管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。11. 一种食品，其特征在于，以保藏编号为CGMCCNo. 8903的菌株进行制备。12. 根据权利要求11所述食品，其特征在于、所述食品为乳制品。13. -种乳酸菌组合物，其特征在于，包含保藏编号为CGMCCNo. 8903的副干酪乳杆菌 和可接受的辅料。14. 根据权利要求13所述组合物，其特征在于，所述辅料选自乳糖、干燥淀粉、淀粉糊、 糊精、环糊精、羧甲基淀粉钠、羧基淀粉丙酸酯、微晶性纤维素、羧甲基纤维素、麦芽糊精、硬 脂酸镁及其类似物。15. 根据权利要求13或14所述组合物，其特征在于，还包括益生菌、益生元、食品添加 剂中的一种或两种。16. 根据权利要求15所述组合物，其特征在于，所述益生元选自聚葡萄糖、低聚木糖、 菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖及其类似物。17. 根据权利要求15所述组合物，其特征在于，所述食品添加剂选自果粉、木糖醇、柠 檬酸、三氯蔗糖、食用香精及其类似物。18. 根据权利要求13所述组合物，其特征在于，其为口服制剂。19. 根据权利要求18所述组合物，其特征在于，所述口服制剂为溶液、悬浮液、乳剂、粉 剂、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、口嚼胶或胶囊。
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体公开了一种副干酪乳杆菌及其应用。本发明所述副干酪乳杆菌保藏编号为CGMCC No.8903，分离自孩童粪便、属于副干酪乳杆菌副干酪亚种。本发明所述菌株增殖快速且产酸能力优异，具有分泌胞外多醣以及对抗胆盐和胃酸侵袭的能力，更可调节免疫反应、抑制过敏和发炎现象，十分适合用于食品、保健品、药品、食品补充剂等产品的制备。CGMCC No.890320140307
【IPC分类】A61P37/08, A61K35/747, A61P29/00, A23L1/29, C12N1/20, A61P37/02
【公开号】CN104894021
【申请号】CN201510298723
【发明人】洪维鍊, 杨政华, 陈俊江, 曹永梅, 蔡英杰
【申请人】宜兰食品工业股份有限公司, 上海旺旺食品集团有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月3日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种副干酪乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前，免疫症状诸如过敏、气喘、慢性鼻炎、异位性皮肤炎（atopic dermatitis)或 是发炎症状在发展中国家或发达国家有越来越普及的趋势。最常使用的治疗方法是口服或 涂抹类固醇，然而其缺点是容易产生副作用例如使病人变胖或增加感染率，甚至有致死的 风险。许多研宄团队正在开发更安全的方法，尽可能在减少副作用的前提下，舒缓或是预防 过敏和免疫疾病。
[0003] 目前普遍已知乳酸杆菌（Lactobacillus spp.)是一群生活在机体内益于宿主健 康的微生物，它维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可。乳酸杆菌属的特定菌 株已被发现能够定殖于肠道粘膜，并协助维持人类和动物的健康，例如抗发炎活性和免疫 调节活性。热灭活的干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei)代田株（strain Shirota) (LcS) 刺激IL-12的分泌，使免疫反应朝向Thl为主状态，藉以抑制IgE之产生。将热致死嗜酸乳 杆菌（Lactobacillus acidophilus)L-55 口服给予经卵清蛋白（简称0VA)致敏的BALB/c 小鼠，结果显示可抑制由OVA诱导之鼻部症状，如打喷嚏及揉鼻。
[0004] 目前的健康产业努力尝试开发新颖可食用且具有特殊功效的乳酸菌种。乳酸杆菌 已有很长的食用历史，属于公认安全（Generally Regarded as Safe, G.R.A.S)的菌属，在 适当条件培养下通常能产生良好的风味，有些菌株甚至能表现出绝佳的产酸能力以及优异 的免疫调节功效，大幅提升产品价值。如干酪乳酸杆菌代田株，其是著名乳酸菌饮料养乐多 中采用的一种乳酸杆菌，虽然其具有一定的产酸能力、免疫调节功能和抗发炎活性等，但是 由于不同菌株的特性与能力，乳酸杆菌的效果是可变且不可预期的。因此，仍有必要发展在 产酸能力、免疫调节功能和抗发炎活性等方面更加优异的乳酸菌。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具 有更加优异的产酸能力。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的消化道存活能力，即提高其抗酸和抗胆盐能力。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的分泌胞外多糖的能力。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的抑制过敏和调节免疫反应的能力。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌，使得所述副干酪乳杆菌具有更 加优异的抗发炎能力。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供所述副干酪乳杆菌在乳制品制备、保健品制备、药 物制备、食品补充剂制备、食品制备中的应用。
[0011] 为实现本发明目的，本发明提供一种分离自台湾孩童之粪便的副干酪乳杆菌，命 名为菌株为V0151。V0151以MRS培养基于37°C下培养一天后，抽取其基因组DNA，并利用 16s rDNA和pheS引物对于该基因组DNA进行PCR扩增，并利用美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对，经 过比对鉴定为副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)， V0151 的 pheS 序列如 SEQ ID NO: 1 所示。
[0012] V0151于2013年6月27日寄存德国微生物及细胞保存中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，寄存编号为 DSM27448。于 2014 年 03 月 07 日寄 存中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCC No. 8903。
[0013] 作为优选，所述副干酪乳杆菌V0151经热去活化，为灭活菌。
[0014] 相比现有产品养乐多中的干酪乳酸杆菌代田株，本发明所述副干酪乳杆菌V0151 具有更加优异的产酸能力、抗酸和胆盐能力、调节免疫反应能留、抑制过敏和发炎症状的能 力。基于此，本发明提供了所述副干酪乳杆菌V0151在制备食品、保健品、药品、食品补充剂 中的应用，特别是在制备具有抑制过敏、调节免疫反应和抗发炎功效的食品、保健品、药品、 食品补充剂中。其中，所述食品优选为乳制品，更优选为功能性酸奶和乳酸菌饮料。
[0015] 作为优选，所述免疫反应为与 IFN-γ、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、 IL-13、TNF- α、一氧化氮合成酶、环氧合酶-2及其组合相关的免疫反应。
[0016] 作为优选，所述过敏为与IL-4、IL-5、IL-12、IL-13及其组合相关的过敏。进一步 优选地，所述过敏为可以引发如下炎症反应的过敏：
[0017] 气管反应过度、气管反应发炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺 炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。
[0018] 作为优选，所述发炎为与IFN-γ、IL-I β、IL-6、IL-KKTNF-α、一氧化氮合成酶、 环氧合酶-2及其组合相关的发炎。进一步优选地，所述发炎为气管反应过度、气管反应发 炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血 管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。
[0019] 根据上述副干酪乳杆菌V0151的应用，本发明提供一种食品，以保藏编号为CGMCC No. 8903的菌株进行制备。进一步优选地、所述食品为乳制品；更优选地，所述乳制品为功 能性酸奶和乳酸菌饮料。
[0020] 此外，本发明还提供一种乳酸菌组合物，包含保藏编号为CGMCC No. 8903的副干酪 乳杆菌和可接受的辅料。
[0021] 作为优选，所述辅料选自乳糖、干燥淀粉、淀粉糊、糊精、环糊精、羧甲基淀粉钠、羧 基淀粉丙酸酯、微晶性纤维素、羧甲基纤维素、麦芽糊精、硬脂酸镁及其类似物。所述类似物 指代的是尚未在本发明中一一具体列明的本领域中常用的辅料。本发明所述辅料可以为一 种，也可以为多种，这由本领域技术人员根据实际制备情况而调节和选择。
[0022] 作为优选，所述乳酸菌组合物还包括益生菌、益生元、食品添加剂中的一种或两 种，由此配合本发明所述副干酪乳杆菌V0151优异的能力来达到最佳效果。其中，所述益生 元选自聚葡萄糖、低聚木糖、菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖及其类似物，所述类似物指代的是 尚未在本发明中一一具体列明的本领域中常用的益生元，所述益生元可以为一种，也可以 为多种，这由本领域技术人员根据实际制备情况而调节和选择。
[0023] 作为优选，所述食品添加剂选自果粉、木糖醇、柠檬酸、三氯蔗糖、食用香精及其类 似物，所述类似物指代的是尚未在本发明中一一具体列明的本领域中常用的食品添加剂， 所述食品添加剂可以为一种，也可以为多种，这由本领域技术人员根据实际制备情况而调 节和选择。
[0024] 本发明所述乳酸菌组合物可以制备成任意一剂型，作为优选，其为口服制剂。进 一步优选地，所述口服制剂为溶液、悬浮液、乳剂、粉剂、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、口嚼胶或胶 裳。
[0025] 由以上技术方案可知，本发明所述菌株增殖快速且产酸能力优异，具有分泌胞外 多醣以及对抗胆盐和胃酸侵袭的能力，更可调节免疫反应、抑制过敏和发炎现象，十分适合 用于食品、保健品、药品、食品补充剂等广品的制备。
[0026] 生物保藏说明
[0027] 分类命名：副干酪乳杆菌，Lactobacillus paracasei于2014年3月7日保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCC No. 8903。
【附图说明】
[0028] 图1所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌生长过程中环 境酸碱值的变化折线图；
[0029] 图2所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的产酸表现折 线图；
[0030] 图3所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的生长曲线；
[0031] 图4所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的胞外多醣产 量柱形图；
[0032] 图5所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的抗胆盐能力折线图，其中，图 例所示为胆盐1. 〇%、胆盐〇. 5%和胆盐0. 25% ;
[0033] 图6所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的免疫调节能力柱形图，其中 6-A为促进hPBMC分泌IFN- γ的能力柱形图，6-B为促进hPBMC分泌IL-10的能力柱形图；
[0034] 图7所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的抗发炎能力柱形图，其中7-A 为抑制小鼠脾细胞分泌TNF-α的能力柱形图；7-B为抑制小鼠脾细胞分泌IL-6的能力柱 形图；7-C为抑制小鼠脾细胞分泌IL-I β的能力柱形图；
[0035] 图8所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151促进小鼠脾细胞分泌IL-12的 能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20感 染复数组；
[0036] 图9所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抑制小鼠脾细胞分泌IL-4的 能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20感 染复数组；
[0037] 图10所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抑制小鼠脾细胞分泌IL-5的 能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20感 染复数组；
[0038] 图11所示为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抑制小鼠脾细胞分泌IL-13 的能力柱形图，其中横坐标依次表示对照组、OVA刺激组，1感染复数组、10感染复数组、20 感染复数组。
【具体实施方式】
[0039] 本发明公开了 一种副干酪乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述副干酪乳杆菌已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法 和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0040] 本发明【具体实施方式】中的试验结果数据皆以平均值土标准差（Means土SD)表示。 统计分析使用单因子变异数分析（One-way analysis of variance (One-way ANOVA))，并以 Tukey多重比较检定（Tukey's Multiple Comparison Test)作为后测比较组间差异，当组 间差异达统计上意义以*(Ρ〈〇·〇5)、**(ρ〈0·01)、*#(ρ〈0·001)或不同英文字母（a，b)表 不O
[0041] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0042] 实施例1 :16s rDNA和pheS序列鉴定
[0043] V0151分离自台湾孩童粪便，以MRS培养基于37°C下培养一天后，抽取其基因组 DNA，并利用16s rDNA和pheS引物（如表1所示）对于该基因组DNA进行聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信 息中心（National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株 比对，结果见表2和表3。
[0044] 表 1、16s rDNA 和 pheS 引物序列
[0045]
[0046] 表2为利用16S rDNA引物进行增殖的序列比对结果，V0151的16S rDNA序列相 同于另两株副干酪乳杆菌副干酪亚种之菌株（AM087710、AM087711)，但和其它几株乳杆菌 属的菌株有些序列上的差异。因此，分离株V0151可以确认为副干酪乳杆菌。
[0047] 由于副干酪乳杆菌种群内16S rDNA相似性在99. 9%以上，种水平分辨率较低， 为进一步辨识V0151的身份，利用pheS引物增殖的序列进行进一步序列比对，pheS序 列可表现出较大的种间差异性。比对结果如表3所示，V0151与副干酪乳杆菌副干酪亚 种（L.paracasei subsp.paracasei)(AM087710)和副干酷乳杆菌坚初亚种（L.paracasei subsp. tolerans) (AM087711)近似度高达91. 8%和91. 4%，但仍非完全相同，且与其它种 类的乳酸菌近似度明显较低，因此可以判定V0151为一种全新的副干酪乳杆菌副干酪亚 种。
[0048] 表2、16S rDNA序列之比对结果
[0049]
[0050] 表3、pheS序列之比对结果
[0051]
[0052] 经过鉴定确认其所属菌种后，副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151根据布达佩斯协 议（Budapest Treaty)分别于2013年6月27日寄存德国微生物及细胞保存中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (Inhoffenstr. 7B, D-38124Braunsc hweig，Germany)，寄存编号为DSM27448,以及2014年03月07日寄存中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No :8903。此生物材料已经存活试验测试并 通过该试验。
[0053] 实施例2 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的发酵能力
[0054] 利用API 50CHL快速鉴定套组（bioMerieux, France)测试副干酪乳杆菌副干酪亚 种V0151对各种不同碳水化合物基质的发酵能力，结果如表4所示。
[0055] 表4、副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151对不同碳水化合物基质的发酵能力
[0056]
!广 1-1 卞山~~1 · y 1 ~λ (Ι.?? -fc=P ~ /.J- OZt I 卞山~1 · / 1 ~Λ -fc=P ~I /.J- CO ( ( < (
[0057] +:阳性；-:阴性
[0058] 实施例3 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的产酸能力
[0059] 副干酪乳杆菌副干酪亚种VO151培养于MRS培养基中，于第24、36及72小时取出 菌液进行涂布培养并计数。取出二次活化菌液体积的百分之一，以脱脂牛奶为基础的培养 液在37°C下培养24小时、36及72小时，取出发酵后的培养液检测培养液酸碱值并进行酸 滴定试验，同时取分离自养乐多的代田菌作为对照。
[0060] 在酸滴定试验中，每5公克发酵后的培养液系混合于20毫升的纯水，并以浓度 〇. IN的氢氧化钠进行滴定以计算待测菌株的产酸量。滴定终点定为pH值8. 30至8. 32间， 乳酸菌产酸量计算公式如下：
[0061] 产酸量（％)=〇· IN氢氧化钠体积（毫升）XFX0. 009/发酵后的培养液重量（公 克）XlOO
[0062] F表示0· IN氢氧化钠的力价；
[0063] 结果见图1-图3。图1为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌 生长过程中环境酸碱值的变化。图2为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代 田菌的产酸表现。图3为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的生长曲 线。
[0064] 由图1-图3中可看出，副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的生长速率明显优于代田 菌，亦具有较佳的产酸能力，因此，培养副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的菌液酸碱值在培 养48小时后有明显急剧的下降现象。由于进行乳酸菌筛选时，产酸能力是一个相当重要的 观察指标，而副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151相对于养乐多代田菌来说，更展现了较佳的 产酸能力，产酸速率也比代田菌更为快速。
[0065] 实施例4 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151胞外多糖产量
[0066] 乳酸菌所分泌的胞外多醣通常会影响流体特性、性质或是发酵乳制品的风味，并 且会表现出某些生理功能。选用具有分泌胞外多醣能力的乳酸菌来取代现行的发酵添加物 已越来越普遍且渐成趋势。
[0067] 将V0151于分别含有2%果糖或蔗糖的MRS培养液大量培养，以95%酒精将 培养 液中的多醣沉淀下来，以酚硫法测定多醣含量，以分离自养乐多的多田菌为对照，结果见图 4〇
[0068] 由图中可看出，在选用蔗糖和果糖为碳源的状况下，每公升副干酪乳杆菌副干酪 亚种V0151培养液产生的胞外多醣产量分别为0. 432±0. 006和0. 329±0. 008公克，皆远 优于代田菌的〇. 246±0. 005和0. 251 ±0. 009公克。
[0069] 实施例5 :副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151抗酸和抗胆盐能力
[0070] 乳酸菌抗酸能力的测试是探讨乳酸菌在不同酸碱度培养基的培养下，经过一段时 间后乳酸菌的存活比例。所使用的菌数如表5所示，取二次活化的副干酪乳杆菌副干酪亚 种V0151菌液各Iml，分别加至pH值为2. 3、2. 5和3. 0的9ml PBS缓冲液中，菌液与缓冲液 混合均匀后，置于37°C培养箱中，1. 5小时后以MRS平板法测定活菌数，以分离自养乐多的 多田菌为对照。
[0071] 结果如表5所示，表5为副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的抗酸 能力比较表，由表中可以看出，副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151在酸性环境下培养1. 5小 时，存活率高于代田菌，表明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151具有在消化道中稳定存活的 能力。
[0072] 表5、副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151与养乐多代田菌的抗酸能力
[0073]
[0074] 乳酸菌抗胆盐的能力测试则是观察乳酸菌在不同胆盐浓度的环境下存活比例。取 二次活化的副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151菌液各200 μ 1，加至9. 8ml MRS培养基（分别 含0.25%、0. 5%胆盐，pH 7.0)中，混合均匀后，置于37°C培养箱中，24小时后以MRS平板 法测定活菌数，以分离自养乐多的多田菌为对照。
[0075] 如第5图所示，其系说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的抗胆盐能力。 胆盐是由肝脏所分泌，并且会抑制消化道中的微生物生长，然而，副干酪乳杆菌副干酪亚种 V0151在0. 25%低胆盐浓度的状态下，其生长并不会受到明显的抑制。
[0076] 实施例6 :热杀死菌V0151的体外免疫调节能力
[0077] 目前已知有两种辅助型T细胞（helper T cell)，分别是Thl细胞和Th2细胞。 Thl细胞可以分泌干扰素 -γ (Interferon- γ，IFN- γ )，并且刺激B细胞分泌免疫球蛋白 G(IgG)，而Th2细胞则可以分泌介白素-4(Interleukin-4, IL-4)、IL-5和刺激B细胞分泌 免疫球蛋白E(IgE)。在正常状况下，Thl细胞和Th2细胞具有相互拮抗的作用，当Thl细胞 增加时，IFN- γ会抑制Th2细胞的过度表现并且降低Th2细胞的免疫反应。此外，由Th2细 胞分泌的细胞素（cytokines)也会抑制Thl细胞的活化以减少Th2细胞的免疫反应。而过 敏原则会增加 Th2细胞的反应与IgE的分泌而引发过敏。
[0078] 此外，调节型T细胞（regulatory T cell，Treg)、辅助型T细胞和B细胞则会分 泌IL-10, IL-10有助于抑制发炎反应并调节免疫反应。
[0079] 因此藉由检测IFN-γ和IL-10的含量可以评估并比较不同组别的免疫调节功 能，以鉴别出具有抗过敏潜力且能适度增加 Thl细胞反应或减少Th2细胞反应的理想乳 酸菌株。人类周边血液单核球细胞包括了多种免疫细胞和少量的自然杀手细胞（natural killer cells)，系广泛应用于刺激免疫反应以评估乳酸菌的免疫调节能力
[0080] 本试验系利用人类周边血液单核球细胞（Human Peripheral Blood Mononuclear Cells，hPBMC)模式来测试本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151的免疫调节能力。试验中 的hPBMC系分离自健康捐赠者的静脉血液，方法如后。将静脉血加到肝素抗凝管中后，加入 Ficoll-PaqueTM PLUS单核球细胞分离液混合均匀，并由棕黄层（buffy coat)取得人类周 边血液单核细胞。使用Turk试剂进行细胞计数后，利用RPMI-1640细胞培养液清洗细胞并 将细胞浓度调整至2 X IO6细胞/毫升备用。在24孔细胞培养盘中，每孔加入2 X 10 5hPBMC 细胞，及IO8CFU经热杀处理的副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151或代田菌。将培养盘置于含 10%二氧化碳的培养箱中，以37°C培养48小时后，收集细胞培养上清液，以酵素免疫分析 法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定干扰素 IFN-γ 及介白素 IL-10 的 含量，结果见图6。
[0081] 图6-A为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151对hPBMC分泌IFN-γ能力的影响 图6-B为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151对hPBMC分泌IL-10能力的影响。由图中 可看出，本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种VO151和代田菌类似，具有促进hPBMC分泌IFN- γ 和IL-10的能力，由此可预期，热杀死菌V0151确实具有抑制过敏和调节免疫反应的能力。
[0082] 实施例7 :热杀死菌V0151的体外抗发炎能力
[0083] 脂多醣（Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜成分，是一种 用来诱发发炎反应的重要因子之一。脂多醣经巨噬细胞接受器接受后，会促进转录因子 NF- κ B(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)活化，进 而促进一氧化氮合成酶（NO synthase，iNOS)和环氧酵素-2 (cyclooxygenase-2，C0X-2) 的活化，以产生一氧化氮和前列腺素群（Prostaglandins，PGs)，并引发发炎反应。因此， iNOS和C0X-2的表现量可以作为乳酸菌抗发炎反应的检测指标。基因转殖巨噬细胞株 RAW264. 7iN0S及RAW264. 7C0X2系分别将iNOS与C0X-2基因之操控子区段，接于荧光素酶 (Iuciferase)基因前面，再转殖入巨噬细胞中，所建构成之细胞评估系统。当iNOS和C0X-2 基因受到活化而启动时，荧光素酶即会被表现而产生荧光反应。
[0084] 两细胞株RAW264. 7iN0S及RAW264. 7C0X2分别培养于12孔盘（5父105细胞/孔）24 小时后，以新鲜DMEM细胞培养液前处理一小时，再加入脂多醣（1 μ g/mL)刺激三小时。移 除DMEM细胞培养液后，每一孔槽分别加入悬浮于DMEM细胞培养液，浓度为I X IO7CFU/毫升 (细胞数：菌数=1 :20)的副干酪乳杆菌副干酪亚种V0151、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)LGG(以下简称LGG)或代田菌之热杀菌体。培养24小时后，移除DMEM细胞培养 液，并且加入细胞裂解液（passive lysis buffer)反应30分钟，收集上清液，进行焚光素 酶冷光分析。
[0085] 表6所示为巨噬细胞受到脂多醣刺激，再与不同乳酸菌株反应后，iNOS和C0X-2的 表现结果比较表。实验结果显示，V0151可降低促发炎因子iNOS和C0X-2的表现，进而减 缓发炎反应。
[0086] 表6、巨噬细胞受到脂多醣刺激后与不同乳酸菌株反应的iNOS和C0X-2的表现
[0087]
[0088] 实施例8 :热杀死菌V0151的体外抗发炎能力（小鼠试验）
[0089] 选用8周龄BALB/c母鼠，每日喂食108与IO7CFU热杀死菌（热杀条件：80°C，20 分钟），总喂食时间为一个月。将小鼠牺牲后，取出脾脏进行初代培养，细胞浓度为lx IO6 细胞/孔，培养于24孔培养皿，添加脂多醣（600ng/mL/孔）处理96小时后，测定其细胞激 素。脂多醣为一促发炎物质，可刺激脾脏细胞分泌促发炎细胞激素 TNF-α、IL_6及IL-I β 等。从图7可知，喂食热杀死菌V0151组的脾脏细胞经脂多醣刺激后之TNF-α (如图7-Α 所示）与IL_6(如图7-Β所示）分泌量显著下降，而IL-Ιβ分泌量亦有下降的趋势（如图 7-C所示），显示小鼠摄取热杀死菌V0151后，重要免疫器官抗发炎能力显著提升。
[0090] 实施例9 :热杀死菌VO151的抑制过敏能力（小鼠试验）
[0091] 选用8周龄BALB/c母鼠于实验第0及第14日腹腔注射20 μ g卵清 蛋白 (ovalbumin, 0VA)/2mg 氢氧化错（aluminum hydroxide)/200 yL PBS 致敏，第21 日牺牲，取 出脾脏进行初代培养，细胞浓度为lx IO6细胞/孔，给予终浓度为100 μ g/mL OVA刺激，仿 真免疫系统处于过敏反应的状况，同时加入热杀死菌V0151，使细胞与菌体比例为1 :20、1 : 10 与 1:1 (感染复数（multiplicity of infection, Μ0Ι) =20、10、1)。于培养 96 小时后 收集上清液，测定细胞激素 IL-4、IL-5、IL-12与IL-13的浓度。
[0092] 体内T细胞分化是受不同细胞激素或抗原刺激所影响，IL-12刺激Thl分化，IL-4 则刺激Th2分化。从图8结果可知，致敏小鼠的脾细胞经OVA刺激后，IL-12并无显著变 化。IL-12是抗原呈现细胞（例如树突细胞或巨噬细胞）所释放的细胞激素，参与Thl型 免疫反应，可促进ThO细胞朝Thl分化。给予热杀死菌V0151的处理后，IL-12浓度显著增 加（如图8所示）。此外，随着感染复数增加，IL-12浓度也显著上升。此结果表示热杀死 菌V0151能显著提高Thl型免疫反应，且随着剂量增加，功效愈强。
[0093] 而在调节Th2型免疫反应方面，热杀死菌V0151也具有明显功效。过敏患者是由于 接触过敏原后，Th2细胞过度反应释放IL-4、IL-5与IL-13等细胞激素，进而使肥大细胞释 放大量发炎介质。由图9至图11可知，热杀死菌VO151可显著的降低脾细胞分泌的IL-4 (如 图9所示）、IL-5(如图10所示）与IL-13(如图11所示）等细胞激素，显示V0151具有减 少Th2细胞过度反应的能力。临床上，治疗气喘药物NuvanceTM为一种水溶性的IL-4受体 a (IL-4Ra)，能与IL-4结合，减少IL-4与初始T细胞（nalfve T cell)上的IL-4R结合，达 到抑制Th2细胞分化的效果。本试验中，热杀死菌V0151显著降低脾细胞分泌的IL-4,进而 降低Th2免疫反应。综合以上实验可知，热杀死菌V0151能显著提高Thl型免疫反应、降低 Th2细胞过度反应，而具有优异的免疫调节能力和抑制过敏能力。
[0094] 实施例10 :V0151作为发酵剂生产乳酸菌饮料
[0095] 脱脂奶粉与葡萄糖以5:1的比例溶于60±5°C水，定容至1L，静止水合30分钟， 95±1°〇杀菌1.5小时，￥0151及1^-802〇^(^(*3(^11118 1161￥6衍(3118)以2.5:1的比例接 种进行发酵，发酵温度37土 1°C，发酵终点乳酸度2. 55±0. 05g/100g，发酵完成后将发酵液 与糖液以1:4的比例混合均匀并进行均质，均质压力4/18MPa，料液加热至92°C时，进行灌 装，即乳酸菌饮料。
[0096] 实施例11 :V0151作为发酵剂生产功能性酸奶
[0097] 全脂奶粉94g加入50±5°C水，溶解后静止水合30分钟，加入炼乳68g升温至 62 ± I °C，与预先以3:1混合均匀的白砂糖和安定剂68g充分搅拌溶解，加入香精搅拌5分 钟，定容至IL并进行均质，均质压力160bar，料液以95 ± 1°C杀菌5分钟后冷却至42 ± I °C， 接种发酵菌（嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌）与V0151-起进行发酵，发酵温度42±1°C， 终点酸度73-75° T，发酵完成后进行破乳至成品粘度为700-1200cp，成品以76± 1°C杀菌 30秒钟，快速冷却以无菌灌装，即功能性酸奶成品。本例中V0151的添加也可于发酵完成 后及无菌装罐前的程序中添加。
[0098] 实施例12 :以V0151生产乳酸菌组合物粉剂
[0099] 一种含有活性益生菌的粉末状食用乳酸菌组合物粉剂产品，该活菌粉原料采用副 干酪乳杆菌V0151菌粉，并搭配植物乳杆菌、乳酸杆菌、双岐乳杆菌菌粉，总活菌数大于等 于每克产品中5X109CFU，意即每袋产品中活菌数含量大于等于IXIO iciCFU;益生元是聚葡 萄糖、低聚木糖、菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖，食品添加剂则包括果粉、木糖醇、柠檬酸、三 氯蔗糖、食用香精。选用益生元与食品添加剂多种按照一定比例混匀，先进行分批预混合后 再行大型混和，而后以隔绝氧气及水气之铝膜袋、纸盒、纸箱进行包装，并进行漏气检查及 异物杂质检查确保密封及产品洁净度，最终存放于25±2°C以下的环境当中。出厂产品控制 水分、大肠杆菌及活菌数，并定期检验重金属等项目。
[0100] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种副干酪乳杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo. 8903。2. 根据权利要求1所述副干酪乳杆菌，其特征在于，pheS序列如SEQIDNO: 1所示。3. 根据权利要求1所述副干酪乳杆菌，其特征在于，其为灭活菌。4. 权利要求1-3任意一项所述副干酪乳杆菌在制备食品、保健品、药品、食品补充剂中 的应用。5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述食品、保健品、药品、食品补充剂、食品 均具有抑制过敏、调节免疫反应和抗发炎功效。6. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述免疫反应为与IFN-Y、IL-I0、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-a、一氧化氮合成酶、环氧合酶-2及其组合相关的免 疫反应。7. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述过敏为与IL-4、IL-5、IL-12、IL-13及 其组合相关的过敏。8. 根据权利要求5或7所述应用，其特征在于，所述过敏为可以引发如下炎症反应的过 敏： 气管反应过度、气管反应发炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、 外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。9. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述发炎为与IFN-y、IL-I0、IL-6、IL-10、 TNF-a、一氧化氮合成酶、环氧合酶-2及其组合相关的发炎。10. 根据权利要求5或9所述应用，其特征在于，所述发炎为气管反应过度、气管反应发 炎、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻瘆、血 管性水肿、花粉热、食物过敏或气喘。11. 一种食品，其特征在于，以保藏编号为CGMCCNo. 8903的菌株进行制备。12. 根据权利要求11所述食品，其特征在于、所述食品为乳制品。13. -种乳酸菌组合物，其特征在于，包含保藏编号为CGMCCNo. 8903的副干酪乳杆菌 和可接受的辅料。14. 根据权利要求13所述组合物，其特征在于，所述辅料选自乳糖、干燥淀粉、淀粉糊、 糊精、环糊精、羧甲基淀粉钠、羧基淀粉丙酸酯、微晶性纤维素、羧甲基纤维素、麦芽糊精、硬 脂酸镁及其类似物。15. 根据权利要求13或14所述组合物，其特征在于，还包括益生菌、益生元、食品添加 剂中的一种或两种。16. 根据权利要求15所述组合物，其特征在于，所述益生元选自聚葡萄糖、低聚木糖、 菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖及其类似物。17. 根据权利要求15所述组合物，其特征在于，所述食品添加剂选自果粉、木糖醇、柠 檬酸、三氯蔗糖、食用香精及其类似物。18. 根据权利要求13所述组合物，其特征在于，其为口服制剂。19. 根据权利要求18所述组合物，其特征在于，所述口服制剂为溶液、悬浮液、乳剂、粉 剂、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、口嚼胶或胶囊。
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体公开了一种副干酪乳杆菌及其应用。本发明所述副干酪乳杆菌保藏编号为CGMCC No.8903，分离自孩童粪便、属于副干酪乳杆菌副干酪亚种。本发明所述菌株增殖快速且产酸能力优异，具有分泌胞外多醣以及对抗胆盐和胃酸侵袭的能力，更可调节免疫反应、抑制过敏和发炎现象，十分适合用于食品、保健品、药品、食品补充剂等产品的制备。CGMCC No.890320140307
【IPC分类】A61P37/08, A61K35/747, A61P29/00, A23L1/29, C12N1/20, A61P37/02
【公开号】CN104894021
【申请号】CN201510298723
【发明人】洪维鍊, 杨政华, 陈俊江, 曹永梅, 蔡英杰
【申请人】宜兰食品工业股份有限公司, 上海旺旺食品集团有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月3日
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