一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用
一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂半乳糖苷酶，以及 一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属于生物制药技术领域。 技术背景
[0002] 叠氮胸苷、阿昔洛韦等核苷类药物是一类重要的抗肿瘤、抗病毒药物，广泛应用于 临床治疗各种癌症。叠氮胸苷是第一个抗HIV病毒药物，阿昔洛韦则是目前临床上最有效 的抗I型和II型单纯疱瘆病毒之一，对急性视网膜坏死水痘带状疱瘆病毒和EB病毒等其 他疱瘆病毒也有疗效。然而，叠氮胸苷由于高血浆浓度而引发较强的毒副作用，阿昔洛韦则 会对血液系统、神经系统、消化系统等具有一定的毒副作用。为了获得最佳治疗效果和较小 毒副作用，可以对叠氮胸苷等核苷类药物进行糖基化修饰。糖基化是一类重要的改性修饰 反应，不仅会改变化合物的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内的运输特性、亚细胞定位以 及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。研宄表明（Abram R.，Aman N.，von Borstel R.，Cell Biophysics, 1994，24-25 (I) :127-133) 5-氟尿苷的半乳糖衍 生物（5' -半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母药5-氟尿苷低100倍。Bonina等 (Bonina, F. , Puglia, C. ; Rimoli, M. G. ; Aval lone, L. , Abignente, E. ; Boatto, G. ; Nieddu, Μ. ; Meli, R. ; Amorena Μ. ; de Caprariis, Ρ. Eur. J. Pharm. Sci., 2002，16(3): 167-174)也报道了叠氮胸苷的半乳糖基衍生物不仅可以降低叠氮胸苷的血 浆浓度，而且可以保持有效浓度更长时间，避免频繁给药。
[0003] 目前，核苷糖基化衍生物主要通过化学法合成，但由于两底物中均存在多个活 性羟基或氨基，化学法的选择性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保护/脱保 护步骤，工艺非常复杂。而酶法糖基化一般只需一步反应，反应条件温和，具有很高的 区域选择性和化学选择性。然而，有关用糖苷酶催化核苷糖基化反应的报道并不多。 Binder 等(Binder ff.H. , Kiihlig Η. , Schmid ff. Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6(7):1703-1710)利用来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通过转糖基反应催化底物对硝基 苯基-β-D-半乳糖苷（/7NPG)和四种天然核苷（2' -脱氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成 了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率仅为3-7 %，区域选择性很差。Andreotti 等（Andreotti G. , Trincone A. , Giordano A. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007，47(1-2) :8-32)利用来源于海洋软体动物黑指纹海兔胰腺的β-半乳 糖苷酶，以邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（〇NPG)为糖基供体，催化叠氮胸苷半乳糖基化生成 5'-仏β-半乳糖基-叠氮胸苷，产率达到了 43 %，但其对底物的转化率仅为21. 5 %。颜丽 强等人（Yan L Q, Li Ν, Zong M Η. Journal of Biotechnology, 2012，164(2):371-375) 利用牛肝β-半乳糖苷酶以oNPG为供体进行了阿昔洛韦等无环核苷的半乳糖基化反应，但 是对底物的转化率仅有13 %，而且底物浓度仅为0.01 M。
[0004] 虽然说在过去几年中生物法糖基化修饰核苷类药物取得了一定的突破与进展，但 仍存在一些问题亟需解决。目前酶法糖基化修饰核苷类药物的糖基供体主要是oNPG或者 是/7NPG，这些相比较于寡糖来说，其价格昂贵，实际的应用价值较低。而通常的酶法催化在 水中进行，而要修饰阿昔洛韦等不溶于水或者难溶于水的化合物时，低产率及低转化率也 成为糖基化修饰的另一瓶颈。近年来不断发展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差 的问题，还可以对产物进行一定程度的调控，如果再以寡糖为糖基供体，将能很好地克服目 前生物法糖基化修饰核苷类药物存在的问题。因此，筛选以寡糖为糖基供体在非水相中糖 基化修饰核苷类药物的半乳糖苷酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的针对目前糖基化修饰核苷类药物存在的糖基供体价格昂贵、糖基化 反应转化前底物浓度低、产物摩尔转化率也较低等问题，提供一种有机溶剂耐受性好、以乳 糖为糖基供体的β -半乳糖苷酶及其产生菌，含有编码该酶基因的重组表达载体、重组表 达转化体及其高效制备方法，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方 法。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明首先从本实验室耐有机溶剂菌库中筛选获得一株 耐有机溶剂β -半乳糖苷酶产生菌，分类命名为干酪乳杆菌YZ09(L3cic^aciT7w5· casei YZ09)，其保藏编号为 CCTCC :M 2014540。
[0007] 本发明对干酪乳杆菌casei YZ09的生物学特征进行鉴定，该菌株 为革兰氏阳性菌株，无芽孢的杆菌，兼性厌氧，最适生长温度为30~40°C。其生理生化特性 表现在：过氧化氢酶反应结果为阴性，明胶反应结果为阴性，无运动，氧化葡萄糖产酸，可利 用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、果糖、麦芽糖、甘露醇等。
[0008] 经16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为ZacioAaciBw1S casei。
[0009] 本发明对该耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ09进行了产酶优化，优化后产酶量 达到了 6. 58 U/mL 本发明分离克隆到c<asi?iYZ09菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL的 编码基因，它具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达 系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂半乳糖苷 酶GAL基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂糖苷酶GAL基因全长1797个核苷酸， 编码598个氨基酸。
[0010] 本发明构建了耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL基因的表达载体。它可以通过本领域常 规方法将本发明所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种 载体，如市售的质粒、粘粒、菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制 得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的产物用限制性内切酶BamH I和Sal I 进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamH I和Sal I 双酶切，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的β-半乳糖苷酶基因的重组表达载体 ρΕ?-galo
[0011] 本发明将上述重组表达载体转化至宿主细胞制得重组表达转化体。所述的宿主可 为本领域常规的各种宿主，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发 明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表发即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌 (万.co7i) JM109 (DE3)。将前述重组表达质粒pET-^a7转化至（万.co7i) JM109 (DE3)中， 即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌（万.cWi) JM109 (DE3)/pET-辟人
[0012] 本发明还提供一种重组β-半乳糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发 明前述的重组表达转化体，获得重组表达的β_半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达 转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的β-半乳 糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7. 0。培 养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域 普通知识进行适当的选择，只要是转化体能够生长并产生本发明所述的β -半乳糖苷酶即 可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及 的重组大肠杆菌JM109 (DE3) /pET-gW接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的 光密度〇D_达到0. 6-1. 0时，在终浓度为0. 1-1. 0 mmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳 糖苷（IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组β-半乳糖苷酶。
[0013] 本发明中催化乳糖和核苷类药物转糖基得到半乳糖基核苷类衍生物的催化剂，可 以是上述产生的重组β -半乳糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离 后得到的转化体细胞。
[0014] 另一方面，本发明提供一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。 该方法包括将具有本发明半乳糖基化酶活力的物质加入含有核苷类化合物的转化夜中，进 行生物转化反应，使核苷类化合物转化为半乳糖基核苷类衍生物，所述转化液中含有核苷 类化合物和糖基供体，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦，所述糖基供体为乳糖。
[0015] 优选地，所述具有半乳糖基化酶活力物质包括具有半乳糖基化酶活力的发酵液、 发酵液上清、纯化的半乳糖基化酶和半乳糖基化酶重组表达蛋白。
[0016] 优选地，所述半乳糖基化酶为半乳糖苷酶，更优选地，所述半乳糖苷酶为 本发明中菌株ΥΖ09所产β-半乳糖苷酶或其重组表达蛋白。
[0017] 优选地，所述反应在非水 相反应条件中进行。
[0018] 优选地，所述的非水相条件为：采用5~20 %的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的 浓度为1〇~300 mmol/L，乳糖浓度为0. 1~1.5 mol/L，半乳糖酶的用量为0. 5~10 U/mL，在 pH5. 0~9. 0的缓冲溶液中，30~55 °C反应1~12 h ;优选的，非水相条件为10 %的亲水性有 机溶剂，20 mM阿昔洛韦或100 mM叠氮胸苷，500 mM乳糖的糖基供体，I U/mL β-半乳糖 苷酶，50 mM ρΗ7. 4的磷酸缓冲，45 °C反应6 h。更优选地，核苷类药物与乳糖的摩尔比为 1 ： 3~1 ： 10〇
[0019] 优选地，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、肌苷、尿苷、2'-脱氧尿苷、 5_氟_2' -脱氧尿苷、阿糖尿苷、胸苷、胞苷。
[0020] 优选地，所述的亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、乙醇或丙酮中的一种或几 种； 另一方面，本发明提供一种本发明菌株所产半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合 物中的应用，其特征在于，包括如下内容： (一）将重组大肠埃希氏菌（万.co/i) JM109 (DE3)/pET-辟人接种至含卡那霉素的LB 培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0)中，37 °C振荡培养过夜，按2 %(v/v)的接重量接入装有40 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置37 °C、180 rpm摇床培 养，当培养液OD6c?达到0. 6时，加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG作为诱导剂，30 °C诱导6 h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬 浮于pH7. 0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，得到重组β -半乳糖苷酶的 粗酶液。
[0021] (二）在ρΗ7. 4磷酸缓冲液中添加10%的二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度 为500 mmol/L，叠氮胸苷100 mmol/L或20 mM阿昔洛韦，加入上述(一）所得的粗酶液，在 45 °C，转速180 rpm条件下反应，定时取样。
[0022] 本发明的有益效果在于：本发明针对目前生物法糖基化修饰核苷类药物的研宄 中存在的糖基供体价格昂贵、部分底物水溶性差、产率及转化率低等问题，提供一种新的 半乳糖苷酶及利用重组半乳糖苷酶在非水相中修饰核苷类药物的方法。反应以廉 价易得的乳糖为糖基供体，在非水相体系中进行转糖基反应，成功克服了目前生物法糖基 化修饰核苷类药物存在的问题，具有很好的应用潜力。
【附图说明】
[0023] 图1为基因济^的PCR扩增电泳图，其中：1. DNA Marker ;2~5.基因济^的PCR 扩增产物。
[0024] 图2为重组β-半乳糖苷酶GAL的聚丙烯酰胺电泳图（1 :蛋白Marker ;2:纯酶； 3 :细胞破碎液)。
[0025] 图3为重组β -半乳糖苷酶GAL的溶剂稳定性。
[0026] 图4为pH对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0027] 图5为温度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0028] 图6为底物浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0029] 图7为乳糖浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0030] 图8为酶添加量对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0031] 图9为有机溶剂种类对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0032] 图10为有机溶剂浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0033] 图11为反应时间对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0034] 本发明所涉及的生物材料，是一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，其属于乳杆 菌属，命名为YZ09,已于2014年11月2日保存于中国典型微生物保 藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO :M 2014540。
【具体实施方式】 [0035] 实施例1 本实施例说明半乳糖基化修饰核苷类药物的耐有机溶剂菌株的筛选程序。
[0036] 初筛采用如下方法：以X-Gal (5-溴-4-氯_3_吲哚-β _D_半乳糖苷)为底物，将 本实验室耐有机溶剂菌库中的菌株接种至筛选平板，直接观察平板颜色变化，如果变为蓝 色，说明该菌株具有β-半乳糖苷酶水解活性。具体筛选培养基配方为：乳糖10 g/L，酵母 膏 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，MgS04 0.5 g/L，K2HP04 2.5g/L，X-Gal 0.1g/L，pH 7.0,琼脂20g/L。培养温度为37 °C，培养时间为12-36 h。此方法可筛选到大量耐有机溶 剂β-半乳糖苷酶产生菌。
[0037] 将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：将初筛获得的菌株接种至产酶发酵 培养基，具体配方为：乳糖10 g/L，酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HP04 2.5g/L，pH 7.0。培养温度为37 °C，培养时间为24 h，摇床转速为180 rpm。 发酵结束后取0. 4 mL发酵液加入至总体积I mL含有0.1 mL DMS0,2. 5 g/L叠氮胸苷，2. 5 g/L阿昔洛韦，100 g/L乳糖，50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0)的2 mL离心管中，37 °C，180 rpm反应24小时后，取样用甲醇终止转化反应，反应液经HPLC检测，计算转化率，选取能半 乳糖基化修饰叠氮胸苷、阿昔洛韦且转化率最高的菌株作为目标菌株。通过上述方法，发明 人获得了一株半乳糖基化修饰叠氮胸苷及阿昔洛韦的耐有机溶剂菌株YZ09。
[0038] 实施例2 本实施例说明耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ09的生物学性质、鉴定。
[0039] 菌株YZ09的生物学性质：该菌株为革兰氏阳性菌，无芽孢，显微镜观察菌体为杆 菌，兼性厌氧，最适生长温度为30~40 °C。其生理生化特性表现在：过氧化氢酶反应结果 为阴性，明胶反应结果为阴性，无运动，氧化葡萄糖产酸，可利用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、 果糖、麦芽糖、甘露醇等。
[0040] 经16S rDNA序列分析，菌株YZ09鉴定为干酪乳杆菌（ZacioAaciBw1S casei)，命 名为干酷乳杆菌（Lacio办aciBiAs casei) YZ09〇
[0041] 干酪乳杆菌（ZacioAaciBw1S casei) ΥΖ09,已经保藏。分类命名为干酪乳杆菌 YZ09保藏日期为2014年11月2日，保藏单位全称为中国典型微 生物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO :M 2014540。
[0042] 实施例3 本实施例说明干酪乳杆菌casei) YZ09发酵产酶方法。
[0043] 平板培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L， K2HP04 2 g/L，错酸钠5 g/L，柠檬酸2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.2 g/L，琼脂20 g/L， pH6. 5,溶于水。
[0044] 种子培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L， K2HPO4 2 g/L，错酸钠5 g/L，柠檬酸2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.2 g/L，pH6.5,溶于 水。
[0045] 种子液制备：250 mL三角瓶中种子液培养基的装液量为40 mL。刮取平板培养 24 h的菌株YZ09,接入种子培养基中，摇床转速为180 rpm，培养温度为37 °C，培养时间为 10~12 h，得到种子液。
[0046] 产酶发酵培养基配方：乳糖10 g/L，酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/ L，MgSO4 0· 5 g/L，K2HPO4 2. 5g/L，pH 6. 5。
[0047] 250 mL三角瓶中种子液培养基的装液量为40 mL。将种子液接种产酶发酵培养 基，接种量为2 % (v/v)，发酵温度37 °C，摇床转速为180 rpm，发酵时间为24 h。发酵结束 后，取发酵液于8000 rpm、4 °C离心10 min，弃上清，去菌体用与发酵液相同体积的50 mM 磷酸缓冲液（pH7. 0)重悬，超生破碎，于8000 rpm、4 °C离心10 min，取上清为粗酶液，酶活 达 6.58U/mL。
[0048] 实施例4 本实施例说明干酪乳杆菌（ZacioAaciBw1S casei) YZ09所产β-半乳糖苷酶GAL编 码基因的分离克隆程序。
[0049] 采用酷-氯仿法抽提菌体总DNA。根据干酪乳杆菌（Zacic^aciBm casei) 12Α (NCBI Reference Sequence :NC_CP006690. 1)的全基因测序结果进行分析，获得一个编码 β -半乳糖苷酶的基因，根据该基因序列设计引物SF和SR。
[0050] SF (SEQ ID NO :2)序列为：GCGGGATCCATGACGACCTTTTCGATCGATC， SR (SEQ ID NO :3)序列为：GCGGTCGACTTATTCCTCCTCTGTGTTCAGT。
[0051] 其中，引物SF下划线部分为BamH I酶切位点，引物SR下划线部分为Sal I酶切 位点。
[0052] 以干酪乳杆菌YZ09的基因组为模板，进行PCR扩增 。PCR 体系为：2\了39?11^]\&18七61]\^11〇41^，引物5?和51?各141^，0嫩模板141^和(1(1!120 7 μ LPCR扩增步骤为：⑴95 °C，预变性5 min; (2) 95 °C，变性30 s ; (3) 55 °C，退火 30 s ; (4) 72 °C，延伸2 min ;步骤（2) ~ (4)重复30次；（5) 72 °C彻底延伸7 min，冷却至 4 °C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带（图 1)。获得一条完整的β-半乳糖苷酶基因序列，全长1797 bp，命名为gal，其碱基序列如表 中 SEQ ID NO :1。
[0053] 实施例5 本实施例说明重组表达载体和重组表达转化体的制备。
[0054] 将实施例4所得的β-半乳糖苷酶基因片段在37 °C用限制性内切酶BamH I 和Sal I双酶切12 h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标 片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经BamH I和Sal I酶切后的质粒 pET28a，在16 °C下连接过夜得到重组表达质粒pET-辟人
[0055] 将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌（万.co/i) JM109 (DE3)感受态细胞中， 在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，菌落PCR验证阳性克 隆，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌（万.co/i) JM109 (DE3)/pET-辟人
[0056] 实施例6 本实施例说明重组β-半乳糖苷酶的诱导表达与纯化过程。
[0057] 将实施例5所得的重组大肠埃希氏菌（凡co/i) JM109 (DE3)/pET_辟Λ接种至含 卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0)中，37 °C振荡 培养过夜，按2 %(v/v)的接重量接入装有40 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置37 °C、 180 rpm摇床培养，当培养液OD6c?达到0. 6时，加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG作为诱 导剂，30 °C诱导6 h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将 所得的静息细胞悬浮于PH7. 0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，即为重组 β-半乳糖苷酶的粗酶液。
[0058] 粗酶液用Ni-NTA Agarose亲和柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，得到了电泳 纯半乳糖苷酶。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图见图2。
[0059] 实施例7 本实施例说明半乳糖苷酶活力测定过程。
[0060] 通过检测410 nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定β -半乳糖苷酶的活力。 β-半乳糖苷酶活力测定方法如下：用50 mM磷酸缓冲液（pH7.0)配置浓度为10 mmol/L 的oNPG底物溶液。反应体系中先加入10 μ L适当稀释的酶液，再加入240 μ L底物溶液， 在酶标仪中进行反应，反应温度为37 °C，反应时间为10 min，在410 nm波长下检测反应结 束时生成的oNP的量。以灭活酶液为空白对照。每1个单位（U) β -半乳糖苷酶定义为：在 相应条件下，每分钟催化oNPG水解产生1 μ mo I oNP所需的酶量。
[0061] 实施例6制备的粗酶液酶活为147. 28 U/mL。
[0062] 实施例8 本实施例考察β -半乳糖苷酶GAL的有机溶剂耐受性。
[0063] 将纯化后的β -半乳糖苷酶GAL稀释液分别加入6种亲水性有机溶剂中，其混合 比例为酶液：有机溶剂=4 : 1(v/v)，以加入相同体积50 mM磷酸缓冲液（ρΗ7.0)为对照。 37 °C，120 rpm振荡，每隔12 h取样检测β-半乳糖苷酶GAL的剩余活力，以缓冲液初始酶 活为对照。β -半乳糖苷酶GAL具有良好的有机溶剂耐受性，在20 %甲醇、乙醇、DMS0、丙 酮中处理96 h，其酶活几乎没有损失（图3)。
[0064] 实施例9 本实施例说明不同因素对叠氮胸苷半乳糖基化的影响。
[0065] 分别设计pH、温度、底物浓度、乳糖浓度、酶量、有机溶剂种类、有机溶剂浓度、反应 时间等作为单变量因素，研宄其对转化率的影响。实验结果（图4-11)表明最适反应pH为 7. 4左右，最适反应温度为45 °C，最适底物浓度为100 mM，乳糖浓度为500 mmol/L，酶添加 量为lU/mL，最适反应体系为10%(v/v)二甲基亚砜，反应6 h达到最大转化率。
[0066] 实施例 10-18 本实施例说明β -半乳糖苷酶GAL在非水相体系中修饰核苷类化合物的应用。
[0067] 在ρΗ7. 4磷酸缓冲液中加入10 % (v/v)二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度 为500 mmol/L，核苷类化合物20 mmol/L或100 mmol/L，加入I U实施例3或实施例6制 备的GAL粗酶液，在45 °C，180 rpm条件下反应6 h后取样。样品用甲醇稀释适当倍数，采 用HPLC进行检测，结果见表1。
[0068] 表1. GAL非水相合成半乳糖基核苷类化合物结果
结果表明β -半乳糖苷酶GAL在非水相中以乳糖为糖基供体，具有良好的修饰叠氮胸 苷、阿昔洛韦的能力，表明该酶将来在修饰新型核苷类药物中具有巨大潜力，具有广阔的应 用前景。
【主权项】
1. 一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，其特征在于，其属于乳杆菌属，命名为 caseiYZ09，已于2014年11月2日保存于中国典型微生物保藏中心，地 址为中国?武汉?武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2014540。2. -种由权利要求1所述菌株生产的半乳糖苷酶，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3. -种重组表达载体，包含如权利2所述的核苷酸序列。4. 一种重组表达转化体，包含如权利要求3所述的重组表达载体。5. 权利要求4所述的重组表达转化体为重组大肠埃希氏菌（万.co/i)JM109 (DE3) / pET-^a7〇6. 权利要求2所述的半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其特征在 于，以乳糖为糖基供体，在非水相反应条件中进行。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的非水相条件为：采用5~20 %的亲 水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为10~300mmol/L，乳糖浓度为0. 1~1.5mol/L，半乳糖 酶的用量为〇. 5~10U/mL，在pH5. 0~9. 0的缓冲溶液中，30~55°C反应1~12h;优选的，非 水相条件为10 %的亲水性有机溶剂，20mM阿昔洛韦或100mM叠氮胸苷，500mM乳糖的糖 基供体，IU/mL0-半乳糖苷酶，50mMpH7. 4的磷酸缓冲，45°C反应6h。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛 韦、肌苷、尿苷、2' -脱氧尿苷、5-氟-2' -脱氧尿苷、阿糖尿苷、胸苷、胞苷。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、 甲醇、乙醇或丙酮中的一种或几种。10. -种权利要求5所述的半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其 特征在于，包括如下内容： (1) 将重组大肠埃希氏菌（万.co/i)JM109 (DE3)/pET-^aA接种至含卡那霉素的LB培 养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7. 0)中，37 °C振荡培养过夜，按2 %(v/ v)的接重量接入装有40mLLB培养基的250mL三角瓶中，置37 °C、180rpm摇床培养， 当培养液OD6tltl达到0. 6时，加入终浓度为0. 5mmol/L的IPTG作为诱导剂，30 °C诱导6h 后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，将所得的静息细胞悬浮 于PH7. 0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，得到重组0 -半乳糖苷酶的粗 酶液； (2) 在pH7. 4磷酸缓冲液中添加10%的二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度为500 mmol/L，叠氮胸苷100mmol/L或20mM阿昔洛韦，加入上述（1)所得的粗酶液，在45 °C，转 速180rpm条件下反应，定时取样。
【专利摘要】本发明公开一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，一种半乳糖苷酶以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。该菌株分类命名为Lactobacillus casei YZ09，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2014540。本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。菌株YZ09所产半乳糖苷酶具有溶剂耐受性好、作用pH范围广、底物特异性好等性质。该半乳糖苷酶能廉价易得的乳糖为供体在非水相体系中修饰核苷类药物，具有很好的工业应用价值。CCTCC NO：M 201454020141102
【IPC分类】C12R1/245, C12N1/21, C12N1/20, C12N9/38, C12N15/70, C12P19/38
【公开号】CN104894022
【申请号】CN201510313195
【发明人】何冰芳, 周有治, 储建林, 张劲松, 刘柯, 吴斌, 钦松, 柏中中, 姜天玥
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂半乳糖苷酶，以及 一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属于生物制药技术领域。 技术背景
[0002] 叠氮胸苷、阿昔洛韦等核苷类药物是一类重要的抗肿瘤、抗病毒药物，广泛应用于 临床治疗各种癌症。叠氮胸苷是第一个抗HIV病毒药物，阿昔洛韦则是目前临床上最有效 的抗I型和II型单纯疱瘆病毒之一，对急性视网膜坏死水痘带状疱瘆病毒和EB病毒等其 他疱瘆病毒也有疗效。然而，叠氮胸苷由于高血浆浓度而引发较强的毒副作用，阿昔洛韦则 会对血液系统、神经系统、消化系统等具有一定的毒副作用。为了获得最佳治疗效果和较小 毒副作用，可以对叠氮胸苷等核苷类药物进行糖基化修饰。糖基化是一类重要的改性修饰 反应，不仅会改变化合物的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内的运输特性、亚细胞定位以 及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。研宄表明（Abram R.，Aman N.，von Borstel R.，Cell Biophysics, 1994，24-25 (I) :127-133) 5-氟尿苷的半乳糖衍 生物（5' -半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母药5-氟尿苷低100倍。Bonina等 (Bonina, F. , Puglia, C. ; Rimoli, M. G. ; Aval lone, L. , Abignente, E. ; Boatto, G. ; Nieddu, Μ. ; Meli, R. ; Amorena Μ. ; de Caprariis, Ρ. Eur. J. Pharm. Sci., 2002，16(3): 167-174)也报道了叠氮胸苷的半乳糖基衍生物不仅可以降低叠氮胸苷的血 浆浓度，而且可以保持有效浓度更长时间，避免频繁给药。
[0003] 目前，核苷糖基化衍生物主要通过化学法合成，但由于两底物中均存在多个活 性羟基或氨基，化学法的选择性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保护/脱保 护步骤，工艺非常复杂。而酶法糖基化一般只需一步反应，反应条件温和，具有很高的 区域选择性和化学选择性。然而，有关用糖苷酶催化核苷糖基化反应的报道并不多。 Binder 等(Binder ff.H. , Kiihlig Η. , Schmid ff. Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6(7):1703-1710)利用来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通过转糖基反应催化底物对硝基 苯基-β-D-半乳糖苷（/7NPG)和四种天然核苷（2' -脱氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成 了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率仅为3-7 %，区域选择性很差。Andreotti 等（Andreotti G. , Trincone A. , Giordano A. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007，47(1-2) :8-32)利用来源于海洋软体动物黑指纹海兔胰腺的β-半乳 糖苷酶，以邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（〇NPG)为糖基供体，催化叠氮胸苷半乳糖基化生成 5'-仏β-半乳糖基-叠氮胸苷，产率达到了 43 %，但其对底物的转化率仅为21. 5 %。颜丽 强等人（Yan L Q, Li Ν, Zong M Η. Journal of Biotechnology, 2012，164(2):371-375) 利用牛肝β-半乳糖苷酶以oNPG为供体进行了阿昔洛韦等无环核苷的半乳糖基化反应，但 是对底物的转化率仅有13 %，而且底物浓度仅为0.01 M。
[0004] 虽然说在过去几年中生物法糖基化修饰核苷类药物取得了一定的突破与进展，但 仍存在一些问题亟需解决。目前酶法糖基化修饰核苷类药物的糖基供体主要是oNPG或者 是/7NPG，这些相比较于寡糖来说，其价格昂贵，实际的应用价值较低。而通常的酶法催化在 水中进行，而要修饰阿昔洛韦等不溶于水或者难溶于水的化合物时，低产率及低转化率也 成为糖基化修饰的另一瓶颈。近年来不断发展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差 的问题，还可以对产物进行一定程度的调控，如果再以寡糖为糖基供体，将能很好地克服目 前生物法糖基化修饰核苷类药物存在的问题。因此，筛选以寡糖为糖基供体在非水相中糖 基化修饰核苷类药物的半乳糖苷酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的针对目前糖基化修饰核苷类药物存在的糖基供体价格昂贵、糖基化 反应转化前底物浓度低、产物摩尔转化率也较低等问题，提供一种有机溶剂耐受性好、以乳 糖为糖基供体的β -半乳糖苷酶及其产生菌，含有编码该酶基因的重组表达载体、重组表 达转化体及其高效制备方法，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方 法。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明首先从本实验室耐有机溶剂菌库中筛选获得一株 耐有机溶剂β -半乳糖苷酶产生菌，分类命名为干酪乳杆菌YZ09(L3cic^aciT7w5· casei YZ09)，其保藏编号为 CCTCC :M 2014540。
[0007] 本发明对干酪乳杆菌casei YZ09的生物学特征进行鉴定，该菌株 为革兰氏阳性菌株，无芽孢的杆菌，兼性厌氧，最适生长温度为30~40°C。其生理生化特性 表现在：过氧化氢酶反应结果为阴性，明胶反应结果为阴性，无运动，氧化葡萄糖产酸，可利 用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、果糖、麦芽糖、甘露醇等。
[0008] 经16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为ZacioAaciBw1S casei。
[0009] 本发明对该耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ09进行了产酶优化，优化后产酶量 达到了 6. 58 U/mL 本发明分离克隆到c<asi?iYZ09菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL的 编码基因，它具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达 系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂半乳糖苷 酶GAL基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂糖苷酶GAL基因全长1797个核苷酸， 编码598个氨基酸。
[0010] 本发明构建了耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL基因的表达载体。它可以通过本领域常 规方法将本发明所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种 载体，如市售的质粒、粘粒、菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制 得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的产物用限制性内切酶BamH I和Sal I 进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamH I和Sal I 双酶切，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的β-半乳糖苷酶基因的重组表达载体 ρΕ?-galo
[0011] 本发明将上述重组表达载体转化至宿主细胞制得重组表达转化体。所述的宿主可 为本领域常规的各种宿主，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发 明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表发即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌 (万.co7i) JM109 (DE3)。将前述重组表达质粒pET-^a7转化至（万.co7i) JM109 (DE3)中， 即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌（万.cWi) JM109 (DE3)/pET-辟人
[0012] 本发明还提供一种重组β-半乳糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发 明前述的重组表达转化体，获得重组表达的β_半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达 转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的β-半乳 糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7. 0。培 养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域 普通知识进行适当的选择，只要是转化体能够生长并产生本发明所述的β -半乳糖苷酶即 可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及 的重组大肠杆菌JM109 (DE3) /pET-gW接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的 光密度〇D_达到0. 6-1. 0时，在终浓度为0. 1-1. 0 mmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳 糖苷（IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组β-半乳糖苷酶。
[0013] 本发明中催化乳糖和核苷类药物转糖基得到半乳糖基核苷类衍生物的催化剂，可 以是上述产生的重组β -半乳糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离 后得到的转化体细胞。
[0014] 另一方面，本发明提供一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。 该方法包括将具有本发明半乳糖基化酶活力的物质加入含有核苷类化合物的转化夜中，进 行生物转化反应，使核苷类化合物转化为半乳糖基核苷类衍生物，所述转化液中含有核苷 类化合物和糖基供体，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦，所述糖基供体为乳糖。
[0015] 优选地，所述具有半乳糖基化酶活力物质包括具有半乳糖基化酶活力的发酵液、 发酵液上清、纯化的半乳糖基化酶和半乳糖基化酶重组表达蛋白。
[0016] 优选地，所述半乳糖基化酶为半乳糖苷酶，更优选地，所述半乳糖苷酶为 本发明中菌株ΥΖ09所产β-半乳糖苷酶或其重组表达蛋白。
[0017] 优选地，所述反应在非水 相反应条件中进行。
[0018] 优选地，所述的非水相条件为：采用5~20 %的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的 浓度为1〇~300 mmol/L，乳糖浓度为0. 1~1.5 mol/L，半乳糖酶的用量为0. 5~10 U/mL，在 pH5. 0~9. 0的缓冲溶液中，30~55 °C反应1~12 h ;优选的，非水相条件为10 %的亲水性有 机溶剂，20 mM阿昔洛韦或100 mM叠氮胸苷，500 mM乳糖的糖基供体，I U/mL β-半乳糖 苷酶，50 mM ρΗ7. 4的磷酸缓冲，45 °C反应6 h。更优选地，核苷类药物与乳糖的摩尔比为 1 ： 3~1 ： 10〇
[0019] 优选地，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、肌苷、尿苷、2'-脱氧尿苷、 5_氟_2' -脱氧尿苷、阿糖尿苷、胸苷、胞苷。
[0020] 优选地，所述的亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、乙醇或丙酮中的一种或几 种； 另一方面，本发明提供一种本发明菌株所产半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合 物中的应用，其特征在于，包括如下内容： (一）将重组大肠埃希氏菌（万.co/i) JM109 (DE3)/pET-辟人接种至含卡那霉素的LB 培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0)中，37 °C振荡培养过夜，按2 %(v/v)的接重量接入装有40 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置37 °C、180 rpm摇床培 养，当培养液OD6c?达到0. 6时，加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG作为诱导剂，30 °C诱导6 h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬 浮于pH7. 0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，得到重组β -半乳糖苷酶的 粗酶液。
[0021] (二）在ρΗ7. 4磷酸缓冲液中添加10%的二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度 为500 mmol/L，叠氮胸苷100 mmol/L或20 mM阿昔洛韦，加入上述(一）所得的粗酶液，在 45 °C，转速180 rpm条件下反应，定时取样。
[0022] 本发明的有益效果在于：本发明针对目前生物法糖基化修饰核苷类药物的研宄 中存在的糖基供体价格昂贵、部分底物水溶性差、产率及转化率低等问题，提供一种新的 半乳糖苷酶及利用重组半乳糖苷酶在非水相中修饰核苷类药物的方法。反应以廉 价易得的乳糖为糖基供体，在非水相体系中进行转糖基反应，成功克服了目前生物法糖基 化修饰核苷类药物存在的问题，具有很好的应用潜力。
【附图说明】
[0023] 图1为基因济^的PCR扩增电泳图，其中：1. DNA Marker ;2~5.基因济^的PCR 扩增产物。
[0024] 图2为重组β-半乳糖苷酶GAL的聚丙烯酰胺电泳图（1 :蛋白Marker ;2:纯酶； 3 :细胞破碎液)。
[0025] 图3为重组β -半乳糖苷酶GAL的溶剂稳定性。
[0026] 图4为pH对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0027] 图5为温度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0028] 图6为底物浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0029] 图7为乳糖浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0030] 图8为酶添加量对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0031] 图9为有机溶剂种类对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0032] 图10为有机溶剂浓度对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0033] 图11为反应时间对半乳糖基化叠氮胸苷的影响。
[0034] 本发明所涉及的生物材料，是一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，其属于乳杆 菌属，命名为YZ09,已于2014年11月2日保存于中国典型微生物保 藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO :M 2014540。
【具体实施方式】 [0035] 实施例1 本实施例说明半乳糖基化修饰核苷类药物的耐有机溶剂菌株的筛选程序。
[0036] 初筛采用如下方法：以X-Gal (5-溴-4-氯_3_吲哚-β _D_半乳糖苷)为底物，将 本实验室耐有机溶剂菌库中的菌株接种至筛选平板，直接观察平板颜色变化，如果变为蓝 色，说明该菌株具有β-半乳糖苷酶水解活性。具体筛选培养基配方为：乳糖10 g/L，酵母 膏 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，MgS04 0.5 g/L，K2HP04 2.5g/L，X-Gal 0.1g/L，pH 7.0,琼脂20g/L。培养温度为37 °C，培养时间为12-36 h。此方法可筛选到大量耐有机溶 剂β-半乳糖苷酶产生菌。
[0037] 将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：将初筛获得的菌株接种至产酶发酵 培养基，具体配方为：乳糖10 g/L，酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HP04 2.5g/L，pH 7.0。培养温度为37 °C，培养时间为24 h，摇床转速为180 rpm。 发酵结束后取0. 4 mL发酵液加入至总体积I mL含有0.1 mL DMS0,2. 5 g/L叠氮胸苷，2. 5 g/L阿昔洛韦，100 g/L乳糖，50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0)的2 mL离心管中，37 °C，180 rpm反应24小时后，取样用甲醇终止转化反应，反应液经HPLC检测，计算转化率，选取能半 乳糖基化修饰叠氮胸苷、阿昔洛韦且转化率最高的菌株作为目标菌株。通过上述方法，发明 人获得了一株半乳糖基化修饰叠氮胸苷及阿昔洛韦的耐有机溶剂菌株YZ09。
[0038] 实施例2 本实施例说明耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ09的生物学性质、鉴定。
[0039] 菌株YZ09的生物学性质：该菌株为革兰氏阳性菌，无芽孢，显微镜观察菌体为杆 菌，兼性厌氧，最适生长温度为30~40 °C。其生理生化特性表现在：过氧化氢酶反应结果 为阴性，明胶反应结果为阴性，无运动，氧化葡萄糖产酸，可利用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、 果糖、麦芽糖、甘露醇等。
[0040] 经16S rDNA序列分析，菌株YZ09鉴定为干酪乳杆菌（ZacioAaciBw1S casei)，命 名为干酷乳杆菌（Lacio办aciBiAs casei) YZ09〇
[0041] 干酪乳杆菌（ZacioAaciBw1S casei) ΥΖ09,已经保藏。分类命名为干酪乳杆菌 YZ09保藏日期为2014年11月2日，保藏单位全称为中国典型微 生物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO :M 2014540。
[0042] 实施例3 本实施例说明干酪乳杆菌casei) YZ09发酵产酶方法。
[0043] 平板培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L， K2HP04 2 g/L，错酸钠5 g/L，柠檬酸2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.2 g/L，琼脂20 g/L， pH6. 5,溶于水。
[0044] 种子培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L， K2HPO4 2 g/L，错酸钠5 g/L，柠檬酸2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.2 g/L，pH6.5,溶于 水。
[0045] 种子液制备：250 mL三角瓶中种子液培养基的装液量为40 mL。刮取平板培养 24 h的菌株YZ09,接入种子培养基中，摇床转速为180 rpm，培养温度为37 °C，培养时间为 10~12 h，得到种子液。
[0046] 产酶发酵培养基配方：乳糖10 g/L，酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/ L，MgSO4 0· 5 g/L，K2HPO4 2. 5g/L，pH 6. 5。
[0047] 250 mL三角瓶中种子液培养基的装液量为40 mL。将种子液接种产酶发酵培养 基，接种量为2 % (v/v)，发酵温度37 °C，摇床转速为180 rpm，发酵时间为24 h。发酵结束 后，取发酵液于8000 rpm、4 °C离心10 min，弃上清，去菌体用与发酵液相同体积的50 mM 磷酸缓冲液（pH7. 0)重悬，超生破碎，于8000 rpm、4 °C离心10 min，取上清为粗酶液，酶活 达 6.58U/mL。
[0048] 实施例4 本实施例说明干酪乳杆菌（ZacioAaciBw1S casei) YZ09所产β-半乳糖苷酶GAL编 码基因的分离克隆程序。
[0049] 采用酷-氯仿法抽提菌体总DNA。根据干酪乳杆菌（Zacic^aciBm casei) 12Α (NCBI Reference Sequence :NC_CP006690. 1)的全基因测序结果进行分析，获得一个编码 β -半乳糖苷酶的基因，根据该基因序列设计引物SF和SR。
[0050] SF (SEQ ID NO :2)序列为：GCGGGATCCATGACGACCTTTTCGATCGATC， SR (SEQ ID NO :3)序列为：GCGGTCGACTTATTCCTCCTCTGTGTTCAGT。
[0051] 其中，引物SF下划线部分为BamH I酶切位点，引物SR下划线部分为Sal I酶切 位点。
[0052] 以干酪乳杆菌YZ09的基因组为模板，进行PCR扩增 。PCR 体系为：2\了39?11^]\&18七61]\^11〇41^，引物5?和51?各141^，0嫩模板141^和(1(1!120 7 μ LPCR扩增步骤为：⑴95 °C，预变性5 min; (2) 95 °C，变性30 s ; (3) 55 °C，退火 30 s ; (4) 72 °C，延伸2 min ;步骤（2) ~ (4)重复30次；（5) 72 °C彻底延伸7 min，冷却至 4 °C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带（图 1)。获得一条完整的β-半乳糖苷酶基因序列，全长1797 bp，命名为gal，其碱基序列如表 中 SEQ ID NO :1。
[0053] 实施例5 本实施例说明重组表达载体和重组表达转化体的制备。
[0054] 将实施例4所得的β-半乳糖苷酶基因片段在37 °C用限制性内切酶BamH I 和Sal I双酶切12 h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标 片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经BamH I和Sal I酶切后的质粒 pET28a，在16 °C下连接过夜得到重组表达质粒pET-辟人
[0055] 将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌（万.co/i) JM109 (DE3)感受态细胞中， 在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，菌落PCR验证阳性克 隆，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌（万.co/i) JM109 (DE3)/pET-辟人
[0056] 实施例6 本实施例说明重组β-半乳糖苷酶的诱导表达与纯化过程。
[0057] 将实施例5所得的重组大肠埃希氏菌（凡co/i) JM109 (DE3)/pET_辟Λ接种至含 卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0)中，37 °C振荡 培养过夜，按2 %(v/v)的接重量接入装有40 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，置37 °C、 180 rpm摇床培养，当培养液OD6c?达到0. 6时，加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG作为诱 导剂，30 °C诱导6 h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将 所得的静息细胞悬浮于PH7. 0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，即为重组 β-半乳糖苷酶的粗酶液。
[0058] 粗酶液用Ni-NTA Agarose亲和柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，得到了电泳 纯半乳糖苷酶。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图见图2。
[0059] 实施例7 本实施例说明半乳糖苷酶活力测定过程。
[0060] 通过检测410 nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定β -半乳糖苷酶的活力。 β-半乳糖苷酶活力测定方法如下：用50 mM磷酸缓冲液（pH7.0)配置浓度为10 mmol/L 的oNPG底物溶液。反应体系中先加入10 μ L适当稀释的酶液，再加入240 μ L底物溶液， 在酶标仪中进行反应，反应温度为37 °C，反应时间为10 min，在410 nm波长下检测反应结 束时生成的oNP的量。以灭活酶液为空白对照。每1个单位（U) β -半乳糖苷酶定义为：在 相应条件下，每分钟催化oNPG水解产生1 μ mo I oNP所需的酶量。
[0061] 实施例6制备的粗酶液酶活为147. 28 U/mL。
[0062] 实施例8 本实施例考察β -半乳糖苷酶GAL的有机溶剂耐受性。
[0063] 将纯化后的β -半乳糖苷酶GAL稀释液分别加入6种亲水性有机溶剂中，其混合 比例为酶液：有机溶剂=4 : 1(v/v)，以加入相同体积50 mM磷酸缓冲液（ρΗ7.0)为对照。 37 °C，120 rpm振荡，每隔12 h取样检测β-半乳糖苷酶GAL的剩余活力，以缓冲液初始酶 活为对照。β -半乳糖苷酶GAL具有良好的有机溶剂耐受性，在20 %甲醇、乙醇、DMS0、丙 酮中处理96 h，其酶活几乎没有损失（图3)。
[0064] 实施例9 本实施例说明不同因素对叠氮胸苷半乳糖基化的影响。
[0065] 分别设计pH、温度、底物浓度、乳糖浓度、酶量、有机溶剂种类、有机溶剂浓度、反应 时间等作为单变量因素，研宄其对转化率的影响。实验结果（图4-11)表明最适反应pH为 7. 4左右，最适反应温度为45 °C，最适底物浓度为100 mM，乳糖浓度为500 mmol/L，酶添加 量为lU/mL，最适反应体系为10%(v/v)二甲基亚砜，反应6 h达到最大转化率。
[0066] 实施例 10-18 本实施例说明β -半乳糖苷酶GAL在非水相体系中修饰核苷类化合物的应用。
[0067] 在ρΗ7. 4磷酸缓冲液中加入10 % (v/v)二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度 为500 mmol/L，核苷类化合物20 mmol/L或100 mmol/L，加入I U实施例3或实施例6制 备的GAL粗酶液，在45 °C，180 rpm条件下反应6 h后取样。样品用甲醇稀释适当倍数，采 用HPLC进行检测，结果见表1。
[0068] 表1. GAL非水相合成半乳糖基核苷类化合物结果
结果表明β -半乳糖苷酶GAL在非水相中以乳糖为糖基供体，具有良好的修饰叠氮胸 苷、阿昔洛韦的能力，表明该酶将来在修饰新型核苷类药物中具有巨大潜力，具有广阔的应 用前景。
【主权项】
1. 一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，其特征在于，其属于乳杆菌属，命名为 caseiYZ09，已于2014年11月2日保存于中国典型微生物保藏中心，地 址为中国?武汉?武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2014540。2. -种由权利要求1所述菌株生产的半乳糖苷酶，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3. -种重组表达载体，包含如权利2所述的核苷酸序列。4. 一种重组表达转化体，包含如权利要求3所述的重组表达载体。5. 权利要求4所述的重组表达转化体为重组大肠埃希氏菌（万.co/i)JM109 (DE3) / pET-^a7〇6. 权利要求2所述的半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其特征在 于，以乳糖为糖基供体，在非水相反应条件中进行。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的非水相条件为：采用5~20 %的亲 水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为10~300mmol/L，乳糖浓度为0. 1~1.5mol/L，半乳糖 酶的用量为〇. 5~10U/mL，在pH5. 0~9. 0的缓冲溶液中，30~55°C反应1~12h;优选的，非 水相条件为10 %的亲水性有机溶剂，20mM阿昔洛韦或100mM叠氮胸苷，500mM乳糖的糖 基供体，IU/mL0-半乳糖苷酶，50mMpH7. 4的磷酸缓冲，45°C反应6h。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛 韦、肌苷、尿苷、2' -脱氧尿苷、5-氟-2' -脱氧尿苷、阿糖尿苷、胸苷、胞苷。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、 甲醇、乙醇或丙酮中的一种或几种。10. -种权利要求5所述的半乳糖苷酶在酶法半乳糖基化核苷类化合物中的应用，其 特征在于，包括如下内容： (1) 将重组大肠埃希氏菌（万.co/i)JM109 (DE3)/pET-^aA接种至含卡那霉素的LB培 养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7. 0)中，37 °C振荡培养过夜，按2 %(v/ v)的接重量接入装有40mLLB培养基的250mL三角瓶中，置37 °C、180rpm摇床培养， 当培养液OD6tltl达到0. 6时，加入终浓度为0. 5mmol/L的IPTG作为诱导剂，30 °C诱导6h 后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，将所得的静息细胞悬浮 于PH7. 0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心手机上清液，得到重组0 -半乳糖苷酶的粗 酶液； (2) 在pH7. 4磷酸缓冲液中添加10%的二甲基亚砜作为反应介质，其中乳糖浓度为500 mmol/L，叠氮胸苷100mmol/L或20mM阿昔洛韦，加入上述（1)所得的粗酶液，在45 °C，转 速180rpm条件下反应，定时取样。
【专利摘要】本发明公开一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，一种半乳糖苷酶以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。该菌株分类命名为Lactobacillus casei YZ09，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2014540。本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。菌株YZ09所产半乳糖苷酶具有溶剂耐受性好、作用pH范围广、底物特异性好等性质。该半乳糖苷酶能廉价易得的乳糖为供体在非水相体系中修饰核苷类药物，具有很好的工业应用价值。CCTCC NO：M 201454020141102
【IPC分类】C12R1/245, C12N1/21, C12N1/20, C12N9/38, C12N15/70, C12P19/38
【公开号】CN104894022
【申请号】CN201510313195
【发明人】何冰芳, 周有治, 储建林, 张劲松, 刘柯, 吴斌, 钦松, 柏中中, 姜天玥
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
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